Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение лапчатки белой - Potentilla alba L., интродуцированной на Северном Кавказе

На правах рукописи

ШЕРИЕВА ФАТИМА КУШБИЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ - POTENTILLA ALBA L., ИНТРОДУЦИРОВАННОЙ НА СЕВЕРНОМ КАВЬСАЗЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 АПР 2015

005566458

ПЯТИГОРСК-2015

005566458

Работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте - филиале

государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биол. наук, профессор

Мелик-Гусейнов Валерий Владимирович

Официальные Бубенчиков Роман Александрович, доктор

оппоненты: фармацевтических наук, ассистент кафедры

фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России

Кусова Раиса Дзиппоевна, кандидат фармацевтических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинский государственный университет» имени К.Л. Хетагурова Министерства образования Российской Федерации, доцент кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита состоится 2015 года в Ю00 часов на заседании

диссертационного совета Д 2(58.008.09. при ГБОУ ВПО «ВолгГМУ» Минздрава России по адресу: 357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «ВолгГМУ» Минздрава России по адресу: 357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11 и на сайте: http://vvvvw.pniedpliarm.ru/

Автореферат разослан асЫ^ » >ЛЛ2015 г.

Ученый секретарь £ п .. „

. /¡/' Ремезова Ирина Петровна

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. В настоящее время потребность в лекарственных средствах растительного происхождения и интерес к ним научной и народной медицины постоянно растет. Однако в результате усиления антропогенной нагрузки на природные популяции лекарственных растений и учащения случаев нерегламентированной заготовки человечество столкнулось с проблемой сокращения их численности. Одним из путей сохранения генофонда ценных лекарственных растений ex situ является интродукция и создание искусственных агропопуляций, в том числе в ботанических садах.

Одним из ценнейших лекарственных растений, нуждающихся в сохранении, является лапчатка белая Potentilla alba L. Лапчатка белая -многолетнее травянистое растение семейства розоцветных (Rosaceae), произрастающее в центральных районах европейской части России, Крыму, Средней и Восточной Европе. Зарослей не образует, встречается рассеянно, часто отдельными экземплярами, не более 2-3 растений на 1 м2.

За счет высокого содержания йода и способности оказывать влияние на уровень гормонов щитовидной железы - тироксина (Т4) и трийодтиронина (ТЗ), лапчатка белая широко применяется для коррекции гипофункции и гиперфункции щитовидной железы. В народной медицине разных стран лапчатка белая используется также при лечении инсульта, инфаркта, атеросклероза, гипертонии, язвы желудка. Лекарственным растительным сырьем являются корневища с корнями, которые содержат углеводы, сапонины, фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды, дубильные вещества.

В настоящее время вследствие интенсификации сельского и лесного хозяйства, массовых заготовок сырья в природных местообитаниях данный вид становится всё более редким и введен в Красную книгу ряда регионов России. В целях сохранения лапчатки белой существует необходимость во введении в культуру, однако вопросы биологии, возможности интродукции и

сохранения ex situ данного вида являются практически неизученными.

з

В связи с этим введение в культуру на территории Северного Кавказ редкого и исчезающего вида, проведение фитохимических и биологически исследований лапчатки белой в условиях интродукции, разработк нормативной документации и внедрение в фармацевтическую практик нового лекарственного растительного сырья является актуальной задачей для фармацевтической науки и практики.

Степень разработанности темы. Фитохимическое изучение травы и корневищ с корнями лапчатки белой проводилось российскими исследователями в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ) (Водопьянова A.M., Архипова Э.В.) и белорусскими исследователями (Башилов A.B.). Работа по введению в культуру лапчатки белой осуществлялась в Беларуси в Центральном ботаническом саду Национальной Академии наук, где создана коллекция из 8 видов и внутривидовых таксонов рода Potentilla L. Российские ученые исследовали только дикорастущую лапчатку белую. Работ по введению в культуру данного вида, изучению особенностей его онтогенеза в условиях интродукции и состава биологически активных веществ не проводилось. Исходя из этого, нами была определена цель диссертационной работы и поставлены задачи, необходимые для ее реализации.

Цель н задачи работы. Целью работы явилась интродукция лапчатки белой в условиях Северного Кавказа и экспериментальное обоснование применения корневищ с корнями культивируемого вида в качестве источника полифенолов, органических кислот, полисахаридов и йода.

Поставленная цель предполагала решение следующих задач:

1. Осуществить интродукционные исследования лапчатки белой на базе Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН (Ставропольский край), Ботанического сада Кабардино-Балкарского государственного университета и в Зольском районе Кабардино-Балкарии;

2. Установить диагностические морфолого-анатомические признаки, определить товароведческие показатели сырья;

3. Исследовать фитохимический состав корневищ с корнями интродуцированного вида;

4. Определить острую токсичность извлечений из культивируемых образцов;

5. Разработать «Инструкцию по сбору и сушке» и проект ФС «Лапчатки корневища с корнями».

Научная новизна. Впервые проведены исследования по введению в культуру лапчатки белой в условиях Северного Кавказа. Впервые установлен состав биологически активных соединений (БАС) корневищ с корнями интродуцированной лапчатки белой. В составе фенольных соединений лапчатки белой идентифицированы впервые кофейная, феруловая кислоты, гесперидин и лютеолин-7-гликозид. В корневищах с корнями исследуемого вида установлен состав полисахаридов, органических кислот; определено количественное содержание йода. Впервые проведено морфолого-анатомическое изучение корневищ с корнями и травы лапчатки белой; установлены характерные диагностические признаки и товароведческие показатели сырья.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость. В результате изучения химического состава подземных органов интродуцированной лапчатки белой доказана целесообразность ее применения как источника фенольных соединений, полисахаридов, органических кислот и йода.

Практическая значимость. Проект ФС «Лапчатки корневища с корнями» апробирован на экспериментальном участке ЗАО «Ст.-Медифарм» (г. Москва) (акт внедрения - 2014 г.). Лапчатка белая предложена в качестве интродуцента в виде лекарственной культуры для посадки на территории сельскохозяйственных угодий Кабардино-Балкарской республики (акт

внедрения — 2012 г.). Разработана «Инструкция по сбору и сушке корневищ с корнями лапчатки белой».

Технологическая схема производства препарата «Лапчатки белой настойка» апробирована в производственных условиях экспериментального участка ООО «Бивитекс» (г. Нальчик, КБР) (акт апробации - 2012 г.).

Результаты научных исследований по интродукции лапчатки белой н Северном Кавказе внедрены в учебный процесс кафедры ботаники и используются на лабораторных и лекционных занятиях студентов 2-3 курс Медицинского колледжа Кабардино-Балкарского университета (ак внедрения — 2013 г.).

Методология и методы исследования. Методология фармакогностического исследования подразумевает научно обоснованную и целесообразно организованную последовательность действий и включае несколько блоков: информационно-исследовательский, фитохимический, технологический, стандартизационный и фармакологический. При проведении работы использовались следующие методы исследований: биологические, химические, физико-химические, микробиологические, технологические и фармакологические.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты интродукционных исследований лапчатки белой в условиях Северного Кавказа;

2. Данные о комплексной оценке растительного сырья, включающей фитохимические, фармакологические и микробиологические исследования корневищ с корнями лапчатки белой, интродуцированной на Северном Кавказе;

3. Результаты морфолого-анатомических исследований корневищ с корнями и травы лапчатки белой;

4. Результаты определения острой токсичности извлечения из корневищ с корнями лапчатки белой.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов достигается благодаря использованию современных фармакогностических, химических, физико-химических, технологических, биологических и фармакологических методов, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты. Результаты измерений

статистически обработаны.

Основные положения диссертационной работы доложены на XIV международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа и Юга России» (г. Махачкала, 5-7 ноября 2012 г.) и научной конференции ПМФИ - филиала ВолгГМУ «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» в 2013 г. По результатам диссертационного исследования опубликовано 10 печатных работ, включая 3 работы в

журналах из перечня ВАК РФ.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Автором проведен литературный поиск и обоснован выбор направления исследований, осуществлен фитохимический анализ корневищ с корнями лапчатки белой, выполнена статистическая обработка данных экспериментальных исследований. Соискателем лично выполнены исследования по определению острой токсичности; разработан проект фармакопейной статьи и проведена его апробация на экспериментальном участке ЗАО «Ст.-Медифарм» (г. Москва). Автор принимал участие в научных конференциях, написании научных статей для публикаций.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, списка цитируемой литературы, включающего 127 источников, из которых 29 иностранных авторов и приложения. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками и 25 таблицами.

Основное содержание работы

Объектами исследования явились корневища с корнями лапчатки белой (л белой), интродуцированной в условиях Северного Кавказа (на территорш Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН, Ботаническом сад Кабардино-Балкарского государственного университета (КБГУ) в г. Нальчш и Зольском районе КБР). Сбор подземных органов проводили к конц, третьего года жизни растений, поскольку именно в этот период происходи формирование значительной подземной биомассы. Очищенные от гнилы, частей, отмытые от земли корневища с корнями сушили при комнатно1 температуре методом воздушно-теневой сушки, в помещении с хороше! вентиляцией. Время между сбором и сушкой не превышало 2 часов. Крупны подземные органы перед сушкой разрезали на части. Сушку считал законченной, когда сырьё не гнулось, а ломалось при сгибании. После сушк корневища с корнями отсеивали ситом от оставшейся земли и пыли.

Выделение и идентификация БАБ из корневищ с корнями л. белой В результате проведенных качественных реакций в извлечениях и корневищ с корнями л. белой идентифицировали фенольные соединения аминокислоты и полисахариды.

Состав фенольных соединений определяли хроматографическим методами. Результаты тонкослойной и бумажной хроматографии извлечения из корневищ с корнями л. белой показали наличие рутина, кверцетина, цинарозида, кофейной, хлорогеновой и феруловой кислот. Методом ВЭЖ при наличии доступных стандартов было идентифицировано 13 веществ фенольной природы, представленных фенолкарбоновым кислотами (галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая, коричная, эллаговая кислоты), флавоноидами (рутин, лгатеолин-7-глюкозид (цинарозид), кверцетин, дегидрокверцетин, кемпферол, апигенин), дубильными веществами (танин) и кумаринами (кумарин). Мажорными фенольными соединениями явились коричная кислота (15,2%), ЭКГгаплат (12,7%), и феруловая кислота (8,8%) (таблица 1).

Время, мни Высота ппка, т\; Площадь пика, тУ*сск Содержание, % от суммы фенольных соединений (метод внутренней нормализации) Название соединения

3,39 291,89 5604,48 5,69 Танин

3,90 275,60 6494,16 6,60 Галловая кислота

4,16 835,78 12483,66 12,68 ЭГКгаллат

5,54 90,80 6127,37 6,22 Хлорогеиовая кислота

6,67 58,57 3356,02 3,41 Кофейная кислота

8,39 110,35 8671,22 8,81 Феруловая кислота

9,75 36,87 3278,53 3,33 Дигидрокумарин

11,72 25,26 1919,71 1,95 Эпнкатехин

13.39 24.00 1051.17 1,07 Лютеолин-7-глюкозид

14,17 31,15 3694,70 3,75 Гесперидин

23,45 110,50 14964,29 15,20 Коричная кислота

26,86 19,02 1624,35 1,65 Эллаговая кислота

59,86 9,18 2213,38 2,25 Кверцетин

Определение органических кислот методом восходящей бумажной хроматографии позволило выявить наличие щавелевой и маликовой кислот, что подтвердилось результатами ВЭЖХ-анализа. Количественное содержание щавелевой кислоты составило 79,95 %, маликовой - 1,18% от суммы органических кислот (таблица 2).

Таблица 2 - Состав органических кислот подземных органов лапчатки белой

Время, мин Высота пика, тУ Площадь пика, тУ*сек Содержание, % от суммарного содержания органических кислот (метод внутренней нормализации) Название соединения

4,34 662,04 13304,65 75,95 Щавелевая кислота

6,47 15,56 205,89 1,18 Маликовая кислота

Выход полисахаридного комплекса составил 2,87±0,21% от массы

корневищ с корнями л. белой. Полисахар и дный комплекс представлял собой аморфное вещество светло-коричневого цвета без запаха, давал положительные реакции осаждения со спиртом, ацетоном, реакцию Фелинга после кислотного гидролиза. Моносахаридный состав определяли методом ВЭЖХ (таблица 3). Среди идентифицированных Сахаров мажорной явилась арабиноза, содержание которой, согласно методу внутренней нормализации, составило 14,91%.

Таблица 3 — Содержание углеводов в подземных органах лапчатки белой

Время, мин

Высота пика, тУ

Площадь пика, тУ^сек

Концентрация, % от полисахаридного комплекса (метод внутренней нормализации)

6,46

138,78

2040,20

2,09

6,95

252,41

14556,60

14,91

Проведенные качественные реакции показали, что корневища с корнями л. белой содержат дубильные вещества и гидролизуемой и конденсированной группы. Хроматографически были идентифицированы танин и кислота галловая.

Для количественного определения дубильных веществ использовали метод перманганатометрии и УФ спектрофотометрии в пересчете на кислоту галловую. Результаты определения представлены в таблицах 4,5,6.

Таблица 4 - Содержание фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту, определенных методом УФ спектрофотометрии (Х,%)

Содержание группы БАВ, % на абсолютно сухое сырье

осаждаемых дубильных веществ не осаждаемых фенольных соединений суммы фенольных соединений

8,57 ± 0,04 5,71 ±0,04 14,28 ±0,09

Таблица 5 - Метрологические характеристики методики количественного определения дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую методом УФ спектрофотометрии

Сырье п X в д- Р, % Т(Р,0 ¡IX

Корневища с корнями лапчатки белой 6 8,57% 0,02 0,008 95 2,57 0,02 3,4

Таблица 6 - Метрологические характеристики перманганатометрической методики количественного определения содержания дубильных веществ

Сырье

в-

Р, %

т(р,0

Корневища с корнями л. белой

16,37%

0,02

0,008

95

2,57

0,12

3,1

Хроматографически в корневищах с корнями л. белой было идентифицировано 10 аминокислот, в том числе 4 незаменимые — лейцин, лизин, фенилаланин, триптофан и 1 частично заменимая аминокислота -аргинин. Результаты определения состава аминокислот методом жидкостной хроматографии приведены в таблице 7.

Ам иноки слота Химическое название Количественное содержание

% от веса воздушно-сухого сырья г/кг

Незаменимые аминокислоты

Лейцин а- аминоизокапроповая 0,17 1,73

Лизин а,е- диаминокапроновая 0,07 0,72

Триптофан Ь-а-амино-Р-индолилпропио-новая 0,20 2,01

Фенил апанин а- амино-р-фенилпропионовая 0,04 0,36

Частично заменимые аминокислоты

Аргинин а- амино-а-гуанидин-н-валериановая 0,16 1,61

Заменимые аминокислоты

Аспарагин а- аминоянтарная 0,38 3,81

Глицин а- аминоуксусная 0,35 3,51

Глютамин а- аминоглутаровая 0,25 2,54

Серии а- амино-Р-оксипропионовая 0,27 2,68

Тирозин а- амино-р-оксифенилпропионова! 0,09 0,93

Общая сумма аминокислот 1,98 19,90

Сумма незаменимых аминокислот 0,48 4,82

Сумма частично заменимых аминокислот 0,16 1,61

Сумма заменимых аминокислот 1,34 13,4/

Согласно результатам анализа, содержание аминокислот составило 19,90 г/кг. Идентифицировано 10 аминокислот, около 24 % из которых -незаменимые. В числе незаменимых аминокислот преобладали триптофан (2,01 г/кг) и лейцин (1,73 г/кг), в числе заменимых - аспарагин (3,81 г/кг) и глицин (3,51 г/кг). Мажорной аминокислотой являлся аспарагин.

Методом эмиссионного спектрального анализа установлено, что состав проб корневище корнями л. белой представлен 38 химическими элементами.

Морфолого-анатомические исследования сырья лапчатки белой Объектом изучения явились подземные органы л. белой, собранные в условиях интродукции на территории ботанического сада г. Нальчик в фазу цветения. Анатомическое строение подземных органов изучали на поперечных срезах корня и корневища. Корень имеет вторичное строение, покровная ткань представлена перидермой. Клетки феллемы таблитчатой формы, клеточные стенки пропитаны суберином. Перициклическая зона образована паренхимными клетками. Флоэма представлена мелкими ситовидными элементами. В паренхимных клетках флоэмы расположено

11

большое количество крахмальных зерен (рисунок 1 А). Зона камбия разделяет флоэму и ксилему. Ксилема характеризуется максимальной паренхиматизацией. Крахмалоносные клетки обильно представлены и в зоне радиальных лучей. Характерно наличие паренхимной обкладки сосудистых элементов (рисунок 1Б). Первичная ксилема триархна, характерна максимальная лигнификация сосудистых элементов.

На поперечном срезе корневища в центральной зоне располагается паренхима сердцевины, образованная живыми крупными паренхимными; клетками округлой формы, в некоторых из которых имеются сферокристаллические включения. Проводящая система пучкового типа, пучки коллатеральные, вытянутой формы. Флоэмная структура неоднородна, содержит ситовидные элементы, представленные мелкими клетками, и паренхимные элементы. Ксилема содержит наряду с проводящими элементами механические и паренхимные элементы. Волокна небольшого диаметра расположены ближе к крупным, округлой формы сосудам. Паренхима сердцевинных лучей имеет клетки вытянутой формы. Клеточные стенки либо не утолщенные, либо слабо лигнифицированные. В лучевой паренхиме можно обнаружить одиночные друзы оксалата кальция и многочисленные сферокристаллы.

Рисунок I - Анатомическое строение корня лапчатки белой А - общий вид поперечного среза, Б - фрагмент поперечного среза

Рисунок 2 — Проводящая система корня (люминисцентный микроскоп) (А-ув.х80;Б-ув.х400)

Рисунок 3- Анатомическое строение корневища в зоне паренхимы сердцевины лапчатки белой (А - ув.х80; Б - ув.х400)

К диагностическим признакам травы относятся: листовая пластинка дорзовентрального типа с кристаллоносной обкладкой жилок, образованной друзами оксалата кальция и густое опушение, образованное простыми одноклеточными волосками. Устьичный аппарат аномоцитного типа. Черешок листа треугольно - седловидной формы на поперечном сечении.

Далее были проведены товароведческие исследования на 6 сериях и разработаны числовые показатели и нормы качества для сырья л. белой, которые положены в основу разработанной нами ФС «Лапчатки корневища с корнями» (таблица 8).

Таблица 8 - Нормы качества «Лапчатки корневища с корнями»

Показатели Методы Нормы

Внешние признаки Внешние признаки В соответствии с ФС

Микроскопия Микроскопический В соответствии с ФС

Качественные реакции К 5 мл водного извлечения прибавляют 1 мл I % водного раствора железоаммониевых квасцов и встряхивают Раствор приобретает черно - зеленое окрашивание

Влажность ГФ XI, вып. 1, С. 285-286 Не более 10%

Зола общая ГФХИ, часть 1, С. 115 Не более 5%

Зола нерастворимая в 10% НС1 ГФ XI, вып. 1, С. 25 Не более 2%

Органические примеси ГФ XI, вып. 1,С. 276 Не более 2%

Минеральные примеси ГФ XI, вып. 1, С. 276 Не более 1%

Количественное определение ВЭЖХ Галловой кислоты - не менее 6 % от суммы фенольных соединений (метод внутренней нормализации)

Микробиологиче екая чистота ГФХПОФС 42-0016-07 Категория 4 А

Упаковка ГФ XI, вып. 2, С. 381 ГОСТ 6077-80 В мешки тканевые или лыю-джуто-кенафные не более 40 кг нетто

Маркировка ГФ XI, вып. 12, С. 384 ГОСТ 14192-96 В соответствии с ГОСТ 14192-96

Транспортировка ГФ XI, вып. 2, С. 385 ГОСТ 14192-77 и ГОСТ 17768-80

Срок годности 2 года

Интродукционные и биологические исследования л. белой на Северном Кавказе

Анализ данных фенологического спектра за 2010-2012 гг. (таблица 9) показал, что, несмотря на относительную отдаленность опытных участков интродукции друг от друга, основные этапы вегетации практически не отличаются по срокам.

Фенофазы

Опытные участки Начало вегетации Бутонизация Начало цветения Массовое цветение Конец цветения Вторичное цветение Созревание семян Конец вегетации

25.03.10 15. 04.10 20.04.10 10.05.10 11.06.12 У1-Х.20Ю 14.06.10 15.11.10

о о. 31.03.11 17.04.11 23.04.11 14.-05.11 13.06.11 У1-Х.2011 17.06.11 10.11.11

н 04.04.12 10. 04.12 22.04.12 27.04.12 10.06.12 - 10.06.12 -

С

> и ио 29.03.11 16.04.12 11.04.11 08.04.12 20.04.11 12.04.12 01.05.11 17.04.12 17.05.11 02.05.12 06-10.2011 22.05.11 15.05.12 10.10.10 13.10.11

д. 5.04.11 16.04.11 26.04.11 06.05.11 24.05.11 06-10.2011 12.06.11 30.10.10

Зольски район КБР 10.04.12 15.04.12 20.04.12 24.04.12 10.05.12 - 22.05.12 03.10.11

Вегетации интродуцированного вида за три года наблюдений несколько отличаются. В первый год жизни у опытных растений цветение отсутствовало. Наиболее ранние сроки начала вегетации наблюдались в 2010 г., а поздние - в 2012 г. При этом дальнейшие фенофазы в эти же годы происходили в более сжатые сроки, что можно объяснить разницей в наступлении положительных среднесуточных весенних температур. В 2010 году весна началась относительно рано по сравнению с последующими годами наблюдений, однако в 2012 году, несмотря на более поздние сроки начала весны (начало апреля), остальные этапы вегетации л. белой происходили в достаточно короткие сроки. Дальнейшее быстрое потепление в апреле привело к более раннему началу цветения. В 2011 году этапы вегетации несколько затянуты, что связано с поздним сходом снежного покрова, при этом весенний и летний периоды были более прохладными и дождливыми по сравнению с другими годами. Наиболее наглядно это прослеживается на рисунке 4, где представлена диаграмма продолжительности периода цветения за 2011-2012 года.

Рисунок 4 - График динамики цветения лапчатки белой за 2011-2012 гг.

Приживаемость черенков при весенних наблюдениях 2010 года составила 98%, что указывает на их устойчивость к отрицательным значениям температур. Формирование надземной массы растений происходило из спящих почек с началом вегетативного периода. В течение первого года жизни происходило активное нарастание как надземной, так и подземной частей растений. К концу первого года сформировались полноценные розетки листьев. Анализ увеличения общей биомассы показал, что после года жизни прирост корневищ с корнями составляет от 150 до 230%. При средней массе черенков 1,5-2,1 г, осенью средняя масса всего растения вместе с надземной частью составила около 4,7 -5,3 г.

На второй год жизни происходило дальнейшее нарастание корневища с корнями и увеличение надземной вегетативной части. Размеры корневища увеличились от 4-5 см до 7-8 см, что составляет 90-100% от исходного размера. Средняя масса растений к концу вегетативного периода второго года составила 7,3 -7,9 г.

На третий год жизни большая часть экземпляров (около 90%) вступила в стадию цветения. Размеры корневища увеличились до 10 см, а увеличение биомассы составило около 30%. На рисунке 5 представлен график прироста биомассы в течение вегетационного периода. Наиболее активный рост л. белой отмечается в начале вегетации и в период активного цветения, после чего прирост растений постепенно снижается и к концу вегетации полностью прекращается.

Рисунок 5 - Прирост биомассы корневищ с корнями лапчатки белой за вегетационный

сезон

Использование биогумусных удобрений при выращивании л. белой дало положительные результаты. Взвешивание опытных образцов на третьем году жизни растения показало, что на участках, где использовались биогумусные удобрения, средняя масса корневище корнями на23% выше (таблица 10).

Таблица 10 - Сравнительные данные массы корневищ с корнями лапчатки

белой при использовании биогумусных удобрений

Участок Масса корневищ с корнями без подкормки, г Масса корневищ с использованием биогумуса, г

Пятигорск 996,7±10,4 1206,1±15,3

КБГУ 875,4±9,7 1076,7±11,4

Зольский район КБР 967,1 ± 10,1 1184,7± 15,9

Наиболее активный прирост подземной части отмечается в первые три года. За это время биомасса растений увеличилась в 10 раз по сравнению с исходной массой черенков. К концу третьего года жизни корневища с корнями полностью сформированы и пригодны для фармацевтического применения.

Определение острой токсичности водно-спиртового извлечения из корневищ с корнями лапчатки белой Для изучения «острой» токсичности аутбредным мышам обоего пола весом 22,0-24,0 г однократно вводили извлечение л. белой. Клиническое наблюдение за каждым животным проводилось в течение первого часа после введения, ежедневно в последующем. Через 14 дней после введения выжившие животные подверглись эвтаназии путем декапитации под

_____

эфирным наркозом. Расчет ЬО50 производили с использованием пробит-анализа по методу Прозоровского.

Гибель животных наблюдалась в первые, очень редко на вторые сутки после введения веществ. Выжившие животные двое суток отказывались от еды и сутки от воды, после чего потребление пищи и воды восстанавливалось. Животные всех групп после введения переставали двигаться и в течение 30-60 минут занимали боковое положение. Наблюдалось тахипноэ. Животные, получавшие 6000 и 6250 мг/кг, в таком положении находились в течение 12-13 часов. После этого выжившие животные совершали попытки вставать и перемещаться по клетке. У животных, получавших 6500 - 6750 мг/кг, боковое положение сохранялось от 12 до 18 часов, после чего двигательная активность медленно восстанавливалась. На дозе 7000 мг/кг смерть наступала в течение суток

(таблицы 11, 12).

Таблица 11 - Определение «острой» токсичности водно-спиртового извлечения из корневищ с корнями лапчатки белой у мышей самцов

Самцы Исследуемые дозы, мкг/кг

Доза 6000 6250 6500 6750 7000

Выжило 5 4 2 1 0

Погибло 0 1 3 4 5

ЛД50 с доверительным интервалом 6477,09±110,07

Нижняя граница ЛД50 6241,02

Верхняя граница ЛД50 6713,17

ЛД,о 6090,73

ЛДк, 6175,66

ЛД84 6778,53

ЛДшо 9929,25

Уровень значимости 0,05

Таблица 12 - Определение «острой» токсичности водно-спиртового извлечения из корневищ с корнями лапчатки белой у мышей самок

Самкн Исследуемые дозы, мкг/кг

Доза 6000 6250 6500 6750 7000

Выжило 5 4 3 1 0

Погибло 0 1 2 4 5

ЛД50 с доверительным интервалом 6522,91±110,07

Нижняя граница ЛД50 6286,83

Верхняя граница ЛД50 6758,98

ЛД,о 6136,54

ЛД,6 6221,47

ЛД84 6824,34

ДДкю 6909,27

Уровень значимости 0,056975,06

У животных, погибших в опытах острой токсичности, не наблюдалось выраженных изменений внутренних органов грудной и брюшной полостей. В верхней части грудной полости над сердцем располагался крупный тимус. Левый желудочек сердца был обескровлен, что свидетельствует об остановке сердца в систоле. Кровенаполнение органов грудной и брюшной полостей без особенностей. При вскрытии черепной коробки отмечали резко выраженный отек мозга, ткань мозга имела водянистую, студнеобразную консистенцию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1.Проведены интродукционные исследования лапчатки белой на базе Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН (Ставропольский край), Ботанического сада Кабардино-Балкарского государственного университета в г. Нальчик и Зольском районе Кабардино-Балкарии. Установлено, что лапчатка белая легко поддается интродукции в условиях Северного Кавказа, обладает высокой урожайностью подземной части. Для увеличения темпов роста подземной части лапчатки белой нами рекомендовано использование биогумусных удобрений.

2.Проведено морфолого-анатомическое исследование и установлены

диагностические признаки корневищ с корнями и травы лапчатки белой.

Листовая пластинка дорзовентрального типа. Характерна кристаллоносная

обкладка жилок, образованная друзами оксапата кальция. Густое опушение

образовано простыми одноклеточными волосками с утолщенной стенкой.

Устьичный аппарат аномоцитного типа. Черешок листа имеет треугольно -

седловидную форму на поперечном сечении. Клетки колленхиматозной

паренхимы пропитаны содержимым желтого цвета. Проводящая система

пучкового типа, образована тремя коллатеральными проводящими пучками.

Корневище цилиндрической формы. Характерна обкладка сердцевинных

19

лучей, образованная сферокристаллами и друзами. Корень вторичного строения, характеризуется хорошо развитой паренхимой радиальных лучей. Ксилема образована сосудистыми элементами, вокруг которых сосредоточены клетки с содержимым желтого цвета.

3.В корневищах с корнями интродуцированного вида методом ВЭЖХ установлен качественный состав фенольных соединений, углеводов и органических кислот. В составе фенольных соединений идентифицированы флавоноиды (лютеолин - 7- гликозид, гесперидин, кверцетин), дубильные вещества (танин, эллаговая кислота, эпикатехин, ЭГКгаплат), органические кислоты (галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая, коричная). Мажорными фенольными соединениями явились коричная кислота (15,2% от суммы фенольных соединений), ЭКГгаллат (12,7% от суммы фенольных соединений) и феруловая кислота (8,8% от суммы фенольных соединений). При этом кофейная, феруловая кислоты, гесперидин и лютеолин-7-гликозид в сырье лапчатки белой были идентифицированы впервые. В составе углеводов идентифицированы арабиноза (14,9% от полисахаридного комплекса) и сахароза (2,1% от полисахаридного комплекса); в составе органических кислот - щавелевая (76,0% от суммы органических кислот) и маликовая (яблочная) (1,2% от суммы органических кислот) кислоты. Изучен элементный состав подземных органов лапчатки белой. Установлено, что мажорным макроэлементом является фосфор, в числе микроэлементов преобладает марганец. Содержание токсичных элементов не превышает ПДК, установленных СанГТИН.

4.Установлено, что по классификации токсичности веществ (К.К. Сидоров, 1973) водно-спиртовое извлечение из корневищ с корнями лапчатки белой относится к 5 классу токсичности, т.е. практически нетоксичным веществам. Токсичность для самцов и самок не имеет значимых отличий.

5.Разработан проект ФС «Лапчатки корневища с корнями» и «Инструкция по сбору и сушке корневищ с корнями лапчатки белой».

Таким образом, проведенные исследования показали идентичность состава БАВ дикорастущей (по литературным данным) и изученной нами интродуцированной на территории Северного Кавказа л. белой, что позволяет сохранить л. белую в естественных условиях обитания и рекомендовать корневища с корнями в качестве лекарственного растительного сырья для получения тиреотропных лекарственных средств. Более глубокое изучение состава БАС корневищ с корнями лапчатки белой, а также биологической активности извлечений из них является перспективным направлением исследований в дальнейшем.

Список опубликованных по теме диссертации работ

1.Мелик-Гусейнов, В.В. Идентификация фенольных соединений в подземных органах лапчатки белой, интродуцированной на Северном Кавказе / В.В. Мелик-Гусейнов, Ф.К. Тхамокова// Вестник МГОУ. - 2012. - № 1. -С. 49-52.

2.Мелик-Гусейнов, В.В. Оценка элементного состава некоторых полезных растений Северного Кавказа / В.В. Мелик-Гусейнов, Ф.К. Тхамокова, C.B. Герасименко // Медицинский вестник Башкортостана. - 2012. - Том 7, № 5. - С.90-91.

3.Мелик-Гусейнов, В.В. Перспективы выращивания лапчатки белой (Potentilla alba L.) на Северном Кавказе / В.В. Мелик-Гусейнов, Ф.К. Тхамокова, Д.С. Шильников // Вестник МГОУ. - 2013. - № 2. - С. 49-52.

4.Фитохимическая оценка некоторых дикорастущих видов флоры Ингушетии и Кабардино-Балкарии / Ф.К. Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов // Материалы XI международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа», посвященной 70-летию Точиева Тугана Юнусовича, Магас, 16-18 октября 2009 г. - Назрань, 2009. - С. 165-169.

5.Тхамокова, Ф.К. Фитохимические исследования лапчатки белой, интродуцированной на Северном Кавказе / Ф.К. Тхамокова // Фундаментальные науки и практика: сб. науч. тр. с материалами 1-ой

международной телеконференции «Фундаментальные медико-биологические науки и практическое здравоохранение». - Томск,-2010. - Т. 1. - С. 124.

6.Тхамокова, Ф.К. К вопросу интродукции лапчатки белой на Северном Кавказе / Ф.К. Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов, Д.С. Шильников / 71 Всеукраин. науч.-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием, посвященная Дню науки «С учасш аспекта медицини i фармации -2011» // Тез. докл 12-13 мая 2011. - ЗапорЬкжя, 2011. -С.171.

7.Тхамокова, Ф.К. Идентификация органических кислот в подземных органах лапчатки белой, культивируемой на Северном Кавказе / Ф.К. Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов // Актуальные научные вопросы: реальность и перспективы: сб. науч. тр. по материалам Международной заочной научно-практической конф. 26 декабря 2011 г. - Тамбов, 2012. - Ч. 5. - С. 143-144.

8.Тхамокова, Ф.К. Морфолого-анатомическое исследование подземных органов лапчатки белой, интродуцированной на Северном Кавказе / Ф.К. Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов, Ф.К. Серебряная // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2012. - Вып. 67.-С. 126-128.

9.Тхамокова, Ф.К. Морфолого-анатомическое исследование травы лапчатки белой Potentilla alba L., интродуцированной на Северном Кавказе / Ф.К. Тхамокова, В.В. Мелик-Гусейнов // Материалы 14 междунар. научн. конф. «Биологическое разнообразие Кавказа и Юга России», посвящ. 70-летию со дня рождения Г.Б. Абдурахманова. - Махачкала, 2012. - С. 353-354. Ю.Тхамокова, Ф.К. Макро- и микроэлементный состав подземных органов лапчатки белой, интродуцированной на Северном Кавказе / Ф.К. Тхамокова,

B.В. Мелик-Гусейнов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013. - Вып. 68. -

C. 110-111.

ШЕРИЕВА ФАТИМА КУШБИЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ - POTENTILLA ALBA L., ИНТРОДУЦИРОВАННОЙ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «Л О» 2015 г., формат 60x84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № // /

ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ-ФИЛИАЛ ГОСУДАРСТВЕННОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНЗДРАВА РОССИИ (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)