Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Методологические основы совершенствования системы микробиологического контроля качества лекарственных средств

На правах рукописи

ГУНАР Ольга Викторовна

Методологические основы совершенствования системы микробиологического контроля качества лекарственных средств

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

0034Б8513

Пермь- 2009

003468513

Работа выполнена в Институте стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный Центр Экспертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора и ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному

развитию »

Научные консультанты: доктор фармацевтических наук, профессор Одегова Татьяна Федоровна доктор медицинских наук, профессор Кочеровец Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Ярыгина Татьяна Ивановна, ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна, ФГУ

«Научный Центр Экспертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора

доктор медицинских наук, профессор Шендеров Борис Аркадьевич, ФГУН МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Пятигорская государственная

фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « 26_» мая 2009 г. в 13 ч. на заседании диссертационного совета Д. 208.068.01 в ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 614990, ГСП -277, г. Пермь, ул. Ленина, 48. Тел./факс (342) 2129006.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия по адресу: 614077, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Автореферат разослан (^Т^ЛтЛ-Л- 2009г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, , /

кандидат фармацевтических наук, доцент I Липатникова И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На современном этапе развития отечественной фармацевтической промышленности и в связи с введением на фармацевтических предприятиях России правил надлежащей производственной практики (GMP) изменяются подходы к контролю качества лекарственных препаратов (ЛП) и субстанций. Необходимость контроля качества лекарственных средств (J1C) обосновывается важностью обеспечения их безопасности и эффективности, т.е. снижения риска возникновения побочных реакций при применении потребителем (Акимочкин В.Е., 2003). «Качество должно быть встроено в лекарственный препарат» (Брахт К. 2004, Pharmaceutical с GMP 2002). В материалах международной конференции по гармонизации - ICH Q10 (2008г) вводится новое понятие «фармацевтическая система качества», по которой на всех этапах необходимо оценивать вероятность риска выпуска некачественных Л С. Особое место при этом занимают биологические методы исследований фармацевтических препаратов, относящиеся в первую очередь к области фармакологии и микробиологии (Попов А.Ю. 2004, Хабриев Р.У.2005).

Особенностью микробиологических видов анализа является специфика объекта исследования - живого микроорганизма, обладающего индивидуальными свойствами.

Учитывая прямую зависимость микробиологических показателей с безопасностью ЛС, результаты испытаний продукции должны быть максимально точными и надежными.

Основными факторами, влияющими на вариабельность результатов микробиологических исследований, являются: специфичность пробы (физико-химические свойства НЛС и биологические особенности выделяемой популяции микроорганизмов), компетентность персонала и условия его работы, отбор образцов и подготовка пробы, условия инкубации, характеристики используемых питательных сред. Последние три фактора подлежат обязательной стандартизации (ИСО 13843:2000) и валидации, что подтверждается общей тенденцией по совершенствованию фармакопейных методов контроля.

Проблема разработки, обоснования и установления нормативов допустимого содержания микроорганизмов в ЛС тесно связана с выбором методов их выявления и идентификации, обусловливающих эффективность анализа. Дальнейшее расширение номенклатуры ЛП и субстанций, внедрение правил вМР, вЬР и систем менеджмента качества на фармацевтических производствах и в контрольных службах требуют стандартных подходов к определению качества ЛС по показателю «Микробиологическая чистота», т.е. создания системы микробиологического контроля качества (СМКК) ЛС. До настоящего времени этот процесс сдерживался рядом объективных трудностей:

постдипломная профессиональная подготовка и усовершенствование специалистов проводились в рамках Государственного образовательного стандарта по специальности «бактериология» для сотрудников, окончивших только медицинские ВУЗы;

не достигнута должная гармонизация с базовыми материалами и положениями Европейской Фармакопеи в отношении классификации ЛС с учетом их происхождения и способа применения;

не разработан системный и универсальный алгоритм микробиологического контроля различных категорий ЛП, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ;

отсутствовали адаптированные к целям исследования методики и схемы определения качества ЛРС по показателю «Микробиологическая чистота»;

немногочисленные отечественные публикации о современном состоянии СМКК ЛС оставались разрозненными и разноплановыми по информации. Представленные в них результаты в силу различного методологического подхода и лабораторного оснащения авторов были часто несопоставимы;

не разработана научно-практическая оценка видового состава грибов-контаминантов ЛС.

Таким образом, возникла необходимость комплексного решения организационно-методических, теоретических и практических проблем, связанных с микробиологическим контролем качества ЛС. Их решение направлено на создание системы микробиологического контроля качества

лекарственных средств (СМКК ЛС), как части системы Государственного контроля качества ЛС. Анализ и перечень приведенных положений определяет актуальность проблемы и практическую значимость темы настоящей работы.

Цель работы. Целью настоящего исследования является формирование теоретических основ и разработка современных методологических подходов к микробиологическому контролю качества ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ с учетом положений СМР и ОЬР в Российской Федерации.

Задачи исследования:

1. Изучить качество ряда ЛП, в том числе не контролируемых ранее растительных ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ по ведущему показателю безопасности - «Микробиологическая чистота».

2. Определить состав основной микрофлоры, содержащейся в различных лекарственных формах, и идентифицировать выделенные грибы.

3. Гармонизировать с Европейской Фармакопеей нормы допустимой микробной загрязненности ЛП; разработать требования к качеству ЛРС, субстанций и вспомогательных веществ по показателю «Микробиологическая чистота».

4. Усовершенствовать методы определения антимикробного действия ЛС и изучить антимикробное действие ЛС различных лекарственных форм и фармакотерапевтических групп.

5. Обосновать и внедрить в практику микробиологических исследований при контроле качества ЛС высокоэффективные методы количественного определения микроорганизмов, а также способы выделения и идентификации отдельных видов бактерий-контаминантов ЛС.

6. Сравнить базовые характеристики питательных сред отечественного и импортного производства, используемых для контроля качества ЛС; обосновать рецептуры и изучить качество соево-казеинового агара, агара с бриллиантовым зеленым и среды типа агара Мак-Конки.

7. Создать систему микробиологического контроля качества (СМКК) ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ, выработать

концепцию рационального построения и функционирования, определить ее структуру.

Научная новизна. Создана система микробиологического контроля качества (СМКК) ЛС, определена ее структура и концепция рационального построения и функционирования. Выполнен дифференцированный подход к установлению предельных норм допустимой микробной загрязненности ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ. Осуществлена классификация препаратов, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ по категориям с учетом происхождения и способа применения. Определены пути повышения информативности микробиологических исследований при контроле качества ЛС.

Установлены особенности исследования микробиологической чистоты ЛРС в соответствии с их физико-химическими, биологическими свойствами, назначением и нормами микробной загрязненности для каждой категории растительных препаратов.

Выявлено антимикробное действие у ряда ЛС из различных фармакотерапевтических групп: нейротропные, антидепрессанты, седативные, антигистаминные, спазмолитические, гипотензивные, сосудорасширяющие, не наркотические противовоспалительные, болеутоляющие и жаропонижающие ЛС.

Впервые проведена углубленная микологическая экспертиза грибов-контаминантов ЛС, при этом выявлена их обсемененность 74 видами грибов из 16 родов, в 28,9% изученных серий ЛС содержание грибов превышало допустимые нормы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанные, усовершенствованные и внедренные в процессе выполнения работы алгоритм, этапы, схемы и методы микробиологических исследований позволили стандартизовать условия испытаний и обеспечить повышение эффективности контроля качества ЛС на фармацевтических предприятиях России и в контрольной службе.

Предложен современный методологический подход к микробиологическому анализу качества ЛС, основанный на использовании комплекса стандартных методов, позволяющих: достоверно установить количество аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, выделить из ЛС и идентифицировать отдельные виды нормируемых микроорганизмов.

Разработан эффективный и экономичный чашечный агаровый метод (модифицированный глубинный) количественного определения в ЛС аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов. Валидация предложенного метода позволила рекомендовать его использование наравне с двухслойным, поверхностным и глубинным методами для получения достоверных, воспроизводимых количественных результатов контроля качества ЛС. Предложены методы количественного и качественного определения микроорганизмов-контаминантов различных лекарственных форм медицинских препаратов с учетом подготовки образцов перед анализом (материалы исследований внедрены в ОФС 42-0067-07 ГФ XII изд.).

Усовершенствованы методы определения антимикробного действия различных ЛС, включая разработку альтернативного метода репликаций для водонерастворимых и окрашенных ЛП. Детализированы подходы к нейтрализации антимикробного действия.

Данные сравнительного изучения ряда сухих питательных сред для контроля микробной загрязненности ЛС различных отечественных производителей свидетельствуют о возможности их использования наравне с импортными сухими и готовыми к употреблению питательными средами (материалы включены в ОФС 42-0067-07 ГФ РФ XII изд.).

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены Изменения №1, №2, №3 к ГФ XI изд., ВФС 42-3455-99 «Определение ростовых свойств питательных сред, используемых для испытания на стерильность и микробиологическую чистоту лекарственных средств»; ВФС 42-3454-99 «Метод наиболее вероятных чисел»; ОФС 42-0016-04 «Методы микробиологического контроля лекарственных растительных средств, состоящих из одного вида сырья

или нескольких (сборы)- фасованная продукция, а также растительного сырья «ангро»»; ОФС 42-0066-07 «Стерильность»; ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота»; ОФС 42-0069-07 «Определение эффективности антимикробных консервантов ЛС» ГФ РФ XII изд.

Методы микробиологического контроля качества ЛС апробированы и внедрены на фармацевтических предприятиях: ОАО «Красногорсклексредства» (акт о внедрении от 26.12.2006), ООО «Бион» (акт о внедрении исх. №458 от 31.10.2006), ЗАО «ФГЖ ФармВИЛАР» (акт о внедрении исх. №28 от 31.01.07), ОАО «АЗТ Фарма К.Б.»(акт о внедрении исх.№288 от 15 сентября 2006г).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в ИСКЛС ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора в рамках отраслевой научно-исследовательской программы НЦ ЭГКЛС «Экспертиза и Государственный контроль лекарственных средств», утвержденной 8 декабря 2000 г. и в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пермская государственная академия» (номер государственной регистрации темы 01.9.50007417)

Апробация работы. Результаты и основные положения работы доложены на Международных научно-практических конференциях «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем» (г. Махачкала, 2001г., 2003 г.), на обучающих семинарах ГНЦА «Современные требования к организации и деятельности микробиологических лабораторий отделов контроля качества фармацевтических предприятий» (г. Москва, 2001 г., 2003 г., 2008 г.), на IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV Конгрессах «Человек и лекарство» (г. Москва, 2002 г., 2003г., 2004 г., 2005г„ 2006 г., 2007г., 2008г.), на XV Международном симпозиуме «Медико-экологическая безопасность, реабилитация и социальная защита населения» (Италия, 2004 г.), на 7 и 8 Всероссийских конференциях по биомеханике (г. Нижний Новгород, 2004г., 2006г.), на научно-практической конференции с международным участием «Роль клинической микробиологии в профилактике внутрибольничных инфекций» (г. Москва, 2004 г.), на VII съезде фармацевтов Республики Беларусь «Фармация

XXI века» (г. Витебск, 2004г.), на Международной научно-практической конференции Санкт-Петербургской хим.-фарм. академии «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем, будущем» (г. Санкт-Петербург, 2004 г.), на ХУ1-Й Международной конференции АСИНКОМ «Правила йМР: задачи и опыт внедрения. Техника чистых помещений» (г. Москва, 2005 г.), на 60-й, 6]-й и 63-й региональных конференциях по фармации и фармакологии (г. Пятигорск, 2005, 2006, 2008 г.г.), на II Всероссийском съезде фармацевтических работников (г.Сочи, 2005 г.), на Международного съезде «Фигофарм-2005» (г. Санкт-Петербург, 2005 г.), на 4 заседаниях секции медицинской и фармацевтической микробиологии Московского Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2006 г., 2008 г.), на Всероссийских научно-практических конференциях «Стандартизация в оториноларингологии» (г. Санкт-Петербург, 2007 г., 2009 г.).

Публикации. Основное содержание работы представлено в 63 публикациях, из них 22 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК, статей и тезисов докладов в сборниках и материалах научных конференций различного уровня.

Положения, выносимые на защиту:

1. Методологический подход к исследованию качества ЛП, растительных лекарственных средств, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ по ведущему показателю безопасности - «Микробиологическая чистота».

2. Разработка норм и методов определения микробиологической чистоты ЛРС, позволяющие объективно оценить их качество.

3. Микологическая экспертиза при микробиологическом анализе ЛС.

4. Определение антимикробного действия ЛС - необходимый этап исследований для снижения риска ложных результатов микробиологических исследований фармацевтических препаратов и субстанций.

5. Разработка эффективного и экономичного метода количественного определения микроорганизмов-контаминантов ЛС.

6. Экспериментальное обоснование базовых характеристик питательных сред импортного и отечественного производства для контроля загрязненности ЛС.

7. Концептуальная модель СМКК ЛС в сферах регистрации, производства и контроля качества ЛС.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 285 страницах машинописного текста, содержит 69 таблиц, 31 рисунок, включает введение, обзора литературы (глава 1), экспериментальную часть (главы 2-8) список цитируемой литературы, содержащий 284 библиографических источника, из которых 131 работа зарубежных авторов, и приложения.

Основное содержание работы Объекты и методы исследования

Исследования проведены в 1992-2007 гг. с использованием отечественных и зарубежных ЛП, субстанций, вспомогательных веществ, тест-штаммов микроорганизмов, питательных сред - сухих отечественного и импортного производства, готовых к употреблению, приготовленных в лаборатории микробиологии ИСКЛС. Объектами исследования служили: 1. Лекарственные препараты, субстанции и вспомогательные вещества.

Исследовано качество и обобщены результаты испытания 1 1.530 серий различных лекарственных форм: мазей, капель, лейкопластырей, трансдермапьных терапевтических систем, вагинальных суппозиториев, таблеток, капсул, порошков, гранул, плиток, суспензий, сиропов, растворов, масел, настоек, соков, жидких, сухих и густых экстрактов, эликсиров, бальзамов, свечей, ЛРС в виде пачек, пакетов, фильтр-пакетов, брикетов и средств «ангро», субстанций для производства стерильных, НЛС, вспомогательных веществ, а также лекарственных растительных препаратов 50 наименований 793 серий. Исследованные образцы ЛРС представлены:

• цветками: ноготков, пижмы, гибискуса, бессмертника песчаного, ромашки, липы;

• корами: крушины, дуба;

• корнями и корневищами: аира, девясила, змеевика, солодки, одуванчика, валерианы, алтея;

• травами: пастушьей сумки, пустырника, горца птичьего, тысячелистника, череды, чистотела, чабреца, фиалки, мелиссы лекарственной, зверобоя, эрвы шерстистой, хвоща полевого, сушеницы топяной, душицы, золототысячника, полыни горькой;

• листьями: эвкалипта прутовидного, березы, мяты перечной, брусники, мать-и-мачехи, крапивы, толокнянки, шалфея, сенны, подорожника большого;

• плодами и семенами: боярышника, шиповника, черемухи, укропа пахучего, льна, кориандра, тыквы, рябины, почек березовых.

Изучено качество жидких лекарственных средств, содержащих спирт этиловый от 14% до 95% (настойки, жидкие экстракты, эликсиры, бальзамы и др.) в количестве 20 наименований 269 серий.

Для проведения микологической экспертизы дрожжевые и плесневые грибы выделены из JIC, изготовленных из сырья синтетического, природного происхождения и лекарственного растительного: брикетов цветков календулы, травы пустырника, травы череды, листа сенны, листа крапивы, травы душицы, листьев брусники, зверобоя, толокнянки, пижмы, алтея, коры дуба, морской капусты, побегов багульника болотного, семян льна. Из группы вспомогательных веществ исследовали крахмал картофельный, муку пшеничную, тальк, сахар, порошок какао. Всего испытано 264 образца (191 серия HJIC 36 наименований, 37 серий JIPC 15 наименований и 36 партий вспомогательных материалов 5 наименований).

2. Тест-микроорганизмы: Bacillus cereus АТСС 10702, Bacillus subtilis АТСС 6633, Escherichia coli АТСС 25922, E. coli 3912/41 (055: K59), E. coli 168/59 (Olli: K58,), Enterobacter cloaceae ГИСК A-186, Salmonella abony IHE 103/39, 5. enteritidis ATCC 11272, S. typhi H 901, S. paratyphi A 225, S. paratyphi В 506, S. paratyphi В 8006, S. typhimurium 301, S. abortus bovis 2, S. dublin 42, S. gallinarum 665, S. typhi bismuth, S. sonnei "S-form", S.flexnerila N8516, Citrobacterfrondii N 33/57, Enterobacter aerogenes 417, Serratia marcescens 1, Klebsiella

rhinoscleromatis КЗ NCTC 5046, Proteus mirabilis Сиднее, Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453, P. aeruginosa ATCC 9027, P. aeruginosa 27/99, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, S. aureus Wood-46 , S. saprophyticus CCM 186, Candida albicans NCTC 885-653, C. albicans ATCC I-0/11, C. albicans CCM 55/79, Aspergillus niger ATCC 9642, Penicillium verrucosum var. cyclopium В KM F-265, Rhodotorula glutinis В KM Y-332, Saccharomyces cereviseae BKM Y-2549, S. cereviseae BKM Y-56.

3. Питательные среды. Использовали сухие питательные среды отечественных и зарубежных производителей, питательные агары и бульоны из сухих сред отечественного производства для контроля микробной загрязненности №№ 1-15 (производства ФГУ ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии п. Оболенск Московской обл., ОАО «Микроген» г. Махачкала, ОАО «Биотехновация» г. Москва, ОАО «Биомед» п. Петрово-Дальнее), а также производства фирмы «Merck»: соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest Agar); соево-казеиновый (Casein Soya Bean Digest Broth), лактозный (Lactose Monohydrate Broth), Мосселя (Enterobacteria Enrichment Broth - Mossel) и Мак-Конки (MacConkey Broth) бульоны; Мосселя (Crystal violet, Neutral Red, Bile Agar with Glucose) и Мак-Конки (MacConkey Agar) агары; тетратионатный (Tetrathionate Bile Brilliant Green Broth) бульон; дезоксихолат-цитрат агар (Deoxycholate Citrate Agar); ксилоза-лизин-дезоксихолат агар (Xylose, Lisine, Deoxycholate Agar); агар с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, с лактозой и сахарозой (Brilliant Green Agar Medium); трехсахарный агар с солями железа (Triple Sugar-Iron-Agar); цетримидный агар (Cetrimide Agar) и (Pseudomonas Agar Medium for Detection оГ Pyocyanin), а также Vogel - Johnson Agar Medium, Baird - Parker Agar И Sabouraud Glucose Agar with antibiotics.

При выделении микроорганизмов из ЛС использовали методы: чашечные агаровые, мембранной фильтрации на установке фирмы «Сарториус», пробирочные - метод наиболее вероятных чисел (НВЧ).

Для таксономического определения плесневые грибы культивировали на среде Чапека, на 10-12 сутки снимали морфологические характеристики колоний: измеряли диаметр, отмечали окраску колонии и реверзума, степень

развития воздушного мицелия, высоту колонии, наличие тяжей, каймы, экссудата, склероциев и клейстотециев. Для определения типа конидиеносцев, формы, величины и цвета конидий, способа конидиогенеза готовили препараты для микрокопирования с использованием 20% уксусной кислоты. Идентификацию видов плесневых грибов проводили с помощью определителей по результатам микроскопического исследования и морфологическим признакам. Определение дрожжевых грибов проводили с помощью системы API 20С AUX (Франция).

В работе применяли оптический стандарт мутности (the international reference preparation of opacity of 10 international units, Лондон, Великобритания), камеру Горяева, микроскоп «Jnaval», оснащенный цифровой видеокамерой Wat-221S производств «Watec» (Япония) с программой ВидеоТесТ - Размер 5,0.

Экспериментальные исследования проводили на искусственно и естественно контаминированных образцах.

Результаты исследования и их обсуждение

Сравнительная характеристика степени микробиологической чистоты различных лекарственных средств.

На первом этапе проводили расчет минимального количества необходимых исследований с помощью критерия Пирсона. При этом число наблюдаемых групп две, ожидаемая минимальная высеваемость 1%, а предполагаемый индекс эффективности используемой питательной среды 1,5. N= 3,84- 2,1,5,(1+1,5) -100/ 1-(М,5)2 = 11520

Таким образом, для достоверной оценки результатов контроля качества ЛС необходимо рассмотреть не менее 11520 образцов. Согласно с этим расчетом изучали микробиологическую чистоту ЛП, субстанций и вспомогательных веществ 11530 серий. На основе обобщения результатов установлен достаточно высокий уровень качества как отечественных, так и зарубежных ЛС (табл. 1).

Таблица 1

Результаты изучения качества НЛС но показателю «Микробиологическая

чистота»

Категория Качество лекарственных средств по годам

ЛП и субстанции 2001 г. 2002 г.

Количество Процент Количество Процент

исследован- брака исследован- брака

ных серии ных серии

ЛИ для местного 704 1,0 689 1,2

применения

Синтетические НЛС 3260 0,3 2692 1,0

Природные НЛС 735 0,8 469 1,9

Субстанции для 189 - 190 0,01

изготовления

стерильных ЛГ1

Субстанции для НЛС 772 0,5 721 1,0

ЛРС 272 1,9 312 3,5

Установлено, что наибольшее число несоответствующих требованиям НД препаратов выявлены среди ЛРС (1,9 и 3,5% соответственно в 2001 и 2002 г.г.) и препаратов, изготовленных из природного сырья (0,8 и 1,9%); наиболее качественными являются субстанции для производства стерильных ЛС. ¡Менее 1% брака по показателю «Микробиологическая чистота» выявлено среди препаратов из синтетических субстанций и самих субстанций для производства НЛС, а также ЛС для наружного и местного применения.

На следующем этапе проведено сравнительное изучение проконтролированных и забракованных ЛП (рис.1-3) по показателю «Микробиологическая чистота» с 1993г. по 2007г.

□ зарубежных серий ® отечественных серий

40000; 30%

10000; 20%

Рис. I - Соотношение количеств исследованных серий отечественных и зарубежных ЛС за периоде 1993г. по 2007г.

За указанный период изучено качество около 50000 серий ЛС (рис.1), при этом 20% из них приходилось на зарубежные препараты. На рис.2 и 3 представлено распределение по годам в % ЛС, несоответствующих требованиям.

Рис.2 - Количество отечественных ЛС, не соответствующих требованиям по показателю «Микробиологическая чистота» в %.

Обозначения: но оси абсцисс - годы, но осн ординат — % исследованных серии ЛС, не соответствующих требованиим но показателю «Микробиологическая чистота»

2.5 2 1.5

1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007

Рис. 3- Количество зарубежных ЛС, не соответствующих требованиям по показателю «Микробиологическая чистота», %. Обочначении:те же, что на рис. 2

Из представленных данных следует, что в среднем число несоответствующих требованиям нормативной документации серий колебалось около 1%, максимальное количество брака приходилось на 1995г и 2002г. - для

отечественных препаратов, на 1994, 1995, 1998 г.г. - для зарубежных лекарственных средств. Проведенный анализ несоответствующей требованиям продукции показал, насколько своевременно были изменены подходы к нормированию микробиологической чистоты ЛС и утверждены разработанные нами Изменения №1 и №2 к ГФ XI изд. (1995 г. и 2001г. соответственно). Проведенное научно-экспериментальное изучение микробиологической чистоты ЛС свидетельствует о высокой значимости данного показателя. Внедрение дифференцированных норм допустимой микробной загрязненности ЛС и введение требований к качеству субстанций и вспомогательных веществ вместе с методами выделения микроорганизмов-контаминантов позволили выявить большее количество некачественных препаратов, в сравнении с ранее применяемыми методами и тем самым не допустить их попадание к потребителю.

Основываясь на многолетнем всестороннем изучении качества ЛС, отобраны препараты, представляющие особую группу, а именно жидкие препараты, изготовленные на основе спирта этилового (настойки, бальзамы, экстракты и др.). Результаты изучения их качества представлены в табл. 2.

Исследование жидких ЛП показало: из препаратов 20-ти наименований 264 серий в 9-ти наименований 62 серий (23,5%) микроорганизмы выделены не были (менее 10 КОЕ/мл). В то же время уровень микробной загрязненности препаратов 4-х наименований 95 серий (36%) превышал допустимые пределы: не более 10000 КОЕ аэробных бактерий и 100 КОЕ грибов в 1 мл при отсутствии P. aeruginosa, S. aureus, Е. coli, видов Salmonella, других кишечных бактерий -не более 100 КОЕ в 1 г (мл). К ним относились бальзам «Московия», настойка женьшеня, настойка календулы, экстракт элеутерококка. Следует отметить, что даже наличие 70% спирта этилового не ингибировало рост спорообразующих бактерий и некоторых грибов. Важным результатом проведенных исследований явились данные о том, что качество жидких ЛС, содержащих спирт этиловый, не зависит от его концентрации. По нашему мнению, на микробиологическую чистоту спиртосодержащих ЛС влияет исходное растительное сырье, технологический процесс и условия производства.

Таблица 2

Микробиологическая чистота исследованных жидких препаратов (в 1 мл)

Наименование препарата Содержание спирта % Кол-во серий Среднее число КОЕ/г

бактерий грибов

I.Бальзам Московия 40 5 37000 < 10

2.Настойка Аралии 61 5 <10 <10

3.Настойка Боярышника 65 23 50 50

4. Настойка Валерианы 28 17 700 < 100

5.Настойка Женьшеня 67 37 11000 < 10

6.Настойка Зверобоя 36 5 < 10 < 10

7.Настойка Календулы 65 29 15000 < 10

8.Настойка Лимонника 95 11 < 10 <10

9.Настойка Овса 40 5 5000 <10

Ю.Настойка Пиона 35 18 700 50

11.Настойка Перца 86 3 < 10 < 10

12. Настойка Полыни 70 5 < 10 < 10

13.Настойка Пустырника 64 30 100 < 10

14.Настойка Чаги 65 8 1400 < 10

15.Экстракт водяного Перца жидкий 64 6 <10 < 10

1 б.Экстракт Левзеи жидкий 62 11 < 10 < 10

17.Экстракт Родиолы розовой жидкий 34 6 < 10 < 10

18.Экстракт Элеутерококка 33 24 500 1000

19.Эликсир грудной 14 6 500 < 10

20.Эликсир «Демидовский» 40 10 < 10 < 10

Примечание: Бактерии сем. Enterobacteriaceae, P.aeruginosa, S.aureus не были обнаружены ни

в одном из исследованных образцов.

Качественный состав микроорганизмов-контаминантов.

В ряде экспериментов изучен качественный состав микроорганизмов-контаминантов ЛС. Исследования показали, что в ЛС в преобладающем большинстве встречались грамположительные спорообразующие палочки и плесневые грибы, реже — дрожжевые грибы, бактерии семейства Enterobacteriaceae и P. aeruginosa. S. aureus обнаружен не был.

В рамках изучения контаминантов ЛС особое внимание было уделено грибам, так как именно среди них встречаются потенциальные продуценты микотоксинов (Тутельян, 1985, 2003). Выделенные из 570 серий 150 наименований ЛС культуры плесневых грибов отличались большим

разнообразием. В таблице 3 обобщены результаты микологической экспертизы. В экспериментах идентифицировано 182 штамма, которые относились к 74 видам грибов из 16 родов, причем лишь 8 принадлежали к дрожжевым грибам. Среди выделенных плесневых грибов-контаминантов более 70% относились к родам Aspergillus, Pénicillium, Mucor.

Таблица 3

Результаты микологической экспертизы лекарственных средств

Категории Роды Кол-во Часто встречающиеся виды

грибов изолятов

мицелиальные 1. Aspergillus 36 flavus, Candidus, niger

2. Pénicillium 53 verrueosum, raeiborskii, steckii

3. Mucor 39 racemosus

4. Fusarium 4 nivali, solani

5. Alte maria 8 consorliall

6. Rhizopus 9 nigricans

7. Trichoderma 6 harciamm

8. Cladosporium 5 cladosporioides

9. Botrytis 3 alii

дрожжевые 10. Candida 9 famata

11. Rhodotorula 1 glutinis

12. Geotrichum 1 cancicum

/3. Cryptococcus 2 laurentii

14. Acremonium 1 charlicola

15. Pichia 1 stipitis

дрожжеподобные 16. A ureobasidium 4 pullulans

Методологические особенности проведения микробиологических исследований качества ЛС

Современные подходы к определению антимикробного действия.

Данный раздел включает научное обоснование необходимости определения антимикробного действия ЛС с последующей его нейтрализацией во избежание получения ложных результатов контроля качества ЛС.

На первом этапе проведено исследование антимикробного действия более 300 препаратов из ниже перечисленных фармакологических групп: сульфаниламидные препараты; производные 8-оксихинолина; нитрофурана;

нафтипиридимина; хинолоны; фторхинолоны; производные хиноксалина; ЛП для лечения грибковых заболеваний; антисептические средства: окислители; галогенсодержащие соединения; кислоты и щелочи; альдегиды; спирты; соли тяжелых металлов; производные фенола; красители; препараты дегтя, смолы, некоторые продукты переработки нефти, минеральные масла, серосодержащие препараты; противомикробные и противопаразитарные ЛС природного происхождения. Полученные данные позволили выделить 4 группы препаратов:

1. ЛП противомикробной направленности, не обладающие антимикробным действием в отношении фармакопейных тест-микроорганизмов в условиях испытания их качества. Например: стрептоцид, порошок; сульфадиметоксин, табл. 0,5г; мазь борная; спирт этиловый 96 %, 70 %, 40 %; линимент Вишневского; ихтиоловая мазь; винилин; мазь бензилбензоата 10 % в разведении 1:10 не оказывали влияние на бактерии и грибы.

2. ЛП, действие которых направлено на один или несколько микроорганизмов и которое нивелировалось разведением в буферном растворе с твином-80 в качестве неспецифического инактиватора. Например: сульфален, таблетки 0,2 г; раствор диоксидина 1%; диоксиколь мазь; лидаприм суспензия для детей; фурациллина раствор спиртовой 1:1500; раствор салициловой кислоты спиртовой 1%;йодинол; настойка календулы; деготь березовый.

3. НЛС, антимикробное действие которых не удавалось нейтрализовать разведением или мембранной фильтрацией: нитроксолин таблетки; неграм капсулы 500мг; фуразолидон таблетки 0,05г - в отношении спорообразующих грамположительных палочек, бактерий семейства Enterobacteriaceae, S. aureus; кетоконазол суппозитории вагинальные - в отношении дрожжевых и плесневых грибов. В таких случаях не проводилось выявление микроорганизмов, на которые влияет конкретный ЛП.

4. ЛП, показатель разведения, которых, снимающий антимикробное действие, совпадал с требованиями их категории. Например, клотримазол крем 1% относится к категории 2. Исследования антимикробного действия 10 серий крема клотримазол 1% различных производителей показали наличие ярко выраженного

фунгистатического влияния на дрожжевые (С. albicans) и плесневые {A. niger) грибы. Выявленное влияние не устранялось ни указанным разведением образцов, ни использованием инактиваторов. Нерастворимость мази в изопропилмиристате не позволила использовать для контроля метод мембранной фильтрации. Таким образом, результаты опытов для этой группы ЛП доказывают возможность выполнения контрольных испытаний, ограничивающихся общим числом аэробных бактерий и отсутствием бактерий семейства Enterobactcriaceae, S. aureus и P. aeruginosa.

Таким образом, впервые установлено наличие антимикробного действия в условиях испытания микробиологической чистоты некоторых ЛС. Среди них препараты из следующих фармакологических групп: нейротропные, антидепрессанты (амитриптиллин табл.), седативные, антигистаминные (супрастин табл, тавегил табл., димедрол табл.), спазмолитические (дротаверина гидрохлорид табл.), гипотензивные (атенолол табл.), сосудорасширяющие, ненаркотические противовоспалительные болеутоляющие (диклофенак табл.), жаропонижающие ЛС. Выявленное антимикробное действие вышеперечисленных веществ связано с химической структурой используемой субстанции.

Для достоверного определения антимикробного действия ЛС нами был модифицирован фармакопейный метод. Суть такой процедуры заключалась в проведении испытания в условиях контроля микробиологической чистоты, начиная с первоначального разведения 1:10 в буферном растворе, а не сухого вещества, как предусматривала ГФ XI изд. Это было выполнено для сохранения связи метода определения антимикробного действия с алгоритмом анализа микробиологической чистоты. В связи со значительной стоимостью фармацевтических субстанций и ЛП, иногда небольшими размерами серий отдельных ГЛС и их физико-химическими свойствами изменился подход к контролю, начиная, прежде всего, с количества образца для анализа.

Разработан метод репликаций, рекомендуемый, в том числе, для нерастворимых и окрашенных образцов ЛС, который заключается в том, что на

внесенное в соответствующую агаризованную среду (в чашке Петри) разведение препарата наносят тест - микроорганизмы в виде бляшек. На следующем этапе исследований проведено сравнительное изучение двух методов определения антимикробного действия JIC к 8 штаммам микроорганизмов, включая спорообразующие палочки, дрожжевые и плесневые грибы. Данные, полученные путем определения антимикробного действия водонерастворимых и окрашенных ЛС (всего 9 наименований: деготь березовый, таблетки дротаверина, йодинол, таблетки олифена, таблетки тамоксифена, мазь ундецин, фукорцин, 1% раствор хлорофилипта, эмульсия пихтовой смолы) двумя методами, показали аналогичные результаты. К преимуществам метода репликаций относятся: экономичность по материалам и времени (требуются только 2 агаризованные среды без пересева на дифференциально-диагностические среды, а результаты можно получить через 24-72 ч); увеличение тест-штаммов микроорганизмов при использовании всего 2-х чашек Петри. При этом не используются жидкие среды, рост тест-штаммов в которых требует подтверждения путем пересева на плотные питательные среды.

Результаты эксперимента показали наличие антимикробного действия у JIC в отношении тех тест-микроорганизмов, которые не допускаются или ограничены количественно в ЛС. На основании полученных данных нами выделены группы ЛС с различным антимикробным действием, перспективные для изучения, а именно: противогрибковые ЛС. Проведенные эксперименты по изучению антимикробного действия более 30 наименований противогрибковых ЛП под международными непатентованными названиями' (МНН): тербинафин, клотримазол, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, эконазол, бутоконазол, циклопироксоламин, нистатин, нихлоргин и субстанций для их производства показали в большей степени фунгистатическое действие in vitro в отношении С.albicans и A.niger у всех изученных ЛС.

Полученные данные с использованием двух разработанных нами методов определения антимикробного действия показали невозможность однозначно определить наличие или отсутствие антимикробного действия ЛС, исходя из его

физико-химических свойств или включения его в определенную фармакологическую группу. Результаты ряда экспериментов не позволили обнаружить непосредственную связь антимикробного действия ЛП и субстанции, из которой он изготовлен. Таким образом, доказана необходимость изучения антимикробного действия каждого конкретного ЛС во избежание ложных результатов контроля по показателю «Микробиологическая чистота». Указанное действие закреплено в алгоритме (рис.4) испытания ЛС на этапе фармацевтической экспертизы (в качестве примера).

Разработка методов выделения и идентификации микроорганизмов-контаминантов ЛС.

Данный раздел включает модельные эксперименты с использованием тест-штаммов микроорганизмов, а также различных лекарственных форм, искусственно и естественно контаминированных микроорганизмами.

Стандартным методом количественного определения микроорганизмов в ЛС в нашей стране принят двухслойный чашечный агаровый метод посева (ГФ XI изд.). Тогда как Европейская и Американская фармакопеи рекомендуют глубинный и поверхностный чашечные агаровые методы. Однако в ряде случаев использование указанных методов затруднено и мало эффективно, например, при определении:

• спорообразующих бактерий - крупных, волокнистых, вязких, слизистых, склонных к слиянию уже через 24-48 ч инкубации.

• грибов из родов Мисог, ЛЫгорш и др., рост которых едва заметен через 24 ч инкубации, а через 48 ч даже единичные колонии покрывают всю поверхность агара в чашке Петри, делая невозможным подсчет отдельных колониеобразующих единиц (КОЕ).

• медленно растущих микроорганизмов, напротив, образующих колонии лишь через 5-7 суток, удлиняя сроки микробиологического контроля.

Рис. 4 - Алгоритм испытания лекарственного средства по микробиологическим показателям на этапе фармацевтической экспертизы

Описанные трудности побудили нас усовершенствовать метод посева для получения достоверных результатов в тех случаях, когда традиционные методы неэффективны. Предложен модифицированный глубинный (МГ), заключающийся во внесении 1 мл разведения препарата в стерильную чашку Петри и равномерном перемешивании с 5-7 мл агаризовапной питательной среды. В отличие от известных методов предлагаемый метод позволяет снизить

количество питательной среды. При этом образовавшийся тонкий слой агара создает аэробные условия (с одной стороны) и ограничивает количество питательных веществ для выделяемых бактерий и грибов (с другой стороны), что приводит к более интенсивному росту колоний, что облегчает их учет.

Проведенные валидационные испытания позволяют обосновать применение МГ метода посева в качестве альтернативного при количественном определении бактерий и грибов, контаминирующих ЛС.

Данные табл. 4 и 5 показывают, что полученные при различных методах посева значения общего числа бактерий и грибов при стагистическом анализе имеют достоверные различия с вероятностью 0,95.

Таблица 4

Сравнительная оценка различных методов посева

Тест-штаммы Методы посева

поверхностный 2-х слойный глубинный Модифицированный глубинный

1 .В. сеreus 71+1 84+2 68+2 108+4

l.B.subtilis 112+6 125+6 147+6 160±6

ZA.niger 131+3 153+4 89+3 190+5

A.P.verrucosum 41+1 59+3 57+3 70+3

5 S.cereviseae 60±1 60+2 58+1 64+3

6,С.albicans 44+1 31+6 36+2 39+1

Особенности роста колоний Типичные недиссоциирова иные колонии, легко сосчитываемые, но при их подсчете используют коэф.100, что не годится для ЛС. Склонность к сливному росту, необходимость учета через 18ч, диссоциация колоний Типичные, изолированные колонии, учет через 18-24ч (бактерии), 48-72ч (грибы).

Таблица 5

Результаты определение плесневых, дрожжевых грибов и аэробных бактерий в контаминнрованных НЛС

Наименование препарата Методы посева, КОЭ,г

поверхностный 2-х слойный глубинный модифицированный глубинный

Плесневые и дрожжевые грибы

1. Аллохол табл. 194,0+4,0 222,0+6,0 204,0+5,0 236,0+2,0

2.Гипозоль 250,0+4,0 210,0+1,0 190,0+3,0 260,0+1,0

3.Желчь медицин. 100,0+1,0 85,0+6,0 72,0+4,0 105,0+1,0

4. Парацетамол таблетки (6,3+0,1) 10' (6,2+0,1) 10' (6,0+0,2) 10' (7,1±0,3) 10'

5Финлепсин табл (1,8+0,5) 104 (6,3+0,2) 104 (6,6+0,1) 104 (6,9+0,1) 104

б.Холензим табл. 250,0+8,0 300,0+6,0 300,0+2,0 350,0+8,0

7.Желчь мед. (3,0+0,1) 10' (6,0+0,2) 10' (5,0+0,2) 10' (6,0+0,2) 10'

8.Карсил-100кап. (1,3+0,2) 104 (1,3±0,2) 104 (1,0+0,2) 104 (1,4+0,4) 104

9.Карсил-50 кап. (2,8+0,1) 104 (1,7+0,2) 104 (1,3+0,2) 104 (2,2+0,1) 104

Ю.Пиперазина адипинат раствор (1,9+0,1) 104 (0,9+0,2) 104 (2,4+0,2) 104 (2,7+0,2) 10"

11 Хай-Трим сусп (4,4+0,2) 10' (4,0+0,1) 10' (4,0+0,2) 10' (4,2+0,1) 10'

Особенности роста колоний недиссоциирова иные колонии, при подсчете их количества используют коэффициент 100, что не годится для определенных категорий ЛС. диссоциация колоний, время инкубации более 72ч недиссоциирован ные четко изолированные, легко сосчитываемые колонии, облегчен учет через 48ч инкубации

Аэробные бактерии

12.Альмагель (2,4+0,1) 10ь (2,6+0,2) 10" (3,0±0,1) 10й (3,0+0,1) 10"

13.Феназепам таблетки (4,5+0,1) 10' (4,8+0,2) 10' (4,4+0,2) 10' (6,6±0,3) 10'

М.Ортосифона тычиночного листья (2,1+0,3) 10* (2,1+0,2) 10" (2,1+0,1) 108 (2,1+0,1) 10"

Особенности роста колоний Диссоциирован ные колонии, склонные к слиянию. Склонность к сливному росту, необходимость учета через 18ч,. • выраженная диссоциация колоний. Недиссоциирован-ные изолированные, легко учитываемые колонии через 24ч |

В экспериментах показаны особенности формирования колоний микроорганизмов, снижение времени инкубации до формирования колоний, облегчение количественного учета бактерий и грибов с сокращением сроков анлиза.

Положительные результаты апробации методов количественного определения микроорганизмов на тест-штаммах (более 12 повторностей) позволили перейти к опытам с использованием сначала искусственно контаминированных ЛС, а затем естественно загрязненных препаратов (табл. 5). Как доказано результатами наших исследований, МГ метод посева может быть использован при количественном определении микроорганизмов, выделяемых из ЛС различных фармакологических групп и лекарственных форм.

Преследуя цель гармонизировать методы контроля качества ЛС с методами Европейской Фармакопеи, на следующем этапе мы разработали методы выделения из ЛС и идентификации отдельных видов бактерий, а именно: Е. coli, Salmonella spp., P. aeruginosa, S. aureus, количественное определение E. coli, энтеробактерий и других грамотрицательных бактерий. На основании экспериментальных исследований определен алгоритм выделения и идентификации отдельных видов бактерий с использованием питательных сред отечественного производства наряду с импортными аналогами. Проведено сравнение среды №3ГРМ (для выделения энтеробактерий) и бульона Мак-Конки, среды №4-М (для идентификации энтеробактерий) и агара Мак-Конки, среды №8™ (для культивирования бактерий) и Триптиказо-соевый бульона; среды №12 (селенитовой), магниевой среды (для накопления сальмонелл) и тетратионатного бульона, трех-сахарного агара с солями железа и среды №13. На основании достоверно выполненных экспериментов установлено:

1. Эффективность испытанного селективного агара для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий (аналога Мак-Конки агара) производства НПО «Питательные среды» г. Махачкала позволяет рекомендовать эту среду для целей выделения Е. coli из ЛС.

2. Наличие в препарате сопутствующей микрофлоры в виде грам положительных спорообразующих бактерий не влияет на выделение Е. coli.

3. Количество бульона Мак-Конки или среды №3 грм в схеме определения Е. coli может быть уменьшено до 10 мл.

4. С целью гармонизации в схему испытания на наличие бактерий рода Salmonella дополнительно к висмут-сульфитному агару (среда №5) предложено ввести еще 3 плотные дифференцирующие среды: Дезоксихолат-цитрат агар, Ксилоза-лизин-дезоксихолат агар, Агар с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, с лактозой и сахарозой. Обнаружение типичных колоний на 2-х из 4-х указанных питательных сред позволяет гарантировать, что выделенные из исследуемого образца бактерии относятся к роду Salmonella.

5. Результаты апробации диагностических наборов фирмы «HiMedia» (Индия) для идентификации Е. coli, Salmonella spp., P. aeruginosa, S. aureus.не позволяют рекомендовать их для целей выделения и идентификации контаминантов J1C.

Особенности испытания лекарственных растительных средств на микробиологическую чистоту

В рамках изучения J1PC по показателю «Микробиологическая чистота» с целью формирования требований к их качеству проведено комплексное изучение их физико-химических, биологических свойств и некоторых особенностей. На первом этапе определены категории JIPC в зависимости от способа применения: 4А (применяемые после термической обработки) и 4Б (применяемые без термической обработки). В зависимости от способов приготовления и применения этих препаратов нормы, ограничивающие микробную загрязненность ЛРС и сырья, различны и представлены в Изменении №3 к ГФХ1 изд. и ОФС 42-0016-04. В результате экспериментов выявлены существенные особенности ЛРС, которые следует учитывать при проведении микробиологического анализа:

1. Высокий уровень контаминации аэробными бактериями и грибами, возникающий из-за объективных условий сбора, переработки и хранения сырья.

2. Значительные пределы количественного содержания микроорганизмов (в 1 г образца допускается не более 107 аэробных бактерий, 105 дрожжевых и плесневых грибов).

3. Большинство ЛРС используется после термической обработки, в результате которой микробная загрязненность отваров и настоев снижается в среднем на 2 порядка. Это положение доказано нами экспериментально на 157 образцах ЛРС 22 наименований отваров и настоев.

4. Проба для анализа некоторых средств при массе 10 г может занимать большой объем, не смачиваемый разбавителем в количестве 100 мл.

5. При добавлении разбавителя ЛРС в виде трав, листьев, цветков и их смесей, набухают настолько сильно, что невозможно использовать условное разведение 1:10 (смыв) для посева на питательные среды. В таких случаях рекомендовано разведение 1:100 (смыв) при контроле их качества.

С учетом перечисленных особенностей нами разработан алгоритм определения микробиологической чистоты ЛРС категория 4А (в качестве примера), что отражено на рис.5.

10 г. ЛРС вносят в 100 мл физиологического раствора, получая исходный смыв 1:10, который исследуется после разведения, как правило, 1:100000 для количественного определения бактерий и, как правило, 1:1000 - для подсчета грибов. Одновременно из имеющегося смыва делают посев методом НВЧ в 3 пробирки со средой №3. Инкубацию засеянных чашек и пробирок проводят в стандартных условиях. Учет результатов осуществляют путем подсчета выросших колоний на чашках. При росте в пробирках делают пересев петлей на среду №4. Полученные колонии идентифицируют на принадлежность к Е.соИ (п. 1-4 по схеме).

Рис. 5 Схема испытания ЛРС (Категория 4.А) по показателю «Микробиологическая чистота»

Состояние и перспективы развития материально-технической базы микробиологических исследований при контроле ЛС

Вопрос функционирования и оснащенности лабораторий микробиологии в настоящее время стоит достаточно остро. В первую очередь это касается питательных сред. Из всего разнообразия выпускаемых промышленностью для целей контроля качества ЛС используется ограниченный набор сред. Помимо накопительных и дифференциально-диагностических сред применяют специализированные для нейтрализации антимикробных агентов ЛС и для восстановления жизнеспособности поврежденных в технологическом процессе производства клеток.

Качество питательных сред - это тот фактор, от которого наравне с правильно выбранным методом испытания и квалификацией персонала зависит достоверность, воспроизводимость и повторяемость микробиологических анализов. Поэтому качество питательных сред подтверждается экспериментально перед анализом микробиологической чистоты ЛС.

Проведенное изучение качества питательных сред обосновывает общий подход к оценке их биологических свойств, который был разработан нами и утвержден в ВФС 42-3455-99 «Определение ростовых свойств питательных сред». На модельных опытах с тест - штаммами и с естественно контаминированными образцами альмагеля, таблеток карбамазепина, феназепама, субстанции метилурацила, листьев ортосифона тычиночного подтверждено качество среды №111>м, сухой. Результаты, представленные на рис.6, показывают, что количество КОЕ тест - микроорганизмов и бактерий из ЛС находилось в пределах от 86 до 98 %, если за 100 % принять количество КОЕ, выросших на соево - казеиновом агаре.

105

3 90 ь

0

¥ 85

1 80

75

□ Ряд1 ИРяд2 |

Рис.6 Количество тест-микроорганизмов и КОЕ/г в контаминироваиных препаратах (время инкубации 48 ч)

Обозначение : Ряд I- Количество КОЕ, выросших на соево-казеиновом агаре принятое за 100%; Ряд 2- Количество КОЕ, выросших на среде №1 ">м в % по отношению к первому ряду.

По оси абсцисс - I - В. cereus, 2- В. subtilis, 3- Е. coli, 4- S. aureus, 5- Альмагель, 6- Карбамазепин таблетки, 7- Метилу рацнл субстанция, 8- Феназепам таблетки, 9- Ортосифона тычиночного листья

Аналогичные результаты были получены для других питательных сред, используемых для контроля качества JIC. Таким образом, результаты изучения ростовых свойств питательных сред позволяют обосновать возможность их использования для целей микробиологического контроля качества ЛС.

В ГФ XI изд. для количественного определения бактерий, выделяемых из НЛС, рекомендована среда №1, приготовленная на основе мясной воды. В последних изданиях ЕР и USP для тех же целей предложена соево-казеиновая среда, в составе которой содержится 0,5% папаинового гидролизата бобов сои и 1,5% панкреатического гидролизата казеина. Переход на питательные среды с соевой основой перспективен и в нашей стране. Это обосновано их стандартностью, высокой биологической ценностью, уникальным химическим составом и относительной дешевизной сои. В связи с этим является актуальным разработка рецептов сред на соевой основе и оценка их ростовых свойств с использованием фармакопейных тест-микроорганизмов и бактерий, часто выделяемых из НЛС. Результаты представлены в виде коэффициентов прорастания (Кпр), т.е. отношением среднего числа колоний, выросших на испытуемой среде, к среднему числу колоний на контрольной среде . Данный раздел включает эксперименты по сравнению сконструированных сред (пептонно-соевого и казеиново-соевого) со средой №1ГРМ и соево-казеиновым агаром (Casein Soya Bean Digest Agar, Merck, №1.05458). Статистически обработанные значения K„p на испытуемых средах колебались от 0,5 до 1,2 (Кпр=1,0на соево-казеиновом агаре (табл. 6).

Таблица 6

Коэффициенты прорастания тест-штаммов на испытуемых питательных

средах

Тест-микроорганизмы Коэффициенты п рорастания на питательных средах

Соево-казеино-вый агар (Merck) СКА (ОАО «Биомед») №1™ (п.Оболенск)

B.cereusATCC 10702 1,0 0,9 0,5

В. sub tills АТСС 6633 1,0 1,2 0,7

£. coli АТСС 25922 1,0 1,2 0,9

S.aureus АТСС 6538 1,0 1,2 1,0

В соответствии со стандартом ИСО ХР CEN ISO/TS 11133-2 (2004 г.) К„р должен быть не менее 0,7. Экспериментальные партии были наработаны на ОАО «Биомед» и с положительными результатами прошли апробацию в ИСКЛС. Как видно из табл.6, предложенные среды не уступали традиционным.

Важным результатом выполненных исследований является размеры клеток бактерий, культивируемых на испытуемых средах. Определение проводили в сравнении с размерами клеток бактерий по определителю Берджи (p. Bacillus 1,2-7,0 - 0,3-2,2, p. Escherichia 0,4-0,7 - 1,0-3,0, p. Staphylococcus 0,5-1,5 мкм в диаметре) (табл.7).

Таблица 7

Размеры клеток фармакопейных тест-микроорганизмов на питательных средах

Тест-микроОрганизмы Размеры клеток тест-мик роорганизмов на питательных средах, мкм

Соево-казеиновый агар (Merck) СКА (ОАО«Биомед») (п.Оболенск)

Длина Ширина Длина Ширина Длина Ширин а

B.cereus АТС С 10702 3,94+0,50 1,00+0,15 4,26+0,59 1,14+0,13 4,14+0,44 1,10+0, 06

B.subtilis АТСС6633 3,13+0,47 0,62+0,10 3,48+0,53 0,66+0,07 4,41+0,50 0,72+0, 08

Е. coli АТСС 25922 2,27+0,43 0,54+0,08 2,29+0,38 0,52+0,06 2,11+0,37 0,55+0, 07

S. aureus АТСС 6538 Диаметр 0,59+0,04 Диаметр 0,52+0,05 Диаметр 0,52+0,06

Таким образом, типичный вид колоний, характерные размеры клеток в мазках после окраски по Грамму доказывают целесообразность использования агара на основе соевого гидролизата в качестве среды для подсчета микроорганизмов-контаминантов ЛС.

Пути совершенствования эффективности работы микробиологических лабораторий в сфере лекарственного обращения

Микробиологические лаборатории фармацевтических предприятий и контрольных служб отличаются от других лабораторий. Это связано с проведением контроля заведомо стерильной или незначительно

контаминированной продукции. В используемых в настоящее время нормативных документах приводятся только обобщенные положения работы любых лабораторий подобной направленности. При проектировании новых или перепланировке существующих лабораторий следует учитывать

отличительные особенности, без учета которых невозможно их дальнейшее функционирование. Микробиологический анализ на фармацевтическом производстве строго ограничен по времени в связи с экономическим аспектом. Основываясь на проведенном научно-экспериментальном изучении комплекса вопросов, связанных с микробиологическим контролем качества ЛС, определена необходимость решения этих вопросов в системе.

Система микробиологического контроля качества лекарственных средств (СМКК ЛС) - направление фармацевтической микробиологии, комплекс элементов, технических средств и организационных мероприятий, обеспечивающих качество и безопасность ЛС по микробиологическим показателям. СМКК ЛС в составе контроля качества (ОС), обеспечения качества (<ЗА), надлежащей производственной (ОМР) и лабораторной (СШ1) практик является частью Государственной системы контроля качества, эффективности и безопасности ЛС, утвержденной Федеральным законом «О лекарственных средствах»(№86-ФЗ от 22 июня 1998 г.) Структура СМКК представлена следующими элементами:

1. Требования к качеству в виде допустимых пределов количественного содержания бактерий и грибов, а также ограничения по наличию или количественному содержанию определенных бактерий в лекарственных препаратах, субстанциях и вспомогательных веществах.

2. Методы микробиологического контроля качества ЛС.

3. Методы микробиологического мониторинга производственных и лабораторных помещений.

4. Питательные среды с гарантированными ростовыми и селективными свойствами и методами их определения.

5. Аттестованный персонал для работы в контрольной службе.

6. Микробиологическая лаборатория (специализированный набор помещений) со специфическим оборудованием и методами его вапидации и аттестации.

7. Документация (ОФС, ФСП, НД, СОП и др.)

Все элементы СМКК ЛС участвуют в оценке достоверности полученных результатов, подтверждая надежность указанной системы (рис. 8). Методологический подход к совершенствованию СМКК ЛС с учетом особенностей разработанной системы действует на основе принципов: научности, адаптивности, оптимальности и экономичности (рис. 7).

Рис.7 Методологический подход к совершенствованию СМКК ЛС

Связи пользователей СМКК ЛС в составе системы Государственнйго контроля качества ЛС представлены на рис. 9.

Научные сотрудники фармацевтических и медицинских учебных и исследовательских институтов

изучение видов микроорганизмов-контаминантов ЛС, совер1 имеющихся подходов к их выделению и разработка альтерш

Органы управления и контроля

принятие решений на основании полученных результатов Гс контроля качества о возможности регистрации (реализации)

Рис.9 Связи пользователей СМКК ЛС в составе системы Государственного контроля качества ЛС

Концепция рационального построения и функционирования СМКК JIC:

1. Наличие современных нормативных документов, определяющих правовые нормы работы СМКК ЛС.

2. Взаимосвязь всех элементов СМКК, образующих 3 главных направления -регистрацию, производство и контроль качества ЛС.

3. Систематическое обучение персонала.

4. Регулярное проведение внутренних лабораторных проверок и периодическое выполнение заданий внешних аудитов.

Выводы

1. На основе системного анализа отечественных и зарубежных ЛС дана оценка качества различных лекарственных форм фармацевтических препаратов по микробиологическим показателям, показана зависимость уровня контаминации микроорганизмами от природы ЛС: препаратов на основе субстанций природного происхождения не соответствовали требованиям 1,9%, лекарственных растительных средств - 3,5%. Представленные методы определения микробиологической чистоты различных форм растительных препаратов в соответствии с утвержденной в ОФС 42-0016-04 схемой исключают преинкубацию в лактозном бульоне (среда №11), что сокращает сроки и трудоемкость анализа на 5 ч и приводит к экономии питательной среды.

2. Выявлено, что характер микрофлоры, выделяемой из ГЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ является полиморфным и обнаруживается преимущественно в виде аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов. Проведенный анализ количественного содержания и видового состава дрожжевых и плесневых грибов показал, что 28,9% изученных 570 серий 150 наименований ЛС содержали грибы выше допустимых пределов, при этом 69% идентифицированных штаммов 70 видов из 17 родов относились к родам Pénicillium, Aspergillus, Mucor.

3. Установлено антимикробное действие некоторых групп ЛС, не являющихся бактериостатическими и фунгистатическими, а это: нейротропные,

антидепрессанты, седативные, антигистаминные, спазмолитические, гипотензивные, сосудорасширяющие и др. Полученные результаты подтвердили необходимость определения антимикробного действия ЛС во избежание получения ложноогрицательных результатов контроля и возможность проводить анализ микробиологической чистоты в полном или сокращенном объеме. Разработанные методики определения антимикробного действия позволят стандартизовать подготовительный этап контроля качества ЛС. 4. Внедрены (ОФС 42-0067-07) современные методы количественного определения микроорганизмов в ЛС, в том числе альтернативный метод, который отличается экономичностью (за счет сокращения количества питательной среды) и высокой эффективностью ввиду ускоренного (48-72 ч) образования колоний, четкого, компактного их формирования, облегчающего их количественный учет. Выполненная валидация предложенного метода позволяет рекомендовать его для получения достоверных результатов в более короткие сроки. Разработанные методологические приемы определения отдельных видов бактерий-контаминантов ЛС (ОФС 42-0067-07) содержат испытание на наличие E.coli, Salmonella sp., P.aeruginosa, S. aureus, количественное определение E.coli, энтеробактерий и других родственных им грамотрицательных микроорганизмов. Они позволяют оценить качество ЛС на сухих питательных средах отечественного производства наравне с сухими и готовыми зарубежными питательными средами.

5. Апробация и сравнительное изучение отечественных аналогов Соево-казеинового агара, питательных сред типа Мосселя и Мак-Конки, изготовленных на ОАО «Биомед», наряду с зарубежными, позволяет рекомендовать их для использования в схемах испытания качества НЛС по показателю «Микробиологическая чистота».

6. На основании анализа уровня микробиологической чистоты ЛС в нашей стране и за рубежом представлены и утверждены требования по микробиологической чистоте ЛС, гармонизированные с Европейской Фармакопеей. Впервые в Российской Федерации обозначены и утверждены

нормы допустимого содержания бактерий и грибов в фармацевтических субстанциях и вспомогательных веществах.

7. Созданная система микробиологического контроля качества лекарственных средств (СМКК ЛС), фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ позволяет обеспечить качество и безопасность ЛС по микробиологическим показателям и состоит из следующих элементов:

- требования к качеству ЛС;

- методы микробиологического контроля и мониторинга производственных и лабораторных помещений;

- питательные среды с гарантированными ростовыми и селективными свойствами и методами их определения;

- персонал;

- микробиологическая лаборатория (специализированный набор помещений) со специфическим оборудованием и методами его вапидации и аттестации;

- документация (ОФС, ФСП, НД, СОП и др.).

Используемые сокращении:

вМР - правила надлежащей производственной практики

вЬР - правила надлежащих лабораторных испытаний

ЛС - лекарственные средства

ЛП - лекарственный препарат

ГЛС- готовое лекарственное средство

НЛС - нестерильные лекарственные средства

ЛРС - лекарственные растительные средства

ИСКЛС ФГУ НЦ ЭСМП Росздравмадзора - Институт стандартизации и

контроля лекарственных средств Федерального Государственного Учреждения

Научный Центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора

ГФ - Государственная Фармакопея

ОФС - общая фармакопейная статья

ВФС - временная фармакопейная статья

Метод НВЧ - метод наиболее вероятных чисел

ОЧБ - общее число бактерий

ОЧГ - общее число грибов

1С„Р- коэффициент прорастания питательной среды

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гунар, О.В. Различные модификации среды Сабуро для количественного определения грибов, контаминирующих нестерильные лекарственные средства / О.В. Гунар, К,А, Каграманова// Химико-фармацевтический журнал.- 1992.- №6.-С.67-68.

2. Каграманова, К.А. Сравнительное изучение микробной загрязненности лекарственного растительного сырья и препаратов, изготовленных на его основе I К.А. Каграманова, О.В. Гунар // Фармация.- 1992,- №6. - С.24-26.

3. Каламова, Н.И. Изменение к статье ГФ XI изд. «Методы микробиологического контроля лекарственных средств»/ Н.И. Каламова, К.А. Каграманова, О.В. Гунар [и др.]// Фарматека.- 1997.- №1.- С.37-38.

4. Каламова, Н.И. Проекты фармакопейных статей. Дополнение к статье ГФ XI изд. «Методы микробиологического контроля лекарственных средств»/ Н.И. Каламова, К.А. Каграманова, О.В. Гунар [ и др.] //Фарматека.-1995.-№5,- С.7-8.

5. Каламова, Н.И. Определение ростовых свойств питательных сред / Н.И. Каламова, К.А. Каграманова, О.В, Гунар [и др.] // Ремедиум. Ведомости Научного Центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств МЗ РФ (НЦ ЭГКЛС). - 2001,- №2 (6).- С.75-76.

6. Каламова, Н.И. Количественное определение микроорганизмов в нестерильных лекарственных средствах/ Н.И. Каламова, К.А. Каграманова, О.В. Гунар// Ремедиум. Ведомости Научного Центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств МЗ РФ (НЦ ЭГКЛС). -2001.- № 2(6).- С.77-78.

7. Гунар, О.В. Валидация питательных сред, используемых для контроля микробиологической чистоты лекарственных средств/ О.В. Гунар, К.А. Каграманова, Н.И. Каламова // Маг-лы Междунар. науч.-практ. конф.: Химия в технологии и медицине. Махачкала, 2001.- С.53-54.

8. Гунар, О.В Микробиологический мониторинг окружающей среды фармацевтических производств/ О.В. Гунар, К.А. Каграманова// Мат-лы междунар. семинара: Современные проблемы химии и технологии косметических средств. Консерванты в косметике. РКПА , 2001.- С. 2-7.

9. Каграманова, К.А. Изменение N2 к статье ГФ XI изд. «Методы микробиологического контроля лекарственных средств» / К.А. Каграманова, Н.И. Каламова, О.В. Гуняр // Ремедиум. Ведомости Научного Центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств МЗ РФ (НЦ ЭГКЛС).- 2002,- №1(9).- С.33-39.

10. Гунар, О.В. Определение качественного состава микофлоры в лекарственных средствах и сырье/ О.В. Гунар, Н.С. Евтушенко// Ремедиум. Ведомости Научного Центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств МЗ РФ (НЦ ЭГКЛС).- 2002,- №1(9).- С.1 (0-112,

11. Гунар, О.В. К вопросу о качестве лекарственного растительного сырья по показателю «Микробиологическая чистота» / О.В. Гунар, Г.М. Булгакова, Н.И. Каламова [и др.]// Фармация,- 2002.- №1.- С.19-22.

12. Гунар, О.В. Проблемы оценки качества лекарственных средств по показателю «Микробиологическая чистота» на стадии Государственного контроля/ О.В. Гунар, К.А. Каграманова, Н.И. Каламова [и др.]// Ремедиум. Ведомости Научного Центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств МЗ РФ (НЦ ЭГКЛС). -2002.- №1(9).- С. 102-106.

13. Гунар, О.В. Качественный и количественный состав грибов-контаминантов нестерильных лекарственных средств/ О.В. Гунар // Мат-лы обучающего семинара: Современные требования к организации и деятельности микробиологических лабораторий отделов контроля качества фармацевтических предприятий. М., 2001г.- С.76-77.

14. Гунар, О.В. Определение антимикробного действия лекарственных средств. Практические подходы/ О.В. Гунар, Н.И. Каламова, Н.С. Евтушенко И Фармация. - 2002,- №2.- С.4-7.

15. Гунар, О.В. Микробиологическая лаборатория для контроля качества лекарственных средств по показателю «Стерильность»: устройство и оборудование/ О.В. Гунар, К.А. Каграманова, А.Ф. Рылин// Химико-фармацевтический журнал.- 2002.- Т.36. № 6,- С.52-54.

16. Каграманова, К.А. Испытание на стерильность. Методы микробиологического контроля лекарственных средств. Проект Общей фармакопейной статьи для ГФ XII изд./ К.А. Каграманова, О.В. Гунар, Н.И, Каламова [и др.]// Ремедиум. Ведомости Научного Центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств МЗ РФ (НЦ ЭГКЛС).- 2002,-№2.- С.52-58.

17. Гунар, О.В. Особенности контроля качества некоторых лекарственных средств с противогрибковым действием по показателю «Микробиологическая чистота» / О.В. Гунар, Н.И Каламова., Н.С. Евтушенко // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т.37. №1. - С.46-48.

18. Гунар, О.В. Валидация метода количественного определения аэробных бактерий и грибов, выделяемых из лекарственных средств. Альтернативный агаровый метод / О.В. Гунар // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. -Т.37. № 3,- С.53-56.

19. Гунар, О.В. Особенности испытания лекарственных растительных средств на микробиологическую чистоту / О.В. Гунар // Фармация.- 2003.- №3.- С.5-8.

20. Гунар, О.В. Микробиологические аспекты анализа качества воды / О.В. Гунар Н Фармация,- 2003,- №1,- С.21-23.

21. Гунар, О.В. Использование нейтрализующей жидкости для снятия антимикробного действия некоторых лекарственных средств // О.В. Гунар/ X Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2003,- С. 710.

22. Гунар, О.В. Разработка питательных сред для контроля микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств на основе ферментативного гидролизата соевой муки / О.В. Гунар, К.А. Каграманова И Мат-лы Междунар. науч.-практ. конф.: Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем. Махачкала, 2003,- С.62-63.

23. Гунар, О.В. Сравнение селективных свойств диагностических питательных сред для выделения Salmonella spp. / О.В. Гунар // Мат-лы Междунар. науч.-практ. конф.: Разработка и стандартизация

микробиологических питательных сред и тест-систем. Махачкала, 2003,- С.11-12.

24. Гунар, О.В. Этапы контроля качества питательных сред, используемых в фармацевтической микробиологии, на стадии их валидации. / О.В. Гунар // Мат-лы Междунар. науч.-практ. конф.: Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем. Махачкала, 2003,- С.71-72.

25. Гунар, О.В. Некоторые аспекты использования метода мембранной фильтрации при контроле стерильности некоторых лекарственных средств/ О.В. Гунар, A.C. Колбикова// Мат-лы XI конгр.: Человек и лекарство. М., 2004.- С. 867.

26. Гунар, О.В. Значение количеств тест-микроорганизмов, вносимых в чашки Петри при определении антимикробного действия лекарственных средств/ О.В. Гунар, Г.М. Булгакова // Мат-лы XI Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2004,- С. 20.

27. Гунар, О.В. Развитие методов оценки безопасности лекарственных препаратов/ О.В. Гунар, С.И.Столяров, А.Г. Ковалев, [и др.]// Мат-лы XV Междунар. Симпозиума: Медико-экологическая безопасность, реабилитация и социальная защита населения. Италия, 2004,- С.227-232.

28. Гунар, О.В. Определение и нейтрализация антимикробного действия лекарственных средств/ О.В. Гунар// Фармация,- 2004.-№3,- С.5-8.

29. Гунар, О.В. Метод мембранной фильтрации в контроле качества лекарственных средств/ О.В. Гунар, A.C. Колбикова// Фармация.- 2004,- №4,-С.11-13.

30. Науменко, A.B. Роль биомеханических характеристик бактерий при фильтрационном анализе стерильности лекарственных средств/ A.B. Науменко, О.В. Гунар, Н.С. Снегирева// Мат-лы VII Всерос. конф. по биомеханике. 2004 , Н. Новгород.-Т.2.-С.81-82.

31. Гунар, O.B. Совершенствование методов микробиологического контроля качества лекарственных средств / О.В. Гунар // Маг-лы VII съезда фармацевтов Республики Беларусь: Фармация XXI века. Витебск, 2004.- С.147-149.

32. Гунар, О.В. Разработка критериев оценки работы специалистов-микробиологов фармацевтических производств и контрольных служб / О.В. Гунар // Мат-лы VII съезда фармацевтов Республики Беларусь: Фармация XXI века. Витебск, 2004,- С.49-51.

33. Каграманова, К.А. Сравнение жидких питательных сред, применяемых для выделения Salmonella из нестерильных лекарственных средств/ К.А. Каграманова, О.В. Гунар, И.А. Буйлова// Мат-лы - XII Рос, нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2005.- С.19-20.

34. Денисова, C.B. Особенности отбора образцов при контроле стерильности лекарственных средств / C.B. Денисова, О.В. Гунар, Е.С. Новик [и др.]// Мат-лы XII Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М,, 2005.- С. 16.

35. Гунар, О.В. Риск получения ложных микробиологических результатов при контроле качества лекарственных средств/ О.В. Гунар// Фармация.-2005.-№2.-С.29-31.

36. Гунар, О.В. Определение антимикробного действия лекарственных средств различными методами/ О.В. Гунар, К.А. Каграманова// Химико-фармацевтический журнал.-2005.- Т.39. №5. - С.53-56.

37. Гунар, О.В. Анализ риска получения ложных результатов контроля качества лекарственных средств по микробиологическим показателям / О.В. Гунар // Мат-лы XVI междунар. конф. АСИНКОМ: Правила GMP: задачи и опыт внедрения. Техника чистых помещений. М., 2005.- С. 56-59.

38. Гунар, О.В. Изучение антимикробного действия некоторых нейротропных лекарственных средств в условиях испытания микробиологической чистоты препарата/ О.В. Гунар// Мат-лы 60-й регион, конф.: Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск, 2005.- С.326.

39. Гунар, O.B. Зависимость уровня микробиологической чистоты лекарственных средств от природы субстанций/ О.В. Гунар, К.А. Каграманова // Мат-лы IX междунар. съезда: Фитофарм. С.-Пб., 2005,- С.249-251.

40. Гунар, О.В. Современные методы выделения Е. coli и Salmonella из нестерильных лекарственных средств/ О.В. Гунар // Фармация,- 2005.- №4.- С.42-46.

41. Гунар, О.В. Современные методы контроля микробиологической чистоты поверхностей при мониторинге помещений фармацевтических предприятий и контрольных лабораторий/ О.В. Гунар, С.Ю. Шишканов //Медицинский бизнес -Лекарства,- 2005,-№7-8 (131-132).- С.38-41.

42. Гунар, О.В. Особенности подготовки таблетированных препаратов для посева на микробиологическую чистоту/ О.В. Гунар, Г.М. Булгакова, Т.Н. Красильникова// Мат-лы XII Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2005,-С.656.

43. Гунар, О,В. Изучение возможности переживания микроскопических грибов в НЛС и вспомогательных веществах для их производства/ О.В. Гунар// Химико-фармацевтический журнал. -2006,- Т.40. №2.- С.54-56.

44. Денисова, C.B. Изучение эффективности антимикробных консервантов некоторых отечественных лекарственных средств/ C.B. Денисова, О.В. Гунар, Ж.И. Аладышева // Ведомости НЦ ЭСМП.-2006,- №1, с. 70-73.

45. Гунар, О.В. К вопросу о контроле качества некоторых антигистаминных лекарственных средств (ЛС) по показателю «Микробиологическая чистота»/ О.В. Гунар//Мат-лы 61 per. конф.: Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск, 2006.- С. 188-189.

46. Багирова, В.Л. Направления развития микробиологического контроля лекарственных средств в Российской Федерации/ В.Л. Багирова, О.В. Гунар, К.А. Каграманова, [и др.]// Ведомости НЦ ЭСМП. - 2006,- №2.- С. 65-67.

47. Гунар, О,В. Микробиологическая чистота новой лекарственной формы антисептических препаратов для местного применения / О.В. Гунар, A.C. Колбикова// Ведомости НЦ ЭСМП.-2006,- №2,- С. 75-76.

48. Гунар, O.B. Гармонизация подходов к анализу качества питательных сред, используемых для микробиологического контроля лекарственных средств с международными требованиями/ О,В. Гунар, К.А. Каграманова, В.А. Мельникова// Мат-лы Всерос. науч.-практ. конф.: Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней. М., 2006.- С.37-38.

49. Новик, Е.С. Изучение качества некоторых препаратов инсулина по показателю «Стерильность» / Е.С. Новик, О.В. Гунар// Химико-фармацевтический журнал. - 2007.- Т.41. №3,- С.55-56.

50. Гунар, О.В. Влияние некоторых лекарственных средств, обладающих антимикробным действием, на морфометрические характеристики Bacillus cereus АТСС 10702/ О.В. Гунар, Г.М. Булгакова// Мат-лы XIV Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2007. - С. 14.

51. Новик, Е.С. Особенности пробоподготовки некоторых лекарственных средств при определении размера частиц методом Каултера / Е.С. Новик, О.В. Гунар // Мат-лы XIV Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2007. - С.26.

52. Денисова, C.B. Сравнение методов определения антимикробной активности препаратов хлорофиллипта в масле / C.B. Денисова, О.В. Гунар // Мат-лы XIV Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2007.-С.16-17.

53. Гунар, О.В. Современное положение и задачи фармацевтической микробиологии, как одного из разделов микробиологии / О.В. Гунар И Мат-лы XIV съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Итоги и перспективы эпидемического благополучия населения Российской Федерации. М., 2007.-т.1,- С.142-143.

54. Зилфикаров, И.З. Вопросы стандартизации препарата Хлорофиллипт раствор в масле 2% / И.З. Зилфикаров, О.В. Гунар // Фармация,- 2007,- №3.- С.7-9.

55. Гунар, О.В. Пробоподготовка лекарственных препаратов на основе клея БФ-6 перед испытанием на микробиологическую чистоту/ О.В. Гунар, А.С Колбикова// Мат-лы XIV Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2007,- С.15.

56. Гуиар, O.B. К вопросу о качестве препарата уголь активированный по показателю «Микробиологическая чистота» / О.В. Гунар, A.C. Колбикова // Мат-лы XV Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. M., 2008.-С.535.

57. Новик, Е.С. Определение частиц в неиньекционных лекарственных средствах методом Каултера/ Е.С. Новик, О.В. Гунар // Мат-лы XV Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2008.-С. 555.

58. Гунар, О.В. Влияние фунгистатического действия некоторых противогрибковых препаратов на морфологические характеристики Candida Albicans NCTC 885-653/ О.В. Гунар, Г.М. Булгакова, Т.Н. Красильникова// Мат-лы XV Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. M., 2008.-С. 535.

59. Денисова C.B. К вопросу устранения антимикробного действия некоторых лекарственных средств для наружного применения при контроле по показателям «Стерильность» и «Микробиологическая чистота» / C.B. Денисова, О.В. Гунар // Мат-лы XV Рос. нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2008,- С.536.

60. Гунар, О.В. Проблемы, возникающие при оценке качества фармацевтических субстанций по микробиологическим показателям/ О.В. Гунар, К.А. Каграманова//Мат-лы 63 per. конф.: Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск, 2008,- С.401-402.

61. Гунар, О.В. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 /О.В. Гунар, Л.А. Каграманова// Санитарно-микробиологическое исследование фармацевтических препаратов/ Под ред. A.C. Лабинской, Е.Г. Волиной. - М„ Изд. БИНОМ, 2008,- С.989-1011.

62. Одегова, Т.Ф. Микроорганизмы и лекарства: опастность и польза /Т.Ф Одегова,. О.В. Гунар, Н.В Николаева // Мат-лы Российск. науч.-практ. конф.: Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения. Пермь, 2008. - С. 27-29.

63. Одегова, Т.Ф. Методическое руководство. Микробиологический контроль качества лекарственных средств/ Т.Ф. Одегова, О.В. Гунар // Пермь, Изд. ПГФА, 2008. -68с.

ГУНАР Ольга Викторовна (Россия)

Методологические основы совершенствования

системы микробиологического контроля качества лекарственных средств

Предложен методологический подход по совершенствованию системы

микробиологического контроля качества лекарственных средств (ЛС), как основы фармацевтической микробиологии, Проведена оценка результатов испытания микробиологической чистоты более 11,5 тыс. серий ЛС различных фармакологических групп и лекарственных форм. Выявлено, что наиболее контаминированными являются препараты на основе природных субстанций (1,9%) и лекарственных растительных средств (3,5%). Установлено, что 28,9% от 570 изученных серий НЛС содержали грибы выше допустимых пределов, Разработаны методы определения антимикробного действия ЛС, количественного и качественного определения аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, энтеробактерий и других грамотрицательных бактерий, Е. coft', Salmonella spp. Обоснованы схемы испытания различных ЛС (в том числе, растительных препаратов) на отечественных и зарубежных питательных средах. Разработаны рецептуры питательных сред на соевой основе и проведена их апробация. Обобщены принципы работы современных микробиологических лабораторий, занимающихся контролем качества ЛС на фармацевтических производствах и в контрольных службах.

Olga Victorovna Gunar Methodological base of perfection of the system of control quality pharmaceutical preparation

We offered the methodological base of perfection of the system of control quality pharmaceutical preparation. There is a complex decision of drug microbiological control in pharmaceutical microbiology. More than 11500 series of pharmaceutical preparation have been controlled, various pharmaceuticals gropes and forms.

It was establish, that the preparations of the natural raw material and herb had the highest level of microbial contamination, exactly: 1,9% and 3,5%. From 570 inspected series 28,9% of non-sterile preparations had more molds, than in allowed. We worked out methods of microbial count (bacteria, moulds, yeasts, enterobacteria), methods of identification of bacteria (E со//, Salmonella spp.).

There is,guidance of various drugs examination using home and foreign nutritive media. The formulas of soya media have been formed. Media of firm «Biomed» were examined,

The work principles of modern microbiological laboratories whish control drugs in f rms and control service have been summarized.

Подписано в печать 20.04.2009 Формат 60*90/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Усл. печ. 3,0 л. Заказ № 76/2009.

Отпечатано на ризографе в типографии ГОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел./факс. 8-901-266-59-37

В связи с введением на фармацевтических предприятиях России правил надлежащей производственной практики (GMP) изменяются подходы к контролю качества лекарственных препаратов (ЛП) и субстанций. Необходимость контроля качества нестерильных лекарственных средств (НЛС) обосновывается важностью обеспечения их безопасности и эффективности, т.е. снижения риска при применении потребителем (Акимочкин В.Е., 2003). «Качество должно быть встроено в лекарственный препарат» (Брахт К. 2004, Pharmaceutical» cGMP 2002). Таким образом, начиная с разработки нового фармацевтического продукта, на всем пути от производства до потребителя, необходимо оценивать риск возникновения некачественного продукта и создавать систему управления рисками; добиваясь обеспечения качества НЛС. Особое место при этом занимают биологические методы испытания фармацевтических препаратов, относящиеся в первую очередь к области фармакологии и микробиологии (Попов А.Ю. 2004, Хабриев Р.У.2005).

Особенностью микробиологических видов анализов является специфика объекта исследования - живого микроорганизма, обладающего индивидуальными особенностями. К наиболее значимым объективным факторам, влияющим на результаты анализа, относятся следующие:

• Наличие антимикробного действия самих лекарственных средств (ЛС) или их компонентов, а также присутствие в некоторых из них консервантов, препятствует выявлению микроорганизмов.

• Опережающий рост сопутствующей микрофлоры, затрудняющий количественное или качественное определение отдельных микроорганизмов-контаминантов.

• Возможно обнаружение микроорганизмов в «стрессовом» состоянии под воздействием условий технологического процесса производства НЛС и неравномерное распределение контаминантов в образцах.

Учитывая тесную связь микробиологических показателей с безопасностью применения ЛС, результаты испытаний продукции должны быть максимально точными и надежными.

Основными факторами, влияющими на вариабельность результатов микробиологических исследований, являются: специфичность пробы (физико-химические свойства НЛС и биологические особенности выделяемой популяции микроорганизмов), компетентность персонала и условия его работы, отбор образцов и подготовка пробы, условия- инкубации, характеристики используемых питательных сред. Последние три фактора подлежат обязательной стандартизации (ИСО 13843:2000) и валидации, что подтверждается общей тенденцией по совершенствованию фармакопейных микробиологических методов контроля.

Проблема разработки, обоснования и установления нормативов допустимого содержания микроорганизмов в HJIG тесно связана с выбором методов- их выявления, и идентификации, обуславливающих эффективность анализа: Дальнейшее расширение номенклатуры. ЛП и субстанций, внедрение правил GMP и систем менеджмента качества, как на фармацевтических производствах, так и в контрольных лабораториях требуют стандартных подходов к определению качества НЛС по показателю «Микробиологическая чистота». Поэтому в настоящей работе решается научная проблема, заключающаяся в пересмотре фармакопейных требований к качеству ЛП, совершенствование методов количественного и качественного определения микроорганизмов, подготовки образцов перед испытанием, определения антимикробного действия и методов его нейтрализации. Актуальны вопросы, связанные с функционированием контрольной микробиологической лаборатории в свете современных требований.

С середины 60-х годов 20-го столетия после того, как микроорганизмы были обнаружены- в лекарственных средствах (ЛС), практически во всех развитых странах разносторонне изучались вопросы микробиологической чистоты лекарственных препаратов (ЛП). Клиницистами установлено, что «лекарственная инфекция», связанная с контаминацией препаратов бактериями и грибами, достаточно опасна, особенно для новорожденных, ослабленных пациентов, для больных пожилого возраста, с хроническими заболеваниями и после применения средств современной терапии. В конце прошлого века появилось много публикаций о микроорганизмах, контаминирующих JIC (Имшенецкий A.JI. и др., 1984, Flaum I., 1978). Клинические данные об ухудшении здоровья пациентов после приема ряда препаратов получили объяснение в работах микробиологов, обнаруживших в них бактерии и грибы (Railings L.O., 1966, Savin J.А., 1967). Среди описанных случаев лекарственной инфекции выделяется заражение грибами новорожденных в одном из роддомов Японии, приведшее к летальному исходу в результате использования контаминированной детской присыпки (Курата X. и др., 1980). Имеются описания кожных заболеваний, вызванных применением медицинского крема, загрязненного патогенным дрожжеподобным грибом С.albicans и синегнойной палочкой P. aeruginosa (Bruck К.А., 1971). В' клинической микробиологии уделялось большое внимание микрофлоре глазных контактных линз,и растворов1 для их промывания (Butrus S., 1986, Pitsigavdaki Е, 1990). Были доказаны мутагенные, тератогенные и канцерогенные свойства метаболитов плесневых грибов (Тутельян 1981, Тутельян 1985, Волгарев 1985, Дурнев 1999, Столярова 2002).

В связи с актуальностью проблемы микробной загрязненности НДС в 1972 г. были опубликованы рекомендации Всемирной Организации Здравоохранения и Международной Федерации Фармацевтов, содержащие общие принципы к установлению норм, лимитирующих допустимый уровень количественного и качественного состава микрофлоры в лекарственных средствах.

Во второй половине 20-го века допустимые пределы микробиологической чистоты JIC и методы количественного и качественного определения микроорганизмов были разработаны и вошли в официальные нормативные документы, в первую очередь в фармакопеи (ЕР 2005, British Р. 2003 USP 2006, JP XIY 2001, P. of China 2000).

Сравнительный анализ структуры ведущих фармакопей и действующего издания отечественной фармакопеи показал, что по своей направленности существующая в Государственной Фармакопее СССР XI изд. общая фармакопейная статья аналогична монографиям Европейской, Американской и Японской фармакопей. Вышесказанное иллюстрировано таблицей 1.

Таблица 1

Данные ведущих фармакопей по микробиологическим показателям качества лекарственных средств

Монографии Европейская Фармакопея ГФ XI изд. Японская фармакопея 5 изд. США 31 изд. фарм. XIV

Испытание на 2.6.1 <71> с.187-192 8.р.1312стерильность 1316

Методы 2.6.12 (Общее <61> с. 193-209 35. микробиологи- коли-чество р.58-64 ческого контроля жизнеспособных нестерильных микроорганизмов) лекарственных 2.6.13 средств (Определение отдельных видов микроорганизмов) •

Микробиологи- 5.1.4 (нормы <71> Измене- 7. ческое качество допустимой ние №3 р.1310фарм. препаратов микробной 1312 допустимые загрязненности) пределы)

Сравнение материалов, указанных в представленных статьях, показывает, что содержание статей требует гармонизации, например: введение преинкубации испытуемых образцов для восстановления жизнедеятельности контаминантов, включение метода наиболее вероятных чисел, использование в испытаниях питательных сред с более воспроизводимыми ростовыми свойствами (без применения мясной воды) и др. Мировой опыт показывает реальность попадания в JIC микроорганизмов, работа в контрольной службе подтверждает это положение.

Введение в отечественную Государственную Фармакопею (ГФ XI изд., 1990г.) испытания, лекарственных средств на стерильность и микробиологическую чистоту открыло перспективу для развития нового направления в микробиологии — фармацевтической микробиологии: Однако возможности улучшения микробиологического контроля? качества JIC сдерживались рядом объективных трудностей: в учебных программах, профильных вузов отсутствовали целевые разделы фармацевтической микробиологии, постдипломная профессиональная подготовка и усовершенствование-специалистов проводилась в рамках Государственного образовательного стандарта по специальности «бактериология»- для сотрудников, окончивших только медицинские ВУЗы, не было; должной гармонизации с базовыми материалами: и положениями Европейской Фармакопеи5 в отношении классификации, лекарственных средств с учетом их происхождения и, способа применения, не было системного и в равной степени универсального алгоритма микробиологического контроля различных категорий лекарственных препаратов, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ. отсутствовали адаптированные к целям исследования методики и схемы определения качества лекарственных растительных средств по показателю «Микробиологическая чистота», немногочисленные отечественные публикации оставались разрозненными и монопрофильными по информации. Представленные в них результаты в силу различного методического подхода и лабораторного оснащения авторов были часто несопоставимы, без должной; научно-практической оценки оставался видовой состав грибов-контаминантов лекарственных средств.

Таким образом, возникла необходимость комплексного решения на современном уровне (с учетом требований GMP и GLP) организационнометодических, теоретических и практических вопросов, связанных с микробиологическим анализом качества лекарственных средств. Это в свою очередь должно обеспечить существенное повышение эффективности системы Государственного контроля- качества лекарственных средств по микробиологическим показателям.

Анализ и перечень приведенных выше положений определяет актуальность проблемы и практическую значимость темы настоящей работы.

Цель, работы. Целью настоящего исследования является формирование теоретических основ и разработка современных методологических подходов к микробиологическому контролю качества JIC, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ с учетом положений GMP' и GLP в Российской Федерации.

Задачи исследования:

1. Изучить качество ряда ЛП; в том числе не контролируемых ранее растительных ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ по ведущему показателю безопасности — «Микробиологическая чистота».

2. Определить состав основной микрофлоры, содержащейся в различных лекарственных формах, и идентифицировать выделенные грибы.

3. Гармонизировать с Европейской Фармакопеей нормы допустимой микробной загрязненности ЛП; разработать требования к качеству ЛРС, субстанций и вспомогательных веществ по показателю «Микробиологическая чистота».

4. Усовершенствовать методы определения антимикробного действия ЛС и изучить антимикробное действие ЛС различных лекарственных форм и фармакотерапевтических групп.

5. Обосновать и внедрить в практику микробиологических исследований при контроле качества ЛС высокоэффективные методы количественного определения микроорганизмов, а также способы выделения и идентификации отдельных видов бактерий-контаминантов ЛС.

6. Сравнить базовые характеристики питательных сред отечественного- и импортного производства, используемых для контроля качества ЛС; обосновать рецептуры и изучить качество соево-казеинового агара, агара с бриллиантовым зеленым и среды типа агара Мак-Конки.

7. Создать систему микробиологического контроля качества (СМКК) ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ, выработать концепцию рационального построения и функционирования, определить ее структуру.

Научная новизна. Создана система микробиологического контроля качества (СМКК) ЛС, определена ее структура и концепция рационального построения и функционирования. Выполнен дифференцированный подход к установлению предельных норм допустимой микробной загрязненности ЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ. Осуществлена классификация препаратов, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ по категориям с учетом происхождения, и способа применения. Определены пути повышения информативности микробиологических исследований при контроле качества ЛС.

Установлены особенности исследования микробиологической чистоты ЛРС в соответствии с их физико-химическими, биологическими свойствами, назначением и нормами микробной загрязненности для каждой категории растительных препаратов.

Выявлено антимикробное действие у ряда ЛС из различных фармакотерапевтических групп: нейротропные, антидепрессанты, седативные, антигистаминные, спазмолитические, гипотензивные, сосудорасширяющие, не наркотические противовоспалительные, болеутоляющие и жаропонижающие ЛС.

Впервые1 проведена углубленная микологическая экспертиза грибов-контаминантов ЛС, при этом выявлена их обсемененность 74 видами грибов из 16 родов, в 28,9% изученных серий ЛС содержание грибов превышало допустимые нормы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанные, усовершенствованные и внедренные в процессе выполнения работы алгоритм, этапы, схемы и методы микробиологических исследований позволили стандартизовать условия испытаний и обеспечить повышение эффективности контроля качества JIC на фармацевтических предприятиях России и в контрольной службе.

Предложен современный методологический подход к микробиологическому анализу качества JIC, основанный на использовании комплекса стандартных методов, позволяющих: достоверно установить количество аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, выделить из JIC и идентифицировать отдельные виды нормируемых микроорганизмов;

Разработан эффективный и экономичный чашечный агаровый метод (модифицированный глубинный) количественного определения в JIC аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов. Валидация предложенного' метода позволила рекомендовать его использование наравне с двухслойным, поверхностным и глубинным методами для* получения достоверных, воспроизводимых количественных результатов контроля качества JIC. Предложены методы количественного и качественного определения микроорганизмов-контаминантов различных лекарственных форм медицинских препаратов с учетом подготовки образцов перед анализом (материалы исследований внедрены в ОФС 42-0067-07 ГФ XII изд.).

Усовершенствованы методы определения антимикробного действия различных JIC, включая разработку альтернативного метода репликаций для водонерастворимых и окрашенных ЛП. Детализированы подходы к нейтрализации антимикробного действия (материалы внедрены в Изменении №2 к Государственной Фармакопее XI изд. от 14.08.01 и в ГФ РФ XII изд.).

Данные сравнительного изучения ряда сухих питательных сред для контроля микробной загрязненности ЛС различных отечественных производителей свидетельствуют о возможности их использования наравне с импортными сухими и готовыми к употреблению- питательными средами (материалы включены в ОФС 42-0067-07 ГФ РФ XII изд.).

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены Изменения №1, №2, №3 к ГФ XI изд., ВФС 42-3455-99 «Определение ростовых свойств питательных сред, используемых для испытания на стерильность, и микробиологическую чистоту лекарственных средств»; ВФС 42-3454-99 «Метод наиболее вероятных чисел»; ОФС 42-0016-04 «Методы микробиологического контроля лекарственных растительных средств, состоящих из одного вида сырья или нескольких (сборы)- фасованная продукция, а также растительного сырья «ангро»»; ОФС 42-0066-07 «Стерильность»; ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая.чистота»; ОФС 42-0069-07 «Определение эффективности антимикробных консервантов JIC» ГФ РФ XII изд.

Методы микробиологического^ контроля качества JIC апробированы и внедрены на фармацевтических предприятиях: ОАО «Красногорсклексредства» (акт о внедрении от 26.12.2006), ООО «Бион» (акт о внедрении исх. №458 от 31.10.2006), ЗАО «ФПК ФармВИЛАР» (акт о внедрении исх. №28 от 31.01.07), ОАО «АЗТ Фарма К.Б.»(акт о внедрении исх.№288 от 15 сентября£006г).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в микробиологических лабораториях ИСКЛС ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора в рамках отраслевой научно-исследовательской программы НЦ ЭГКЛС «Экспертиза и Государственный контроль лекарственных средств», утвержденной 8 декабря 2000 г. начальником Управления научно-исследовательских медицинских учреждений МЗ РФ Ткаченко С.Б. и в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пермская государственная академия» (номер государственной регистрации 01.9.50007417).

Положения, выносимые на защиту:

1. Методологический подход к исследованию качества ЛП, растительных лекарственных средств, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ по ведущему показателю безопасности - «Микробиологическая чистота».

2. Разработка норм и методов определения микробиологической чистоты JIPC, позволяющие объективно оценить их качество.

3. Микологическая экспертиза при микробиологическом анализе JIC.

4. Определение антимикробного действия JIC - необходимый этап исследований для снижения риска ложных результатов микробиологических исследований фармацевтических препаратов и субстанций.

5. Разработка эффективного и экономичного метода количественного определения микроорганизмов-контаминантов JIC.

6. Экспериментальное обоснование базовых характеристик питательных сред импортного и отечественного производства для контроля загрязненности JIC.

7. Концептуальная модель СМКК JIC в сферах регистрации, производства и контроля качества JIC.

257 Выводы

1. На основе системного анализа отечественных и зарубежных JIC дана оценка качества различных лекарственных форм фармацевтических препаратов по микробиологическим показателям, показана зависимость уровня контаминации микроорганизмами от природы ЛС: препаратов на основе субстанций природного происхождения не соответствовали требованиям 1,9%, лекарственных растительных средств — 3,5%. Представленные методы определения микробиологической чистоты различных форм растительных препаратов в соответствии с утвержденной в ОФС 42-0016-04 схемой исключают преинкубацию в лактозном бульоне (среда №11), что сокращает сроки и трудоемкость анализа на 5 ч и приводит к экономии питательной среды.

2. Выявлено, что характер микрофлоры, выделяемой из ГЛС, фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ является полиморфным и обнаруживается преимущественно в виде аэробных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов. Проведенный анализ количественного содержания и видового состава дрожжевых и плесневых грибов показал, что 28,9% изученных 570 серий 150 наименований ЛС содержали грибы выше допустимых пределов, при этом 69% идентифицированных штаммов 70 видов из 17 родов относились к родам Penicillium, Aspergillus, Mucor.

3. Установлено антимикробное действие некоторых групп ЛС, не являющихся бактериостатическими и фунгистатическими, а это: нейротропные, антидепрессанты, седативные, антигистаминные, спазмолитические, гипотензивные, сосудорасширяющие и др. Полученные результаты подтвердили необходимость определения антимикробного действия ЛС во избежание получения ложноотрицательных результатов контроля и возможность проводить анализ микробиологической чистоты в полном или сокращенном объеме. Разработанные методики определения антимикробного действия позволят стандартизовать подготовительный этап контроля качества ЛС.

4. Внедрены (ОФС 42-0067-07) современные методы количественного определения микроорганизмов в ЛС, в том числе альтернативный метод, который отличается экономичностью (за счет сокращения количества питательной среды) и высокой эффективностью ввиду ускоренного (48-72 ч) образования колоний, четкого, компактного их формирования, облегчающего их количественный учет. Выполненная валидация предложенного метода позволяет рекомендовать его для получения достоверных результатов в более короткие сроки. Разработанные методологические приемы определения отдельных видов бактерий-контаминантов JIC (ОФС 42-0067-07) содержат испытание на наличие E.coli, Salmonella sp., P. aeruginosa, S. aureus, количественное определение E.coli, энтеробактерий и других родственных им грамотрицательных микроорганизмов. Они позволяют оценить качество JIC на сухих питательных средах отечественного производства наравне с сухими и готовыми зарубежными питательными средами.

5. Апробация и сравнительное изучение отечественных аналогов Соево-казеинового агара, питательных сред типа Мосселя и Мак-Конки, изготовленных на ОАО «Биомед», наряду с зарубежными, позволяет рекомендовать их для» использования в схемах испытания качества HJIC по показателю «Микробиологическая чистота».

6. На основании анализа уровня микробиологической чистоты ЛС в нашей стране и за рубежом представлены и утверждены требования по микробиологической чистоте ЛС, гармонизированные с Европейской Фармакопеей. Впервые в Российской Федерации обозначены и утверждены нормы допустимого содержания бактерий и грибов в фармацевтических субстанциях и вспомогательных веществах.

7. Созданная система микробиологического контроля качества лекарственных средств (СМКК ЛС), фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ позволяет обеспечить качество и безопасность Л С по микробиологическим показателям и состоит из следующих элементов:

- требования к качеству ЛС;

- методы микробиологического контроля и мониторинга производственных и лабораторных помещений;

- питательные среды с гарантированными ростовыми и селективными свойствами и методами их определения;

- персонал;

- микробиологическая лаборатория (специализированный набор помещений) со специфическим оборудованием и методами его валидации и аттестации;

- документация (ОФС, ФСП, НД, СОП и др.).