Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Оптимизация методов контроля и совершенствование качества препарата Ретинола пальмитат

На правах рукописи

Ноздрин Константин Владимирович

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ КАЧЕСТВА ПРЕПАРАТА РЕТИНОЛА ПАЛЬМИТАТ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

□□34Б1342

Москва-2008

003451342

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени ИМ. Сеченова Росздрава

Научныйруководитель:

академик РАМН, доктор фармацевтических наук, профессор Арзамасцев Александр Павлович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Финкельштейн Евгений Иосифович

доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна

Ведущая организация:

НИИ Фармакологии им. РАМН

В.В. Закусова

Защита диссертации состоится « » 1 ( 2008 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава по адресу: 121019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «_ » (О 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.040.09

докт. фармацевт, наук, проф. // С Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Контроль качества препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь согласно ФСП 42-0716-06 для определения субстанции ретинола пальмитата (РП), а также антиоксидантов бутилгидроксианизо-ла (БОА) и бутилгидрокситолуола (БОТ) предусматривает использование методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Однако при серийном анализе препарата возникает ряд затруднений. Анализ субстанции и антиоксидантов длителен, что не вполне рационально в условиях серийного фармацевтического производства. При хроматографировании антиоксидантов регистрируемые пики сигналов имеют неправильную форму, БОА довольно быстро элюируется с колонки, его сигнал часто накладывается на пики несорбируем ых компонентов и реакцию детектора на ввод пробы, что приводит к невысокой селективности и точности определения, а также осложняет вали-дацию аналитических методик. При хроматографическом анализе субстанции РП в препарате Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь помимо пика РП на хроматограмме наблюдаются пики соединений, которые рассматривают в качестве посторонних примесей. Структура этих соединений до сих пор не описана. По результатам проведённых предприятием-изготовителем маркетинговых исследований одним из основных недостатков препарата является неудобство применения. При улучшении его потребительских свойств путём замены рекомендуемой для дозирования глазной пипетки на современный капельный дозатор, препарат может сохранить свой сектор на фармацевтическом рынке. Кислород воздуха, находящийся во флаконе над раствором, может способствовать окислению субстанции. На наш взгляд, целесообразно заменить его газом, индифферентным по отношению к РП. Всё вышеперечисленное делает исследование, направленное на оптимизацию методов контроля и совершенствование качества препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь, актуальным и имеющим научное и практическое значение.

Цель и задачи. Целью настоящей работы явилась оптимизация методов контроля и совершенствование качества препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь. Достижение цели осуществлялось путем решения следующих задач:

- для повышения селективности, точности и экспрессности определения оптимизировать методику хроматографического анализа БОА и БОТ в препарате;

- для увеличения экспрессности определения оптимизировать мето

хроматографического анализа РП в препарате;

- установить структурные характеристики веществ, дополнительно выявляемых при хроматографическом анализе РП;

- провести валидацию методик определения РП и антиоксидантов в препарате;

- усовершенствовать первичную упаковку препарата для улучшения его потребительских свойств.

Основные положения, выносимые на защиту. На защиту вынесены следующие положения:

- оптимизация хроматографического определения РП, БОА и БОТ в препарате Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь на основе использования колонки, заполненной сорбентом «Phenyl-Hexyl»;

- структурные характеристики родственных РП соединений, выявляемых при хроматографическом анализе препарата;

- применение препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь в медицинской практике во флаконе, оснащённом капельным дозатором, и хранение его под азотом.

Новизна полученных результатов. Впервые показано, что вещества, формирующие дополнительные пики на хроматограмме при анализе РП, в условиях обращённой хроматографии представляют собой родственные ему соединения и не являются посторонними примесями. Они имеют идентичные РП спектры поглощения в УФ свете с максимумами при той же длине волны, содержат в своей структуре кольцо р-ионона и изопреноидную боковую цепь, при масс-спектроскопическом определении образуют основной фрагментарный ион, характерный для ретинола.

Использование колонок, заполненных сорбентами, модифицированными нитрильными и фенильными группами, в частности «Phenyl-Hexyl», в сравнении с колонками с сорбентом С18, при хроматографическом определении компонентов в препарате позволяет увеличить время удерживания БОА (его пик не накладывается на пики несорбируемых компонентов) и симметричность пиков антиоксидантов, что повышает точность и селективность их определения. Применение указанной колонки снижает время удерживания РП и БОТ, что увеличивает экспрессность анализа препарата. Использование для растворения анализируемой пробы препарата смеси изопропилового и метилового спиртов, позволяет увеличить симметричность пиков антиоксидантов

и тем самым повысить точность их определения. На основании полученных данных оптимизированы методики количественного определения РП и анти-оксидантов в препарате Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь.

Внедрение. Полученные в работе данные по оптимизации первичной упаковки препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь введены в ФСП 42-0716-06. Препарат зарегистрирован в соответствии с Федеральным законом «О лекарственных средствах» (номер государственной регистрации PN000550/01 от 12.11.2007), разрешён для медицинского применения и поступает на отечественный фармацевтический рынок. Результаты исследования включены в методические рекомендации по применению препарата в педиатрической практике (утверждены Департаментом здравоохранения Правительства Москвы 7 мая 2007 г.) и защищены патентом на полезную модель (Патент № 58916 с приоритетом от 21.06.2006 г.).

Апробация работы. Основные материалы работы доложены и обсуждены: на двух Всероссийских конференциях «Бабухинские чтения в Орле» (июнь 2006, март 2007 гг.), на четырёх Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (апрели 2004 - 2008 гг.) и на шестом Российском национальном конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (октябрь 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них в журналах, рекомендуемых ВАК, - 4.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им. ИМ. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (№ гос. регистрации 01.200.110545).

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 120 страницах компьютерного текста (гарнитура Times New Roman, формат A4, 1800 знаков на 1 стр.), состоит из глав «Общая характеристика работы», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 48 рисунками. Указатель литературы включает 143 источника, в том числе - 102 отечественных и 41 зарубежный.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Изучению подвергали субстанцию РП - «Витамин А паль-митат, субстанция, стабилизированная БОА/БОТ - раствор [масляный]», используемую для серийного производства лекарственного препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь. Субстанцию закупали у ООО «ВИ-РУД», являющегося официальным представителем компании-производителя DSM Nutritional Products в России. При выполнении работы использовали стандартные образцы РД БОА и БОТ производства фирмы Sigma-Aldrich (США). Изучали препарат Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь, который выпускает ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие "Ретиноиды" по ФСП 42-0716-06. Препарат представляет собой прозрачную маслянистую жидкость от светло-жёлтого до жёлтого цвета без прогорклого запаха.

Объектами исследования были капельные дозаторы от препаратов Ти-зин® и Валокордин®, 4 вида дозаторов фирмы «АВА», а также флаконы типа ФВ объёмом 15, 30 и 100 мл, произведённые ООО «Солстек» и флаконы объёмом 10 и 15 мл, произведённые фирмой «STOLZLE OBERGLAS AG».

Методы. Для оптимизации хроматографического анализа антиоксидан-тов в препарате сначала выявляли закономерности хроматографического поведения БОА и БОТ при совместном присутствии в анализируемой пробе раствора стандартных образцов на колонках с различными сорбентами. Затем исследовали влияние растворителя, используемого для растворения анализируемой пробы препарата, на хроматографирование антиоксидантов. На основании полученных данных выбирали оптимальные условия определения БОА и БОТ, составляли методику и проверяли её применительно к анализу препарата. Для выявления закономерностей хроматографического поведения БОА и БОТ при их совместном присутствии в пробе приводили их хроматографи-ческое разделение с использованием 11 колонок БиоХимМак (Россия), Элси-ко (Россия) и Phenomenex (США), заполненных сорбентами четырёх типов: сорбенты с привитой алифатической фазой (Диасфер 110 С18, Диасорб 130С16Т, Synergi Max RP, Kromasil С8, Luna С8(2), Luna С18); сорбенты с фенильными группами (Диасфер 110 Фенил, Synergi POLAR RP, Luna Phenyl-Hexyl); сорбенты с нитрильными группами (Диасфер 110 нитрил, Диасфер 110 C10CN) и сорбент с аминогруппой (Luna NH2). Работу проводили с использованием хроматографических комплексов «Agilent» 1100 (США) и

ЕЛвсИс^ (Германия), оснащённых УФ детекторами с переменной дайной волны. Детектирование БОА и БОТ осуществляли при 280 нм. В качестве подвижных фаз использовали смеси метилового спирта и воды в различных соотношениях. Объёмная скорость подвижной фазы составляла 0,8-1,0 мл/мин. Количественную оценку гидрофобности БОА и БОТ проводили, используя приём, основанный на расчёте коэффициентов распределения (О) антиокси-дантов в системе хлороформ-вода (Золотов Ю.А., 2006). Б антиоксидантов оценивали, обрабатывая растворы БОА и БОТ (100 мг/л) в хлороформе равными объёмами воды и определяя общие концентрации антиоксидантов в экстракте (СБот; Сбоа; мг/л) спектрофотометрически. Коэффициент распределения рассчитывали по формуле:

где С - концентрация антиоксиданта в водной фазе.

Исходные растворы стандартных образцов антиоксидантов готовили растворением точных навесок стандартных образцов БОА и БОТ в изопропи-ловом спирте, метиловом спирте или смесях растворителей. Рабочие растворы готовили разбавлением исходных. При изучении влияния на хроматогра-фический анализ растворителя, применяемого для растворения анализируемой пробы, помимо изопропилового спирта использовали смеси растворителей (изопропиловый спирт, метиловый спирт, хлороформ) в различных соотношениях. Испытуемый раствор препарата готовили растворением навески препарата в соответствующем растворителе. Для анализа использовали колонки Диасфер 110 C10CN, Диасфер110 Фенил и Luna Phenyl-Hexyl. Результаты хроматографирования оценивали, рассчитывая коэффициент ёмкости (К') и эффективность хроматографических колонок. При изучении новых колонок для анализа антиоксидантов использовали хроматограф Agilent серия 1100 (США). Для анализа использовали колонку Nucleodex beta РМ 200 х 4,0 мм, 5 мкм. (Macherey - Nagel, Германия). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил - вода - триэтиламин - уксусная кислота (500:500:1:1). Детектирование осуществляли при 280 нм. Хроматографирова-ли растворы стандартных образцов БОА и БОТ (Sigma-Adrich, США) и рассчитывали эффективность колонки и коэффициенты разделения. Также применяли монолитную хроматографическую колонку Chromolith Speed ROD RP 18e 50 x 4,6 мм (Merck, Германия). В качестве элюента использовали смеси

метанола и воды или ацетонитрила и воды. Детектирование осуществляли

5

при 280 нм. Хроматографировали растворы стандартных образцов БОА и БОТ (Sigma-Aldrich, США) и определяли времена удерживания (Т) антиокси-дантов. В ходе хроматографического разделения фиксировали максимальные значения давления в системе (Рмах.) при заданной объёмной скорости ПФ.

Дня оптимизации хроматографического анализа РП в препарате с целью уменьшения времени его удерживания исследовали влияние модификации подвижной фазы и природы сорбентов. Для модификации свойств элюента к метиловому спирту добавляли по 10 % метиленхлорида, н-бутанола, метил-изобутилкетона, этилацетата или метилэтилкетона, в качестве гидрофобных агентов. При этом использовали колонку с сорбентом Диасфер 110 С18, аналогичную той, которая указана в ФСП. Хроматографировали растворы стандартного образца РП. Исходный раствор стандартного образца готовили растворением точной навески стандартного образца в изопропиловом спирте. Для изучения возможности использования иных, отличных от С18 сорбентов, использовали хроматографические колонки БиоХимМак (Россия) и Phenomenex (США), заполненные сорбентами Luna С18, Диасфер 110 Фенил, Luna Phenyl-Hexyl, Диасфер 110 C10CN и Диасфер С16. При тестировании сорбентов в качестве подвижных фаз использовали 100 % метиловый спирт или смеси метилового спирта и воды в различных соотношениях. Хроматографировали растворы стандартного образца. Работу проводили с использованием хроматографических комплексов Agilent 1100 (США) и Bischoff (Германия), оснащённых УФ детекторами с переменной длиной волны. Детектирование РП осуществляли при 326 нм. Объёмная скорость подвижной фазы составляла 0,8-1,0 мл/мин в зависимости от диаметра колонок. Результаты хроматографирования оценивали, рассчитывая коэффициент ёмкости (К') и эффективность хроматографических колонок. При анализе препарата испытуемый раствор готовили растворением навески препарата (около 1 г на 100 мл растворителя) в изопропиловом спирте или в смеси изопропилового и метилового спиртов в соотношении 7:3. На основании полученных данных корректировали методику анализа.

Хроматографировали раствор препарата с использованием жидкостного хроматографа Bischoff (Германия), оснащённого УФ детектором с переменной длиной волны и колонкой, заполненной сорбентом С18. Детектирование осуществляли при 326 нм. В качестве подвижной фазы использовали 100% метиловый спирт. Объёмная скорость подвижной фазы составляла

1,0 мл/мин. В тех же условиях проводили анализ субстанции РП Рассчитывали относительные времена удерживания разделённых компонентов при анализе препарата и субстанции. Затем проводили анализ субстанции РП при помощи хроматографа, оснащённого диодно-матричным детектором, позволяющим проводить детектирование одновременно в широком диапазоне длин волн и записывать спектры поглощения разделяемых компонентов пробы. Разделение проводили в следующих условиях: колонка - Диа-сфер 110С16 150 х 4.0 мм, 5 мкм, подвижная фаза - 100% метиловый спирт, объёмная скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин. Спектры разделённых компонентов записывали в области 220-450 нм. Хроматографировали концентрированный (1 мг/мл) и разбавленный (20 мкг/мл) растворы субстанции РПи растворы препарата. Концентрированный раствор готовили растворением точной навески субстанции в изопропиловом спирте, разбавленный - разбавлением концентрированного раствора метанолом. Записывали хроматограм-мы разбавленного и концентрированного растворов. Рассчитывали относительные времена удерживания разделённых компонентов при анализе препарата и субстанции. При хроматографировании разбавленного раствора записывали спектр поглощения только РП. При хроматографировании концентрированного раствора записывали спектры поглощения разделяемых компонентов, определяли максимумы. Полученные спектры сравнивали со спектром РП Для получения масс-спектров веществ, выявляемых при хроматографиче-ском анализе РП, смесь разделяли при помощи ВЭЖХ в условиях, аналогичных используемым ранее: колонка - Zorbax С18 150 х 0,5 мм, 5 мкм, подвижная фаза - 100 % метиловый спирт, объёмная скорость подвижной фазы -20 мкл/мин. Хроматографировали раствор субстанции РП в метаноле с концентрацией 1 г/л. Объём вводимой пробы составлял 1 мкл. Затем использовали квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр Agilent 6510 Q-TOF с ионизацией электроспреем. Масс-спектр записывался в диапазоне значений m/z от 100 до 650.

Критерием оценки аналитической методики служит доказательство её валидности. С этой целью выполнено экспериментальное исследование по изучению таких валидационных характеристик, как стабильность стандартных растворов, линейность зависимости аналитического сигнала от концентрации аналита, нижняя граница диапазона определяемых содержаний, воспроизводимость и правильность результатов определения.

Для оценки роли азота в предотвращении окисления препарата кислородом воздуха использовали две группы образцов препарата по 21 флакону в каждой. Препарат разливали по 10 мл во флаконы для капель тёмного стекла, вместимостью 15 мл, производства фирмы «STOLZLE OBERGLAS AG» и укупоривали навинчивающимися крышками с уплотнителем производства фирмы «ABA». Флаконы в первой группе не продували азотом. Во второй -воздух во флаконе над раствором замещали на азот.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты оптимизации хроматографического анализа БОА и БОТ

Изучение хроматографического поведения антиоксидантов на колонках, заполненных различными сорбентами. При хроматографировании БОА и БОТ на колонках с фенильными и нитрильными сорбентами различие в их гидро-фобности проявляется менее ярко (рис. 1). Специфическая сорбция БОА и БОТ на сорбентах этих типов обусловлена л-тс взаимодействиями между электронными системами неподвижной фазы и ароматическим фрагментом молекул антиоксидантов.

Традиционный фенильный сорбент представляет собой силикагель с привитыми фенил-пропильными группами (Диасфер 110 Фенил). Коэффициент ёмкости БОА достаточен для того, чтобы его пик не накладывался на пики несорбируемых компонентов и реакцию детектора на ввод пробы. В то же время коэффициент ёмкости БОТ имеет небольшое значение. На колонке с этим сорбентом удалось получить симметричные пики БОА и БОТ. На колонке с сорбентом «Phenyl-Hexyl» (Luna), где алифатическая цепь между фе-нильной группой и поверхностью сшшкагеля увеличена до 6 атомов углерода, эта тенденция сохраняется.

Сорбенты с нитрильными группами, в частности, Диасфер 110 C10CN позволяют разделить БОТ и изомеры БОА с применением в качестве подвижной фазы смеси метанола и воды. Для сорбента Диасфер 110 Нитрил значение ДК' анализируемых соединений совсем невелико и анализ антиоксидантов на колонке с этим сорбентом целесообразно проводить с помощью подвижных фаз с меньшим содержанием метанола. При этом коэффициенты ёмкости и значение ДК' разделяемых веществ несколько увеличиваются (см. рис. 1). Однако эта хроматографическая система будет иметь ограниченное применение для анализа препарата РП, поскольку содержащиеся в нём триглицериды

при контакте с обогащенным водой элюентом образуют эмульсию.

Сравнивая результаты, полученные на колонках с сорбентами Диа-сфер 110 Нитрил и Диасфер 110 C10CN, можно отметить, что увеличение длины алифатической цепи с трёх до десяти атомов углерода оказывает положительное влияние на разделение БОА и БОТ (см. рис. 1). При этом становится возможным проводить анализ при большем содержании метанола в подвижной фазе. Это актуально при анализе БОА и БОТ в препарате РП.

Сорбенты, модифицированные аминными группами, неприменимы для анализа фенольных антиоксидантов в системе элюентов метанол-вода Аминогруппы сорбента не содержат я-связей, по этой причине не наблюдается заметной сорбции БОА и БОТ на колонке и хроматографические пики правильной формы не формируются. Таким образом, использование сорбентов Диасфер 110 Фенил, Luna Phenyl-Hexyl и Диасфер 110 C10CN для хромато-графического разделения БОА и БОТ при совместном присутствии позволяет достичь сокращения времени удерживания БОТ, при этом БОА не накладывается на пики несорбируемых компонентов и реакцию детектора на ввод пробы. На основании этого, принимая во внимание значения эффективности колонок и аналитические свойства пиков антиоксидантов, использование таких стационарных фаз позволяет проводить анализ с достаточной точностью, селективностью и экспрессностью.

Изучение влияния растворителя, используемого для растворения анализируемого образца препарата. Увеличение содержания метанола в составе смеси растворителей для растворения образца существенно улучшает форму пиков БОА и БОТ по сравнению с использованием 100 % изопропанола, а присутствие хлороформа в пробе резко ухудшает её (рис. 3). Аналогичные результаты были получены при использовании колонки Luna Phenyl-Hexyl. Эффективность хроматографической колонки и симметричность пиков также возрастала с увеличением содержания метанола в пробе. Вероятно, это связано не столько со специфической ролью метанола в этой системе, сколько с приближением состава пробы к составу элюента. Таким образом, состав элю-ента значительно влияет на разделение антиоксидантов, и соотношение метанола и воды следует подбирать, учитывая тип сорбента, используемого для хроматографирования. Приближение состава пробы к составу ПФ повышает эффективность хроматографической колонки и симметричность пиков, что способствует улучшению метрологических характеристик анализа.

Изучение возможности применения новых хроматографических колонок для анализа БОА и БОТ. При хроматографировании раствора стандартных образцов БОА и БОТ на колонке Nucleodex beta-PM 200 изомеры БОА уверенно разделяются. При уменьшении объёмной скорости ПФ до 0,8 мл/мин разделение изомеров БОА улучшается. Коэффициенты ёмкости анализируемых соединений составили: для 3-БОА изомера - 3,40, для 2-БОА изомера - 4,23 и для БОТ -11,11. Необходимо отметить, что на данной колонке происходит лучшее разделение изомеров БОА, чем на колонке Диасфер 110C10CN.

Таким образом, применение хроматографической колонки Nucleodex beta-PM позволяет разделять изомеры БОА. В условиях совместного анализа антиоксидантов на данной колонке было достигнуто более полное разделение изомеров БОА, чем на колонках с фенильными и нитрильными сорбентами. При анализе БОА целесообразно использовать скорость потока 0,8 мл/мин для достижения лучшего разделения изомеров, а при совместном анализе БОА и БОТ скорость потока можно увеличить с целью сокращения времени анализа. Однако в настоящее время колонки, содержащие оптически активные сорбенты, имеют малое распространение и относительно высокую стоимость, что осложняет их использование в серийном фармацевтическом анализе.

Изучали возможность использования монолитной колонки для анализа БОА и БОТ. Под градиентным элюированием обычно подразумевают изменение состава подвижной фазы в процессе хроматографического разделения. В данном исследовании использовался принцип градиента (увеличения) объёмной скорости подвижной фазы в ходе проведения анализа. Учитывали времена удерживания БОА и БОТ при использовании применявшихся в ходе исследования параметров хроматографирования и максимальные значения давления в системе. Градиент объёмной скорости элюента при применении подвижных фаз с метанолом был составлен таким образом, чтобы обеспечить элюирование БОА в изократических условиях при скорости потока подвижной фазы около 1 мл/мин. Затем объёмная скорость подвижной фазы возрастала в 4—5 раз. При этом максимальное давление в системе не превышало рабочий диапазон давлений, обычно наблюдаемых в жидкостной хроматографии. В наибольшей степени сокращение времени удерживания БОТ (в 1,9-2,3 раза) при достаточном времени удерживания БОА наблюдалось при исполь-

зовании в качестве ПФ смеси метанола и воды в соотношении 7:3. Увеличение объёмной скорости ПФ не приводило к ухудшению формы пика БОТ, но приводило закономерно лишь к уменьшению его площади. Аналогичные результаты были получены и при использовании в качестве элюентов смесей метанола и воды 8:2 и ацетонитрила и воды 7:3.

Таким образом, применение монолитной колонки Chromolith Speed ROD RP-18e 50 x 4,6 мм позволяет проводить хроматографический анализ БОА и БОТ с использованием элюента постоянного состава, а градиент объёмной скорости ПФ позволяет значительно сократить время их анализа. Однако монолитные колонки пока мало распространены и весьма дороги. Это значительно ограничивает их применение в серийном фармацевтическом анализе и, по нашему мнению, внесение методов, основанных на их использовании, в фармакопейные статьи в настоящее время нецелесообразно.

Результаты оптимизации хроматографического анализа РП

Модификация подвижной фазы. По результатам анализа раствора стандартного образца РП на колонке, заполненной сорбентом Диасфер 110 С18 с использованием подвижных фаз с гидрофобными добавками, можно видеть что применение подвижных фаз, состоящих из метанола и метиленхлорида (9:1), метанола и н-бутанола (9:1), метанола и метилизобутилкетона (9:1), метанола и этилацетата (9:1), метанола и метилэтилкетона (9:1), сокращало время анализа соответственно в 1,9; 1,8; 1,7; 1,5 и 1,4 раза по сравнению с применением в качестве подвижной фазы метанола. Гидрофобные добавки повышали элюирующую способность метилового спирта и не оказывали значительного влияния на эффективность хроматографической колонки (число теоретических тарелок) при анализе РП (рис. 2). Наилучшая форма его пика была получена с использованием подвижных фаз, содержащих хлористый метилен или этилацетат. При хроматографировании стандартного образца РП на колонке Диасфер 110 С18 с использованием элюентов, содержащих хлористый метилен и этилацетат, фактор асимметрии пика РП имел значение, близкое к 1,0. По соображениям доступности применение хлористого метилена и этилацетата также предпочтительнее.

Следовательно, использование элюентов, содержащих гидрофобные компоненты, сокращает время анализа РП при использовании колонок с сорбентом С18 с 40 мин до 13-15 мин. Наиболее рационально с этой целью использовать подвижные фазы с хлористым метиленом или этилацетатом.

Вариации сорбента. Сорбенты, модифицированные фенильными группами и цианогруппой, обладают сродством к системе сопряжённых двойных связей молекулы РП, в результате чего гидрофобность его молекул не оказывает значительного влияния на удерживание. При использовании 100 % метанола в качестве подвижной фазы, на колонках с этими сорбентами в ряде случаев коэффициент ёмкости имеет слишком низкие значения, и пик РП может накладываться на пики несорбируемых компонентов при анализе препарата. Эта проблема легко решается добавлением к элюенгу от 1 % до 10 % воды в зависимости от используемого сорбента (табл. 1). Это означает, что использование этих колонок позволяет также сократить время анализа РП по сравнению с традиционными сорбентами С18 с применением метанольного элюен-та.

Таким образом, в результате предварительных исследований установлено, что и модификация элюента гидрофобными компонентами, и вариация сорбентов позволяют достичь значительного сокращения времени анализа РП, и для оптимизации его хроматографического анализа можно использовать любой из методов.

Применение подобранных условий анализа к определению РП, БОА и БОТ в препарате

В качестве оптимального растворителя анализируемого образца была выбрана смесь изопропилового и метилового спирта в соотношении 7:3. При этом возрастала эффективность хроматографической колонки и симметричность пиков антиоксидантов, а интенсивность пиков несорбируемых компонентов была значительно меньше, чем при анализе в условиях, описанных в ФСП на препарат. Повышения экспрессное™ определения РП в препарате с использованием колонок с сорбентами С18 можно добиться путем добавления к метанольному элюенту гидрофобных модификаторов или путем замены сорбента на фенильный или нитрильный без использования дополнительных модификаторов ПФ. С целью унифицирования колонок и элюентов, используемых при анализе препарата, для хроматографического определения БОА, БОТ и РП предпочтение было отдано колонке с фенильным сорбентом -Phenyl-Hexyl 150 х 4,6 мм, 5 мкм. На колонке с этим сорбентом удалось существенно снизить время удерживания БОТ и РП, при этом пик БОА не накладывается на пики несорбируемых компонентов. Пики симметричны, колонка обладает достаточной эффективностью в отношении анализируемых соеди-

нений. Колонки с этим сорбентом широко представлены на рынке и относительно недороги. В качестве элюента для анализа БОА и БОТ была выбрана смесь метилового спирта и воды в соотношении 8:2, а для анализа РП - смесь метилового спирта и воды в соотношении 98:2. На основании полученных данных составлены методики хроматографического определения РП, БОА и БОТ в препарате, которые приведены ниже.

Методика анализа РП в препарате методом ВЭЖХ

Приготовление раствора испытуемого образца

Около 0,5 г препарата (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в смеси изопропиловош и метилового спиртов в соотношении 7:3. После полного растворения навески доводят объём раствора до метки тем же растворителем.

Приготовление раствора стандартного образца

Около 0,05 г стандартного образца РП (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в смеси изопропилового и метилового спиртов в соотношении 7:3 и перемешивают. После полного растворения навески доводят объём раствора до метки тем же растворителем. Условия хроматографирования Колонка - ЬшаРЬепу1-Неху1150 х 4,6 мм, 5 мкм Подвижная фаза - метиловый спирт-вода (98:2) Объёмная скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин Детектор - УФ, 326 нм

Последовательно хроматографируют по 20 мкл испытуемого раствора и раствора стандартного образца.

Содержание ретинола пальмитата в препарате в МЕ (X) вычисляют по формуле:

хрхШ7000 = Ах^х^х/Гх5ж1817; в,х100 100 50 а,

где 5/ - площадь пика РП на хроматограмме раствора испытуемого образца;

5*о— площадь пика РП нахроматограмме раствора стандартного образца

а0 - навеска стандартного образца, в граммах;

а, - навеска испытуемого образца, в граммах;

р - плотность препарата в г/мл;

К - содержание ретинола пальмитата в СО в %;

1817000 - активность 1 г 100 % ретинола пальмитата (МЕ).

При использовании разработанной методики для анализа РП в препарате время его удерживания составило около 9,5 минут, что в 2,5-3 раза меньше, чем при хроматографировании согласно методике, приведённой в ФСП. Хро-матограмма представлена на рис. 4. Эффективность колонки составляет более

3000 т.т., коэффициент асимметрии - от 0,9 до 1,2.

Методика анализа БОА и БОТ в препарате методом ВЭЖХ

Приготовление раствора испытуемого образца

Около 0,5 (0,25) г препарата (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 50 (25) мл, растворяют в смеси изопропилового спирта и метилового спирта в соотношении 7:3. После полного растворения навески доводят объём раствора до метки тем же растворителем.

Приготовление раствора стандартных образцов

Около 0,1 г бугилгидроксианизола и около 0,1 г бутилгидрокситолуола (точные навески) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в изопропило-вом спирте и перемешивают. После полного растворения навесок доводят объём раствора до метки тем же растворителем. 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём раствора до метки метиловым спиртом и перемешивают.

Условия хроматографирования Колонка-LunaPhenyl-Hexyl 150 х 4,6 мм, 5мкм Подвижная фаза - спирт метиловый-вода(4:1). Объёмная скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин Детектор - УФ, 280 нм

Последовательно хроматографируют по 20 мкл испытуемого раствора и раствора стандартных образцов.

Содержание антиоксидантов в препарате в процентах (X) вычисляют по формуле:

S0 a, xlOOxlOO 100 S0 а,х 200

где S¡ - площадь пика антиоксиданта на хроматограмме раствора испытуемого образца;

S0 - площадь пика антиоксиданта на хроматограмме раствора стандартного образца

а0 - навеска стандартного образца, в граммах; а, - навеска испытуемого образца, в граммах; р - плотность препарата в г/мл;

К- содержание соответствующего антиоксиданта в СО в %.

Применение разработанной методики определения антиоксидантов в препарате позволило повысить симметричность пиков БОА и БОТ (коэффициенты асимметрии составили 0,95 и 1,1 соответственно), а также уменьшить

К'50-/ 40-f 30 20 10

s

□ к* (БОА) ПК'(БОТ)

№

<шьт

г* г* $ О . О Ц." л

# / у ^

о"

с? £

* d*

г

^

& Л®Г А

о®

S

л

J J

Рис. 1. Коэффициенты ёмкости (К') БОА и БОТ, полученные при хро-матографировании на колонках, заполненных сорбентами с привитыми алифатическими, фенильными, нитрильными и аминными группами.

с о.

Рис. 2. Результаты хроматографического анализа РП на колонке Диа-сфер 110 С18 с использованием различных элюентов. Состав элюента: А - метанол; Б - метанол-метиленхлорид (9:1); В - метанол-н-бутанол (9:1); Г - метанол-метилизобутилкетон (9:1); Д - метанол-этилацетат (9:1); Е - метанол-метилэтилкетон (9:1).

Приложение 1РП

Рис. 3. Хроматограммы антиокси-дантов в препарате Ретинола пальми-тат, раствор для приёма внутрь. (Колонка - Диасфер СЮСМ 250 х 4,0 мм, 5 мкм, ПФ - метанол-вода (8:2), объёмная скорость ПФ - 0,8 мл/мин, детектирование - УФ 280 нм., растворитель пробы: А - хлороформ-метанол (1:1), Б - изопропанол-метанол (7:3).

Рис. 4. Хроматограмма раствора препарата Ретинола паль-митат, раствор для приёма внутрь (Колонка - Luna Phenyl-Hexyl 150 х 4,6 мм, 5 мкм, ПФ - метанол-вода (98:2), объёмная скорость ПФ - 1,0 мл/мин, детектирование - УФ 326 нм).

БОА

rnV SO

РП

БОТ

А

мин 0

Рис. 5. Хроматограмма раствора препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь (Колонка - Luna Phenyl-Hexyl 150 х 4,6 мм, 5 мкм, ПФ - метанол-вода (8:2), объёмная скорость ПФ - 1,0 мл/мин, детектирование -УФ 280 нм).

Рис. 6. Хроматограмма раствора субстанции РП (Колонка -Диасфер 110 С16 150 х 4,0 мм, 5 мкм, ПФ - метанол 100 %, объёмная скорость ПФ - 1,0 мл/мин, детектирование - УФ 326 нм).

Табл. 1. Значения коэффициентов ёмкости РП, полученные при хро-матиграфировании на колонках с различными сорбентами.

щЕта.гав--

ЙШИВТь-

ишша

Диасфер-110-СЮСЫ

1,77

4,29 14,91

Диасфер-110-фенил

1,95

4,55 14,29

1.ипа РЬепу!-Неху!

2,61

3,52 4,27

Рис. 8. УФ спектр соединений с относительными временами удерживания 0,53, 0,72, 0,85, 1,17 и 1,38.

хЮ 1

m/z=269

о -А

kA 269

i

хЮ4

-lililí-¿lAIh

<)m/z=269

lUllUlmJ U

Рис. 9. Масс-спектр РП (иониза-

Рис. 10. Масс-спектр соединения с

ция электроспреем) и механизм об- относительным временем удерживания 0,24 (ионизация электроспреем).

разования фрагментарного иона.

хЮ'

О m/z=269

ji

Ali

Х10" 1

ilk

il.i>llllilliLlLilllJlililí, t.tlill JH

О m/z=269

J.L.. л. 1... .1. 1.1 Ii...

100 620 miz 100 620 miz

Рис. 11. Масс-спектр соединения Рис. 12. Масс-спектр соединения с

с относительным временем удержи- относительным временем удержива-

вания 0,49 (ионизация электроспре- ния 0,70 (ионизация электроспреем), ем).

хЮ'

kill

iiiiu

m/z=269

ILA

L

tüLi

il

0m/z=269

¿ÍL,ii|LJ|IüI|1|

" -

L

620 m/z ioo

Рис. 13. Масс-спектр соединения Рис. 14. Масс-спектр соединения с

с относительным временем удержи- относительным временем удержива-

вания 0,72 (ионизация электроспре- ния 0,81 (ионизация электроспреем), ем).

время удерживания БОТ до 12,5 минут, что в 2-2,5 раза меньше, чем при хроматографировании согласно методике, приведённой в ФСП. Эффективность колонки, рассчитанная по пику БОА, составила более 3000 т.т. (рис. 5).

Таким образом, разработаны методики количественного определения РП и антиоксидантов в препарате, позволяющие повысить экспрессность хрома-тографического анализ, симметричность пиков БОА и БОТ и селективность их определения.

Результаты идентификации веществ, дополнительно выявляемых при хроматографнчеком анализе РП

При анализе препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь методом ВЭЖХ в условиях, описанных в ФСП, на колонке с сорбентом С18, помимо основного пика РП, на хроматограмме наблюдаются дополнительные пики разделяемых компонентов. Значения времён удерживания соединений относительно РП составляют около 0,18,0,52,0,71 и 0,88. Затем был проведён анализ субстанции РП в аналогичных условиях (рис. 6). Значения времён удерживания соединений относительно РП совпали с таковыми, рассчитанными в результате хроматографирования раствора препарата. На основании этого можно утверждать, что вещества, формирующие эти пики, присутствуют в субстанции РП.

Для дальнейших исследований использовали хроматограф, оснащённый диодно-матричным детектором и колонкой с сорбентом С16. Рассчитанные относительные РП времена удерживания элюирующихся веществ - 0,17,0,53, 0,73,0,85 и 1,4 - оказались идентичны полученным ранее. Был записан спектр поглощения в УФ свете для РП (рис. 7). Его максимум наблюдался при 326 нм. При концентрации анализируемого образца 1 мг/мл удалось записать спектры поглощения в УФ свете разделённых компонентов с относительными временами удерживания 0,17, 0,53, 0,72, 0,85, 1,17 и 1,38. На полученных спектрах были определены их максимумы. Для соединений с относительными временами удерживания 0,53, 0,72, 0,85, 1,17 и 1,38 максимум поглощения составил 326 нм (рис. 8). Сравнение спектров поглощения разделённых веществ показал, что спектры соединений с относительными временами удерживания 0,53, 0,72, 0,85, 1,17 и 1,38 идентичны спектру поглощения РП, и имеют максимумы при одной и той же длине волны (326 нм). На основании этого можно предположить, что эти соединения, как и РП, имеют в своей структуре кольцо Р-ионона и боковую изопреноидную цепь, обусловливаю-

щие характер спектра.

Соединение со значением относительного времени удерживания 0,17 имеет спектр поглощения, существенным образом отличающийся от спектров поглощения ретинола и его эфиров, и, вероятно, является продуктом деструкции. Для проверки этого предположения концентрированный раствор субстанции повторно подвергли хроматографическому разделению через 15 часов хранения при комнатной температуре. Интенсивность пика соединения с относительным временем удерживания 0,17 возросла в 15 раз, при этом интенсивность остальных пиков значимо не изменилась. Из этого можно сделать вывод, что соединение со значением относительного времени удерживания 0,17 является продуктом деградации одного из компонентов пробы.

На хроматограмме концентрированного раствора РП наблюдаются пики со значениями относительных РП времён удерживания 0,12 и 0,14, имеющие очень малую интенсивность, что не позволило записать их спектры. Основываясь на схеме синтеза РП - переэтерификацией из ретинола ацетата, можно предположить присутствие в субстанции остатков неэтерифицированного ретинола, его уксусного эфира, и пальмитиновой кислоты. Поскольку пальмитиновая кислота не поглощает УФ свет в диапазоне длин волн, являющихся аналитическими для ретинола и его эфиров, обнаружить её в условиях анализа не представляется возможным даже в случае присутствия в пробе.

Ввиду того, что ретинола ацетат имеет короткий углеводородный радикал, а ретинол не имеет его вовсе, времена их удерживания на колонке С18, вероятно, будут иметь небольшие значения. Для проверки этого предположения, был проведен анализ стандартных образов ретинола и ретинола ацетата в условиях, аналогичных условиям анализа субстанции РП. Относительные времена удерживания ретинола и ретинола ацетата составили 0,12 и 0,14 соответственно. Следовательно, соединения со значениями относительных РП времён удерживания 0,12 и 0,14 на хроматограмме концентрированного раствора РП являются ретинолом и ретинола ацетатом. Подтвердить присутствие остальных соединений, предположительно эфиров ретинола, не представлялось возможным ввиду недоступности стандартных образцов.

Для проверки предположения, что все разделённые примеси имеют в своей основе молекулу ретинола, был проведён анализ субстанции методом масс-спектроскопии с предварительным разделением смеси методом ВЭЖХ в аналогичных условиях. Рассчитанные относительные времена удерживания

разделённых соединений составили 0,17, 0,24, 0,49, 0,7, 0,72 и 0,81. Относительные времена удерживания соединений практически соответствовали полученным в предыдущем исследовании, кроме соединения с относительным временем удерживания 0,24, которое ранее не выявлялось на хроматограм-мах, вероятно вследствие недостаточной чувствительности детектора В условиях хроматографирования удалось частично разделить соединения, которые ранее формировали единый пик с относительным временем удерживания 0,72. На хроматограмме наблюдаются два пика с относительными временами удерживания 0,7 и 0,72 соответственно. Для основного пика РП и для веществ с относительными временами удерживания 0,24, 0,49, 0,7, 0,72 и 0,81 были записаны масс-спектры после их ионизации электроспреем.

Известно, что при ионизации электроспреем эфиров ретинола происходит образование основного фрагментарного иона ретинола с отношением m/z 269, образующегося в результате элиминации остатка жирной кислоты (рис. 9). Проанализировав масс-спектры, полученные при анализе субстанции РП можно видеть, что во всех случаях основной пик формирует ион с отношением m/z 269, являющийся фрагментарным ионом ретинола (рис. 9, 10, 11, 12, 13 и 14). Помимо этого иона на спектрах можно видеть ряд других ионов, образующихся, вероятно, в результате фрагментации молекул по другим механизмам и аддукции молекул и их фрагментов с Na и К, что часто встречается в масс-спекгроскопии. Однако присутствие иона с отношением m/z 269 в качестве основного говорит о том, что все соединения имеют в своей структуре фрагмент ретинола.

Таким образом, проведённые исследования дают основания утверждать, что примеси на хроматограмме субстанции РП представляют собой соединения, имеющие в своей основе молекулу ретинола, и с высокой степенью вероятности являются его эфирами с гомологами пальмитиновой кислоты.

Результаты валидации методик хроматографического анализа РП, БОТ и БОА в препарате

Валидационной проверке подвергалась разработанная методика количественного определения РП БОА и БОТ в препарате Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь. Квалификационные исследования заключались в оценке устойчивости стандартных растворов, подтверждении линейности зависимости аналитического сигнала от концентрации определяемого вещества, достигаемой чувствительности определения, расчёте метрологических харак-

теристик и выявлению систематических погрешностей анализа. Результаты валидации показали высокую чувствительность определения (до 0,00005 % для РП, до 0,003 % для БОА и 0,004 % для БОТ) и строгость линейных зависимостей аналитических сигналов от содержания антиоксидантов (коэффициенты корреляции составили 0,999), что определяет высокую точность анализа Это выражается в хорошей воспроизводимости результатов, а также в статистически доказанной правильности определения. Полученные экспериментальные данные позволяют заключить, что растворами стандартных образцов можно пользоваться в течение как минимум 7 дней. Сделанные выводы дают возможность считать проверенные методики пригодными для достоверного количественного определения РП, БОА и БОТ в препарате Ретинола пальми-тат, раствор для приёма внутрь.

Результаты оптимизации первичной упаковки препарата

Подбор капельного дозатора и флакона. Согласно нормативной документации, в одной капле должно содержаться 3300 МЕ препарата, соответственно доза препарата на один приём составляет от 2 до 91 капли. Объём капли должен составлять 0,033 мл. Капельный дозатор № 1 образует капли нужного объёма (около 0,033 мл). Он вмещает в себя 5-7 капель препарата. Следовательно, для дозирования препарата у потребителя может возникать необходимость многократно наполнять пипетку, что не совсем удобно, способствует микробиологической контаминации препарата и его разрушению кислородом воздуха. На основании этого применение такого дозатора нецелесообразно. Объём капли из дозатора № 2, оказался сравним с таковым, который указан в нормативной документации на препарат (0,033 мл), но в процессе дозирования были обнаружены некоторые проблемы. Во-первых, капля формировалась слишком медленно, что неудобно при применении препарата. Во-вторых, некоторые капли резко отличались в объёме от остальных (0,05-0,06 мл). Видимо, данный дозатор предназначен для дозирования только водных или спиртовых растворов, имеющих значительно меньшую вязкость и силы поверхностного натяжения, и для дозирования препарата в форме масляного раствора не подходит. Два дозатора фирмы «ABA» № 3 и № 4 были отброшены, т. к. из одного из них раствор вытекал струёй, капли не формировались, и точное дозирование было невозможно, а другой выдавал слишком большие капли (0,06+0,003 мл). В такой капле содержится около 6000 МЕ витамина А, это неудобно

для точного дозирования и требует внесения дополнительных изменений в нормативную документацию. Дозатор № 5 имел такую конструкцию, что скорость каплеобразования и объём капли изменялись в зависимости от угла наклона дозатора, при этом также невозможна точная и стандартная дозировка препарата. Дозатор № 6 формировал каплю средним объёмом 0,033+0,0008 мл. Объём капли был постоянен, не зависел от угла наклона флакона, скорость каплеобразования была достаточной для того, чтобы считать образующиеся капли.

Итак, для применения препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь в медицинской практике его целесообразно снабдить дозатором № 6. Полное обозначение дозатора по каталогу фирмы «АВА» - тип Б-ТУРЕ II - 1,0. Выбранный капельный дозатор комплектует флаконы для капель тёмного стекла производства фирмы «8ТОЬ2ЬЕ ОВЕ1ЮЬА8 Ав» объёмом 10, 15, 20, 30 и 50 мл. Следовательно, для оснащения препарата капельным дозатором потребуется заменить и флакон.

Для оценки качества флаконов были разработаны спецификации, содержащие 18 параметров. Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что качество флаконов типа ФВ, не удовлетворяет требованиям спецификации. Качество же флаконов «ЗТОГ^ЬЕ ОВЕИСЬАБ Ав» соответствует спецификации, к тому же они более эстетичны в сравнении с флаконами типа ФВ. Это также повышает качество и потребительские свойства препарата.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что препарат целесообразно упаковывать во флаконы для капель тёмного стекла производства фирмы «БЮСТЬЕ ОВЕГЮЬАЗ АО», укомплектованные капельным дозатором фирмы «АВА» - тип Б-ТУРЕ П -1,0.

Оценка влияния газа во флаконе над раствором препарата на его стабильность. Результаты сравнительного исследования стабильности 2 групп препарата в течение 3 лет по показателям «Кислотное число», «Поглощающие примеси» и «Количественное определение ретинола пальми-тата» показали, что обе группы препарата соответствуют спецификации по указанным показателям на протяжении всего срока годности препарата. Однако значения показателей качества в образцах 2-й группы изменялись менее значительно и в конце срока хранения были ближе к начальным. На основании этого можно полагать, что замена воздуха во флаконе над раствором препарата на азот повышает стабильность препарата. Азот не ток-

сичен и не требует использования в производстве дополнительного оборудования.

Таким образом, установлено, что для повышения потребительских свойств препарата его целесообразно упаковывать во флаконы для капель тёмного стекла производства фирмы «STOLZLE OBERGLAS AG» с капельным дозатором фирмы «ABA». Воздух во флаконе над раствором препарата целесообразно замещать на азот.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В соответствии с целью и задачами исследования в настоящей главе представляется целесообразным обсудить часть вопросов, выносимых на защиту: возможность использования сорбента Luna Phenyl-Hexyl для анализа РП в препарате и целесообразность нормирования содержания веществ, формирующих дополнительные пики на хроматограмме, при анализе РП.

Возможность использования сорбента Luna Phenyl-Hexyl для анализа РП. Механизм удерживания РП на сорбенте С18 заключается в гидрофобном взаимодействии участков его молекулы и алкильных групп сорбента. Ввиду особенности строения молекулы РП время его удерживания на сорбенте С18 довольно значительно. В некоторых методиках, приведенных в фармакопеях США и Великобритании, проблема длительного элюирования РП решается путем пробоподготовки, в ходе которой он подвергается гидролизу с образованием ретинола, который после экстракции определяется методом ВЭЖХ в условиях обращёно-фазовой хроматографии. Способ является весьма эффективным, но в процессе гидролиза ретинол подвергается деструкции. Для её предотвращения иногда в реакционную смесь добавляют антиок-сиданты, однако данных по эффективности стабилизации ретинола в этих смесях в литературе обнаружить не удалось. Помимо этого, дополнительная пробоподготовка осложняет аналитическую процедуру, снижает её экспресс-ность, а также увеличивает потери анализируемого вещества. Как показано в настоящем исследовании, существенно ускоряет элюирование РП добавление модификаторов подвижной фазы, однако, при разработке методики анализа препарата немаловажным является унифицирование используемых реактивов и растворителей. При использовании сорбента, модифицированного фениль-ными радикалами, которые обладают сродством к системе сопряжённых

двойных связей молекулы РП, в отличие от традиционного сорбента Cl 8, время удерживания последнего значительно сокращается. На этом основании оптимизация хроматографического определения РП путём использования колонки с сорбентом Luna Phenyl-Hexyl - той же, что и при анализе антиокси-дантов - является более предпочтительным.

Целесообразность нормирования содержания веществ, формирующих дополнительные пики при анализе РП. Обнаружено, что большинство веществ, формирующих дополнительные пики на хроматограмме при анализе РП, имеют идентичные с ним спектры поглощения в УФ свете с максимумами поглощения при той же длине волны, характерной для соединений, содержащих в своей структуре кольцо ß-ионона и боковую изопреноидную цепь. При масс-спектрометрическом определении все они образуют фрагментарный ион, характерный для соединений ретинола. Основываясь на полученных данных и сведениях литературы, с определённой вероятностью можно утверждать, что эти соединения представляют собой эфиры ретинола и гомологов пальмитиновой кислоты. В этом ключе актуализируется вопрос, относить ли их к посторонним примесям или к специфическим родственным примесям, а также вопрос о необходимости регламентирования содержания этих веществ в субстанции РП и его лекарственных формах и методах их определения. Известно, что из кишечника в кровоток ретинол поступает в форме РП и в составе липопротеинов доставляется в печень, где освобождается от остатка пальмитиновой кислоты, превращаясь в ретинол, связывается с транспортным белком и вступает в дальнейшие метаболические пути (Ноздрин В.И. и др., 2004). В литературе нами обнаружено небольшое количество исследований, в которых было изучено содержание ретинола и его эфиров с жирными кислотами в различных жидкостях организма человека и животных. Так, в опыте на добровольцах, получавших с пищей РП, методом ВЭЖХ обнаружено повышение содержания в крови не только РП, но и других эфиров ретинола (OrthM., 1998). В более детальном исследовании обнаружено, что в плазме человека витамин А присутствует в форме РП, а также в формах ретинола бутирата, ретинола олеата и ретинола стеарата (Sowell A.L., 1994). В исследовании на собаках, которые получали РП с пищей, витамин А в виде РП и ретинола стеарата обнаружен в составе хиломикронов, в виде ретинола, РП, ретинола олеата и ретинола стеарата - в плазме и в виде ретинола, ретинола олеата и РП - в моче (Raila J., 2002). Обобщая эти данные, можно сказать, что

после введения в желудочно-кишечный тракт РП, витамин А в крови и в моче, помимо ретинола может обнаруживаться в форме его эфиров - РП, ретинола олеата и ретинола стеарата и др. Эти данные могут служить подтверждением давно высказывавшегося предположения, что не весь витамин А превращается в организме в ретинол. Часть его может присутствовать в форме эфиров с гомологами пальмитиновой кислоты. В нашем исследовании обнаружено, что в субстанции РП и его лекарственной форме помимо основного вещества присутствуют соединения, имеющие в своей структуре кольцо (3-ионона и изопреноидную боковую цепь и являющиеся эфирами ретинола. Сопоставляя эти данные, можно обоснованно предположить, что поступающий в кровь человека и животных витамин А, может состоять не только из РП, но и из других эфиров ретинола. Подтверждением этого могут служить данные Raila J. и др., которые методом ВЭЖХ показали, что у собак в крови после орального введения РП витамин А представлен на 49 % ретинола стеа-ратом, на 24 % ретинолом, на 21 % ретинола пальмитатом и на 6 % ретинола олеатом. В различных состояниях эти соотношения могут меняться. Следовательно, при оральном введении витамина А, его присутствие в биологических жидкостях как в форме РП и ретинола, так и в форме других его эфиров естественно для организма человека и крупных животных. Таким образом, другие эфиры ретинола вместе с РП должны входить в понятие витамин А и не могут являться посторонними примесями. Это распространяется как на субстанцию РП, так и на его лекарственные формы. Вероятно, на этом основании зарубежные фармакопеи при анализе витамина А рекомендуют гидролизовать ретиноловые эфиры до свободного ретинола и определять его хроматографи-чески или спектрофотометрически. В отечественных нормативных документах на ретинолсодержащие лекарственные средства эфиры ретинола и гомологов пальмитиновой кислоты ошибочно попадают в группу посторонних примесей. С нашей точки зрения подход, описанный в зарубежных фармако-пеях, является более верным. В соответствии с определением, которое дано в фармакопее Великобритании, примесь (Impurity) - это то, что не соответствует химической сущности субстанции, а специфическая примесь (Specified Impurity) - это вещество, ограниченно связанное по специфическим критериям с субстанцией, которое может быть идентифицировано или не идентифицировано. В нашем случае другие эфиры ретинола, помимо РП, в соответствии с этим определением могут рассматриваться как специфические примеси,

поскольку они, как и РП, имеют в своей структуре кольцо (3-ионона и изопре-ноидную боковую цепь. Их можно относить к родственным соединениям и нормировать их содержание в субстанции РП и готовых лекарственных формах. В качестве метода анализа этих, родственных РП соединений можно предложить высокоэффективную жидкостную хроматографию с диодно-матричным детектированием. Это позволит в процессе анализа контролировать УФ спектры примесей, соотносить их со спектром РП и принимать решение об их родственности, позволит в ходе определения отличать родственные РП соединения от продуктов его деструкции.

Заключение. В соответствии с целью настоящей работы - оптимизацией (выбор наилучшего из множества возможных) методов контроля и совершенствованием качества препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь в представленном исследовании проанализированы методы определения РП в качестве субстанции, а также БОА и БОТ в качестве антиоксидан-тов. Показаны пути оптимизации методов контроля и совершенствования качества этого препарата. В частности, показано, что вещества, формирующие дополнительные пики на хроматограмме при анализе РП, в условиях обращенной хроматографии имеют идентичные РП спектры поглощения в УФ свете с максимумами при той же длине волны, содержат в своей структуре фрагмент ретинола и являются его эфирами с гомологами пальмитиновой кислоты. Получены доказательства, что использование колонки, заполненной сорбентом «Phenyl-Hexyl» (Phenomenex), в сравнении с колонками с сорбентом С18, при хроматографическом определении компонентов в препарате позволяет увеличить время удерживания БОА (его пик не накладывается на пики несорбируемых компонентов) и обеспечить симметричность пиков анти-оксидантов, что повышает точность и селективность их определения. Применение указанной колонки при анализе препарата также снижает времена удерживания РП и БОТ, что существенно сокращает время анализа препарата. Использование для растворения анализируемой пробы препарата смеси изо-пропилового и метилового спиртов, позволяет увеличить симметричность пиков антиоксидантов и тем самым повысить точность их определения. На основании полученных данных предложены и валидированы методики количественного определения РП и антиоксидантов в препарате, которые в дальнейшем могут быть внесены в нормативную документацию. Полученные в работе данные по оптимизации первичной упаковки препарата Ретинола

пальмитат, раствор для приёма внутрь введены в ФСП 42-0716-06. Препарат зарегистрирован в соответствии с Федеральным законом «О лекарственных средствах» (номер государственной регистрации Р N000550/01 от 12.11.2007), разрешён для медицинского применения и поступает на отечественный фармацевтический рынок. Результаты исследования включены в методические рекомендации по применению препарата в педиатрической практике (утверждены Департаментом здравоохранения Правительства Москвы 7 мая 2007 г.) и защищены патентом на полезную модель (Патент № 58916 с приоритетом от 21.06.2006).

ВЫВОДЫ

1. Использование колонки, заполненной сорбентом «Phenyl-Hexyl» (Phenomenex), в сравнении с колонками с сорбентом С18 при хроматографи-ческом определении компонентов в препарате:

- увеличивает время удерживания БОА (его пик не накладывается на пики несорбируемых компонентов) и повышает симметричность пиков антиок-сидантов, что повышает точность и селективность их определения;

- снижает время удерживания РП и БОТ, что увеличивает экспрессность анализа препарата.

2. Использование для растворения анализируемой пробы препарата смеси изопропилового и метилового спиртов позволяет получить более симметричные пики антиоксидантов и тем самым повысить точность их определения.

3. Вещества, формирующие дополнительные пики на хроматограмме при анализе РП представляют собой родственные ему соединения: они имеют идентичные РП спектры поглощения в УФ свете с максимумами при той же длине волны и содержат в своей структуре фрагмент ретинола

4. Валидация оптимизированных аналитических методик показала возможность их применения для достоверного количественного определения РП БОА и БОТ в препарате.

5. Для применения препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь в медицинской практике его целесообразно упаковывать во флакон с капельным дозатором.

6. Для обеспечения сохранности препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь на протяжении всего срока годности (2 года) его целесооб-

разно хранить под азотом.

7. Полученные данные использованы при разработке нормативной документации на препарат Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь (ФСП 42-0716-06, per. № Р N000550/01 от 12.11.2007 г), включены в методические рекомендации по его применению в медицинской практике (утверждены Департаментом здравоохранения Правительства Москвы 7 мая 2007 г) и в патент на полезную модель № 58916 с приоритетом от 21.06.2006 г.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ноздрин К Л. Дозатор для ретинола пальмитата в педиатрии // Тез. докл. XI Российский нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 19-23 апр. 2004. - С. 888.

2. Ноздрин К.В. Подбор дозатора для раствора ретинола пальмитата // Ремедиум. -2004,-№9.-С. 80-81.

3. Ноздрин К.В., Родионова Г.М., Гузев К.С. Сравнительна оценка качества флаконов ю темного стекла отечественного и зарубежного производства // Тез. докл. XII Российский нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 18-22 апр. 2005. - С. 780.

4. Ноздрин К.В., Родионова Г.М., Гузев К .С., Осипов A.C., Поляченко JI.H. Стабильность раствора ретинола пальмитата в масле при изменении условий его хранения // Тез. докл. XII Российский нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 18-22 апр. 2005. - С. 780.

5. Ноздрин К.В., Родионова Г.М., Гузев К.С., Осипов A.C., Поляченко J1.H. Способ повышения стабильности ретинола пальмитата в масляном растворе // В сб.: Ретиноиды. - М: Изд. ЗАО "Ретиноиды", 2005. - Вып.19. - С.23-28.

6. Ноздрин К.В. Способ повышения химической стабильности раствора ретинола пальмитата и усовершенствование его упаковки // Тез. работ участников Открытого российского конкурса на лучшую научную работу студентов 2005 г. по разделу «Медицинские науки», Школы молодых исследователей «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» и итоговой научной студенческой конференции «Татьянин день». - М.: Изд. дом «Русский врач», 2006.-С. 21-22.

7. Ноздрин К.В. К истории создания отечественного ретинола пальмитата // Мат. 5-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 5-7 июня 2006 г. - В сб.: Ретиноиды,-М.: Изд. ЗАО "Ретиноиды", 2006. - Вып.24. - С. 19-23.

8. Ноздрин К.В., Осипов A.C. Анализ бутилгидроксианизола и бутилгидрокситолуола в условиях изокрагической хроматографии // Мат. 6-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 28-29 марта 2007 г. - В сб.: Ретиноиды.- М.: Изд. ЗАО "Ретиноиды", 2007. -Вып. 25. - С.56-62.

9. Ноздрин КЗ., Нечаева Е.Б., Осипов A.C. Применение изократической хроматографии для анализа бутилоксианизола и бутилокситолуола // Тез. докл. XIV Российский нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 16-20 апр. 2007. - С. 858.

10. Ноздрин К JB., Великородный A.A., Осипов A.C., Родионова Г.М. Оптимизация условий хроматографирования бутилгидроксианизола и бутилгидрокситолуола при совместном присутствии // Фармация. - 2007. - № 5. - С. 7-10.

11. Ноздрин К.В., Альбанова В.И., Гузев К.С. «Ретиноиды»: наука и производство // Фармация. - 2007. - № 7. - С. 36-10.

12. Коколина В.Ф., Картелищев A.B., Ноздрин К.В. Системная ретинолотерапия в педиатрической практике // Тез. докл. 6-го Российского нац. конгр. «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - М., 23-25 окг. 2007. - С. 200.

13. Ноздрин К.В., Осипов A.C., Нечаева Е.Б. Применение колонок с новыми типами сорбентов для анализа бутилгидроксиголуола и бутилгидроксианизола методом ВЭЖХ // Тез. докл. XV Российский нац. конгр. «Человек и лекарство».-М., 14-18 апр. 2008. - С. 677-678.

14. Ноздрин К.В., Осипов A.C. Идентификация примесей в субстанции ретинола пальми-тата // Тез. докл. XV Российский нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 14-18 апр. 2008. -С. 678.

15. Ноздрин К.В., Осипов A.C., Родионова Г.М. Применение метода ВЭЖХ с использованием монолитной колонки в анализе антиоксидангов // Фармация. - 2008. - № 5. - С. 29-31.

16. Ноздрин В.И., Белоусова ТА., Лаврик О.И, Алексеев А.Г, Горелова М.В., Горпи-нич И.В., Крутых Е.Г., Ноздрин К.В., Сапожников Д.В., Жучков A.C. Морфогенез кожи и её производных в свете данных доказательной морфологии // Морфология. - 2008. - № 3. - С. 80.

ПАТЕНТ

Ноздрин В.И., Гузев. К.С., Ноздрин К.В., Альбанова В.И., Осгапчук Н.В., Лаврик О.И., Кинзирский A.C., Белоусова Т.А, Володин П.В., Володин К.В., Архапчева Л.Д. Упаковка Ретинола пальмитата// Патент на полезную модель№ 58916 приоритет от 21.06.2006 г.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Коколина В.Ф., Картелищев A.B., Альбанова В.И., Родионова Г.М., Ноздрин К.В. Технологии системной ретинолотерапии в педиатрической практике (методические рекомендации № 10, утверждены Департаментом здравоохранения Правительства Москвы 7 мая 2007 г.) // М.: Изд. ЗАО "Ретиноиды", 2007. - 44 с.

СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА

Фармакопейная статья предприятия ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие «Ретиноиды» ФСП 42-0716-06 Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь

Подписано в печать 13.10.2008 г. Формат 60x84/16. Гарнитуры Times New Roman. Бумага тип. Печать цифровая. Тираж 150 экз. Заказ № 190

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором в типографии ЗАО «Ретиноиды» 111123, Москва, ул. Плеханова, д. 2/46 стр. 5. Тел./факс: (495) 788-50-14.

1.1. Актуальность

Риск возникновения гиповитаминозов у современного человека по-прежнему высокий. Причиной этого является недостаточное поступление витаминов с пищей вследствие снижения её общего количества, употребление химически и термически обработанных, законсервированных продуктов, малое содержание в рационе свежих фруктов и овощей. В последние годы в российском обществе употребление витаминных препаратов в профилактических целях становится нормой жизни [86, 87, 91]. Это в полной мере относится и к витамину А. Несколько лет назад отечественным фармацевтическим предприятием ЗАО "Ретиноиды" разработан, зарегистрирован и в настоящее время выпускается препарат «Ретинола пальмитат, раствор для приема внутрь».

Для контроля качества препарата «Ретинола пальмитат, раствор для приема внутрь» согласно ФСП для определения субстанции РП, а также ан-тиоксидантов БОА и БОТ используются методы ВЭЖХ [97]. При серийном анализе образцов препарата по методикам, описанным в фармакопейной статье, возникает ряд затруднений. Анализ субстанции и антиоксидантов длителен, что не вполне рационально в условиях серийного производства. При хроматографировании антиоксидантов регистрируемые пики сигналов имеют неправильную форму, БОА довольно быстро элюируется с колонки, и его сигнал часто накладывается на пики несорбируемых компонентов и реакцию детектора на ввод пробы, что приводит к невысокой селективности и точности определения и осложняет валидацию аналитических методик. По этим основаниям, представляется целесообразным оптимизировать условия анализа субстанции и антиоксидантов в препарате «Ретинола пальмитат, раствор для приема внутрь».

При хроматографическом анализе субстанции РП в препарате «Ретинола пальмитат, раствор для приема внутрь» в условиях, описанных в ФСП

97], помимо пика РП на хроматограмме наблюдаются пики соединений, которые в ряде нормативных документов на другие ретинолсодержащие препараты рассматривают в качестве посторонних примесей. Структура этих соединений до сих пор не описана, и следовательно их идентификация может представлять интерес как с научной, так и с практической точек зрения.

Начиная с 2003 года, несмотря на снижение цены, спрос на препарат «Ретинола пальмитат, раствор для приема внутрь» заметно снизился. Одной из причин, по которой это произошло, стало появление на рынке конкурирующих препаратов отечественного и зарубежного производства. Другой — выход большого количества витаминсодержащих биологически активных добавок, которые заняли часть рынка, ранее принадлежащего фармацевтическим производителям [43, 46]. Одним из препаратов, конкурирующим с «Ретинола пальмитатом, раствором для приема внутрь» в первую очередь по цене является ретинола ацетат, однако он обладает более низкой биологической доступностью [4]. Другим препаратом является РП в желатиновых капсулах, основное преимущество которого - это удобство в применении. Однако препарат в такой лекарственной форме трудно дозировать индивидуально, с учетом возраста, массы тела, заболевания и пр. Этих недостатков нет у «Ретинола пальмитата, раствора для приема внутрь». По результатам проведенных предприятием-изготовителем маркетинговых исследований неудобство применения является одним из основных недостатков препарата. И если улучшить его потребительские свойства и заменить рекомендуемую для дозирования глазную пипетку на капельный дозатор, то препарат может сохранить свой сектор на фармацевтическом рынке.

РП неустойчив и разрушается от действия света, температуры и кислорода воздуха. Если первые два агрессивных фактора учтены и устранены (препарат не нагревают, хранят при температуре не выше 10 °С во флаконах из темного стекла), то кислород воздуха, находящийся во флаконе над раствором, может способствовать окислению субстанции. На наш взгляд, целесообразно заменить его газом, индифферентным по отношению к РП.

Все вышеперечисленное делает исследование, направленное на оптимизацию методов контроля и совершенствование качества препарата «Ретинола пальмитат, раствор для приема внутрь» актуальной научной и практической задачей.

1.2. Цель и задачи

Целью настоящей работы явилась оптимизация методов контроля и совершенствование качества препарата «Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь». Достижение цели осуществлялось путем решения следующих задач:

- для повышения селективности, точности и экспрессности определения оптимизировать методику хроматографического анализа БОА и БОТ в препарате;

- для увеличения экспрессности определения оптимизировать методику хроматографического анализа РП в препарате;

- установить структурные характеристики веществ, дополнительно выявляемых при хроматографическом анализе РП;

- провести валидацию методик определения РП и антиоксидантов в препарате;

- усовершенствовать первичную упаковку препарата для улучшения его потребительских свойств.

выводы

1. Использование колонки, заполненной сорбентом «Phenyl-Hexyl» (Phenomenex), в сравнении с колонками с сорбентом С18 при хроматографи-ческом определении компонентов в препарате:

- увеличивает время удерживания БОА (его пик не накладывается на пики несорбируемых компонентов) и повышает симметричность пиков антиоксидантов, что повышает точность и селективность их определения; снижает время удерживания РП и БОТ, что увеличивает экспресс-ность анализа препарата.

2. Использование для растворения анализируемой пробы препарата смеси изопропилового и метилового спиртов позволяет получить более симметричные пики антиоксидантов и тем самым повысить точность их определения.

3. Вещества, формирующие дополнительные пики на хроматограмме при анализе РП, представляют собой родственные ему соединения: они имеют идентичные РП спектры поглощения в УФ свете с максимумами при той же длине волны и содержат в своей структуре фрагмент ретинола.

4. Валидация оптимизированных аналитических методик показала возможность их применения для достоверного количественного определения РП, БОА и БОТ в препарате.

5. Для применения препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь в медицинской практике его целесообразно упаковывать во флакон с капельным дозатором.

6. Для обеспечения сохранности препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь на протяжении всего срока годности (2 года) его целесообразно хранить под азотом.

7. Полученные данные использованы при разработке нормативной документации на препарат Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь (ФСП 42-0716-06, per. № Р N000550/01 от 12.11.2007 г), включены в методические рекомендации по его применению в медицинской практике (утверждены Департаментом здравоохранения Правительства Москвы 7 мая 2007 г) и в патент на полезную модель № 58916 с приоритетом от 21.06.2006 г.

5.4. Заключение

В соответствии с целью настоящей работы - оптимизацией (выбор наилучшего из множества возможных) методов контроля и совершенствованием качества препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь в представленном исследовании проанализированы методы определения РП в качестве субстанции, а также БОА и БОТ в качестве антиоксидантов. Показаны пути оптимизации методов контроля и совершенствования качества этого препарата. В частности, показано, что вещества, формирующие дополнительные пики на хроматограмме при анализе РП, в условиях обращенной хроматографии имеют идентичные РП спектры поглощения в УФ свете с максимумами при той же длине волны, содержат в своей структуре фрагмент ретинола и являются его эфирами с гомологами пальмитиновой кислоты. Получены доказательства, что использование колонки, заполненной сорбентом «Phenyl-Hexyl» (Phenomenex), в сравнении с колонками с сорбентом С18, при хроматографическом определении компонентов в препарате позволяет увеличить время удерживания БОА (его пик не накладывается на пики несорби-руемых компонентов) и обеспечить симметричность пиков антиоксидантов, что повышает точность и селективность их определения. Применение указанной колонки при анализе препарата также снижает времена удерживания РП и БОТ, что существенно сокращает время анализа препарата. Использование для растворения анализируемой пробы препарата смеси изопропилово-го и метилового спиртов, позволяет увеличить симметричность пиков антиоксидантов и тем самым повысить точность их определения. На основании полученных данных предложены и валидированы методики количественного определения РП и антиоксидантов в препарате, которые в дальнейшем могут быть внесены в нормативную документацию. Полученные в работе данные по оптимизации первичной упаковки препарата Ретинола пальмитат, раствор для приёма внутрь введены в ФСП 42-0716-06. Препарат зарегистрирован в соответствии с Федеральным законом «О лекарственных средствах» (номер государственной регистрации Р N000550/01 от 12.11.2007), разрешён для медицинского применения и поступает на отечественный фармацевтический рынок. Результаты исследования включены в методические рекомендации по применению препарата в педиатрической практике (утверждены Департаментом здравоохранения Правительства Москвы 7 мая 2007 г.) и защищены патентом на полезную модель (Патент № 58916 с приоритетом от 21.06.2006).