Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование очистки, разделения и анализа растительных дубильных веществ методами хроматографии на адсорбентах аффинного типа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

АНТИПЕНКО

ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

УДК 547.98.543:541.183.1 - 543.544.

ИССЛЕДОВАНИЕ ОЧИСТКИ, РАЗДЕЛЕНИЯ И АНАЛИЗА РАСТИТЕЛЬНЫХ ДУБИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ МЕТОДАМИ ХРОМАТОГРАФИИ НА АДСОРБЕНТАХ АФФИННОГО ТИПА

15.00.02.- фармацевтическая хим"~ - ---------------

АВТОРЕФЕР^ Диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

РГб од

- 8 ОКТ 1996

На правах рукописи

Санкт-Петербург 1996 г.

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии Кемеровской государственной медицинской академии.

Научный руководитель -доктор фармацевтических наук, профессор КУЗНЕЦОВ П.В.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, с. н. с. ЗЕНКЕВИЧ И.Г. кандидат фармацевтических наук, м. н. с. ЧЕМЕСОВА И.И.

Ведущая организация: Пермская государственная фармацевтическая'академия,

Защита диссертации состоится 29 октября 1996 года на заседании диссертационного совета Д 084.63.01 при Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, СПХФА, ул. проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии.

Автореферат разослан сентября 1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук и РУСАК А.В.

. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Широкие перспективы использования дубильных веществ, обладающих более чем 20 видами фармакологической активности, требуют создания простых и эффективных способов их разделения и очистки из растительных экстрактов, а также применения доступных методов стандартизации. Следует особо отметить, что стандартизация танидоносного растительного сырья, содержащего сложную смесь полифенолов близких по структуре и свойствам, является важной задачей фотохимического и фармацевтического анализа. Основная трудность заключается в отсутствии пригодных для этого стандартных образцов.

Успехи, достигнутые в области химии полимеров специального назначения, и становление метода неклассической аффинной хроматографии позволяют получать синтетические адсорбенты, обладающие специфическими хроматографическими свойствами. Химическая модификация полимерных носителей на эснове стратегии синтеза адсорбентов аффинного типа с учетом эптимального влияния структурных фрагментов системы «матрица - вставка - лиганд» на разделение и очистку дубильных веществ шеет важное теоретическое и практическое значение. Исследования в этом направлении позволят существенно расширить возможности современных методов фармацевтического и фитохи-•.шческого анализа.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заклю-тлась в синтезе адсорбентов аффинного типа для жидкостной солоночной хроматографии дубильных веществ, в получении зысокоочшценных стандартных образцов дубильных веществ из шзличных видов лекарственного растительного сырья и фитопре-¡аратов, а также изучении возможности их применения в области фармацевтического, фотохимического анализа и стандартизации.

Исходя из этого нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность использования некоторых немоди-фицированных полимерных носителей для жидкостной колоночной хроматографии низкого давления фенольных и полифеноль-ных соединений.

2. Синтезировать на основе выбранных матриц адсорбенты с фенольными, полифенольными и азотсодержащими лигандами.

3. Изучить влияние различных вариантов метода химической модификации полимерных носителей и структурных параметров системы «матрица - вставка - лиганд» на хроматографическое поведение дубильных веществ и их низкомолекулярных фенольных примесей.

4. Разработать способы получения высокоочищенных образцов дубильных веществ из некоторых видов растительного сырья и фитопрепаратов.

5. Изучить возможность применения полученных образцоЕ для стандартизации растительного сырья и препаратов на егс основе.

6. Разработать простые и альтернативные существующим методы анализа ряда фитопрепаратов, содержащих комплекс фенольных и полифенольных соединений,

Научная новизна работы. Впервые для разделения и очистки дубильных веществ методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления использованы химически модифицированные поливиниловые адсорбенты аффинного типа Впервые разработаны оригинальные способы получения азоад-сорбентов «аминофенилыюго» («бензгидразонного») и «ревер-сного» типов.

Синтезированно более 25 азоадсорбентов, некоторые из ни? впервые, с различными струкгурными фрагментами системь

«матрица - вставка - лиганд».

Из числа синтезированных адсорбентов определены более эффективные и селективные для аналитической и препаративной хроматографии фенольных и полифенольных соединений. Установлено влияние типа используемых вставок на хроматографичес-кое поведение фенольных соединений. Показана возможность одностадийного группового разделения различных по структуре фенольных соединений: простые фенолы, фенолкарбоповьте и оксикоричные кислоты, их гликозиды, олиго- и полимерные дубильные вещества гидролизуемого и конденсированного типов.

Разработаны способы получения высокоочищенных образцов дубильных веществ различного типа с использованием хрома -тографической очистки на адсорбентах аффинного типа. Изучены некоторые физико-химические характеристики полученных образцов,- Исследована возможность применения их для стандартизации танидопосного лекарственного сырья.

Предложены хромато-спектрофотометрические методы анализа биологически активных веществ экстракта родиолы розовой и настойки пиона. Разработаны методы стандартизации данных препаратов по содержанию дубильных веществ с использованием специально полученных образцов-стандартов.

Практическая значимость работы. Синтезированные полимерные азоадсорбенты с фенольными, полифенольными и азотсодержащими лигандами и способы разделения фенольных соединений и дубильных веществ могут быть рекомендованы для использования в области фармацевтического и фитохимического анализа, 'а также хемотаксономических исследований. Полученные высокоочищенные суммарные образцы дубильных веществ некоторых видов лекарственного сырья могут использоваться для его стандартизации и контроля качества методами комплек-

сонометрического и фотоколориметрического анализа.

Результаты проведенных исследований внедрены в лаборатории физиологии и биохимии древесных растений Института леса СО РАН г.Красноярска (акт внедрения от 16.02.95), на кафедре фармакогонозии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института (акт внедрения от 25.05.95) и кафедре фармацевтической химии Сибирского медицинского университета (акт внедрения от 28.09.95), а также в учебный процесс кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии Кемеровской государственной медицинской академии (акт внедрения от 14.02.96 ).

Основные положения выносимые на защиту

1. Скрининг немодифицированных полимерных носителей для аналитической и препаративной хроматографии низкого давления фенольных и полифенольных соединений.

2. Синтез и хроматографический скрининг полимерных поливиниловых адсорбентов аффинного типа , синтезированных по «аминофенильному» и «реверсному» пути с лигандами феноль-ного и полифенольного типов, а также азотсодержащими лигандами.

3. Результаты исследований по определению влияния структурных параметров системы «матрица - вставка - лиганд» на эффективность и селективность разделения фенольных соединений и дубильных веществ.

4. Методики выделения, препаративного фракционирования и анализа дубильных веществ некоторых видов лекарственного растительного сырья. Результаты стандартизации растительного сырья с использованием аутентичных высокоочшценных суммарных образцов дубильных веществ.

5. Методики разделения, анализа и стандартизации биологи-

тсски активных веществ фенольного характера, содержащихся в экстракте родиолы и настойке пиона.

Апробация работы. Основные материалы исследования юложены на Всесоюзной и областных научных конференциях : »Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва,1991), «Решение актуальных задач фарма-дии на современном этапе» (Москва, 1994), «Актуальные проблемы фармации» (Барнаул, 1995), «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1995) и научной сессии сотрудников НМИ (Новосибирск, 1995).

Публикации. Основные материалы исследований опублико-заны в 8 работах.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит кз введения, литературного обзора, обсуждения резуль-атов работы, экспериментальной части и выводов. Работа изложена на 177 страницах машинописного текста, содержит 16 аблиц, 38 рисунков. Список литературы включает 178 источнике, из них 100 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ . Выбор полимерной матрицы для синтеза адсорбентов аффинного типа

В качестве полимерных носителей для последующей хими-:еской модификации нами исследованы традиционные для сидкостпой колоночной хроматографии дубильных веществ (ДВ) [олиамидные (полиамид), полисахаридные (сефароза, сефадекс) [ поливиниловые («Toyopearl») адсорбенты, а также полиметакри-атная матрица - сферон.

При выборе матрицы для препаративной хроматографии [В принимались во внимание следующие факторы - собственная ффективность колонки с немодифицированной полимерной

матрицей, а также ее разделительная эффективность в условиях хроматографии танина, являющегося сложной смесью полифенолов. Из адсорбентов, включенных нами в скрининг, только сефадекс, тойопал (ТП) и сфсрон характеризуются удовлетворительными гидродинамическими параметрами и могут эффективно использоваться в препаративном режиме разделения.

Определение разделительной эффективности колонок показало низкую разрешающую способность сефадекса 1Л120. Удовлетворительные результаты разрешения пиков были получены только на ТП и сфероне.

С целью более детальной характеристики выбранных полимерных носителей проведена оценка адсорбционного взаимодействия относительно коэффициента емкости вещества-стандарта -катехина (К ,кх). Исходя из полученных значений К 'кх изученные адсорбенты были классифицированы по масштабу разделения (табл.1) .•

Таблица 1

Значения К ' кх и емкостная характеристика немодифицированных адсорбентов поливинилового типа

Полимерный адсорбент К 'кх Емкость по танину, мг/мл Масштаб разделения

Toyopearl HW-40 179,0 28,8 МкП, А

Toyopearl HW-50 119,0 30,0 МкП, А

Toyopearl HW-55 106,5 31,5 П

Toyopearl HW-60 106,5 32,0 П

Примечание: *) - результат получен на колонке с 1 мл упакованного объема адсорбента (150 х 5 мм), ПФ - вода, А-аналитичес-кий, МкП - микропрепаративный, П - препаративный.

Сильный адсорбционный эффект и трудности, возникающие с регенерацией сфероновых носителей, не позволяют рекомендовать их для хроматографии полифснольных соединений.

Определение селективности ТП в отношении низкомолеку-тярных фенольных соединений проводилось нами в условиях разделения модельной смеси (МС): пирогаллол (ГТГ) - галловая <ислота (ГК) - кофейная кислота (КК) при элюции водой. Низкая разрешающая способность ТП в отношении компонентов указанной смеси (К 5 пг гк = 0 ,0 и Я 5 кк = 0,7) не позволяет использовать его для хроматографии низкомолекулярных фенольных соединений.

Таким образом, показано, что поливиниловые адсорбенты ГП обладают достаточной селективностью и эффективностью при разделении полифенольных соединений в режиме ЖКХ низкого давления и не селективны в отношении низкомолекулярных фенольных соединений (простые фенолы, фенолокислоты, коричные кислоты и т.д.) Существенным ограничением для хроматографии ДВ на ТП является неспецифическая сорбция их зысокомолекулярных фракций на поверхности носителя, приво-щщая к эффекту «забивки» колонки и негативно влияющая на зоспроизводимость результатов разделения.

Изученные ТП адсорбенты выбраны нами для последующей симической модификации, с целью повышения селективности -I эффективности разделения фенольных и полифенольных сочинений.

2. Синтез адсорбентов аффинного типа На первом этапе химической модификации полимерных :ойопаловых носителей нами были получены их эпоксипроиз-юдные по модифицированному методу Аксена (см.схему 2.1) . концентрация свободных эпоксигрупп на поверхности адсор-

о

С1-СН2-СН-СН2 1

-ОН -»-1-0-СН2-СН-СН2

рН>7,Ь=60°С 1

ДШ), рН 9

з-г-кн-ын-

но2

б) Ш2-Н=СТ-N02

ДМСО, рН 8

I -О-2-НН-Н=СН-

он.

I в)ЫН2-МН-

насыщ. бура, рН 9,2

ОН

-г-ш-нн-с-^-^

2 - СН2.-СН-СН2-

Он

I

Схема 2.1.

бента составила 15-30 мкМ/мл упакованного объема геля.

Затем проводили иммобилизацию вставки по известным реакциям между оксирановыми производными и гидразидами карбоновых кислот - н-нитробензойной (Т,а) и салициловой (1,в) (см. схему 2.1 ). Для получения нитропроизводных был разработан метод иммобилизации гидразона п-нитро-а-хлор-коричного альдегида (1,6), не описанный ранее в литературе (см.схему 2.1). Далее нитропроизводные восстанавливали дитионитом натрия до аминопроизводных (II,а и б) (Туркова,1980).

Иммобилизация фенольных, полифенольных и азотсодержащих лигандов проводилась по реакции азосочетания, после предварительного диазотирования аминоадсорбентов (III,а и б) (см.схему 2.2). В качестве лигандов для азоадсорбентов «бензгидразидного» и «бензгидразонного» TimoB использовали следующие группы соединений: 1) низкомолекулярные простые фенолы - резорцин, гексилрезорцин, ß - нафтол и ванилин; 2) флавоноиды - катехин, морин, кверцетин, рутин и троксевазин и 3) азотсодержащие соединения - 8-оксихинолин, тетрациклин, тиамин и теофиллидин.

Для синтеза азоадсорбентов «реверсного» типа (IV) также использовали реакцию азосочетания (см.схему 2.3). Для иммобилизации соединений, содержащих ароматическую аминогруппу, были выбраны новокаин, новокаинамид и производные амида сульфаниловой кислоты - стрептоцид, сульфодиметоксин, этазол и норсульфазол. Данные азоадсорбенты синтезированы впервые.

Качественный и количественный анализ на стадиях синтеза адсорбентов проводили методами, используемыми в аффинной хроматографии (Туркова, 1980; Дин и др., 1988). Концентрация связанного лиганда, определенная спектрофотометрически, не превышала 8-10 мкМ/мл.

/т—5% раствор ИаМ, Щ уу—сч

>КНл ----->-Гг

0.4 М НС1, КВг, 1 t = 4-10° С

II

С1-

ОН

| рН 9-11

ОН

III

2- - 0-СН2-СН-СН,-Ш-НН-С- ; -0-СН2-СН-СН,-ЫН-Н=СН-С=СН-

| и I Т

а) ОН 0 б) ОН С1

Схема 2.2.

ОН

-О-СНр-СН-СН2-нн-нн-с I II

ОН О

ОН

-снг-сн-сн2-?ш-ш-с-

1. 0.5 М ИаОН

2.

он

к

С1"

0 - Б

Схема 2.3.

IV

3. Влияние структурных параметров адсорбентов аффинного типа на хроматографическое поведение фенольных и полифенольных соединений Влияние структуры вставок и лигандов на селективность и эффективность разделения низкомолекулярных фенольных соединений определялось на основе изменения К' и К компонентов МС: ПГ-ГК-КК. Установлено, что разделение компонентов смеси происходит уже на адсорбентах, модифицированных на

уротше вставок. Причем увеличение И,, на аминоадсорбентах как «бензгидразидного» (Я 3 пг.гк= 2,10 и Я 8ГК.КК= 3,47), так и «беизгидразониого» (II 5 пг_гк = 3,10 и К 3 ГК К1С = 3,80) типов происходит только после активации их растворами кислот (серная, соляная, уксусная). Положительное влияние на селективность разделения МС на адсорбентах с вставкой - гидразидом салициловой кислоты - (Я 5 пг гк = 0,95 и II х кк = 1,16) связано, вероятно, с образованием водородных связей между фенольным гидроксилом вставки и фенольными и карбоксильными группами анализируемых соединений:

Проведенные исследования по разделению трехкомпонент-ной смеси на адсорбентах аффинного типа показали две наиболее

типичные картины разделения (см.рис.1).

1 но

"О Пирогаллол

соон

сн=сн-соон

Кофейная кислота

О&ьем элюента, мл

Рис. 1. Хроматография модельной смеси на ААфТ «аминофе-нильного» и «реверсного» типов (матрица - ТП-50). ПФ - вода.

Тип лиганда:

А) кверцетин, катехин, резорцин, р-нафтол, 8-оксихинолин, рутин, троксевазин, тетрациклин, ванилин.

Б) тиамин, теофиллидин, стрептоцид, этазол, норсульфазол, сульфодиметоксин.

Показано отсутствие групповой специфичности у ААфТ «аминофенильного» типа с фенольными лигандами. Эффективными оказались как низкомолекулярные фенолы, так и лиганды флавоноидного типа. Значения К' и Я 8 компонентов МС на некоторых ААфТ приведены в таблице 2.

Таблица 2

Хроматографические параметры разделения компонентов

модельной смеси на ААфТ с фенольными лигандами

Адсорбент Емкостные факторы Разрешение пиков

Структура лиганда К П [' К ГК к кк ^s пг-гк Ks гк-кк

<^ 6.5 13,0 26.0 1.25 1.53

6.5 14,0 29.0 1,40 1.73

О - pNTW HOiA ОН О R- СНг-СИ-ОЧ 6.5 12,5 28.5 1,48 1.70

„ • Л /—СОР- Он Ji, С,- Ow,-Wfr-OH 8,0 17.5 37,5 1.61 1.64

ОН * 6,2 13,5 30.0 1,60 1,83

Примечание: ААфТ синтезированы на основе ТП-~50, вставка - III, а ; *) вставка - III, б.

Из этих данных следует, что значения К' анализируемых соединений на ААфТ с фенольными лигандами различались незначительно. Основные отличия ААфТ наблюдаются в значениях К 8 пиков компонентов модельной смеси и, соответственно, в эффективности разделения. Наибольшее разрешение пиков наблюдалось на ААфТ группы III, а с 8-оксихинолиновым и Р-

нафтольным лигандами, а наименьшее - на ААфТ с иммобилизованными в качестве лигандов резорцином, ванилином и тетрациклином.

Показано увеличение удерживания ГК и КК на ААфТ III,б с троксевазиновым лигандом на 30 и 23% соответственно, по сравнению с подобным ААфТ III,а .

ААфТ III,а и IV с лигандами содержащими в структуре вторичную, третичную и четвертичную аминогруппы: теофилли-цин (Я. ЗПГ.1К =1,10 и Я § гк-кк = 2>34)> новокаин ( И $ иг гк = 3,52 (I Я 5ГК КК = 1,67), новокаинамид (Я 3 ИГ [Х = 3,30и И 8 ге кк = 1,52) и тиамин (И 8ПГ,ГК = 1,79 и К & гккх = 1,66), селективно разделяли компоненты МС только после изменения ионной формы основных центров.

Изучение изменения хроматографической подвижности компонентов МС в зависимости от состава подвижной фазы выявил следующие закономерности. Увеличение на 30 % значений емкостного фактора ГК и КК при добавлении в элюент соляной кислоты и их снижение в спиртовых элюатах позволило установить, что в механизме взаимодействия £енолькых соединений с ААфТ, модифицированными фе-нгольными лигандами, главную роль играют гидрофобные взаимодействия и водородные связи.

Исследование влияния структурных особенностей синтезированных ААфТ на хроматографическую подвижность полифенольных соединений осуществлялось на примере разделения фармакопейного препарата - танина. Сравнение элюционных хроматографических профилей немодифициро-занных матриц (ТП-40-55) и ААфТ, синтезированных на их эснове, не обнаружило существенных различий в разделении ганина (см.рис.2).

о_20 30_40_% этанола

О&ъем элюента, лет

Рис. 2. Хроматография танииа на колонке (15 х 95 мм) с ААфТ групп III и IV. Нагрузка - 30 мг.

Результаты проведенного скрининга ААфТ III,а и IV с лигандами как фенольного, так и азотсодержащего типа позволили расположить их в следующий ряд в порядке уменьшения разделительной способности в отношении танина (указан тиг: иммобилизованного лиганда): троксевазин = кверцетин = тиамш > новокаинамид > 8-оксихинолин > ß-нафтол > катехин > резорцин > стрептоцид > теофиллидин > ванилин > тетрациклин Таким образом , установлено, что хроматографическое поведение полифенольных компонентов танина , зависит не только о-структуры вставки и типа иммобилизованных лига!шов, но и о: свойств исходной матрицы.

3.1. Выбор адсорбентов аффинного тина для препаративной очистки дубильных экстрактов Выбор ААфТ для препаративной хроматографии полифе нольных соединений основывался на комплексной оценке изме нения параметров удерживания модельного соединения катехина и адсорбционной емкости (мг/мл) в отношении танина Эти показатели в препаративной хроматографии находятся :

обратно пропорциональной зависимости (Бидлингмейер,1990).

Сравнительный анализ изменения К ' кх в ряду ААфТ (III,а) с флавоноидными лигандами показал, что уменьшение удерживания происходит с увеличением полярности лиганда : кверцетин (К' кх = 66,5; адсорбционная емкость - 26,0 мг/мл) > рутин (61,5;32,0 мг/мл) > катехин (56,5;44,4 мг/мл) > троксевазин (49,0; 46,0 мг/мл). В данном ряду лигандов прослеживается четкая взаимосвязь изменения удерживания КХ с числом свободных фенольных групп лиганда, способных образовывать водородные связи.

Структурные особенности теофиллидина (III,а) (79,0; 27,0 мг/мл) и новокаинамида (IV) (74,0; 29,0 мг/мл), содержащих вторичные амидные группы, также влияют на параметры удерживания КХ и адсорбционный потенциал. Образование более прочных водородных связей, по сравнению с фенольными и сложно-эфирными группами других лигандов (новокаин - 54,0; 40,0 мг/ мл), приводит к сильному удерживанию КХ и снижению адсорбционного потенциала в отношении танина. Оба параметра для этих ААфТ находятся на уровне немодифицированпой матрицы (74,0; 30,0 мг/мл), что не позволяет использовать их для препаративной хроматографии ДВ .

Положительное влияние химической модификации на хро-матографические свойства ААфТ в отношении полифенольных соединений отражается также на снижении эффекта необратимой сорбции конечного продукта очистки. Увеличение полноты элюции является одним из важных критериев позволяющих более эффективно использовать данные адсорбенты.

Таким образом, на основании проведенного скрининга для препаративного фракционирования ДВ выбраны ААфТ (III,а) с гроксевазиновым (46,0 мг/мл), катехиновым (44,4 мг/мл) и 8-

оксихинолиновым (38,5 мг/мл) лигандами имеющие высокий адсорбционный потенциал в отношении полимерных полифе-нольных соединений.

4. Получение стандартных образцов дубильных веществ, исследование их физико-химических свойств и использование для стандартизации лекарственного растительного сырья В исследования по выделению и очистке суммарных образцов ДВ, а также возможности их использования в целях стандартизации, нами включены традиционно используемые в медицине танидоносные виды лекарственного растительного сырья. Это, в частности, кора дуба (Quercus robur L.), корневища и корни кровохлебки! (Sanquisorba officinalis L.), корневища лапчатки (Potentilla erecta L.), змеевика (Polygonum bistor-ta L.) и бадана (Bergenia crassifolia L.) а так же фармакопейный препарат -«Танин».

Суммарные дубильные экстракты получали экстракцией растительного сырья 50-70% растворами ацетона. Вторичную экстракцию суммы ДВ из водно-ацетоновых вытяжек проводили смесью н-бутанола и этилацетата (1:1) после полного удаления ацетона. ТСХ выделенных бутанолэтилацетатных экстрактов в системе растворителей: толуол - этилацетат - муравьиная кислота (5:4:1), показала наличие в них как высокомолекулярных полифенолов (Rf < 0,3), так и низкомолекулярных соединений феноль-ного характера (Rf > 0,3).

Предложенный нами способ выделения суммарных высоко-очищенных образцов ДВ из различных видов лекарственного растительного сырья основан на их хроматографической очистке в режиме ЖКХ низкого давления на ААфТ с фенольными лигандами, Данный способ отличается простотой исполнения, позволяет получать миллиграммовые количества ДВ в одну ста-

дию, не требует использования сложного лабораторного оборудования и значительных затрат времени.

Препаративное фракционирование суммы ДВ от низкомо-пекулярных примесей фенольного характера проводили, используя в качестве подвижной фазы 10% этанол. Целевую фракцию, содержащую сумму ДВ различной степени полимеризации, элю-ировали с колонки 50% раствором ацетона. Суммарные экстракта ДВ, содержащихся в растительном сырье, получали после удаления ацетона многократной экстракцией водной вытяжки смесыо н-бутанола и этилацетета (1:1).

Анализ хроматографически очищенных образцов ДВ методами TGX и ВЭЖХ подтвердил достоверность их очистки от низкомолекулярных примесей фенольного характера. На ТСХ полученных образцов наблюдалось одно пятно полимерных ДВ ча уровне старта и несколько пятен с Rf < 0,3, характерных для элигомерных ДВ, процианидинов и мономерных производных флаванола-3. Сравнительный анализ элюционных профилей фоматограмм исходных и хроматографически очищенных ду-Зильных экстрактов, полученных на колонке «Силасорб С 18 » в /словиях ВЭЖХ, также подтвердил факт очистки.

В полученных образцах обнаружены гидролизуемые й конденсированные (проантоцианидины) ДВ различной степени полимеризации. В ИК-спектрах выделенных субстанций присутствуют частоты, характерные для ДВ (Блажей, Шутый,1977).

Хотя полученные нами хроматографически очищенные эбразцы ДВ ие вполне соответствуют требованиям, предъявляемым стандартным образцам лекарственных средств, так как их химический состав не отличается постоянством, зависит от условий произрастания растения и других факторов окружающей среды, тем не менее они могут использоваться для предваритель-

ной оценки целесообразности их применения при стандартизации растительного сырья. Таким образом, в настоящей работе под стандартным образцом (СО) ДВ подразумевается аутентичный хроматографически очищенный образец, отражающий общий состав и свойства полимерных полифенольных соединений данного растительного сырья, предназначенный для использования в количественном анализе, где его свойства сравниваются со свойс-твами исследуемых соединений.

Проведенные исследования по комплексонометрическому определению содержания ДВ в СО (Беликов, 1980) показали, что полученные нами дубильные экстракты можно расположить в следующий ряд в порядке увеличения содержания ДВ: экстракт корневищ лапчатки (92,57 %) > экстракт корневищ и корней кровохлебки (99,45%) > экстракт корневищ бадана (107,41 %) > экстракт коры дуба (131,27%) > экстракт корневищ змеевика (153,52 %).

Найденные различия в содержании ДВ позволили установить титры и коэффициенты пересчета для каждого вида растительного сырья. Титр по СО ДВ лапчатки, бадана и кровохлебки практически не изменился и коэффициенты пересчета составили 1,08 , 0,93 и 1,01 соответственно, для ДВ дуба он равен 0,76 и ДВ змеевика - 0,61. Результаты комплексонометрического определения ДВ в растительном сырье с использованием титров, рекомендуемых Беликовым и установленных с использовнием полученных нами СО, преведены на рис. 3.

Определение содержания танина в фармакопейном препарате с использованием при расчетах титра, рекомендованного ФС 42-2217-84, приводит к завышенным результатам - 108,65 %. Применение СО танина позволило нам установить более точный титр (0,001136 г/мл) и повысить правильность определения -содержание танина в препарате составило 95,14 %.

Ж 50-

1 2 3 4 5

Рис. 3 . Количественное содержание дубильных веществ в лекарственном растительном сырье, определенное комплексонометрически с использованием:

□ - титра - 0,0153 г/мл

Щ - титра, экспериментально установленного с использованием высокоочищенных образцов ДВ.

Растительное сырье: 1) корневища змеевика, 2) кора дуба, 3) корневища бадана, 4) корневища лапчатки, 5) корневища кровохлебки.

Таким образом, использование СО ДВ, полученных хрома-тографической очисткой на ААфТ типа III, а с троксевазиновым лигандом, при контроле качества и стандартизации танидоносно-го лекарственного растительного сырья позволяет получать более достоверные данные и , кроме того, в значительной степени повышает точность и воспроизводтюсть используемых методик.

5. Применение химически модифицированных адсорбентов в гибридных методах анализа и для стандартизации лекарственных препаратов С использованием фитопрепаратов «Экстракт родиолы розовой жидкий» и «Настойка пиона» разработаны методики микропрепаративного разделения основных биологически активных

веществ (БАВ) (фенолоспирты, фенолокислоты, фенилпропано-иды и их гликозиды), а также препаративного выделения дубильных веществ конденсированного и гидролизуемого типов. В основе, предложенных хроматоспектрофотометринеских методов анализа данных фитопрепаратов, лежит одностадийное разделение на ААфТ и количественное определение действующих компонентов.

Разработанный метод количественного определения салвд-розида в «Экстракте родиолы розовой» отличается от известных методик простым техническим оснащением и не требует дополнительной пробоподготовки. Относительная случайная погрешность определения ±3,5 %.

Использование препаративной хроматографии на ААфТ с троксевазиновым лигандом для очистки и выделения ДВ из данных фитопрепаратов позволило наработать высокоочищенные образцы и исследовать их физико-химические свойства, а также изучить возможность использования для стандартизации препаратов.

Для количественного определения ДВ родиолы розовой, относящихся к группе проантоцианидинов (ПАЦ), предложен модифицированный фотоколориметрический метод, использованный Stafford et all. (1986) для определения проантоцианидинов в растениях семейства Хвойные.

Метод основан на гидролитическом расщеплении ПАЦ в кислой среде и последующем фотометрическом определении окрашенного продукта реакции - дельфинидина - при длине волны 540 нм. Данный метод позволяет избирательно определять проантоцианидины в присутствии других фенольных и полифе-нольных соединений. Содержание ПАЦ в препарате «Экстракт родиолы розовой жидкий» рассчитывали по калибровочному гра-

фику, построенному в аналогичных условиях для СО ПАЦ роди-олы. Ошибка определения не превышала ±3,2 %.

Таким образом, сочетание адсорбционного и распределительного механизмов разделения, определяющее хроматографи-ческое поведение фенольных и полифенольиых соединений на ААфТ, позволяет существенно расширить возможности их применения в хроматографическом анализе фитопрепаратов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые на основе эпоксиактивированных поливиниловых носителей синтезированы азоадсорбснты «реверсного» и «ами-нофенильного» типов с фенольными и азотсодержащими лиган-дами . Проведено разделение и очистка дубильных веществ методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления на адсорбентах аффинного типа.

2. Установлено, что адсорбенты с фенольными лигандами эффективны при разделении многокомпонентных смесей, включающих простые фенолы, феноло- и оксикоричные кислоты. Азоадсорбенты, полученные с использованием вставки гидра-зона п-нитро-а-хлор-коричного альдегида, избирательно повышают удерживание фенольных соединений. В механизме удерживания фенольных соединений важную роль играют гидрофобные взаимодействия и водородные связи.

3. Адсорбенты аффинного типа, содержащие в структуре лигапдов вторичные, третичные и четвертичные аминогруппы, проявляют слабые анионообменные свойства. Наибольшую эффективность при разделении смесей фенольных соединений проявляют адсорбенты в 80 4 2 и С1 -формах.

4. Сравнительное исследование влияния типа матрицы, химической структуры вставки и лигандов адсорбентов аффинного типа позволило рекомендовать адсорбент с матрицей ТП-55 и

троксевазиновым лигандом для препаративной хроматографии дубильных веществ.

5. Разработаны методики препаративной очистки дубильных экстрактов от низкомолекулярных фенольных примесей. Получены и охарактеризованы аутентичные высокоочищенные образцы дубильных веществ коры дуба, корневищ лапчатки, кровохлебки, бадана и змеевика, а также фармакопейного препарата - танина.

6. Предложено использование хроматографически очищенных на адсорбентах аффинного типа образцов дубильных веществ, содержащих весь комплекс биологически активных полифенолов, в качестве стандартных образцов для повышения точности и правильности косвенного комплексонометрического определения дубильных веществ в растительном сырье.

7. Предложены хроматоспектрофотометрические методы анализа биологически активных веществ фитопрепаратов «Экстракт родиолы розовой жидкий» и «Настойка пиона». Хроматог-рафической очисткой на адсорбентах аффинного типа выделены дубильные вещества данного растительного сырья. Изучены некоторые физико-химические свойства данных субстанций. Впервые показана возможность их использования при стандартизации данных фитопрепаратов по количественному содержанию дубильных веществ.

8. Разработан фотоколориметрический метод количественного определения конденсированных дубильных веществ в препаратах и растительном сырье родиолы розовой с использованием стандартного образца .

Основные результаты исследований опубликованы в следующих работах:

1.Кузнецов П.В., Шкаренда В.В., Антипенко Е.М., Захарова Е.А. К проблеме получения стандартных образцов

дубильных веществ на адсорбентах аффинного типа./ Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств. Тез. докл. Межресп. конф.,посвященной 20-летию ГНИИСКЛС.-Мос-ква,1991.-Т.2,ч.2.- С.36-37.

2. Антипенко Е.М., Кузнецов П.В. Скрининг адсорбентов аффинного типа для разделения и очистки танина. // Сб. на-учн. тр .-Кемерово.: КГМИ , 1993 .- С. 3 - 7.

3. Антипенко Е.М., Кузнецов П.В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ.У1. Стратегия и перспективы жидкостной колоночной хроматографии дубильных веществ . (Обзор) . // Хим.- фарм. журнал.- 1995. - Т.29, N 9.- Р. 53 - 60.

4. Антипенко Е.М., Чистохин Ю.Г., Кузнецов П.В. Новые подходы к исследованию дубильных веществ на адсорбентах аффинного типа./ Решение актуальных задач фармации на современном этапе. Тез. докл. науч.- практ. конференции ,посвя-щенной 50-летию НИИ фармации.- Москва, 1994.- С. 155-156.

5. Кузнецов П.В., Антипенко Е.М., Никонова Е.Г. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиолога-чески активных веществ.Х.Новые адсорбенты с иммобилизованными азотсодержащими лигандами для хроматографического скрининга танина.//Актуальные проблемы фармации: Сб.на-уч.тр.-Барнаул,1995.- С.73-77.

6. Антипенко Е.М., Шестов A.A., Береговых Г.В., Кузнецов П.В., Вострикова Т.И. Получение очищенного фармакопейного танина на новых адсорбентах аффинного типа и изучение его свойств./Актуальные вопросы современной медицины. Тез. докл. 5-ой научно-практической конференции врачей, посвященной 50-летию Победы,- Новосибирск, 1995.-Т.1.- С . 288-289.

7. Антипенко Е.М., Шестов A.A., Вострикова Т.И. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии для оценки степени очистки дубильных веществ на адсорбентах аффинного типа./Тез. докл. науч. сессии сотрудников НМИ.-Новосибирск, 1995.-Т.1-- С.4.

8. Кузнецов П.В., Антипенко Е.М., Шкаренда В.В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ. IX. Исследование танина на адсорбентах с фенольными и полифенольными лигандами. // Хим. - фарм. журнал. - 1996. - Т. ЗО.^С. 51 -53.

Подписано к печати 12.09.96. Формат 60x84 1/16. Бумага писчая. Гарнитура типа "Times". Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,6. Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ № 357.

АОЗТ Издательство "Кузбассвузиздат". 650043 Кемерово, ул. Ермака, 7.