Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Обоснование химического синтеза биологически активных веществ с векторным противоопухолевым и противовирусным действием

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ УКРАЇНСЬКА ФАРМАЦЕВТИЧНА АКАДЕМІЯ ^ ї" 0 0/1 На правах рукопису

МАРТИНОВ Артур Вікторович

ОБГРУНТУВАННЯ ХІМІЧНОГО СИНТЕЗУ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН З ВЕКТОРНОЮ ПРОТИПУХЛИННОЮ ТА ПРОТИВІРУСНОЮ АКТИВНІСТЮ

15.00.01-технологія ліків

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

Харків-1997

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі органічної хімії Української фармацевтичної академії та в лабораторії вірусології Харківського науково-дослідного інституту’ мікробіології та імунології ім. І.І.Мечнікова.

Наукові керівники: доктор хімічних та фармацевтичних наук, професор

ЧЕРШІХ Валентин Петрович; доктор медичних наук, професор ДИКИЙ Ігор Леонідович;

Офіційні доктор фармацевтичних наук, професор

опоиенти: ПЕРЦЕВ Іван Матвійович;

доктор фармацевтичних наук, професор КОНЄВ Федір Андрійович

Провідна

організація: ЛЬВІВСЬКИЙ МЄДИЧНИЙ університет

Захист відбудеться “ 1997 р. о

Іб 50

год. на

засіданні спеціалізованої Вченої” ради Д 02.16.02 при

'Українській фармацетнчніи академії за адресою: 310002, м. Харків,

пул. Пушкіиська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Української фармацевтичної академії (310168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розіслано “ 2У" 1997 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради, доктор / {■ / Д. І. Дмнтріспськиіі

фармацевтичних наук, про:]>ссор

З •

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми і ступінь досліджсності тематики.

Однією з актуальних задач фармацевтичної науки с пошук ювих високоефективних лікарських засобів з протипухлинною та іротивірусною властивостями .

Відсутність якісних ,дешевих та високоефективних ютипухлилних сполук с основною причиною швидкої загибелі одей, хворих на онкологічні захворювання , особливо в останні >ки після Чорнобиля. Ракові захворювання по смертності іаходяться на другому місті після серцево - судинних захворювань.

Розробка принципово нової молекулярно-біологічної іанспозоштої теорії виникнення злоякісних пухлин па базі світових юягнень біохімії та молекулярної біології призвела до необхідності цповідно скорегувати дослідження довколо нових напрямків кування цих захворювань.

Серед нових напрямків пошуку протипухлинних сполук »кліттю виділити , по-перше, аугологічну векі орну терапію рака використанням рослинних галактозоселективних лектинів , які с іібіторами синтезу білку в клітині, та по-друге, і мі дів та амідів онітової і малеїнової кислот, сполук які блокують функції вже осинтезованих білків .

Для цілеспрямованого постачання діючих сполук до 'хлини є перспективним використання аутологічних антитіл. Це Зумовлено присутністю в крові протипухлинних антитіл фактично всіх онкологічних хворих. Для синтетичних засобів :рспективним с використання структурних аналогів глюкози -юкозаміну , глюкозидів, та ін. Цей факт можна обгрунтувати двпщеним гліколізом більшості пухлин, та відповідно збільшеним

захватом пухлинними клітинами глюкози. Завдяки цьому ефекту ракову пухлину називають « ловушкою для глюкози».

Мета та чадячі дослідження. Мета роботи - створення , відбір, розробка технологій та аналізу нових протипухлинних і противірусних засобів синтетичного і природного характеру, які мають векторні властивості, тобто вибірково накопичуються в злоякісній пухлині чи клітинах, інфікованих вірусами.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі

-проаналізувати останні досягнення в розробці векторних протипухлинних та противірусних засобів;

-розробити методи одержання векторних засобів, які с інгібіторами синтезу та функцій білку : імідів аконітової кислоти , глюкозаммонійних солей аконітариламідів , лектину омели білої МЬ-1 в ліпосомальному комплексі;

-підтвердити структуру синтезованих сполук , вивчити їх фізико -хімічні властивості , використовуючи методи УФ-,14- та 11МР-спектроскопії, елементного аналізу та тонкошарової хроматографії;

-провести біологічний скрпиіиг відібраних та досліджених засобів;

-розробити методи якісного та кількісного аналізу найбільш активних сполук (препарату АЛЬФАВІР) -та кон’югатів (препарату АНТИКАН) ;

-розробити технологію, методи аналізу субстанції та лікарської форми препаратів АНТИКАН та АЛЬФАВІР;

-розробити НТД на препарати АНТИКАН та АЛЬФАВІР для подання документів в Фармакологічний комітет з метою отримання дозволу на клінічні випробування.

Паукова новизна та теоретичне значення дослідження.

Па базі останніх біохімічних досліджень властивостей пухлин та вірусів запропоновані нові напрямки лікування злоякісних пухлин, розроблено нову групу протипухлинних сполук - похідних аконітової кислоти і глюкозаміну , а також ліпосомальної композиції з векторною дією , розроблено нову групу синтетичних противірусних сполук, які не мають аналогів по механізму дії. Розроблено технологію та методи аналізу для субстанцій та лікарських форм препаратів АЛЬФА ВІР та АІ1ТИКАІІ

Практична значущість і впровадження результатів дослідження. Розроблені методи синтезу амідів та імідів аконітової кислоти та їх солей з глюкозаміном. Запропонована удосконалена технологія ліносомального векторного засобу для терапії раку з використанням лектипу МІ-1 омели білої. Розроблена дешевша та удосконалена технологія вилучення лектину МЬ-І з сировини з використанням програмованого силікагелю, яка може бути використана у промисловості. Розроблені методи якісного та кількісного аналізу, та технологія найбільш активних засобів: н-карбетоксі -М-аріл-а ко н іті міду , ()-Г)-глюкозамоніиної солі а-бромізовалеріанової кислоти (препарат АЛЬФАВІР) , імуносомального протипухлинного засобу на основі лектину МЬ-І (препарат АІІТИКАІІ). Розроблено ЇТГД іга запропоновані засоби. Один з імідів аконітової кислоти, 4-метил - 7 - N - кумариніл-транс-аконітімід використовується в якості флуоресцентного зонду в діагностиці вірусних захворювань людей та тварин.

Зв’язок задач дослідження з проблемним планом Фармацевтичних наук. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Української фармацевтичної академії по проблемі «Фармація» (№ держ. реєстрації 01860042145).

Апробація роботи. Фрагменти дисертаційної роботи доповідались на науково-практичній конференції “Досягнення сучасної фармації - і; медичну практику” (Харків , 1996).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5

робіт.

Обсяг та структура дисертації . Дисертація складається з вступу, огляду літератури (глави 1,2) , експериментальної частиш (гдави]-8) , загальних висновків, списку літератури та додатку.

Дисертація викладена на ЩО сторінках машинописного тексту, ілюстрована 2. Ц таблицею та і § рисунками. Список літературі включає ^(»літературних джерел , з яких ^іноземні.

Методологія , методи та об’єкти досліджень Для

розробки технології вилучення та аналізу лектинів були використай : метод гель-хроматографічного розділення білків з використання?» сефарози , програмованого силікагелю , тіреоглобуліну використаний спектрофотометричний метод їх визначення. Для якісного визначення наявності активних лектинів у екстракті омелі використано метод аглютинації еритроцитів. ГІри визначенії розміру часток ліиосом використовувалися методи електрофорезу } буфері та електронно-мікроскопічні дослідження.

Стабільність ліиосом досліджувалась по відсотку вивільнення мстипу. Для дослідження структури імідів та амідів аконітової ¡слоти використані ГІМР- , (Ч- , УФ- тії елементний методи тлілу. Ьіологічна дія засобів досліджувалась па культурах клітин с-Ьа, ТгКІ’С та на моделях тварин з перевивною асцитною цепокарциномою Ерліха і бензидиновую саркомою шкіри, б’єктамп досліджень були головний лектин омели білої, ліиосоми фосфотиднлхоліну , іміди та аміди аконітової кислоти , похідні покозамІпу.

Особистий внесок дисертанта .

> розроблена технологія вилучення лектинів омели з сировини та методи аналізу ;

» проведене розділення білків омели білої та дослідження їч імупомодулюючих та нртщпппуючих властивостей,

» розроблена методика виготовлення векторних ліпосом з лектиками та хптозаиом;

» синтезовано ряд нових сполук з протипухлинною та противірусною дією , проведено їх аналіз;

- вивчені біологічні характеристики вилучених та синтезованих засобів;

» розроблено НТД на субстанцію та лікарську (¡юрму сшітезонгших засобів - препаратів АЛЬФАШР та АНТИКАМ.

На захист шшосятьси результати досліджений по :

» вивченню фізико-хімічних та технологічних властивостей ліпосомальпих векторних засобів та синтезованих сполук;

• порівняльному аналізу методів синтезу похідних аконітової кислоти та глюкозаміну;

• винчению біофармацевтичних характеристик розроблених засобів;

• порівняльному аналізу окремих білків омели білої;

• розробці технології, складу та аналізу лікарської форми ліпосомального засобу АІІТИКАН і субстанції та лікарської форми противірусного засобу АЛЬФАВІР (сх-бромізовалеріанату- (ї-О-глюкозаміну)

• розробці необхідної НТД на препарати АНТИКАН та АЛЬФАВІР

ЗМІСТ РОБОТИ

1.Векторні протипухлинні та противірусні засоби як об’екти

досліджень

У 1979 році Луцик та ГІанасюк дослідили протипухлинну дію ML-1 на різних моделях пухлин. Вони показали, що тільки один єдиний лектин серед відомих на той час галактозоспецпфічних лектинів - ML-1 гальмує рісг ракових пухлин на 85-95 % in vivo завдяки гальмуванню синтезу білку .

.Малеініміди та їх структурні аналоги - аконітіміди теж, як і лектини омели, мають протипухлинні властивості, але завдяки гальмуванню функцій вже синтезованих білків. Це призводить до апоптозу (програмованої клітинної загибелі ) ракових клітин. Але похідні аконітової кислоти як біологічно, так і хімічно фактично не досліджувалися, особливо аконітіміди.

Аконітіміди є перспективними синтетичними інгібіторами функцій білків завдяки реакції між -SH групами білків та подвійним

СООН

Аконітіміди Малеініміди

зв’язком іміду, аконітіміди також мають пілікну карбоксильну групу для пристосування векторної груші- глюкозаміну. Серед досліджених похідних аконітової кислоти можливо виділити синтезовані раніше піразоліии та піридазини. Аконітіміди синтезовано при цьому не було. Біологічні властивості синтезованих сполук раніше не досліджувались.

2. Розробка технології вилучення М L (лектинів омели білої)

із сировини

Для розробки векторного засобу на основі лектину , необхідно було розробити промислово доступний метод вилучення лектину, його аналізу, метод додання до ліпосом (це необхідно для захисту лектинів від взаємодії з елементами крові), оптимальний мегод зберігання та використання. Перший eran вилучення представляв собою виготовлення первинного екстракту. При ці.ому лсктин не повинен був втратити аглюпшуючої здатності до еритроцитів та преципітуючої здатності до імуноглобулінів. В результаті дослідження було встановлено, що на активність лектинів важливу дію впливає термін та температура екстракції

сировини. Короткочасна екстракція водою (1-5 хв.) порошкованої сировини як на холоді, так і при температурі водяної бані не призводить до денатурації лектиніи. Хоч довготривала екстракція (до 1,5 годин) при 100° С призводить до втрати екстрактом властивості до аглютінації крові. Концентрація спирту більше 65% у розчині призводить до незворотньої денатурації лектинів (НДЛ), а мінімальна концентрація спирту при якій осідають лектипи є 42%.

Також проведене очищення сухої сировини від ліпофільних фракцій хлороформом, та встановлена аглютипуюча дія екстракту після очищення. Встановлено, що холодна екстракція

0,9% розчином натрію хлориду очищеної сировини призводить де екстракту, який не втрачає аглютинуючої дії на ерітроцити. Але подальше осадження спиртом білково-полісахаридної фракції (БИК) вже призводить до НДЛ при 40% спирту в розчині замість 65% при неочищеному екстракті, а мінімальна концентрація спирту , яка осаджує активні лектипи є 20% .

3. Дослідження окремих білків омели

Для встановлення тих білків , які мають імуиомодулююч} властивість та властивість до преципітації імуноглобулінів, буле проведене диференційне осадження білкових фракція сульфатом аммопія, та подальше розділення білків в кожної фракції за допомогою хроматографічної гель - фільтрації у сефадексі. Прояв}, білків проводили за допомогою відбитка на бумагі, який обробляли бромфеноловим блакитним . Забарвленні пятна співставляли • відповідними місцями у шару геля та екстрагували. Встановлювали молекулярну масу (відносно гемоглобіну) білків, ї> бласттрансформуючу дію на Т - лімфоцити та преципітуючу дію нг І8М.

Було показано , що більшість білків омели мають властивості до іктивації бласттрансформації лімфоцитів та до преципітації І§М Три цьому лектипи МИ,2,3 ие мали самих великих показників .

4. Розробка технології розділення сумарної фракції лектинів

омели білої

На основі експериментально- теоретичних досліджень МЬ-1 іами була створена нова технологія вилучення лектинів з шкористанням програмовапог'о силікагелю, який був сформований і присутності галактози.(силікагель має особливість сорбувати той субстрат чи його антипод із розчину, в присутності якого він був ¡формований ) • Для порівняння методів вилучення використані: ель-хроматографія з використанням ^Сї- сефарози (1 метод), виділення суміші лектинів з використанням тіреоглобуліна ( 2 летод), виділення лектинів на галактозоселективпому силікагелі (З летод). Спектрофотометричні дослідження проводили на спектрофотометрі вресотсі М40 при 280 нм, Якісний аналіз проводився з використанням гель-елеісі рофорезу та реакції аглютинації зритроцітів. Як виходить з мал. 1, очищення екстрактів від ііпофільних фракцій сприяє підвищенню виходу лектинів . [анкраще вилучення іде з використанням тіреоглобуліна. використання силікагелю теж селективно вилучає лектини, так як у іромивнпх водах немає білку (ІМ)), а після додання розчину 'алактози, білок з’являється. При цьому цей білок гарно аглютинує ¡рітроцити, та концентрація нього у розчині більше ніж при шкористаппі методів І та 2

100 90 80 70 G0 -50 -40 ЗО 20 10 O

■ЗЩІ

iE@

Í4r®f

SÍ33¿Sj

□ Еестракт N° 1 O Екстракт N9 9

Методи вилучення

Мал. 1. Порівняльна діаграма методів вилучення лсктинін омели білої.

1

з

5. Розробка аналізу ML-1

Специфічна якісна peaкція аглютинації з еритроцитами , Гірі розробці реакції аглютинації були апробовані 3 методи j мікромодифікації: реакція гемаглютинації з оцінкою результаті! після центрифугування суміші (метод І); реакція гемагглютинації і.: самостійним осіданням еритроцитів (2 метод) та реакції гемаглютинації з використанням гепаринизованої цільної крові (1 метод). ГІри порівнянні методів було встановлено, що третій метод хоч і с мепьш чуткішим, ніж 1 та 2, він може бути використованиг

ік більш дешевший ніж попередні, бо НІН не потребує центрифуги та зчищених еритроцитів.

О Екстракти □ Аглютинація

1 2 З 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Номери есктрактів

Мал. 2. - Залежність аглютинації екстрактів від

концентрації спирту

Спектрофотометричне дослідження суми________лектинів (кількісний

і наліз) Відсутність якісних фізико-хімічпих методів аналізу лектинів шели білої , незважаючи , по даним літератури , на високу тротипухлиниу дію лектину МИ, привабила нас розробити шіькісний аналіз суми лектинів омели з використанням

іайдоступнішого методу- спектрофотометрії (Мал. 3.). Як метод юрівняння нами використано гравіметричний метод аналізу. Також зстановлена залежність між концентрацією лектинів та деревом-іласником омели. При статистичному порівнянні методів з зикористанням критерію Фішера було встановлено, що

спектрофотометричний метод по відтворюванності краще

равіметричного, та не має систематичних помилок.

Далі були проведені дослідження з різною сировиною ,зібраною я різних дерев, та у різний час. Було встановлено , що найбільша кількість дентинів знаходиться у свіжій сировині, яка була зібрана 5 верби взимку.

6. Розробка технологи отримання цитотоксичних ліпосом з ноліклональннми аутологічнимн антнтелами сироватки крові хворих тварин, та з МЬ-1

Дія встановлення оптимальної нетоксичної концентраці метало комплексів як стабілізаторів та консервантів ліпосом, памі була досліджена залежність між концентрацією доданого де ліпосомальної мембрани металокомплекса, відсотком введеного де ліпосом МЬ1, середніми розмірами створених ліпосом, а також ї: стабільністю протягом місяця при кімнатній температурі. Я\ еталонний препарат використовувався Ліпін (фосфатіділхолінов ліофілізоввані ліпосоми) . Агрегаційна стійкість ліпосом виміряласі різницею у розмірах при їх створенні та після. Діфільнимі комплексами трьохвалеїшюго заліза є синтетичні аналоги і омі пі і; Наміром цього дослідження було розробити найменш токсичниі металокомплекс, який може стабілізувати ліпосоми бе збільшення їх агрегації та окислення. Гемін видобувалі синтетичним шляхом з використанням хлорофілії Мультівезікулярні ліпосоми утворювали широко відомим методо! зворотніх фаз. Перед утворенням металокомплекс змішували 10% спиртовим розчином ЯЇЧНОІ’О лецитину у відповідни дозах,суміш упарювали під вакумом у роторному випарювані тип Яосіаіеаі до створення сухої плівки на стінках колби. Подалі сух плівку фосфоліпідів розчиняли у діетиловому зфірі, до створеної’

озчину додавали ектеріцидний розчин MLI . Суміш обробляли льтразвуком з використанням дезінтегратора УЗДН 2Т чи

50000 42000 34000 24000

СМ'1

“ - - СУХИЙ ЄКСТРАК ---------ML-1,2,3

Мал. 3. -УФ- Спектр чистого лектниу ML-1 та сухого кстракту омели білої.

взбивали на ш/сокошішдісіспій мішалці . Створювалася палесцююча емульсія, із якої подалі з використанням роторного ипарювача відділяли органічний розчинник. Процес закінчувався творенням ліиосом, до яких додавали зктеріцид . Відсоток не клточеного до ліиосом МІ. І визначали спектрофотометрично після ропускання ліиосом через хроматографічну колонку з гранулами :МЦ. Розмір ліпосомальнпх часток визначали за допомогою пектронного мікроскопу та електрофорезом . Розміри фіксували ри рази-одразу після виготовлення, через 10 та через 20 днів, оксичність ліиосом вивчали же прес- методом по Пастушенко. В езультаті досліджень (Мал. 4.) було встановлено , що найбільш

оптимальним , є стабілізація ліпосом геміном в концентрації 0,1 г/ сухого лецитину.

50

і 45

и

.і 40 « 35

= ЗО 5 25

'¡а 20

; « О

5 ю

о

0.01 0.03 0.05 0.07 0.09 0.11 0.13 0.15 0.17

Концентрація мєталопорфірину г/г фосфоліпіду

20 день

іМал. 4. Вплив концентрації порфірину на вивільненії лектинів з ліпосом.

Збільшення концентрації геміну у розчині призводить до йог агрегації у гемінові конгламерати, а зменьшешія до иадінн стійкості. При цьому агрегація не призводить по посиленії вивільнення МІЛ із ліпосом, хоч розміри конгломерат перебільшують 1-2 мкм. Інші метали та їх комплекси практично н мали дії на стабильність ліпосом . Далі були досліджені синтетичі векторні засоби з властивостями до гальмування синтезу білку іміди аконітової кислоти та її аміди.

7.Синтеі та фізико-хімічне дослідження імідів аконітової

КИСЛОТИ

ІМ-арил- транс-аконітіміди синтезували методами ¡давлення аконітової кислоти з аріламінамн, методом циклізації М-рил- транс-аконітамідів у середовищі льодяної оцтової кислоти, іиклізацією ^аріл-транс-аконітамідів в середовищі льодяної АсОїі присутності оцтового ангидриду, та методом плавлення

Г?- п-И (а),м СООІІ (б), п ООСЖІ (з), п -Ц0,,Г\ІН, (г), п ОН (д),п-Оі (є), о-ОН (ж), о-ІЗі (^), п-Мо (и)

іконітового анптдрпду з аридаміном .

Воан дають червоно-оранжеве забарвлення з лугом, яке часом самостійно зникає . Потенціометричне титрування N-феніл-траис-аконітіміду показало , що зникнення забарвлення доповнюється нейтралізацією вільної карбоксильної груші іміду, г забарвлення виникає при додаванні надлишкової краплі луїу. Hi відміну від дикарбонових кислот аміди аконітової кислоті циклізувалися на холоду у середовищі льодяної оцтової кислоти н; протязі 5-7. При нагріванні створеної суміші спостерігався повниі гідроліз аміду до ариламіну (краплі аниліну на донці пробірки) ч< аконітової кислоти. Структури синтезованих імідів иідтверджен ПМР-, 14- спектрами та елементним аналізом, особливісті під тверджена за допомогою тонкошарової хроматографії.

Синтез глюкозаммонійних солей N-аріл-транс-аконітамідіі проводили з глюкозаміну та N-аріл-транс-аконітамідів в метанолі Аналогічно проводили синтез глюкозамонійної солі а бромізовалеріанової кислоти (АЛЬФАВЇР). Структури с полу підтверджено ЇЧ- спектроскопічним та елементним аналізом. Даі були досліджені лікарські форми найбільш активних сполук ,та ї протипухлинна і противірусна дії.

8. Розробка лікарських форм АНТИКАНу та АЛЬФАВІРу

Так як препарат АНТИКАН містить ліпосоми та білки , ві; повинен був використовуватися тільки парентерально, бо білки н можуть всмоктуватися в незмінному вигляді при пероральном використанні. В зв’язку з нестабільністю ліпосом запропопопап екстемпоральне виготовлення векторного коп’югаїу ліпосомального препарату ЛПШІ, розчину гематопорфірину розчину ML-1 та сироватки крові. Фармакопейна стаття н ліофілізований в ампулах ML-1 розроблена. При дослідженні різни

лікарських форм препарату АЛЬФАВІР було встановлено, що його водний розчин с нестабільним до стерилізації та світла. Тому було .запропоновано використання пероральних сухих лікарських форм -таблеток та порошку. При спробі утворення таблеток, субстанція АЛЬФА ВІРу виділяла вологу, злипалася з пуансонами, тому було запропоновано використовувати порошок, як найбільш стабільну лікарську форму. На порошок та субстанцію АЛЬФАВІРу розроблено фармакопейні етапі.

9. Біологічний скрішінг розроблених засобів на противірусну та протипухлинну дію

Визначення цитотокснчності еннтезовашшх

'люкозаммонійних солей N-арил-аконітамідів проводили в культурі :літин HeLa-2. Більшість досліджених сполук були неактивні в іейтральному середовищі при відповідній дозі. В кислому :ередовищі гліокозаммонійні солі N-феніл -транс - аконітамідів іризводили до 100 % дегенерації пухлинних клітин. Для

іідтвердженпя протипухлинної дії in vivo сполуки були досліджені іа моделях спонтанної бензидинової шкіряної саркоми та іеревшшої асцітної аденокарциноми Крліха.

Було встановлено, що розмір пухлини корелює з :онцентрацісю введеної глюкозаммоніпної солі п-карбегоксі- N-[юнілтрапсаконітаміду . Інші сполуки ие призводили до зникнення ібо регресії пухлини. Подібні результати були показані також па доделі асцитної аденокарциноми Ерліха (АКЄ), Глюкозаммонійна ;оль п-карбетоксі- N-фенілтрансаконітаміду більше чим у 10-15 шів збільшувала термін життя тварин призводячи до повної )еіресії пухлин при використанні сполуки в дозі 10 мг/кг маси вариии. При скринінгу синтезованих імідіи було знайдено сполуки,

які в дуже низькій концентрації мають противірусну активність . І п-карбстоксіфенілаконітімід (А1) та глюкозаммонійна сіль < бромізовалеріанової кислоти (АЛЬФАВГР). Визначення токсичнос АІ та АЛЬФАВІРу проводили у культурі клітин трахеї ембріона ВР (г1’г) та НеЬа-2. Дослідження противірусної активності до вірус везикулярного стоматиту (УУ8) та вірусу простого герпесу (Н8У-проводилн на культурах клітин Тг та Нер-2 в умов одноциклового досліду. Досліджені сполуки мали низь токсичність (МГІД 25 мг/мл для АІ та 50 мг/мл для АЛЬФАВІРу) значну противірусну дію (в концентрації 12,5 мг/мл для АІ АЛЬФАВІРу) щодо УУБ та НБУ-І. Ці сполуки перевищува. препарати порівняння на по активності , а препарат АЛЬФАВГР б в 5000 разів менш токсичним , ніж порівняльна сполука глюкозамін (МГТД- 0,01 мг/мл для глюкозаміну у вигляді аміну) .

Дослідження протипухлинної властивості ліпосомальн композицій проводили на моделях раку Ерліха. Як зв’язуючі аген використовували гемін. Як векторну групу використовува. аутоантитіла відповідної миші, потім вводили кон’югат. Як токси використовували ряд лектннів -омели (МЫ , часнику (АЬ), ома високого (ІЬ) та хитозан. Лектиии отримували з використанні лактозо- та галактозо- селективних сілікагелів, створених показано для МЫ. ГІри дослідженні було встановлено, що сполу порівняння - хитозан в чистому вигляді був дуже токсичним, хо: вигляді ліпосомального комплексу в 95% випадків призводив , повної регресії пухлин у мишей ( в концентрації 0,2 мг/кг ма тварини , тобто в концентрації 1 мл 0,3 % ). Лектини в чистої вигляді трохи збільшували тривалість життя тварин. Найбілі активним, таким чином, був ліпосомальний векгор на оснс хнтозану. Миші , хворі на аденокарциному Ерліха після лікуван

позану. Миші , хворі на аденокарциному Іірліха після лікування гозановим ліпосомальним кон’югатом жили відповідно 32 та 38 6, що в 13 разів довше контролю. При патоморфологічному »слідженні ознак пухлин знайдено не було.

ВИСНОВКИ

1. Обгрунтовано перспективність пошуку протипухлинних та противірусних засобів, що маюгь векторні властивості (цілеспрямовано накопичуються в пухлині, чи клітині, інфікованої вірусом).

2. Синтезовано , охарактеризовано та вивчено протипухлинну та противірусну активність аконітімідів та солей глюкозаміну з N-арил-транс-аконітамідами .

3. Запропоновано глюкозаммонійні солі іі-карбетоксі-N-феніл -

транс-аконітаміду , н-мегіл -N-феніл -транс-аконітаміду та м-метіл -N-феніл -транс-аконітаміду як протипухлинних засобів. Низька токсичність , виражена тропність та вибіркова аіспівність в концентрації 10 мг/кг маси щодо клітин пухлин підкреслюють перспективність конструювання на їх основі ефективних та малотоксичних протипухлинних препаратів з новим механізмом дії. .

4. Сконструйований хітозаповпн ліпосомальннй коїмо гаг з протипухлинними IgG хворих тварин призводив до регресії пухлин (карциноми Ерліха та бензідініндукованої саркоми шкіри) у 90% лікованих тварин та збільшував тривалість їх життя у 13 разів (39,3 проти 3 діб ). Аналогічно сконструйований кон’югат з ML-1 (омели білої) не призводив

до повної регресії пухлин, але збільшував тривалість житія тварин в 6 разів. Інкапсульовані в ліпосомах сполуки вводили із концентрації 0,2 мг/кг , чи 1 мл 0,3 % розчину на мишу.

5. Показана висока противірусна дія та низька токсичність п-карбетоксі-К-феніл-фанс-аконітіміду (МІІД-- 25 мг/мл та МАД -- 12,5 мг/мл) та глюгсозоаммоніґшої солі а-бромізовалеріанової КИСЛОТІ! (МПД 50 мг/мл та МЛД' 12,5 мг/мл).

6. Розроблені НТД на субстанцію та лікарську форму препаратів ЛЛЬФАШІ’ (глюкозоаммоніішої солі а-бромізовалеріанової кислоти ) та АНТИКАІ1 (ліпосоми з МЬ-І).

Основний зміст дисертації опубліковано в наступних роботах:

1. Залежність аглютинуючої здатності лектинів Омели білої від технології отримання екстракту /В.П Чорних., ІЇ.М Ковальов., А.В Мартинов., Т.А Краснікова// Вісник фармації,- 1996.-№ 1-2, С.23-25.

2. ІПемчук Л.А., Петюнин П.А., Мартынов А.ІЗ. Конденсация аренсульфонамидов с етиловым эфиром Ы-мезитилоксаминовой кислоты. //Жури, органич. химии. - 1996.-Т 32.-Вып. 10.-С.1560 -1562.

3. Спектрофотометричне дослідження суми лектинів омели білої / В.П., Черних В.Н Ковальов., А.В.,Мартинов Т.А Краснікова., Н.І Філімонова.; Укр. Фармац. академія,- Харків, 1996.-8с,-Бібліогр.: 4 назв.-Укр,- Ден. У ГПТБ України.09.01.97 № 33-Ук97

К вопросу о трансдермалыгых жидкостях для локальной терапии злокачественных новообразований / Дикий И.Л., Ковалёв П.П., Мартынов A.B. , Красникова ТА., Филимонова НИ.; Укр. Фармац. академия,- Харьков, 1996.-7 с.-Ьиблиогр.: 6 назв.-Рус,- Деп. В ГНТБ Украины 09 01.97 № 32~Ук97 Мартинов А.В.,Черних В.II., Шемчук J1.A. Синтез та дослідження властивостей різних похідних аконітової кислоти.// Тез. доп.наук,- нракт. конф., присвяч 75-річчю УкрФа. -Харків, 1996.-С.. 52-54.

Мартынов A.B. Обоснование химического синтеза биологически ивиых соединений с векторными противоопухолевой и угивовирусной активностью.

’уколись диссертации на соискание ученой степени кандидата шацевтических наук по специальности 15.00.01,- технология арств, Украинская фармацевтическая академия, Харьков, 1997. защищается 5 научных работ , которые содержат результаты работки новых средств с использованием векторных групп для сиия раковых опухолей и вирусных инфекции.

Осуществлен синтез глюкозаммонийных солей N-арил -тралс-питамндов и глюкозаммопийной соли а-бромизовалернаиовой лоты (АЛЬФАВИР) ,а также синтез N-арил -транс-нитимидов, обладающих противовирусными свойствами in vitro i vivo. Получен векторный конъюгат токсического растительного тина омелы белой в липосомах с аутоантителами “раковых” потных (АНТИКАН), обладающий в низких концентрациях (7 кг веса животного) . Разработаны методы анализа лектипов :лы белой, а также технология его получения, разработаны НТД препараты АНТИКАМ и АЛЬФАВИР.

Martinov A.V. A substantiation of chemical synthesis biologically active substances with vectoring anticancer and antiviral activity.

The manuscript of the dissertation of a scientific degree by doctor of philosophy of pharmacy on a speciality 15.00.01,- technology of medicines, Ukrainian pharmaceutical academy, Kharkov, 1997.

Is protected 5 scientific works, which contain results of development of new means with use vectoring groups for cancer and viral infections treatment.

The glucosaminic salts of N-aril -trans-aconitimidic and bromisova-leric acid (ALFAV1RE), and also N-aril-trans-aconitiniides synthesis, having antiviral properties in vitro and in vivo is carried out. Ts received vectoring liposomal conjugates of mistletoe lectin with autoantibodies of "canceling" animals (ANTICANE). It have anticancer activity in concentration 7 mg/kg . Methods of mistletoe lectin analysis are developed. Technology and technical documentation on ANTICANE and ALT''AVIRE drugs are developed.

Ключові слова : N-аріл-транс-аконітаміди та N-аріл-траис-

аконітіміди, лектин омели білої ML-1, ліносоми, протиракові та противірусні засоби, гематопорфірин.

С