Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Биофармацевтическая характеристика цифетрелина как потенциального противоопухолевого препарата

005015918

На правах рукописи

Михаевич Екатерина Игоревна

БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИФЕТРЕЛИНА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА

14.01.12 — Онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 1.1 А Г, 2012

Москва - 2012

Работа выполнена в:

Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ректор - член-корреспондент РАМН, профессор П.В.Глыбочко);

Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов).

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор Оборотова Наталия Александровна доктор медицинских наук, профессор Аляутднн Ренад Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, главный научный сотрудник ФГБУ «Института биохимической физики

имени Н.М.Эмануэля» РАН Островская Лариса Анатольевна

доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией фармакологии и токсикологии НИИ ЭДиТО ФГБУ

«РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН Бухман Владимир Михайлович

Ведущая организация:

ФГБУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Защита состоится «» 2012 г. в /(?" часов на заседании

Диссертационного совета Д.001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный Центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан «/У » Яи^иилЦ 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Спектр химиотерапевтических препаратов, применяемых в современной терапии злокачественных новообразований, многообразен — алкшшрующие агенты, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, гормональные и антигормональные средства, а также ферментные препараты. Несмотря на это, имеется немало ограничений для их применения в клинической практике, в первую очередь - высокая токсичность. В связи с этим поиск, изучение и разработка лекарственных форм на основе субстанций, обладающих высокой противоопухолевой активностью, но менее выраженными побочными эффектами, имеет большое научно-практическое значение.

Успехи науки в изучении механизма злокачественной трансформации клеток позволили определить новые мишени для потенциальных противоопухолевых средств. В последнее время повышенный интерес онкологов вызывают аналоги пептидного гормона гипоталамуса соматостатина. Известно, что соматостатин ингибирует высвобождение гормона роста, тиреотропина, глюкагона, инсулина, гастрина, а также подавляет пролиферацию многих нормальных и опухолевых клеток. Механизм антипролиферативного действия соматостатинов имеет два компонента: прямой и опосредованный. Прямое противоопухолевое действие обусловлено связыванием с рецепторами соматостатина на поверхности опухолевых клеток и реализуется путем ингибирования клеточного цикла и эффектов ростовых факторов, а также путем индукции апоптоза. Опосредованное противоопухолевое действие обусловлено ингибированием ангиогенеза и высвобождения ростовых факторов и гормонов.

В настоящее время в клинической практике широко применяются такие аналоги соматостатина, как октреотид и лантреотид. Показаниями к их применению в онкологии являются эндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы (инсулиномы, ВИПомы,

гастриномы, глюкагономы), терапия гормонорезистентного рака предстательной железы. Кроме того, активно изучается противоопухолевая активность соединений этого класса при других типах злокачественных новообразований. Имеются сообщения об антипролиферативной активности аналогов соматостатина в отношении рака молочной железы, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы. Таким образом, создание новых соединений группы соматостатина, изучение их механизма действия и спектра антипролиферативной активности, а также разработка их лекарственных форм является перспективным направлением современной науки.

В лаборатории химического синтеза НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН был синтезирован новый отечественный аналог гипоталамического гормона соматостатина, пентапептид цифетрелин. Была выявлена гормональная активность цифетрелина: он подавлял секрецию СТГ и пролактина. Также была продемонстрирована противоопухолевая активность цифетрелина: на перевиваемых солидных опухолях мышей максимальный эффект составлял 90% торможения роста опухоли (ТРО), на ДМБА-индуцированных опухолях молочной железы крыс максимальный эффект составлял 79-90% ТРО, цифетрелин ингибировал рост аденокарциномы предстательной железы крыс R-3327-H (максимальный эффект 46-65%ТРО) и перевиваемого рака молочной железы человека РМ-1 у бестимусных мышей (47-63% ТРО). Задачей следующего этапа разработки данного соединения являлось выявление оптимальных терапевтических доз и пути введения, изучение механизма действия цифетрелина, а также разработка подходов к созданию его лекарственной формы.

Цель исследования.

Изучение противоопухолевой активности цифетрелина и механизмов ее развития и обоснование его лекарственной формы.

Задачи исследования.

1. Изучить противоопухолевую активность цифетрелина in vitro в культуре

клеток MCF-7.

2. Определить влияние цифетрелина на уровень апоптоза в культуре клеток

MCF-7.

3. Исследовать противоопухолевую активность цифетрелина in vivo, выявить оптимальную терапевтическую дозу и путь введения.

4. В результате комплексных биофармацевтических исследований обосновать состав и технологию таблетированной лекарственной формы цифетрелина для приема внутрь.

Научная новизна исследования

На культивируемых in vitro клетках рака молочной железы человека MCF-7 установлена минимальная концентрация цифетрелина, достаточная для подавления клеточного роста. Продемонстрировано, что в культуре клеток MCF-7 цифетрелин индуцирует апоптоз по р53-независимому пути, который сопровождается деградацией PARP, ранним подавлением базальной и индуцированной активности NF-kB и одновременным снижением уровня NF-kB в ядрах клеток. Кроме того, продемонстрирована способность цифетрелина усиливать проапоптотическое действие адриамицина. Определены оптимальные терапевтические дозы цифетрелина на животных моделях опухолевого роста (1-10 мг/кг) и рациональный путь введения (перорапьный). Предложен состав таблетированной лекарственной формы цифетрелина, обеспечивающий соответствие показателей качества лекарственной формы требованиям Государственной Фармакопеи XI изд. На биологической модели опухолевого роста показано, что эффективность лекарственной формы цифетрелина не уступает эффективности субстанции при пероральном введении. Практическая значимость исследования

На основании полученных результатов предложена технологическая схема получения и состав таблетированной лекарственной формы

5

цифетрелина, выбраны показатели и критерии качества таблеток цифетрелина. На биологической модели опухолевого роста показано, что таблетированная лекарственная форма цифетрелина по эффективности не уступает субстанции цифетрелина. Апробация работы

Апробация работы проведена 19 января 2012 г. на заседании кафедры фармакологии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова и 26 января 2012 г. на межлабораторной конференции с участием лабораторий разработки лекарственных форм, экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, химического синтеза, химико-фармацевтического анализа НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, отдела экспериментальной химиотерапии НИИ ЭДиТО и лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН по теме: «Создание технологии лекарственных форм противоопухолевых препаратов с организацией производства» (№ Государственной регистрации 0120.0 809454), а также в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по теме «Разработка современной технологии подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (№ Государственной регистрации - № 01.2.006 06352). Тема диссертации

утверждена 29 июня 2009 г. на заседании Ученого совета фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав результатов собственных экспериментальных исследований, обсуждения результатов, общих выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 178 источников, в том числе 165 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы п методы

Объектом исследования являлся новый отечественный синтетический аналог гипоталамического гормона соматостатина - пентапептид цифетрелин

Boc-Cys(Thp)-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr-OMe Экспериментальные животные и модели опухолевого роста

В экспериментах in vivo использованы мыши - самки, самцы массой 18-21 г в возрасте 1,5-2 месяца линий СВА2, BDF, и BALB/C. Количество животных в контрольных группах составляло 10 мышей, в опытных - 7-8. Животные были получены из питомника ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, содержались в одинаковых условиях вивария с брикетированным режимом кормления. Работа проведена на экспериментальных перевиваемых солидных опухолях мышей: раке шейки матки РШМ-5, аденокарциноме молочной железы Ca 755, аденокарциноме толстого кишечника АКАТОЛ. В экспериментах in vitro использовали культуру клеток рака молочной железы человека MCF-7. Клетки культивировали в стандартной среде DMEM, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки («Gibco») и гентамицин (50 ЕД/мл) в атмосфере с 5% содержанием С02 при 37°С.

Оценка противоопухолевой активности цифетрелина in vivo

Критериями эффективности цифетрелина и его лекарственной формы являлось торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ) леченных животных по сравнению с контролем. Указанные критерии рассчитывали по формулам:

ТРО % = (Vk - Vo )/Vk х 100, где Vk и Vo - средний объем опухолей (мм3) в контрольной и опытной группах соответственно, который для каждой опухоли определяли как произведение трех перпендикулярных измерений опухолевого узла.

УПЖ % = (СПЖо - СПЖк )/ СПЖк х 100, где СПЖк и СПЖо - средняя продолжительность жизни (дни) в контрольной и опытной группах животных соответственно.

Критериями противоопухолевой активности препарата являлось торможение роста опухоли более, чем на 50%, или увеличение продолжительности жизни животных более, чем на 25%.

Введение препарата животным начинали через 48 часов после перевивки опухолей. Цифетрелин вводили перорально и подкожно. Статистическую обработку полученных данных проводили по методу Фишера-Стьюдента. Различия сравниваемых величин считали достоверными при р < 0,05.

Оценка противоопухолевой активности цифетрелина in vitro

Для оценки противоопухолевой активности циферелина in vitro использовали два метода: визуальный метод подсчета живых клеток с использованием счетной камеры Горяева и МТТ-тест. МТТ-тест основан на способности митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ живых метаболически активных клеток восстанавливать бесцветную соль тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) до нерастворимых в воде голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется колориметрическим методом после растворения в

ДМСО (570 им). Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток. Процент живых клеток вычисляли по формуле:

_ Ni х 100%

No--.

N2

где No - процент живых клеток; Ni - средняя оптическая плотность лунок, содержащих клетки и препарат; N2 - средняя оптическая плотность контрольных лунок, содержащих только клетки. Определение уровня апоптоза в культуре клеток MCF-7

Уровень апоптоза в культуре клеток оценивали с помощью метода лазерной проточной цитофлуориметрии с использованием йодистого пропидия («Sigma»). Клетки фиксировали в 70% охлажденном этаноле, центрифугировали и ресуспендировали в 1 мл раствора, содержащего йодистый пропидий (5 мкг/мл), 0,1% натрия цитрата, 0,1% Тритона Х-100, а затем инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Образцы анализировали в цитометре FACSCalibur («Becton Dickinson»). Компьютерную обработку данных проводили с помощью программы WinMDI 2.9 (Joseph Trotter, La Jolla, CA, USA). Процент апоптотических клеток определяли как npe-Gl-пик на ДНК-гистограмме. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы Origin 5.1. Различия сравниваемых величин считали достоверными при р <0,05. Определение активности транскрипционного фактора NF-kB с помощью репортерного анализа

Активность транскрипционного фактора NF-kB оценивали путем трансфекции клеток MCF-7 плазмидой, содержащей репортерный ген люциферазы под контролем промотора с NF-kappaB-чувствительным элементами, и котрансфекции плазмидой, содержащей ген Р-галактозидазы (для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции), с использованием липофектамина («Life Technologies-BRL», США) при 37°С. Все последующие эксперименты на клетках-трансфектантах выполнялись в течение 48 ч после окончания трансфекции.

Клетки-трансфектанты культивировали без добавок (контроль), в присутствии 10"5М цифетрелина в течение 4 или 24 ч и/или при добавлении на последние 4 часа инкубации индуктора NF-kB тетрадеканоилфорболацетата (TPА) в концентрации 2x10"4 мг/мл. Активность Р-галактозидазы в клеточных экстрактах измеряли по стандартной методике, основанной на метаболизировании Р-галактозидазой субстрата ONPG (О-нитрофенил-Ь-О-галактопиранозида) с образованием желтого О-нитрофенола, интенсивность окраски измеряли методом спектрофотометрии (420 нм). Активность люциферазы измеряли по стандартному протоколу («Promega», США) на люминометре «Turner BioSystems 20/20п», США). Расчет активности люциферазы проводили в условных единицах (отношение активности люциферазы к активности галактозидазы в исследованных образцах).

Получение клеточных и ядерных экстрактов клеток MCF- 7

Для проведения иммуноблоттинга клетки снимали с чашек в 1 мл физиологического раствора, затем из полученных образцов выделяли клеточные экстракты как описано ранее [Красшьников М.А., 2004]. Осадок клеток обрабатывали лизирующим буфером в течение 30 мин и затем центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 минут при +4°С.

Для исследования белков ядерной фракции выделение ядер проводили по модифицированному методу [Slawson С., 2010]. Осадок клеток инкубировали 5 минут в 80 мкл низкосолевого буфера, центрифугировали при 13000 g 10 минут, и повторяли процедуру 3 раза. Осадок экстрагировали в 50 мкл высокосолевого буфера, инкубировали 30 мин при 4°С при периодическом встряхивании. Центрифугировали при 13000g 20 минут и ядерный экстракт далее использовали в экспериментах по иммуноблоттингу. Разделение белков с помощью вертикального электрофореза и иммупоблоттинг

Разделение белков проводили с помощью вертикального электрофореза в 10% полиакриламидном геле в течение 3,5-4 ч. Затем экстракты переносили

на нитроцеллюлозные фильтры (Amersham BS). Для иммуноблоттинга использовали антитела к р53 (ОР29, Oncogene Research Products), PARP (F014028, eBioscience) и NF-kB (C22B4, Cell Signaling). Для предотвращения неспецифической сорбции фильтры обрабатывали 5% раствором обезжиренного молока (Nestle). Фильтры инкубировали с первичными, а затем с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (Amersham BS). Обнаружение белков на нитроцеллюлозном фильтре проводили путем регистрации люминесценции при обработке фильтра хемилюминесцентным реагентом, с помощью анализатора Image Quant Las 4000 (Amersham Biosciences, CK). Для контроля эффективности нанесения ядерных и клеточных экстрактов на нитроцеллюлозные фильтры проводили иммуноблоттинг с антителами к гистону НЗ и актину, соответственно. Получение и оценка качества таблеток цифетрелина

Таблетки цифетрелина получали на лабораторном таблеточном прессе фирмы «Erweka» (Германия) с применением влажного гранулирования. В качестве гранулирующей жидкости использовали 5% крахмальный клейстер, в качестве вспомогательных веществ - лактозу, крахмал, целлюлозу микрокристаллическую, аэросил и поливинилпирролидон в различных соотношениях. Качество гранулята оценивали по сыпучести, насыпной плотности и углу естественного откоса по стандартным методикам. Масса таблеток составляла около 0,1 г.

Качество таблеток цифетрелина оценивали по методикам, регламентируемым ГФ XI, по следующим параметрам: внешний вид, подлинность, средняя масса и отклонение в массе, однородность дозирования, прочность на истирание, прочность на радиальное сжатие, распадаемость, количественное определение. Использовали оборудование фирмы «Erweka» (Германия): фриабиллятор типа TAR10, приборе ТВТ, прибор «качающаяся корзинка» серии ZT300, прибор для теста «растворение».

Определение подлинности и количественное определение таблеток цифетрелина проводили методом спектрофотометрии в УФ-области. В качестве растворителя использовали 95% спирт этиловый. Оптическую плотность раствора таблеток цифетрелина и PCO измеряли в диапазоне длин волн от 350 нм до 220 нм в кювете толщиной 10 мм относительно раствора сравнения. Электронный спектр поглощения цифетрелина имел выраженный максимум поглощения при длине волны 282 нм.

Результаты

Торможение роста культуры клеток МСР- 7 под действием цифетрелина

Изучение действия цифетрелина на рост клеток МСР-7 было начато с исследования диапазона концентраций: 10"9М, 10"8М, 10"7М, 10"6М, 10"5М и выявления ингибирующей концентрации (ИК50). Установлено, что при инкубации в течение 48 ч 50%-ное торможение роста культуры клеток МСР-7 достигается при концентрации цифетрелина 10"5М (51,1% выживших клеток), а в концентрации 10"6 М цифетрелин практически не подавляет рост

культуры (85,2% выживших клеток) (рис. 1). %

Рисунок 1. Влияние цифетрелина в диапазоне концентраций 10"9- 10"5М на рост и выживаемость клеток МСР-7 при инкубации 48 ч

10"

10"6 105

Цифетрелин

Был проведен сравнительный анализ антипролиферативного действия соматостатина («Sigma») и цифетрелина (рис. 2). Клетки MCF-7

культивировали без добавок (контроль), в присутствии 10"5М цифетрелина или соматостатина («Sigma») в течение 96 ч; через 48 ч, 72 ч и 96 ч

инкубации определяли количество живых клеток. Установлено, что, в отличие от цифетрелина, клетки MCF-7 были практически нечувствительны к действию соматостатина (рис. 2).

Количество

Рисунок 2.

Влияние -»-Контроль цифетрелина на — Соматостатин рост клеток MCF-7 "•" Цифетрелин

в сравнении с

соматостатином

(«Sigma»)

Время, ч

Индукция апоптош в культуре клеток MCF-7 под действием цифетрелина

В целях изучения механизма противоопухолевого действия цифетрелина in vitro с помощью метода проточной цитофлуориметрии был оценен уровень апоптоза, индуцируемого в культуре клеток MCF-7 под действием препарата. Клетки MCF-7 культивировали без добавок (К), в присутствии 10°М цифетрелина (Цф) или соматостатина (Сс) в течение 48 час. Установлено, что цифетрелин увеличивал количество апоптотических клеток в культуре вдвое (цифетрелин - 21,1% апоптотических клеток, контроль - 10,2% апоптотических клеток), в то время как соматостатин не индуцировал апоптоз (рис. 3).

Число апоптотических

клеток, %

1

15 -

Рисунок 3. Индукция апоптоза в культуре клеток МСР-7 под действием цифетрелина (Цф) и соматостатина (Сс).

о

к

Сс

Цф

С целью установить, может ли цифетрелин усиливать действие других противоопухолевых средств, было исследовано комбинированное действие цифетрелина и адриамицина - противоопухолевого химиопрепарата, широко применяемого в клинической практике. Клетки МСР-7 культивировали в присутствии 10"6М адриамицина, 10"5М или 5х10"6М цифетрелина или комбинации адриамицина и цифетрелина в течение 48 час. Оказалось, что в концентрации 10° М цифетрелин усиливал проапоптотическое действие адриамицина (цифегрелин/адриамицин - 36,5% апоптотических клеток, адриамицин - 21,8% апоптотических клеток). Более того, в концентрации 5х10"6М, не вызывающей апоптоз при отдельном применении цифетрелина, препарат также усиливал проапоптотическое действие адриамицина (цифетрелин/адриамицин - 32,4% апоптотических клеток, адриамицин -21,8% апоптотических клеток) (рис. 4).

Для изучения механизма цифетрелин-индуцированного апоптоза исследовали действие цифетрелина на некоторые ключевые белки, вовлеченные в апоптотические сигнальные пути, в частности -проапоптотический белок р53, поли(АДФ-рибоза)-полимеразу (РАЯР), расщепление которой под действием каспаз сопровождает апоптоз, и

транскрипционный фактор антиапоптотической активностью.

№-кВ,

обладающий

выраженной

Число апоптотических

клеток

45 -

40 -

35 -

30 -

25 -

20 -

15 -

10 -

5

0

К Адр

Цф1 Цф1

+Адр

Цф2 Цф2

+Адр

Рисунок 4. Индукция апоптоза в культуре клеток МСР-7 под действием цифетрелина (Цф) и адриамицина (Адр).

Цф1=5х10'6М; Цф2=10"5М.

Определение уровня р53 и РАИР проводили методом иммуноблоттинга в тотальных лизатах клеток МСР-7, полученных через 48 ч после культивирования с 10'5М цифетрелина или 10~6М адриамицина. Было обнаружено, что в отличие от адриамицина, цифетрелин не вызывал повышения уровня р53. При этом цифетрелин приводил к деградации РАЯР, сопоставимой с таковой при действии адриамицина, что свидетельствует о р53-независимом пути индукции апоптоза под действием цифетрелина (рис. 5).

Цф

ю-5м

Адр

10-6М

РА(*Р

р53 Рисунок 5. Влияние цифетрелина (Цф) и адриамицина (Адр) на уровень р53 и РАР1Р в культуре Актин клеток МСР-7.

Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов.

Анализ влияния цифетрелина на транскрипционную активность ОТ-кВ методом репортерного анализа показал, что за 24 ч цифетрелин в концентрации 1(Г5М подавляет базальную активность ОТ-кВ примерно в 4 раза. Преинкубация клеток МСР-7 с цифетрелином в течение 20 ч с

тетрадеканоилфорболацетата (ТРА) на 4 ч приводит к подавлению ТРА-индуцированной активности №-кВ в 9 раз. При одновременном добавлении в среду цифетрелина и ТРА на 4 ч препарат подавляет ТРА-индуцированную активность №-кВ в 1,5 раза (рис. 6).

Активность №-кВ/люциферазы, отн. ед.

6000 -сппп _

При определении уровня NF-kB в ядерной фракции клеток MCF-7 методом иммуноблоттинга клетки культивировали с цифетрелином и/или ТРА. Было обнаружено, что под действием цифетрелина снижается как базальный, так и ТРА-индуцированный уровень NF-kB в ядрах клеток MCF-7 (рис. 7), т.е. снижение активности NF-kB развивается параллельно с уменьшением уровня его содержания в ядрах.

В целом, полученные данные свидетельствуют о противоопухолевой активности цифетрелина in vitro. Показано, что в культуре клеток MCF-7

последующим добавлением

в

среду индуктора NF-kB

Рисунок 6. Влияние цифетрелина (Цф) на транскрипционную активность NF-kB в клетках MCF-7

К Цф24ч ТРА ТРА+ ТРА+ Цф4ч Цф24ч

цифетрелин индуцирует апоптоз и усиливает проапоптотическое действие адриамицина. Установлено, что индуцированный цифетрелином апоптоз развивается по р53-независимому механизму и сопровождается ранним подавлением активности NF-kB и деградацией PARP.

NF-kB " Гистон НЗ

¡

К Цф24ч ТРА ТРА ТРА

+Цф4ч +Цф24ч

I

^ Рисунок 7. Влияние цифетрелина (Цф) на уровень NF-kB в ядрах клеток MCF-7. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов.

1

Противоопухолевая активность цифетрелина in vivo

| Противоопухолевая активность субстанции цифетрелина in vivo

1 изучена в диапазоне доз от 0,1 мг/кг до 120 мг/кг веса животного на трех | перевиваемых моделях опухолей (РШМ-5, Са 755 и АКАТОЛ) при I пероральном и подкожном введении в течение 5 дней с интервалом 24 ч.

На модели рака шейки матки РШМ-5 при пероральном введении в i дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг и 120 мг/кг цифетрелин имел выраженный непосредственный противоопухолевый эффект (65-90% ТРО), торможение ! роста опухоли сохранялось выше 50% до 19 дня после окончания лечения. Зависимости выраженности эффекта от дозы отмечено не было. При дозе цифетрелина 1 мг/кг торможение роста опухоли (ТРО) после окончания лечения составляло 73% и сохранялось выше 50% до 16 дня после окончания лечения, однако к концу наблюдения составляло всего 35%. При | подкожном введении цифетрелина в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг и 25 мг/кг был отмечен выраженный непосредственный эффект (74 - 84% ТРО), который сохранялся выше 50% до 16 дня после окончания лечения (59-63%) ТРО),

I Í

однако к концу периода наблюдения составлял не более 40%. Увеличение продолжительности жизни (УПЖ) животных было зафиксировано только при пероральном введении цифетрелина (табл. 1).

Таблица 1

Противоопухолевая активность цифетрелина на модели опухоли

РШМ-5 при пероральном и подкожном введении в режиме 5дн/24ч

Доза, мг/кг Пероралыю Подкожно

% ТРО, дни после окончания лечения % УПЖ % ТРО, дни после окончания лечения % УПЖ

1 5 8 12 16 19 1 5 8 12 16 19

120 65* 59* 70* 60* 62* 61* 21 - - - - - - -

25 83* 79* 80* 76* 70* 53 49* 78* 73* 67* 69* 59* 30 7

10 90* 80* 76* 75* 67* 54* 55* 84* 79* 72* 71* 63* 39 4

1 73* 69* 72* 68* 56* 35 35 74* 51* 57* 61* 57* 30 10

Примечание: * - достоверно к контролю при р < 0,05.

Сравнительный анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что на модели РШМ-5 предпочтительным является пероральный путь введения препарата в связи с более выраженным УПЖ и ТРО по сравнению с подкожным введением. Оптимальной суточной дозой является доза 10 мг/кг, поскольку снижение дозы до 1 мг/кг ведет к снижению ТРО и УПЖ, а повышение дозы до 25 мг/кг и выше не дает никаких преимуществ по указанным критериям эффективности.

На модели аденокарциномы молочной железы Са-755 были получены сходные данные. При пероральном введении цифетрелина в дозах 1-120 мг/кг отмечен выраженный непосредственный эффект (69-87% ТРО), который сохранялся выше 50% ТРО до 16 дня после окончания лечения. Максимальное увеличение продолжительности жизни (59%) отмечено на дозе 10 мг/кг. При подкожном введении цифетрелина в дозах 1-25 мг/кг

торможение роста опухоли было сравнимо с таковым при пероральном введении препарата, однако УПЖ получено только на дозе 25 мг/кг (табл. 2).

Таблица 2

Противоопухолевая активность цифетрелина на модели опухоли

Са-755 при пероральном и подкожном введении в режиме 5дн/24ч

Доза, мг/кг Перорально Подкожно

% ТРО, дни после окончания лечения % УПЖ % ТРО, дни после окончания лечения % УПЖ

1 5 8 12 16 1 5 8 12 16

120 86* 87* 76* 68* 58* 53* - - - - - -

25 72* 81* 80* - 77* 43* 82* 90* 84* - 83* 78*

10 69* 87* 84* - 81* 59* 80* 66* 69* 60* 60* 12

1 87* 77* 81* 55* 50* 28* 81* 56* 61* 59* 60* 10

Примечание: * - достоверно к контролю при р < 0,05.

На модели AKATOJI были исследованы дозы 0,1, 1 и 10 мг/кг. Устойчивое торможение роста опухоли выше 50%, сохранявшееся на протяжении всего периода наблюдения (до 29 дня после окончания лечения) и сопровождавшееся увеличением продолжительности жизни, наблюдалось только при пероральном введении цифетрелина в дозах 1 и 10 мг/кг. По указанным критериям доза 10 мг/кг не имела преимуществ по сравнению с более низкой дозой 1 мг/кг. На основании этого можно сделать вывод, что на модели AKATOJI предпочтительным также является пероральное введение препарата, а оптимальная суточная доза составляет 1 мг/кг (табл. 3).

Таким образом, по результатам исследований противоопухолевой активности цифетрелина т vivo, можно сделать вывод, что на изученных моделях опухолей предпочтительным является пероральный путь введения цифетрелина, а оптимальная терапевтическая доза составляет 10 мг/кг на модели РШМ-5 и Са755 и 1мг/кг на модели AKATOJI.

Таблица 3

Противоопухолевая активность цифетрелина на модели опухоли АКАТОЛ при пероральном и подкожном введении в режиме 5дн/24ч

Путь введения Доза мг/кг % ТРО, дни после окончания лечения % УПЖ

1 5 8 12 16 19 22 26 29

Перорально 10 68* 51* 63 51* 58* 60* 52* 52* 51* 13

1 72* 56* 58* 57* 61* 59* 58* 55* 57* 43*

0,1 69* 48* 48* 37 41 47 49* 25 47 б/э

Подкожно 10 79* 65* 65* 57* 56* 53* 47* 51* 50* 39*

1 62* 55* 62* 58* 58* 62* 43* 55* 47* 3

0,1 63* 59* 63* 60* 60* 63* 62* 61 64* б/э

Примечание: * - достоверно к контролю при р < 0,05, б/э - без эффекта.

Исследование возможности создания лекарственной формы цифетрелина для нерорального применения

Учитывая терапевтические дозы, определенные в экспериментах in vivo на мышах, в таблетированную лекарственную форму цифетрелина была заложена доза 6 мг.

Технологические характеристики субстанции цифетрелина исключают возможность прямого прессования, поэтому нами был выбран метод таблетирования с предшествующим влажным гранулированием. В качестве гранулирующего агента использовали 5% крахмальный клейстер. Вследствие малой дозы цифетрелина в таблетке для обеспечения необходимого объема и массы таблетки, а также оптимальных характеристик технологического процесса в состав лекарственной формы были введены вспомогательные вещества: лактоза, крахмал, целлюлоза микрокристаллическая, аэросил, поливинилпирролидон, опудривающая смесь (талыемагния стеаратжрахмал в соотношении 3:1:6) в различных соотношениях.

По результатам оценки распадаемости и прочности таблеток, полученных из пяти модельных смесей, был отобран состав с оптимальными технологическими характеристиками: цифетрелина - 0,006 г лактозы - 0,055 г

целлюлозы микрокристаллической - 0,005 г крахмала - 0,025 г поливинилпирролидона - 0,005 г опудривающей смеси - 0,010 г

В соответствии с выбранным составом была произведена наработка гранулята. Сыпучесть гранулята составила 7,5 г/с, насыпная плотность - 0,65 г/см3, а угол естественного откоса - 34,7°. Диаметр гранул составлял около 0,8 мм, гранулят не электризовался. В связи с удовлетворительными технологическими характеристиками гранулята была проведена наработка таблеток цифетрелина для дальнейшего изучения.

Основные критерии качества таблеток цифетрелина были выбраны на основании требований ГФ XI. Результаты оценки качества таблеток цифетрелина приведены в таблице 4.

При оценке подлинности таблеток цифетрелина раствор лекарственной формы цифетрелина в 95% спирте этиловом имел выраженный максимум поглощения при длине волны 282 нм (как и PCO). Предварительно установлено, что зависимость оптического поглощения раствора цифетрелина в 95 % спирте этиловом от концентрации подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера. При проведении количественного определения среднее содержания цифетрелина в таблетках наработанной серии составляло 0,0058 г.

По результатам оценки качества таблеток цифетрелина был сделан вывод, что предложенный состав обеспечивает соответствие показателей качества лекарственной формы требованиям ГФ XI. Таблетки цифетрелина

наработанной серии были использованы в исследовании противоопухолевой активности лекарственной формы цифетрелина ш vivo.

Таблица 4

Оценка качества таблеток цифетрелина

Показатель Требования ГФ XI Результаты оценки модельных таблеток цифетрелина

Описание (внешний вид) Круглые таблетки белого цвета с глянцевой поверхностью, двояковыпуклые, с ровными, без сколов краями, без запаха

Средняя масса таблетки 0,925-0, 1075 г 0,1059

Отклонение в средней массе ±7,5% ± 5,5%

Однородность дозирования ±15%, ни в одной таблетке более ±25%. от-7% до+9%

Распадаемость не более 15 минут для таблеток без оболочки не более 9 минут

Прочность на истирание не менее 97 % 99%

Растворение не менее 75 % за 45 мин. в воде, если иное не указано в частных статьях не менее 96% за 45 мин. в 95% спирте этиловом

Количественное содержание 5,4 - 6,6 мг 5,8 мг

Исследование противоопухолевой активности таблеток цифетрелина

Сравнение противоопухолевой активности цифетрелина в таблетках и в субстанции проводилось на модели РШМ-5 в дозах 10 мг/кг и 1 мг/кг при различных режимах введения. Установлено, что при всех изученных режимах введения лекарственная форма цифетрелина не уступала

субстанции по эффективности (по показателю торможения роста опухоли) (табл. 5).

Таблица 5

Противоопухолевое действие субстанции и таблеток цифетрелина на модели опухоли РШМ-5 при пероральном введении в различных

режимах

Доза, мг/кг Режим дозирования Таблетки/ субстанция % ТРО, дни после перевивки опухоли

7 11 14 18 22 25

10 5 дн. с инт. 24 ч, 1 курс Субстанция 90* 80* 76* 75* 67* 54

Таблетки 84* 82* 87* 74* 60* 56

5 дн. с инт. 24 ч, 2 курса с инт. 7 дн. Субстанция 77* 82* 88* 91* 79* 78*

Таблетки 70* 76* 73* 50 63* 59*

1 р/нед в теч. 3 нед. Субстанция 79* 74* 56 62* 66* -

Таблетки 88* 92* 82* 67* 69* 70*

1 5 дн. с инт. 24 ч, 2 курса с инт. 7 дн. Субстанция 70* 61* 69* 79* 68* 53

Таблетки 80* 89* 78* 69* 73* 69*

10 дн. с инт. 24 ч, 1 курс Субстанция 59* 69* 51 63* 58* 55

Таблетки 67* 85* 70* 57* 57* 64*

Примечание: * - достоверно к контролю при р < 0,05; «-» - нет данных.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что использованные при получении таблеток цифетрелина вспомогательные вещества не снижают его противоопухолевый эффект при пероральном введении.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Цифетрелин подавляет пролиферацию клеток рака молочной железы человека MCF-7 в культуре, ИК50 составляет 10"3М.

2. В концентрации 10"5М цифетрелин увеличивает количество апоптотических клеток в культуре MCF-7 в два раза, а также усиливает проапоптотическое действие адриамицина.

3. Апоптоз, индуцируемый цифетрелином в культуре клеток MCF-7, протекает по р53-независимому механизму и сопровождается деградацией PARP и ранним подавлением базальной и индуцированной активности транскрипционного фактора NF-kB. Одновременно с этим наблюдается снижение содержания NF-kB в ядрах клеток.

4. Продемонстрирован выраженный противоопухолевый эффект цифетрелина (65-90% ТРО) на моделях солидных опухолей мышей (РШМ-5, Са-755, АКАТОЛ).

5. На моделях опухолей РШМ-5, Са-755, АКАТОЛ выявлен рациональный путь введения цифетрелина - пероральный и рекомендован диапазон терапевтических доз -1-10 мг/кг.

6. Предложен состав лекарственной формы цифетрелина, обеспечивающий соответствие показателей качества таблеток требованиям Государственной Фармакопеи XI изд.

7. Установлено, что на модели опухоли РШМ-5 при пероральном введении в дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг таблетки цифетрелина не уступают субстанции по эффективности: ТРО для таблеток составляет 67-88%, а для субстанции - 59-90%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Михаевич, Е.И. Синтез и противоопухолевая активность Цифетрелина при пероральном введении / Смирнова А.П., Сушинина Л.И., Устинкина C.B., Шпрах З.С., Будько А.П., Смирнова Л.И., Яворская

Н.П., Голубева И.С., Михаевич Е.И., Смирнова З.С. // Российский биотерапевтический журнал. - 2009 г. - Том 8. - № 2. - С. 18. 2. Михаевич, Е.И. Разработка ЛФ Цифетрелина для перорального применения / Михаевич Е.И., Полозкова А.П., Партолина С.А. и др. // Российский биотерапевтический журнал. - 2010 г. - Том 9. - №2.- С.

3. Михаевич, Е.И. Индукция апоптоза в клетках рака молочной железы МСБ-7 под действием нового аналога соматостатина цифетрелина / Красильников М.А., Михаевич Е.И. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011 г. - № 12. - С. 45-49.

4. Михаевич, Е.И. Гистологическое исследование внутренних органов мышей с перевиваемыми опухолями при применении Цифетрелина / Меркулова И.Б., Маркова Н.П., Голубева И.С., Абрамова Т.В., Михаевич Е.И., Смирнова Л.И.// Российский биотерапевтический журнал. - 2011 г. - Том 10. - № 1. - С. 39-40.

5. Михаевич, Е.И. Исследование противоопухолевого действия аналога соматостатина - Цифетрелина / Михаевич Е.И., Яворская Н.П., Голубева И.С. и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011г. - № 10. - С. 68-72.

6. Михаевич, Е.И. Определение терапевтической дозы и оптимального режима дозирования Циферелина при пероральном введении / Яворская Н.П., Голубева И.С., Михаевич Е.И. // Российский биотерапевтический журнал. - 2011 г. - Том 10. - № 1. - С. 73.

7. Михаевич, Е.И. Исследование возможности создания лекарственной формы цифетрелина для перорального применения / Михаевич Е.И, Яворская Н.П., Голубева И.С. и др. // Российский биотерапевтический журнал.-2012г.-Том 11.- № 1.-С.З-6.

89.

Подписано в печать 17.02.12 Формат 60x84/16 Бумага офисная «БуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ №311 Отпечатано на участке множительной техиники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24