Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-фармацевтическое изучение и стандартизация лекарственных форм новых противоопухолевых комплексных соединений платины, меди, кобальта ("Циклоплатам", "Сетремед", "Терафтал")

РГ5 ОД

к фев гт

На правах рукописи

ИГНАТЬЕВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НОВЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИИ ПЛАТИНЫ, МЕДИ, КОБАЛЬТА (ЦИКЛОПЛЛТЛМ, СЕТРЕМЕД, ТЕРАФТЛЛ)

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва -2001

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина Российской Академии медицинских наук.

доктор фармацевтических наук, профессор H.H. Дементьева доктор фармацевтических наук, профессор В.И. Прокофьева

Ведущее учреждение: Институт государственного контроля лекарственных средств Научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств Минздрава России, г.Москва.

Защита состоится 14 января 2002 г. в 14 час на заседании Диссертационного Совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: г. Москва, ул. Грина,7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР РАСХН по / адресу: г. Москва, ул. Грина,7. I

Автореферат разослан «_» _2001 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 006.070.01,

кандидат сельскохозяйственных наук М.В. Кирцова

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук,

профессор, академик РАМН А.П. Арзамасцев

кандидат фармацевтических наук H.A. Оборотова

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Эффективность борьбы с раковыми заболеваниями по многом зависит от возможностей лекарственной терапии онкологических больных. Наряду с хирургическими и лучевыми методами лечения, химиотерапия злокачественных опухолей получила широкое распространение не только как составная часть комплексного лечения больных, но при ряде локализаций опухолевого процесса она является определяющей. Одним из важнейших достижений химиотерапии опухолей явилось обнаружение высокой противоопухолевой активности у некоторых комплексных соединений переходных металлов, и в первую очередь, платины [Rosenberg В. et al., 1969]. Среди большого числа комплексных соединений металлов, исследованных в РОНЦ РЛМН и показавших противоопухолевую активность, для углубленного изучения были отобраны комплексные соединения платины, меди и кобальта: S(-)-малатоаммин (цнклопентнламин) платииа(И) - циклоплатам; L-серннато-L-треошшат меди(П) - сетремед; натриевая соль окта-4,5-карбоксифтало-цианина кобальта(Н) - терафтал.

Циклоплатам в эксперименте значительно превосходит карбоилатнн то эффективности и широте спектра действия . Важными положительными свойствами являтся его эффективность в отношении опухолей с 1риобрстенной устойчивостью к цисплатииу, а также отсутствие ¡ефротоксичностн. При клиническом изучении циклоплатам показал 1Ысокую противоопухолевую активность при раке яичников и шейки 13ТКИ, раке предстательной железы, мезотелиоме плевры, множественной [иеломной болезни [Горбунова В.Л., 2000].

Сетремед проявил заметную противоопухолевую активность в тношении ряда солидных опухолей мышей (рак шейки матки, мсланома др.), но был не активен при лейкозах п асцитных опухолях. В отличие от элыпипства известных цитостатиков сетремед не является прямым

ингибитором ДНК. Препарат не обладает гастроинтестинальной токсичностью и не проявляет нефро- и гепатотоксичность [Трещалииа Е.М. идр, 1995].

Терафтап отобран из ряда специально синтезированных комплексных соединений кобальта и железа для бинарной каталитической терапии - нового способа лечения злокачественных новообразований. В отличие от фотодинамической терапии, цитотоксический эффект при этом методе лечения достигается в отсутствие облучения светом при взаимодействии двух нетоксичных соединений. Терафтал и аскорбиновая кислота последовательно вводятся в организм; терафтал катализирует окисление аскорбиновой кислоты с образованием активных форм кислорода, которые поражают опухолевые клетки [Вольпин М.Е. и др., 1996].

Для углубленного изучения циклоплатама, сетремеда, терафтала необходимо было разработать лекарственные формы. Это потребовало проведения комплекса химико-фармацевтических исследований, в который входит изучение физико-химических свойств препаратов, выбор критериев качества и определение параметров стандартности лекарственной формы, разработка способов контроля технологического процесса и методов анализа лекарственной формы, исследование ее стабильности, определение условий хранения и срока годности.

Вышеизложенное определяет актуальность и практическую значимость исследований по химико-фармацевтическому изучению и стандартизации рассматриваемых лекарственных форм новых противоопухолевых комплексных соединений платины, меди, кобальта. Учитывая гигроскопичность, гидролитическую неустойчивость и фоточувствительность изучаемых соединений, представляло научный и практический интерес изучение стабильности лекарственных форм как в технологическом процессе их наработки, так и при хранении.

Цель исследования заключается в выборе и разработке методик стандартизации и контроля качества лиофилнзированных лекарственных }юрм противоопухолевых препаратов - сетремед, циклоплатам и терафтал, I также в создании для них нормативной документации.

Основные задачи исследования: изучение физико-химических свойств препаратов и выбор критериев качества для лиофилизиропаиной лекарственной формы; разработка методик анализа лекарственной формы, определение параметров стандартности;

стандартизация и исследование стабильности лекарственной формы, определение условий хранения и срока годности;

разработка нормативной документации на уровне фармакопейных статей предприятия на лиофкльпо высушенные лекарственные формы циклоплатама, сетремеда, терафтала.

Методы исследования: спектрофотометрический анализ; ютенциометрия; высокоэффективная жидкостная хроматография; ¡умажная хроматография; органический функциональный анализ; итриметрический анализ; статистическая обработка результатов ксперимента.

Научная новизна

Впервые проведены химико-фармацевтические исследования иофилизировамных лекарственных форм новых противоопухолевых [репаратов - производных платины, меди и кобальта. Разработаны 1етодики количественного определения препаратов в лекарственных юрмах и технологических «концентратах». Разработаны методики пределения специфических примесей в сетремеде лиофшшзированном [етодами бумажной хроматографии и ИК-спектроскоиии. Разработаны акже методики определения и установлены параметры следующих сновных показателей качества исследуемых препаратов: прозрачность и

цветность раствора, рН раствора, потеря в массе при высушивании, средняя масса содержимого флакона. Выбраны условия хранения и установлен срок годности лекарственных форм циклоплатама, сетремеда, терафтала

Практическая значимость

Разработанные методики использованы для стандартизации, контроля технологического процесса приготовления лекарственной формы и определения срока годности лиофилизированных лекарственных форм противоопухолевых препаратов циклоплатам, сетремед, терафтал.

Выполнение исследования позволило создать нормативную документацию для получения разрешения на широкое медицинское применение циклоплатама и на проведение второй фазы клинического изучения сетремеда и терафтала.

Методики включены в Фармакопейные статьи предприятия: «Циклоплатам лиофилизированный 0,05 г, 0,1 г и 0,15 г для инъекций» ВФС 42-3682-00; «Сетремед лиофилизированный по 0,1 г для инъекций»; «Терафтал, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,05 г » ФСП 42-0047-1681-01.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в рамках темы «Комплексное исследование физико-химическими и аналитическими методами новых потенциально противоопухолевых соединений. Стандартизация отобранных веществ с высокой противоопухолевой активностью и разработка для них ВФС И ФС (субстанции и лекарственные формы)», номер Госрегистрации темы1940009598, по специальности 15.00.02 «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», номер Госрегистрации 01970007161.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на V Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998 г.); на 2-м Международном симпозиуме по фармации, биофармации и фармацевтической технологии (Франция, 1998 г.); на 3-м Международном симпозиуме по фармацевтической химии (Турция, 2001 г.); на межлабораторной конференции НИИ ЭДиТО РОНЦ им.Н.Н.Блохима РАМН (Москва, 2001 г.).

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 11 работ. На защиту выносятся:

- методики количественного определения циклоплатама, сегремеда, терафтала в лиофилизированных лекарственных формах;

- результаты изучения стабильности циклоплатама и терафтала в технологическом растворе - «концентрате»;

- методики контроля специфических примесей;

- методики определения подлинности препаратов;

- методики контроля остальных показателей качества лиофилизированных лекарственных форм препаратов, предусмотренных требованиями нормативной документации;

- результаты определения срока годности лиофилизированных лекарственных форм циклоплатама, сетремеда, терафтала.

Структура и объем диссертации. Диссертации состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 27 таблиц. Библиография включает 171 наименование, в том числе 76 иностранных. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении отражены актуальность, научная новизна и практическая значимость исследований, определены их цель и задачи.

В обзоре литературы рассмотрены противоопухолевые свойства комплексных соединений платины, меди и кобальта; описано биологическое действие циклоплатама, сетремеда и терафтала; даны химические и физико-химические характеристики, а также методы определения изучаемых веществ в субстанциях.

В четырех главах экспериментальной части приведены результаты выполненных исследований. При этом, в соответствии с требованиями действующей в РФ нормативной документации по контролю качества лекарств предварительно были отобраны критерии качества и определены оптимальные значения параметров для стандартизации лекарственных форм исследуемых препаратов.

1. Разработка методик количественного определения циклоплатама. сетремеда и терафтала (лекарственные формы и технологические растворы - «концентраты»)

Исследования спектральных характеристик и разработка соответствующих методик количественного определения проводились на регистрирующем спектрофотометре «Carry 219» («Varian», США) и спектрофотометре СФ-46.

Количественный анализ циклоплатама в лекарственной форме Для количественного определения препарата в лекарственной форме наиболее простым и доступным методом является спектрофотомстрия. Однако в электронном спектре поглощения растворов циклоплатама не имеется выраженных максимумов, удобных для прямого спектрофотометрирования (рис.1). Поэтому для количественного определения циклоплатама использована реакция между платиной(И), присутствующей в циклоплатаме, и хлоридом олова(И). При этом образуется окрашенный комплексный ион [Pt(SnCb)5]3" [Гинзбург С.И. и др., 1972], которому соответствует интенсивная полоса поглощения с максимумом при 403±2 нм (рис.2).

О

2,0 АД \

1,6 у \ у — С=0.5

1,2 / \ Г с=0-05 \

0,8 \ Нг-с=0.01% V_

0,4 1 -Г- —1——

200 225 250 275 300 325 350 400 X, км

Рис. 1. Электронный спектр поглощения в УФ-области свежеприготовленного раствора циклоплатама.

Рис. 2. Электронный спектр поглощения в видимой области продукта взаимодействия 0,002 % раствора циклоплатама с избытком хлорида олова (II) в солянокислой среде.

Установлено, что при большом избытке хлорида олова(Н) (оптимальное мольное отношение циклоплатам : хлорид олова(Н) - 1:4000) окраска полностью развивается в течение 10 минут и остается стабильной не менее 3 часов (табл. 1) При меньшем избытке хлорида олова(Н) окраска достигает максимума значительно медленней и она менее устойчива.

Таблица 1

Стабильность окраски комплекса циклоплатама с хлоридом олова (II) в солянокислой среде

№№ опыта Оптическая плотность раствора; \ = 403 мм

Время выдерживания раствора, мин

15 60 180

1 0,423 0,423 0,423

2 0,423 0,425 0,425

3 0,374 0,374 0,374

4 0,376 0,377 0,377

5 0,309 0,309 0,310

Исследована зависимость поглощения окрашенных комплексов при длине волны 403 им от концентрации циклоплатама в растворе. В диапазоне концентраций (в пересчете на платину) от 0,1 мкг/мл до 15 м кг/мл наблюдается подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера, причем спектры поглощения продуктов взаимодействия циклоплатама и хлорплатината(И) калия с хлоридом олова(П) в солянокислой среде были идентичны. Это позволило при разработке методики и определении молярного показателя поглощения использовать хлорплатинат(П) калия в качестве эталона. Средняя величина молярного показателя поглощения для эталонных образцов хлорплатината(П) калия составляет 8072. Эта величина использована для количественного определения циклоплатама в изученных сериях лекарственной формы (табл.2) и в технологическом «концентрате». При анализе также можно использовать способ сравнения

исследуемого раствора с раствором рабочего стандартного образца (PCO), применяя в качестве PCO циклоплатам-субстапцию.

Таблица 2

Результаты количественного определения циклоплатама в лекарственной форме (Р=95 %, tpi= 2,57, п=б)

Серия Содержание по Оптическая Найдено по Метрологические

лекарственной флаконе, плотность флаконе. характеристики

формы г г

040698 0,1 0,374 0,375 0,373 0,377 0,0996 0,0999 0,0993 0,1001 х= 0,0996 S4 = 3,488-10 " S- = 1,424-10 4

0,373 0,0993 Ах = 3,66-10 4

0,373 0,0993 ё = 0,37 %

060998 0,15 0,547 0,547 0,550 0,545 0,1454 0,1454 0,1462 0,1450 х = 0,1452 Ss = 5,317-10"4 S- = 2,171-10 " х 1

0,547 0,1454 Дх= 5,58-10 4

0,544 0,1446 с =0,38%

Количественный анализ сетремеда в лекарственной форме Для количественного определения сетремеда в лиофилизированной лекарственной форме, а также в технологическом растворе -"концентрате" выбран титриметрнческнй метод. В основу определения юложен метод косвенной йодометрии по катиону меди(И) после дарушения сетремеда добавлением неорганической кислоты. Катион меди »еагирует с иодидом калия, а выделившийся иод отгитровывают тандартным раствором тиосульфата натрия.

Условия выполнения анализа, соотношение препарата и реактивов одобраны экспериментально таким образом, чтобы исключить или свести минимуму возможные источники ошибок, присущие самому методу, [отери йода за счет его летучести и абсорбции на осадке йодида меди(1) страняли добавлением пятикратного избытка йодида калия по сравнению теоретически требуемым количеством и энергичным перемешиванием

реакционной смеси, особенно в конце титрования. Чтобы избежать возникновения ошибок в результате окисления йодида калия до свободного йода (фотохимический процесс, катализируемый катионами меди), титрование выделившегося иода выполняли сразу же после добавления йодида калия без предварительного выдерживания раствора. Одному эквиваленту сетремеда соответствует один эквивалент тиосульфата натрия. Титр 0,02 М раствора тиосульфата натрия по сетремеду равен 0,0057148 г/мл.

В таблице 3 приведены данные 6 независимых определений количественного содержания сетремеда в двух сериях лекарственной формы. Как видно из таблицы, получаемые результаты воспроизводимы, относительная ошибка среднего результата не превышает 1,0 %.

Таблица 3

Результаты количественного определения сетремеда в лекарственной форме (Р=95 %, tpr= 2,57, п=6)

Серия лекарственной формы Масса содержимого флакона, г Найдено во флаконе, г * Найдено во флаконе, % Метрологические характеристики

Серия 040992 0,1126 0,1124 0,1121 0,1137 0,1126 0,1156 0,1096 0,1094 0,1090 0,1107 0,1096 0,1126 97,30 97,37 97,21 97,37 97,30 97,45 х = 97,33 Sx = 0,082 S- = 0,034 Дх = 0,086 е = 0,09 %

Серия 010493 0,1109 0,1117 0,1120 0,1097 0,1110 0,1095 0,1079 0,1087 0,1086 0,1067 0,1079 0,1066 97,27 97,32 96,95 97,29 97,23 97,35 х = 97,24 Sx = 0,146 S- = 0,059 X * Дх =0,153 е = 0,16%

* Приведены данные , полученные в эксперименте, без пересчета на высушенное вещество. Потеря в массе при высушивании составляет 2,40 % для серии 040992; 2,54 % для серии 010493.

Количественный анализ терафтапа в лекарственной форме Количественное определение содержания основного вещества в лекарственной форме и в технологическом «коинентрате» терафтала проводили методом прямого спектрофотометрироваиия. В электронном спектре поглощения терафтала наблюдаются две характеристические полосы с максимумами при 332+2 им и 674+2 им. Интенсивность узкой полосы поглощения при 674 нм в 1,3 -1,5 раза выше, чем при 332 им (рис. 3), и эта полоса расположена в области спектра, где не поглощает большая часть органических соединений. Все это позволило использовать А.=674 им в качестве рабочей длины волны для количественного определения терафтала. Поскольку величина оптической плотности водных растворов препарата при длине волны 674 нм зависит от pH раствора, при приготовлении растворов для анализа использовали фосфатный буферный раствор pH 8,0. Специально проведенные исследования показали, что поглощение растворов лекарственной формы подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в диапазоне концентраций от 0,003 до 0,008 мг/мл.

^ис. 3. Электронный спектр поглощения 0,0005 % раствора лекарственной формы терафтала в фосфатном буферном растворе рН 8,0.

Предложенная методика предусматривает использование PCO (субстанция терафтала) или величины удельного показателя поглощения (Е!'е«)> составляющего 1100+20 см 2 т и определенного для специально полученных и дополнительно очищенных разными способами стандартных серий субстанции терафтала.

В таблице 4 приведены результаты количественного спектрофото-метрического определения терафтала в лекарственной форме. Как видно из таблицы, относительная ошибка определения не превышает 2,0 %.

Таблица 4

Результаты количественного определения терафтала в лекарственной форме ((Р=95 %, tpf= 2,57, п=6)

Серия лекформы D674 Найдено терафтала, г Метрологические Характеристики

030498 0,576 0,573 0,572 0,548 0,572 0,563 0,0524 0,0521 0,0520 0,0498 0,0520 0,0512 х = 0,0516 Sx = 9,600-10 S- = 3,919-Ю-4 X ' Дх= 1,0076 10 "3 £ = 1,95 %

040498 0,547 0,549 0,559 0,548 0,556 0,548 0,0497 0,0499 0,0508 0,0498 0,0506 0,0498 х = 0,0501 Sx = 4,733'10 м S- = 1,932-10 "4 X ' Дх = 4,968-10 -* е = 0,99 %

Разработанные методики количественного определения использованы для изучения стабильности циклоплатама и терафтала в технологическом процессе производства лекарственной формы. Анализ 10 % «концентрата» циклоплатама и 2 % «концентрата терафтала» до и после мембранной фильтрации показал, что изменения концентрации растворов в процессе мембранной фильтрации через фильтры "МПНроге" с диаметром пор 0,22 мкм не происходит. Не обнаружено изменений препаратов в процессе замораживания и лиофилизации.

2. Определение специфических примесей в лекарственных формах сегремеда и терасЬтала

Разработка методик обнаружения примеси свободных аминокислот в сетремеде

При отклонении от технологии получения и при нарушении режима хранения возможно появление в препарате примеси свободных аминокислот. Определение возможной примеси Ь-дерина и Ь-треошша осуществляли методом бумажной хроматографии и ИК-спектроскопип.

Хроматографию на бумаге проводили восходящим способом, используя хроматографическую бумагу с быстрым продвижением растворителя. Хроматограммы проявляли опрыскиванием их 0,5 % раствором нингидрина в ацетоне, содержащем 5 % воды, с последующим нагреванием хроматограмм при 100 "С в течение 2-3 мин.

Наличие в водном растворе препарата равновесия между смешанным координационным соединением (сетремедом) и симметричными бис-комплексами Си(Ь-5ег)г и Сп(Ь-Тге)2 приводит к тому, что сетремед не дает на хроматограмме четкого пятна, а проявляется в виде светло-розовой полосы или же (при длительном хроматографировашш) в виде двух светло-розовых пятен бис-комплексов с Кг около 0,8 и 0,6. Обе аминокислоты проявляются в виде ярких фиолетовых пятен с Иг около 0,37 для Ь-серина и с около 0,50 для [.-треонина, окраска которых резко отличается от окраски полосы сетремеда. Примеси обеих аминокислот проявляются на хроматограммах модельных смесей в виде фиолетовых пятен на фоне розовой полосы сетремеда при их содержании в препарате не менее 2 %. Препарат можно считать однородным, если на хроматограмме его 5 % водного раствора после проявления наблюдается полоса розового цвета, и на ее фоне отсутствуют фиолетовые пятна аминокислот.

Сравнение ИК-спектров поглощения сетремеда и входящих в его состав свободных аминокислот показало, что у сетремеда отсутствуют полосы поглощения в области 1470-1500 см"1, а Ь-треонин и Ь-серин в этой области имеют достаточно сильные полосы поглощения (рис.4). Исследования с модельными смесями показали, что указанная область спектра чувствительна к наличию примеси Ь-серина и Ь-треонина в препарате, что позволило разработать методику определения примеси этих аминокислот в препарате методом ИК-спектроскопии.

Контроль специфических примесей в терасЬтале методом ВЭЖХ

В качестве специфических примесей в лекарственной форме терафтапа рассматриваются побочные продукты синтеза препарата и продукты частичной деградации, образующиеся в процессе его получения и при хранении. Эти соединения имеют структуру, близкую к терафталу, например, продукт днмеризации. Для определения специфических примесей применен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Хроматографический анализ проводили на жидкостном хроматографе «Милихром-1» с аналитической колонкой, заполненной сорбентом Силасорб С] 8, в обращенно-фазовом режиме при ступенчатом градиентном элюировании. В качестве подвижной фазы использовали последовательно смеси метанола и фосфатного буферного раствора (рН 6,86) при изменении соотношения компонентов в подвижной фазе от 10:90 до 80:20. На хроматограммах образцов терафтала с детектированием при длине волны 340 нм наблюдаются два основных пика (рис.5) и 2-3 пика незначительной интенсивности, соответствующие специфическим примесям.

Специальное исследование поведения терафтала в окислительно-восстановительных системах, выполненное параллельно методами ВЭЖХ и электронной спектроскопии, показало, что основные пики относятся к

1600 1500 1400 •), см"-*

Рис. 4. Инфракрасные спектры Рис. 5. ВЭЖХ лекарственной

поглощения (1400-1600 см "') формы терафтала с.071097

1 - Ь-серин; 2 - Ь-треонин; 1,2 - основное вещество;

3 - сетремед. 3 - специфическая примесь.

восстановленной (пик 2) и окисленной (пик 1) формам терафтала и могут рассматриваться суммарно как пики двух форм одного активного соединения. Поскольку механизм действия препарата как катализатора окисления аскорбиновой кислоты предполагает чередующиеся циклы окисления и восстановления иона кобальта в молекуле фталоцианина, соотношение окисленной и восстановленной форм в терафтале не регламентируется. Все дополнительные соединения, обнаруживаемые методом ВЭЖХ в указанных выше условиях, рассматриваются как специфические примеси. Как показало изучение лекарственной формы, во всех проанализированных сериях сумма площадей пиков специфических примесей не превышала 2,0 %, составляя обычно 0,1 -1,0 %.

3. Разработка методик контроля остальных критериев качества лекарственных форм циклоплатама, сетремеда и терафтала. предусмотренных требованиями нормативной документации

В соответствии с требованиями «Отраслевого стандарта качества лекарственных средств» были разработаны методики определения подлинности препаратов.

В циклоплатаме платина была идентифицирована с помощью качественной реакции с раствором хлорида олова(П). Малат-ион определяли с помощью реакции с Р-нафтолом в концентрированной серной кислоте. Для идентификации аммиака и циклопентиламина, была использована реакция с фенолфталеином.

В сетремеде наличие катиона ыеди(Н), связанного в комплекс, доказывали отсутствием осадка гидроксида меди(П) при взаимодействии растворов препарата и гидроксида натрия. Обнаружение комплексно-связанных а-аминокислот в сетремеде проводили с помощью нингид-рина. Входящий в состав препарата треонин содержит оксиэтильную группу. Специфической реакцией на эту группу является образование

йодоформа после добавления к раствору препарата гидрокспда натрия и иода.

Наличие кобальта в молекуле тсрафтала было подтверждено характерной реакцией с роданидом аммония после сжигания препарата в присутствии концентрированной серной кислоты, а присутствие натрия -качественной пробой на натрий после внесения препарата в бесцветное пламя.

Для характеристики подлинности препаратов использованы спектры поглощения в УФ, видимой и ИК-областях.

Для оценки стандартности лекарственной формы были разработаны также методики определения и установлены параметры следующих показателей качества: прозрачность и цветность раствора, рН раствора, потеря в массе при высушивании, средняя масса и однородность по массе, однородность дозирования.

Показатели качества лекарственных форм представлены в таблицах

5,6,7.

4. Изучение стабильности и определение срока годности лиофилизированных лекарственных форм циклоплатама. сетремеда, терафтала.

При выборе условий хранения лекарственных форм циклоплатама, сетремеда и терафтала исходили из физико-химических свойств препаратов и результатов экспериментальных исследований. Для определения срока годности лекарственную форму циклоплатама хранили в защищенном от света месте при температуре ( +5 + 3) "С. Храпение лекарственной формы сетремеда осуществлялось в защищенном от света месте при двух температурах: комнатной (+22 ± 3) "С и в условиях холодильной камеры (+5 + 3) °С. Учитывая высокую гигроскопичность тсрафтала, его хранили в сухом защищенном от света месте при комнатной температуре (не выше +25°С).

Таблица 5 СПЕЦИФИКАЦИЯ на Циклоплатам лиофилизиронанный 0,05 г, 0,1 г и 0,15 г для инъекций

Показатель Метод Норма

Описание Визуальный Сухая пористая масса светло-серого пли светло-серого с желтоватым оттенком цвета, с блестящей пленкой на поверхности.

Растворимость ГФ XI, вып. 1, с. 175 Очень легко растворим в воде, практически нерастворим в спирте этиловом 95%, эфире, хлороформе.

Средняя масса и одно родность по массе Весовой; ГФ XI, вып.2, с. 140 0,042 г-0,060 г; 0,090 г - 0,115 ги0,140г -0,165 г.

Подлинность Качественная реакция Появление оранжевого окрашивания при добавлении раствора хлорида олова(П) (платина).

Качественная реакция Появление ярко-зеленой флюоресценции при прибавлении свежеприготовленного 2,5 % раствора Р-нафтола в серной кислоте конц. и нагревании на кипящей водяной бане (малат-ион).

Качественная реакция Появление малинового окрашивания при прибавлении 10 % раствора тиосульфата натрия, раствора фенолфталеина и последующем нагревании на водяной бане (аммиак, амины).

Прозрачность раствора Визуальный; ГФ XI, вып. 1, с. 198 0,05 % раствор препарата в воде должен быть прозрачным.

Механические включения РД-501-98 Должен выдерживать требования.

Цветность раствора Спектрофотометр ия Удельный показатель поглощения при длине волны 465 нм должен быть не выше 0,10.

рн ГФ XI, вып. 1, с. 113, потенциометрически От 3,8 до 4,6 (1% водный раствор).

Вода по К.Фишеру Не более 4,0 %.

Количественное определение Спектрофотометрия 0,042 г - 0,058 г; 0,090 г - 0,110 г и 0,140 г- 0,160 г для дозировки 0,05 г, 0,1 г и 0,15 г соответственно .

Однородность дозирования Спектрофотометрия 85-115 % (для дозировки 0,05 г).

Хранение Список А. В защищенном от света месте при температуре не выше+10 °С.

Срок годности | 2 года.

Таблица 6

СПЕЦИФИКАЦИЯ иа Сетремед лиофилизированиый 0,1 г для инъекций _

Показатель Метод Норма

Описание Визуальный Сухая пористая масса синего цвета с фиолетовым оттенком.

Средняя масса и однородность по массе Весовой; РФ XI, вып.2, с. НО 0,09 г-0,12 г; Отклонение от средней массы + 10,0%.

Подлинность Спектрофотометрия Электронный спектр поглощения 0,005 % водного раствора препарата имеет максимум поглощения при 234+2 им, а 0,3 % водного раствора препарата имеет максимум поглощения при 62112 им.

Качественная реакция Не наблюдается выпадение характерного осадка гндрокепда меди(И) при добавлении раствора едкого натра к подкисленному раствору препарата (катион меди, связанный в комплекс).

Качественная реакция Появление красновато-коричневого кольца на фильтровальной бумаге при проявлении ннигпдршюм (аминокислота в комплексе).

Качественная реакция Выпадение желтого аморфного осадка и появление характерного запаха при добавлении к раствору препарата раствора едкого натра и водного раствора иода (окенэтильная группа).

Прозрачность раствора Визуальный; ГФ XI, вып. 1, с, 198 1 % раствор препарата в воде должен быть прозрачным.

Механические включения РД-501-98 Должен выдерживать требования.

Цветность раствора Спектрофотометрия Оптическая плотность 0,3 % водного раствора препарата при 621+2 им в кювете с толщиной слоя 10 мм должна быть в пределах от 0,45 до 0,60.

РП ГФ XI, пып.1, с. 113, потеншюметрнчески От 7,5 до 8,0 (5 % водный раствор).

Специфические примеси Бумажная хроматография; ИК-спектр На хроматограмме должны отсутствовать фиолетовые пятна аминокислот. В ИК-спектре должны отсутствовать полосы поглощения в области 1470-1500 см"1.

Потеря в массе при высушивании ГФ XI, вып. 1, с. 176 Не более 6,0%.

Количественное определение Иодометрическое титрование 0,09 г -0,11 г; .

Хранение Список Л. В защищенном от света месте при температуре не выше +10 °С.

Зрок годности 3 года.

Таблица 7 СПЕЦИФИКАЦИЯ на Терафтал, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,05 г

Показатель Метод Норма

Описание Визуальный Сухая пористая масса темно-синего цвета с фиолетовым оттенком.

Растворимость ГФ XI, вып. 1, с.175 Умеренно растворим в воде, практически нерастворим в спирте этиловом 95 %, хлороформе.

Средняя масса и однородность по массе Весовой; ГФ XI, вып.2, с.140 0,047 -0,056 г; Отклонение от средней массы ± 10,0%.

Подлинность Спектрофотометрия Электронный спектр поглощения 0,0005 % раствора препарата в фосфатном буферном растворе pH 8,0 в области 250-850 нм должен иметь два максимума поглощения при 332±2 нм, 674+2 нм и плечо при 608+2 нм. Отношение значений оптической плотности в максимумах D674/D332 должнс быть в интервале 1,3 - 1,5,

Качественная реакция Появление сине-зеленого окрашивать при добавлении раствора аммонк; роданида в ацетоне к розоватому остатку полученному после нагревания препарат, с концентрированной серной кислого! (кобальт).

Качественная реакция Окрашивание бесцветного пламени i желтый цвет при внесении в неп препарата (натрий).

Прозрачность раствора Визуальный; ГФ XI, вып. I, с.198 0,05 % раствор препарата в воде должен быть прозрачным.

Механические включения РД-501-98 Должен выдерживать требования.

РН ГФ XI, вып. 1, с. 113, потенцпометрически 7,3 - 8,3 (свежеприготовленный водны раствор содержимого флакона в 50 м. воды).

Специфические примеси ВЭЖХ Сумма примесей не должна превышат 2,0%.

Потеря в массе при высушивании ГФ XI, вып. 1, с. 176 Не более 6,0 %.

Однородность дозирования Спектрофотометрия 85-115%.

Количественное определение Спектрофотометрпя 0,047 - 0,053 г.

Хранение Список А. В сухом защищенном от света месте при температур не выше +25 "С.

Срок годности 2 года.

Контроль качества проводили через каждые 6 месяцев по выбранным критериям, включенным в ФСП (описание, растворимость, цветность и прозрачность раствора, рН, специфические примеси, потеря в массе при высушивании, количественное определение), по методикам, разработанным для стандартизации. При хранении качество испытанных образцов лекарственных форм оставалось в пределах-установленных параметров. На основании полученных результатов установлен срок годности лекарственных форм циклоплатама и терафтала - 2 года, сетремеда -3 года.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики количественного определения циклоплатама (для трех дозировок), сетремеда и терафтала в лекарственных формах и технологических растворах - «концентратах». Циклоплатам определяли спектрофотометрическим методом, основанным на реакции образования окрашенного комплекса с хлоридом олова(П). Сетремсд определялся методом косвенной иодометрии по катиону меди(Н). Терафтал определяли методом прямой спектрофотометрии. Разработанные методики количественного определения обладают высокой точностью и воспроизводимостью. Относительная ошибка определения не превышает 1,0 % - для циклоплатама и сетремеда; 2,0 % - для терафтала.

2. Методом спектрофотометрии показана устойчивость циклоплатама и терафтала в технологическом растворе - «концентрате». Установлено отсутствие изменения препаратов в процессе мембранной фильтрации, замораживания и лиофилизации.

I. Разработаны методики определения специфических примесей в сетремеде и терафтапе. Определение примеси свободных аминокислот в сетремеде лиофилизированном осуществляли методами бумажной

хроматографии и ИК-спектроскопии. Содержание свободных аминокислот во всех исследованных сериях препарата не превышало 2,0 %. Специфические примеси в терафтале лиофилизированном определяли методом ВЭЖХ. Сумма примесей не должна превышать 2,0 %.

4. Разработаны методики определения и установлены параметры следующих основных показателей качества исследуемых препаратов: подлинность, прозрачность и цветность раствора, рН раствора, потеря в массе при высушивании, средняя масса содержимого флакона.

5. Определены условия хранения и установлен срок годности лекарственных форм: циклоплатама и терафтала - 2 года; сетремеда -3 года.

6. По результатам исследований составлены Фармакопейные статьи предприятия: «Циклоплатам лиофилизированный 0,05 г, 0,1 г и 0,15 г для инъекций» ВФС 42-3682-00, «Сетремед лиофилизированный 0,1 г для инъекций» и «Терафтал, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,05 г » ФСП 42-1681-01.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Н.Оборотова, Б.Кикоть, Е.Игнатьева и др. Фармацевтические аспекты разработки и стандартизации лекарственных форм противоопухолевых препаратов. // V Национальный Конгресс «Человек и лекарство»,- М., 1998.-С. 652.

2. N.Oborotova, P.Cheltsov, E.Ignatieva et al. Drug formulations of cycloplatam, a second-generation antitumour platinum complex. // 2-nd World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics, Pharmaceutical Technology. - France, 1998.-. Proc.- P. 1261.

3. B.Kikotj, L.Gatinskaya, E.Ignatieva et al. Chemical and pharmaceutical study of new anticancer preparation setremed.// 2-nd World Meeting on

Pharmaceutics, Biopliarmaceulics, Pharmaceutical Technology.- France, 1998,-Proc. - P. 1263.

4. N.Oborotova, B. Kikotj, E.Ignatieva at al. Development of new antineoplastic drug formulations from platinum and copper complexes.// Abstracts, European Journal of Pharmaceutical Siences II, 2000.- P. 114.

5. N.Oborotova, E.Ignatieva, B.Kikotj et al. Stabilization of hydrolytically unstable aiititumour preparations by lyophilization. // 3-rd International Symposium on Pharmaceutical Chemistry. - Turkey, 2001.- Proc., - P. 201.

6. Н.А.Оборотова, П.А.Чельцов, Е.В.Игнатьева и др. Технологические и химико-фармацевтические исследования нового противоопухолевого препарата «Циклоплатам лиофилизированный для внутривенного введения»// Химико-фармацевтический журнал. - 2001. - Том 35. -№8. -С. 36-42.

7. Е.В.Игнатьева, Б.С.Кикоть, Н.А. Оборотова и др. Химико-фармацевтическое изучение циклоплатамд - противоопухолевого комплексного соединения платины.// Мат. докл. II Конгресса онкологов закавказских государств. - Баку, 2001. - С. 84.

3. Циклоплатам лиофилизированный 0,05 г, 0,1 г и 0,15г для инъекции. ВФС 42-3682-00.45 с.

Сетремед лиофилизированный по 0,1 г для инъекций. Временная фармакопейная статья. 35 с.

Ю.Терафтал. ФСП 42-1680-01. - 33 с.

11 .Терафтал, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,05 г. ФСП 42-1681-01.-47 с.

Актуальность темы. Борьба со злокачественными новообразованиями является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины [51]. В экономически развитых странах злокачественные новообразования занимают второе место (15-20 %) в общей структуре смертности. По опубликованным данным ВОЗ в мире ежегодно заболевает раком 6,5 млн. человек, из них умирает не менее 4,3 млн.

Число больных раком на земном шаре составляет до 20 млн. человек. В России количество пациентов с впервые установленным диагнозом рака увеличилось за 1991 - 1996 гг. на 7 % и достигло 400 случаев на 100 тысяч населения. В 2001 году ожидается возрастание этого показателя до 480. Приводимые данные свидетельствуют не только о распространенности онкологических заболеваний, но и о тенденции к дальнейшему росту [40].

Эффективность борьбы с раковыми заболеваниями во многом зависит от возможностей лекарственной терапии онкологических больных. Наряду с хирургическими и лучевыми методами лечения, химиотерапия злокачественных опухолей получила широкое распространение не только как составная часть комплексного лечения больных, но при ряде локализаций опухолевого процесса она является определяющей [76].

Одним из важнейших достижений химиотерапии опухолей явилось обнаружение высокой противоопухолевой активности у некоторых комплексных соединений переходных металлов, и в первую очередь, платины и меди. Интенсивный поиск противоопухолевых соединений среди комплексных соединений металлов стал особенно актуален с момента открытия высокой активности цисплатина, внедренного в медицинскую практику в 70-х годах. Его использование значительно расширило возможности химиотерапии опухолей, в частности злокачественных опухолей яичек, яичников и др. [50,60,153]. Синтез и исследование новых активных производных платины преследует цель не только сохранить, но, возможно, и увеличить эффективность, расширить спектр применения и одновременно с этим уменьшить токсичность получаемых соединений. Наиболее интересным отечественным препаратом из второго поколения комплексных соединений платины является циклоплатам, синтезированный в Институте общей и неорганической химии им.Н.С.Курнакова РАН (ИОНХ) и изученный в Российском онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина РАМН (РОНЦ РАМН).

Созданию лекарственной формы циклоплатама, выбору химико-фармацевтических критериев стандартности, а также разработке соответствующих методик контроля качества посвящена одна из частей предлагаемой диссертационной работы.

Среди комплексных соединений двухвалентной меди также обнаружены вещества с выраженной противоопухолевой активностью. Наиболее интересными из них оказались продукты взаимодействия ионов меди с тиосемикарбазонами а-кетокарбоновых кислот и с некоторыми аминокислотами [71]. Самое активное соединение из этой группы, получившее название "Сетремед", успешно прошло углубленное предклиническое изучение и передано на клинические испытания.

Исследованиям, выполненным по разработке лекарственной формы сетремеда и по созданию необходимой нормативной документации, также посвящена одна из частей диссертации.

Некоторые комплексные соединения переходных металлов с успехом применяются также и в фотодинамической терапии новообразований. При этом используется способность порфириновых металлических комплексов селективно накапливаться в опухоли. Поглощая энергию света определенной длины волны при облучении ткани лазером, атомы металла возбуждаются. Энергия возбуждения передается молекулам кислорода, присутствующим в ткани, активирует их и приводит к образованию в значительных концентрациях свободных радикалов, вызывающих гибель опухолевых клеток [86].

В развитие метода фотодинамической терапии академиком М.Е.Вольпиным и чл.-корр. РАН Г.Н.Ворожцовым была сформулирована оригинальная идея о возможности подавления, роста злокачественных опухолей бинарной каталитической системой, состоящей из фталоцианинового комплекса переходного металла и биогенного восстановителя (бинарная каталитическая терапия) [144]. В таких окислительно-восстановительных системах свободные радикалы образуются за счет химических взаимодействий компонентов без использования лазерного облучения. В эксперименте в качестве восстановителя наиболее активной оказалась аскорбиновая кислота, а из комплексов металлов -катализаторов окисления аскорбиновой кислоты - комплекс одного из производных фталоцианина с кобальтом(П), получивший название терафтал.

Химико-фармацевтическому изучению лекарственной формы препарата терафтал и созданию для него нормативной документации посвящена последняя часть диссертации.

В настоящее время все три разработанные лекарственные формы препаратов цикпоплатам, сетремед и терафтал успешно проходят изучение в клинических подразделениях РОНЦ РАМН и других лечебных учреждениях РФ.

Настоящая диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН в рамках темы «Комплексное исследование физико-химическими и аналитическими методами новых протенциально противоопухолевых соединений. Стандартизация отобранных веществ с высокой противоопухолевой активностью и разработка для них ВФС И ФС (субстанции и лекарственные формы)», номер Госрегистрации 01940009598, по специальности 15.00.02 «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», номер Госрегистрации 01970007161.

Цель исследования заключается в выборе и разработке методик стандартизации и контроля качества лиофилизированных лекарственных форм противоопухолевых препаратов сетремед, циклоплатам и терафтал, а также в создании для них нормативной документации. Основные задачи исследования:

- изучение физико-химических свойств препаратов и выбор критериев качества для лиофилизкриванной лекарственной формы;

- разработка методик анализа лекарственной формы, определение параметров стандаршости;

- стандартизация и исследование стабильности лекарственной формы, определение условий хранения и срока годности;

- разработка нормативной документации на уровне фармакопейных статей предприятия на лиофильно высушенные лекарственные формы циклоплатама, сетремеда, терафтала.

Методы исследования: спектрофотометрический анализ; потенцио-метрия; высокоэффективная жидкостная хроматография; бумажная хроматография; органический функциональный анализ; титриметрический анализ; статистическая обработка результатов эксперимента. Научная новизна

Впервые проведены химико-фармацевтические исследования лиофилизированных лекарственных форм новых противоопухолевых препаратов - производных платины, меди и кобальта. Разработаны методики количественного определения препаратов в лекарственных формах и технологических концентратах. Разработаны методики определения специфических примесей в сетремеде лиофилизированном методами бумажной хроматографии и ИК-спектроскопии. Разработаны также методики определения и установлены параметры следующих основных показателей качества исследуемых препаратов: прозрачность и цветность раствора, рН раствора, потеря в массе при высушивании, средняя масса содержимого флакона. Выбраны условия хранения и установлен срок годности лекарственных форм циклоплатама, сетремеда, терафтала. Практическая значимость

Разработанные методики использованы для стандартизации, контроля технологического процесса приготовления лекарственной формы и определения срока годности лиофилизированных лекарственных форм противоопухолевых препаратов циклоплатам, сетремед, терафтал.

Выполнение исследования позволило создать нормативную документацию для получения разрешения на широкое медицинское применение циклоплатама и на проведение второй фазы клинического изучения сетремеда и терафтала.

Методики включены в Фармакопейные статьи предприятия: «Циклоплатам лиофилизированный 0,05 г, 0,1 г и 0,15 г для инъекций» ВФС 42-3682-00; «Сетремед лиофилизированный по 0,1 г для инъекций»; «Терафтал лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,05 г » ФСП 42-0047-1681-01.

Материалы по исследованию стабильности растворов циклоплатама, сетремеда, терафтала использованы при разработке лабораторных технологических регламентов на производство лекарственных форм. На защиту выносятся:

- методики количественного определения циклоплатама, сетремеда, терафтала в лиофилизированных лекарственных формах;

- результаты изучения стабильности циклоплатама и терафтала в технологическом растворе - «концентрате»;

- методики контроля специфических примесей;

- методики определения подлинности препаратов;

- методики контроля остальных показателей качества лиофилизирован-ных лекарственных форм препаратов, предусмотренных требованиями нормативной документации;

- результаты определения срока годности лиофилизированных лекарственных форм циклоплатама, сетремеда, терафтала.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на V Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998); на 2-м Международном симпозиуме по фармации, биофармации и фармацевтической технологии (Франция, 1998 г); на 3-м Международном симпозиуме по фармацевтической химии (Турция, 2001 г.); на межлабораторной конференции НИИ ЭДиТО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (Москва, 2001 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ и 4 Фармакопейные статьи предприятия.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, 4-х глав экспериментальной части, Выводов, Списка литературы и Приложений. Работа изложена на 150 страницах текста, содержит 21 рисунок и 27 таблиц.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики количественного определения циклоплатама (для трех дозировок), сетремеда и терафтала в лекарственных формах и технологических растворах - «концентратах». Циклоплатам определяли спектрофотометрическим методом, основанным на реакции образования окрашенного комплекса с хлоридом олова(П). Сетремед определялся методом косвенной иодометрии по катиону меди(И). Терафтал определяли методом прямой спектрофотометрии. Разработанные методики количественного определения обладают высокой точностью и воспроизводимостью. Относительная ошибка определения не превышает 1,0 % - для циклоплатама и сетремеда; 2,0 % - для терафтала.

2. Методом спектрофотометрии показана устойчивость циклоплатама и терафтала в технологическом растворе - «концентрате». Установлено отсутствие изменения препаратов в процессе мембранной фильтрации, замораживания и лиофилизации.

3. Разработаны методики определения специфических примесей в сетремеде и терафтале. Определение примеси свободных аминокислот в сетремеде лиофилизированном осуществляли методами бумажной хроматографии и ИК-спектроскопии. Содержание свободных аминокислот во всех исследоваши сериях препарата не превышало 2,0 %. Специфические примеси в терафтале лиофилизированном определяли методом ВЭЖХ. Сумма прч л не должна превышать 2,0 %.

4. Разработаны методики определения и установлены параметры следующих основных показателей качества исследуемых препаратов: подлинность, прозрачность и цветность раствора, рН раствора, потеря в массе при высушивании, средняя масса содержимого флакона.

5. Определены условия хранения и установлен срок годности лекарственных форм: циклоплатама и терафтала - 2 года; сетремеда - 3 года.

6. По результатам исследований составлены Фармакопейные статьи предприятия: «Циклоплатам лиофилизированный 0,05 г, 0,1 г и 0,15 г для инъекций» ВФС 42-3682-00, «Сетремед лиофилизированный 0,1 г для инъекций» и «Терафтал, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,05 г» ФСП42-1681-01.