Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Комбинированное действие неорганических соединений моделей лекарственных средств - на эукариотную клетку

СЧ> ..с.

На правах рукописи

СЛОНСКАЯ Татьяна Кимовна

КОМБИНИРОВАННОЕ ДЕЙСТВИЕ НЕОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ -МОДЕЛЕЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ -НА ЭУКАРИОТНУЮ КЛЕТКУ

15.00.02 — Фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова

Научные руководители:

- доктор химических наук, профессор Ершов Ю.А.

- доктор химических наук, профессор Плетенева Т.В.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

кандидат фармацевтических наук, ведущий научный сотрудник

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт фармации — НИИФ

Защита состоится " 1996 г. в 15 часов

на заседании диссертационного Совета Д074.05.06 при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (г.Москва, Суворовский бульвар, д. 13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии (Зубовский б-р, д.37/1)

Автореферат разослан " ^¿¿ОЛ. 1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д 074.05.06,

кандидат фармацевтических наук, доцент Н.П.Садчикова

Ю.Я. Харитонов А.В.Титова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В медицине широко используются различные соединения элементов с1-блока. Прежде всего они могут предназначаться 1ля полного парентерального питания солями необходимых элементов ( £п, ¥е, Со, Мп, N1, Си). Создание полимикроэлементных препаратов эбеспечивает лечение многих патолошй [Крисс Е.Е., 1986].

Тем не менее, в настоящее время наука практически не располагает »¡формацией о последствиях мультихимических воздействий на чело-зека и имеет очень скудные данные об эффектах, которые возникают у 1абораторных животных при одновременном введении им нескольких химических веществ. Анализ одновременного воздействия нескольких шмических соединений является одной из важнейших задач фармации I токсикологии, поскольку человек подвергается воздействию более чем эдного вещества, когда он принимает лекарства, пищу, а также при естественной биоциркуляции элементов. Установлено, что эффекты, вызываемые несколькими металлами, часто больше суммы их индивиду-шьных эффектов. Механизмы, лежащие в основе рассматриваемых взаимодействий в большинстве случаев, не ясны, и в настоящее время не еуществует основы для их прогнозирования. Исследователи сталклва-отся с целым набором методических трудностей из-за отсутствия прин-лшов оценки биологической активности при комбинированном дейст-зии неорганических соединений. Это в значительной мере касается действия лекарственных препаратов, например, новых комбинированных трепаратов серебра и меди (лабкатал - комплексный препарат Ад, Си, \и, циаркум — препарат на основе серебра и меди). Последнее обстоятельство вызывает необходимость исследований биологической активности растворов, содержащих одновременно ионы этих элементов. Актуальным является исследование комбинаций, содержащих ион металла л органических соединений различной природы. Представляет интерес изучение комбинированного действия тяжелых металлов, обладающих

канцерогенным, или антиканцерогенным действием. Это особенно актуально в связи с резким возрастанием техногенных нагрузок на организм. Например, исследование комбинированного действия ионов никеля (II) и хрома (VI) актуально потому, что именно в таком сочетании эти элементы оказывают действие на организм (электролиты и отходы гальванических производств содержат ионы никеля (II) и хрома (VI)). Особо следует подчеркнуть, что хотя эти элементы и не относят к необходимым, они постоянно присутствуют в организме. При этом достоверно установлена их биологическая роль, не связанная с токсичностью. Оба элемента выполняют важные биологические функции. Хром влияет на толерантность к глюкозе, увеличивая активность инсулина. Никель входит в состав фермента уреазы, катализирующего гидролитическое расщепление мочевины на аммиак и углекислый газ.

Изучение комбинированного действия требует проведения большой числа экспериментов в широком интервале концентрационных сочета ний этих элементов, достаточных для токсикологической характеристи ки многокомпонентных воздействий, а также для метрологической оценю получаемых результатов. Этому требованию не может удовлетворить ни какая биологическая система, использующая организм млекопитающи; в целом. Поэтому исследования комбинированных воздействий перечне ленных систем представлялось целесообразным проводить на иодельно! системе. В качестве такой системы выбраны клетей простейших эука риотов дрожжей ЗассЬаготусеэ сегеуЫае. Дрожжи легко культивируют ся, быстро накапливают биомассу. Способны расти практически на лю бых углеродсодержащих субстратах, что делает выбранную методику эко номически обоснованной. Кроме того, дрожжи интересны для исследо ваний, как прекрасные биосорбенты, способные накапливать в биомасс« достаточно высокие количества тяжелых металлов [Бабьева В.П., 1992].

Исследование биологической активности лекарственных средств на простейших эукариотах имеет ряд преимуществ перед традиционными

методами с использованием экспериментальных животных. Результаты, полученные на клетках, информативны и дают выигрыш в затратах средств и времени. Применение клеточных моделей обосновано еще и потому, что молекулярные механизмы генетической токсичности одинаковы для биологических систем различного иерархического уровня.

На возможность использования клеточных тестов in vivo и in vitro для ускоренного прогнозирования типа действия тех или иных комбинаций токсических веществ на организм указывает общий характер комбинированного действия на разных уровнях биологической организации.

В настоящей работе представлены результаты исследования индивидуальных и комбинированных воздействий соединений меди и серебра, хрома и никеля, ртути и органических соединений на клетки дрожжей Saccharomyces cerevísiae.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось теоретическое обоснование и разработка экспериментальных методик количественной оценки комбинированного действия неорганических соединений серебра, меди, хрома, никеля, ртути — моделей лекарственных средств — на эукариотную клетку.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- теоретически обосновать выбор биологических моделей и моделей лекарственных средств для количественной оценки их комбинированного действия на биообъекты;

- разработать новые экспериментальные методики исследования индивидуального и комбинированного действия лекарственных средств неорганической природы и их моделей;

- исследовать биологические эффекты индивидуального действия ионов Ag (I), Cu (II), Ni (II), Cr (VI), Hg (II) на клетку на основании динамики роста, колониеобразующей способности, микроскопирования

- S -

культуры;

- исследовать биологические эффекты комбинированного действия ионов Ag (I) и Cu (II), Сг (VI) и Ni (II), Hg (II) и органических лигандои на дрожжи S.cerevisiae;

-разработать методологию изучения комбинированного воздействия лекарственных средств неорганической природы;

Научная новизна работы. Впервые исследовано действие ионов серебра (I), меди (II), хрома (VI), никеля (II) на культуру дрожжей S. cerevisiae — модель эукариотной клетки — в широком диапазоне концентраций 5-10"12 — 5-10 3 моль/л.

Обнаружены зоны цитостатического действия ионов хрома (VI), никеля(Н) в области концентраций 5-Ю12 — 5-Ю"10 моль/л, что указывает на возможную опасность этих элементов даже в столь низких дозах.

Впервые изучено комбинированное действие ионов тяжелых металлов на культуру дрожжей S. cerevisiae в комбинациях Ag (I) — Cu(II), Cr(VI) — Ni(II), Hg(II)- органическое соединение.

Впервые обнаружено, что эффект комбинированного действия ионов Ag(I) и Cu(II), Cr(VI) и Ni(Il) выше аддитивного в областях цито-нейтрального и цитостатического действия и имеет аддитивный характер в области цитоцидного действия.

Установлено, что эффект комбинированного действия Hg(II) и органических соединений, содержащихся в виноградном вине, ниже аддитивного.

Предложен диаграммный метод количественной оценки комбинированного действия лекарственных препаратов неорганической природы. Метод позволяет прогнозировать характер комбинированных воздействии ионов металлов в различных концентрационных сочетаниях.

Практическая значимость работы.

Предложенный метод количественной оценки комбинированного действия неорганических соединений может быть использован для оценки

биологической активности сложных лекарственных смесей, а также природных, питьевых, промышленных и бытовых сточных вод, содержащих различные комбинации примесей.

Метод позволяет количественно оценить токсикометрические характеристики комплексных лекарственных средств на основе серебра и меди.

Метод апробирован в химической лаборатории цеха гальванопокрытий АО "Москвич" и на кафедре процессов ферментации и промышленного биокатализа Московской академии пищевых производств. Акты прилагаются.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Международной конференции "Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК" (Москва, май 1995), на Российской национальной конференции "Формирование приоритетов лекарственной политики" (Москва, июнь 1995), на международной конференции "Экология и металлические покрытия" (Румыния, 1995), на Международном симпозиуме "Человек и лекарства" (Москва, апрель 1996), на межкафедральной конференции кафедр неорганической, физической и коллоидной химии и токсикологической химии ММА им. И.М. Сеченова.

Публикации. По теме диссертации имеется 8 публикаций.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических паук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ММА им. И.М.Сеченова (№ госрегист-рацин 0910039990), соответствует проблеме Научного совета АМН РФ №48 "Фармация", частной проблеме 15.00.02 "Фармацевтическая химия и фарамкогиозия".

Положения, выдвигаемые на защиту. На защиту выносятся: 1) Результаты исследований индивидуального действия соединений серебра (I), меди (II), ртути (II), хрома (VI), никеля (II) на культуру дрожжей Б. сегеУ151ае. 2) Результаты исследований комбинированного действия солей серебра-меди, хрома-никеля, а также ртути и органических лиган-

дов на культуру дрожжей 5. сегеУ151ае. 3) Действие малых доз тяжелых металлов на дрожжевые клетки. 4) Методы прогнозирования биологической активности сложных лекарственных смесей.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав экспериментального исследования, включающих методику эксперимента, результатов эксперимента и их обсуждения, общих выводов, библиографии и приложения. Работа изложена на 122 страницах, содержит 23 таблицы, 27 рисунков. Список литературы включает 136 источников, из которых 97 на иностранных языках.

Во введении сформулированы актуальность темы, научная новизна исследований и практическая значимость результатов работы.

Глава I содержит обзор литературы, в котором представлены данные о современном состоянии проблемы комбинированного действия в фармакологии неорганических соединений. Обобщены накопленные сведения о механизмах действия ионов серебра (I), меди (И), ртути (II), хрома (VI) и никеля (II) на биологические объекты различного иерархического уровня, в том числе и на дрожжи.

В главе II представлена характеристика объектов и методов исследования, а также описание разработанных методик количественной оценки комбинированного действия неорганических соединений на клетку.

Глава III посвящена обсуждению полученных результатов исследований индивидуального и комбинированного действия ионов металлов на дрожжевые клетки, предполагаемым механизмам цитостатического и цитоцидного действия.

Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали чистую культуру дрожжей БассЬаготусез сегеутаае штамм 776 из коллекции кафедры "Процессы ферментации и промышленного биокатализа" Московской академии пищевых производств.

Клетки 3.сегеУ)51ае шт. 776 имеют округлую, яйцевидную или эллип-

соидную форму; размер их от 6 до 9 мкм в поперечнике и от 8 до 10 мкм в длину. Вегетативно размножаются путем многостороннего почкования. 8.сегеу15!ае шт. 776, как и все другие дрожжи-сахаромицеты, имеют примитивный половой процесс соматогамного типа — копуляция соматических клеток, а не специализированных гамет. Половой процесс наблюдается у дрожжей лишь в неблагоприятных условиях.

Для поддержания культуры дрожжей использовали жидкую питательную среду — пивное сусло (рН=5-6, плотность 6°Б) и плотную среду -сусло агар.

Металлы использовали в виде растворов солей: №504, К2Сг207, Си(Ы03)2 или Си504, Ав1Ч03. Все соли имели квалификацию "хч". Кристаллогидраты обезвоживали и хранили в эксикаторе над твердым КОН.

Растворы солей готовили в диапазоне концентраций 5-10 3 — 5-Ю12 моль/л.

Методы исследования.

¡.Метод изучения влияния тяжелых металлов на жизнеспособность дрожжей

Влияние тяжелых металлов на жизнеспособность дрожжей изучали путем добавления растворов солей серебра (I), меди (II), ртути (II), хрома (VI), никеля (II) в питательную среду сусло-агар.

Из 48 часовой культуры дрожжей, выращенной на сусло-агаре, готовили исходную суспензию дрожжей путем внесения 4 бактериологических петель в 10 мл стерильной воды. В исходной суспензии производили подсчет клеток дрожжей в камере Горяева. Для приготовления рабочей суспензии исходную суспензию разводили стерильной водой. Рабочую суспензию дрожжей засевали поверхностным способом на среду сусло-агар, в которую перед посевом добавляли растворы солей металлов. В контрольном варианте использовали сусло-агар без добавления металлов. Опыты ставили троекратно, каждый — в трех повторностях.

Культивирование дрожжей проводили при температуре 28°С в тече-

ние 72 часов. Количество клеток дрожжей определяли по числу выросших колоний на среде сусло-агар (чашечный метод Коха).

Влияние тяжелых металлов на жизнеспособность дрожжей изучали также при внесении раствора металла определенной концентрации в рабочую суспензию дрожжей (время воздействия 30-60 минут). Затем чашечным методом Коха определяли жизнеспособность культуры.

При росте дрожжей на сусло-агаре изучали следующие признаки: формы колоний, размер колоний (ё, мм), пигментацию.

Изучение микроморфологических признаков — характеристику вегетативных клеток дрожжей — проводили путем микроскопирования живых клеток (препарат "Раздавленная капля"). Изучали следующие характеристики: форма клеток дрожжей, размеры, внутренняя структура клеток. Отмечали также способность вегетативных клеток к почкованию.

2. Метод изучения влияния ионов металлов на рост и размножение дрожжей

Культивирование дрожжей проводили в сусле (плотностью 6°Б, рН 5,5) в течение 96 часов при температуре 28°С. В среду перед посевом добавляли растворы солей металлов в исследуемом диапазоне концентраций. Через 24, 36, 48,60, 72, 76 и 96 часов отбирали пробы, в которых определяли концентрацию биомассы дрожжей нефелометрически на фо-тоэлектроколориметре (ФЭК-КФК-2, 1 = 590 нм). Параллельно подсчитывали число клеток в пробе в камере Горяева. Это позволило построить калибровочную прямую в координатах "абсорбция света — число клеток в 1 мл пробы".

3. Метод количественной оценки комбинированного воздействия неорганических соединений на биологические объекты

Для количественной оценки комбинированного воздействия неорганических соединений на биообъекты предложен диаграммный метод "доза-ответ".

За ответ при индивидуальных воздействиях принимали отношение

разности числа дрожжевых клеток в контроле Nk и числа дрожжевых клеток опыте Non к числу клеток в контроле.

NK-Non ~ м

* к

За ответ R при комбинированном действии принимали сумму ответов при индивидуальных воздействиях RMe. ^ =

î= ' Щ

Строили "ожидаемую" кривую "доза-ответ" для комбинированного воздействия.

О " N к — N Ие1+Ие 2

"Ожидаемую" кривую сравнивали с "экспериментальной", построенной по результатам опытов.

Если "экспериментальная" кривая совпадала с "ожидаемой", эффект комбинированного действия, равный сумме эффектов индивидуальных воздействий, рассматривали как суммарный или аддитивный. Если "экспериментальная" кривая располагалась выше "ожидаемой", то эффект комбинированного действия неорганических соединений выше аддитивного. Если "экспериментальная" кривая лежгла ниже "ожидаемой", то наблюдаемое действие было ниже аддитивного.

Результаты н их обсуждение

Проведены исследования действия меди (II) в виде CuS04 (Cu(N03)2), серебра (I) в виде AgN03, солей хрома (VI) в виде К2Сг207, никеля (II) в виде NiS04, в диапазоне концентраций от 5-1012 моль/л до 5-I0"3 моль/л. Установлены минимальные подавляющие концентрации (МПК) и минимальные цитоцидные концентрации (МЦК) для ионов серебра (I), меди(Н), xpoMa(VI), никеля(И), а также концентрации ионов металла,

вызывающие стимуляцию роста дрожжей. Результаты представлены в таблице 1.

Как следует из данных таблицы 1, МПК для ионов хрома (VI) и никеля (II) совпадают — 5104 моль/л. Для меди (II) эта характеристика имеет более высокое численное значение — 8-Ю-4 модь/л. В то же время МЦК для всех трех ионов одинаковы — 2-10"5 моль/л. К действию серебра дрожжевые клетки оказались значительно более чувствительны. Значения МПК и МЦК серебра отличаются на несколько порядков по сравнению с другими металлами МПК 2-10"7 моль/л, МЦК — 5-10 е моль/л.

Таблица 1

Эффекты индивидуального действия ионов мета,иов в концентрациях от 510-" до 5-10-3 моль/л на /слетки дрожжей $.С. по раъшчпым критериям (рост, размножение, жизнеспособность)

Металл Стимуляция МПК МЦК

¿¿5(1) 510-|2-510-'° 2-10-' 5-Ю-6

Си (II) 510'12- 5-10~10 810"4 2-10"1

Сг (VI) МО'12, 5-10-1° 510"4 2-Ю-3

N1 (II) 510-12- 5-Ю-11 5- 10"4 2-10"3

Полученные результаты хорошо согласуются с другими исследованиями [Каспаро!ва С.Г., 1991]. Известно, что микроорганизмы способны расти при довольно высоких концентрациях тяжелых металлов и накапливать их в биомассе. При этом микроорганизмы демонстрируют различия в отношении к разным ионам металлов, причины и механизмы которых до конца не ясны. Чаще всего устойчивость микроорганизмов к металлам объясняют низкой проницаемостью клеточных мембран, нейтрализацией их в вакуолях или связыванием металлов специфическими низкомолекулярными белками — металлотионеинами. Можно предполагать, что устойчивость клеток дрожжей к действию исследуемых ионов тяжелых металлов (Сг(У1) , N1(11), Си (II) связана именно с этими факторами. В случае меди более широкий диапазон концентра-

дий "МПК - МЦК", вероятно, объясняется именно адсорбцией ионов Си2* на поверхности клеточной мембраны с образованием прочных ор-ганометаллических комплексов. Последние нарушают проницаемость цитоплазматической мембраны, сшская эффективность прощшювеиия следующих порций металла внутрь клетки. При этом медь в основном накапливается в клеточных стенках дрожжей, а не в растворимой фракции белков.

Особого внимания, на наш взгляд, заслуживает тот факт, что при действии ионов металлов в концентрациях, не вызывающих гибели клеток или обладающих слабым статическим эффектом, наблюдаются изменения структуры дрожжевых клеток.

Исследуя влияние тяжелых металлов на дрожжи чашечным методом Коха н методом микроскопии, удалось обнаружить макро- и микроморфологические изменения культуры, а именно, изменение размера колонии, клеток, числа почкующихся клеток, а также изменеш!е внешнего вида клеток и появле1ше пигментащш. Результаты исследовашш обобщены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние тяжелых металлов на структуру, размер и развитие дрожжевых клеток

Ме Кощ. Д»5сттаг Число лонкукицихся клеток Размер ы»тст> Рааиер кола ид Ерушз изменения

№ 10" 10* 1С* 1а' нейтральное цитавйтрагьнм цетостатичаскм цитаттичвсков спи*я«м снижение сккженм сжжсяча уменьшение каблвдапк половой процесс, эеристая стркяура к/и гак

Сг О О О О статическое сильное сташческоа без изиенеилй клетем зиэитоыю едаН9в,чемв контроле зкмительюа уменьшен» уввоми« васуоли

АЭ ю7 10' стоическое сильное статическое сква«е без «цена«« баз изменений без изиенений

Си ю1 сгапмвско» ггапмвека» сншме без изменений сильное уменьшение небольшое уменьшен» колонии имеет коричнгецо пигмеквда!

Увеличение размера клеток можно объяснить тем, что хромат-ионы, использующие сульфатные транспортные механизмы, проникают в цитоплазму, значительно повышая внутриклеточное осмотическое давление [Venugopal В., 1978]. Для восстановления нарушенного равновесия в клетку проникает растворитель и она увеличивается в размерах. Серебро (I) не влияет на размеры клеток, но ингибирует процесс размноже-ния-почкование. Последнее, вероятно, связано с блокированием тиоло-вых групп ферментов, ответственных за процесс размножения. Наблюдаемый характер воздействия наиболее схож для Ni(II) и Си(И), что не исключает идентичности механизмов их действия. В то же время коричневая пигментация колоний при действии Cu(II) может косвенно свидетельствовать о существовании редокс-процессов с участием тиоловых групп (последние невозможны для никеля) [Rüssel, 1994]: 2RS- + Cu2+ = R-S-S-R + Cu+; Cu+ = Cu2+ + Cu°. Таким образом, результаты исследований показали, что воздействия ионов металлов в процессе развития дрожжей имеют различные эффекты в зависимости от природы и концентрации ионов, времени воздействия на культуру.

Особый интерес как для фармации, так и для токсикологии и экологии, представляет характер индивидуального и комбинированного действия химических веществ с низким уровнем содержания [Бурлакова, 1995]. Для фармации - это действие гомеопатических доз, для токсикологических исследований — хронические опыты, для экологии и гигиены — действие на живую клетку веществ в количествах ниже ПДК. Известен и постоянно получает новые экспериментальные доказательства тот факт, что малые дозы неорганических соединений действуют зачастую совершенно отлично-от больших концентраций. Значительные трудности при оценке действия малых доз (ниже Ю-9 г) связаны, в частности, с ограниченными возможностями аналитических методов. Контроль за их действием на человека затруднен, так как не разработаны крите-

рии выбора характера ответа, который чаще всего не проявляется так наглядно, как в случае больших доз [Плетенева Т.В., 1995].

В связи со сказанным выше представляло интерес изучить действие Ag(I), Cu(II), Cr(VI), Ni(II) на дрожжи при концентрациях данных ионов в питательной среде порядка Ю10 - 10'2 моль/л. Эти концентрации значительно ниже МПК, что позволяло предположить цитонейтральное действие ионов металлов.

Особого внимания на наш взгляд заслуживают эффекты действия ионов Cr(VI) и N¡(11) в исследуемом диапазоне концентраций, представленные на диаграммах "доза-ответ" (рис. 1).

Так для ионов xpoMa(VI) (рис. 1) обнаружена область цитостатиче-ского действия 51012 — 5-Ю " М. При этом для Cr(VI) в концентрации 5-10 " М цитостатическое действие более выражено. В исследуемом временном интервале количество биомассы не достигает контрольных значений (рис.1).

XpoM(V]) в концентрации 5-Ю"10 М обладает стимулирующим действием, эффект которого сравним с эффектом действия меди (II) в той же концентрации.

Для никеля (II) концентрации 5-Ю"'2, 5-Ю"10 М являются цитостати-ческими. При концентрации никеля 5-Ю " М наблюдается стимуляция роста (131%).

Как следует из экспериментальных результатов (таблица 1), эффект действия малых доз ионов металлов на клетки дрожжей отличался от предполагаемого эффекта цитонейтрального действия. Полученные экспериментальные результаты по стимулирующему действию низких концентраций серебра и меди согласуются с литературными данными[Бур-лакова, 1995].

Так ионы серебра (I) и меди (II) в концентрациях 5-Ю"12 — 5-Ю"10 М вызывают стимулирующий эффект роста дрожжей порядка 111-125%. Интересно отметить, что ионы серебра в концентрации 5-10'" М и ионы

0.00 Сг 5*10-12

0,00 N1 5*10-12

-48 -60 -72

5*10-11 О

-48 ;

-60 ■ -72 ;

5*10-10

5*10-11

В

Рис. 1. Диаграмма "доза (Э)-ответ (Н)" при воздействии "малых" доз ионов хрома (VI) и никеля (II)

меди (5-Ю"'2 — 5-10 " М) задерживают рост культуры примерно на сутки по сравнению с контрольным вариантом, и лишь затем проявляют стимулирующее действие.

Комбинированное действие ионов металлов на культуру дрожжей

БассЬаготусев сегеуЫае Для изучения комбинированного действия были выбраны диапазоны концентраций солей от уровня ненаблюдаемого эффекта до минимальной цитоцидной концентрации.

Как следует из полученных результатов между воздействием солен

серебра и меди, хрома и никеля в отдельности и воздействием их парных комбинаций (серебро — медь), (хром — никель) наблюдаются значительные различия.

В качестве примера рассмотрим более подробно действие ионов серебра и меди на развитие дрожжевых клеток. Ионы серебра в концентрации 510 7 — 1-Ю 6 моль/л не оказывают заметного влияния на динамику развития культуры: экспериментальная кривая совпадает с контрольной (рис. 2). При увеличении концентрации Ag(I) до 2- 10 б моль/л наблюдается цитостатический эффект, и кривая, отражающая динамику накопления биомассы, располагается ниже контрольной. При этом предельные значения абсорбции достигаются с запаздыванием примерно на 5 часов. Увеличение концентрации в 2,5 раза (до 5-Ю'6 моль/л) приводит к полной гибели клеток. Развитие культуры не наблюдается в исследуемом временном интервале, и все экспериментальные точки лежат ira оси абсцисс.

При совместном действии ионов серебра и меди цитостатический эффект наблюдается уже для комбинации (Ag 5-10'7 + Си 5-10"4). При индивидуальных воздействиях компонентов смеси в этих концентрациях влияния на развитие культуры не наблюдалось. Несмотря на отсутствие эффекта при индивидуальном воздействии ионов серебра, комбинация (Ag 8-Ю"7 + Cu 8-10"4) оказывает цитостатический эффект (рис.2). Цитоцидным действием обладает комбинация Ag 2-Ю"6 + Cu 2-Ю"3, хотя серебро в такой концентрации, действуя индивидуально, оказывает цитостатический эффект.

Для количественной оценки взаимного влияния солей металлов в комбинациях совершенно недостаточно сравнения кривых динамики развития клеточной культуры. Известно, что для расчета эффекта комбинированного действия могут применяться различные диаграммные методы, например, 2-х и 3-х мерные болограммы ' "доза-ответ" (Леве 1928, Кудрин, 1978). Нами модифицирован и применен количествен- 17 -

во

50 60 70 60

бремя роста, час

в Контроль • A3,5*10-7 Л Ад. 8*10-7 х Ад, 1*10-6 х Ад, 2*10-6 о Ад, 5*10-6

Е^еиярост», час

50 60 70

Бреця роста, час

Я Контре ль ♦ Ад5Щ-7,Си5*-1М Л-4вв*1>7, СцвЧМ XAaTD-6.CuTt>-3 ЖАд 2"tWÎ, Си 2*Ю-3 eAe5D-i,Cu5-0-3

Рис. 2. Динамика развития культуры $ассЬаготусг$ сегеуЫае шт. 776 при культивировании на сусле с ионами серебра (II) и меди (II) (С, моль/л)

_ 1я .

ный метод оценки эффектов комбинированного действия неорганических соединений на биологические объекты на клеточном уровне на основе построения двухмерных болограмм "доза-ответ".

Болограммы строили для 48, 60 и 72 часов роста культуры. На рис. 3, 4 представлены болограммы "доза-ответ" для комбинированного действия пар серебро-медь, хром-никель на культуру дрожжей Б. сегеУ151ае шт. 776 в период логарифмической стадии роста (60 часов).

Сравнение "ожидаемых" и экспериментально полученных кривых показывает, что в общем случае комбинированное действие нельзя рассматривать как результат простого суммирования индивидуальных эффектов. Так из представленной диаграммы следует, что в области более низких содержаний ионов рассматриваемое различие достоверно (рис. 3). При этом экспериментальная кривая лежит выше суммарной ("ожидаемой"). Это является свидетельством того, что эффект комбинированного действия меди и серебра в указанном концентрационном интервале выше аддитивного. Сумма индивидуальных токсических эффектов меди и серебра может быть равна эффекту при комбинированных воздействиях, но лишь при наиболее высоких концентрациях в исследуемом диапазоне: 5-Ю 6 моль/л /^(1).

Для солей Сг (VI) и N¡(11) (рис. 4) область концентраций выше 210" 3 моль/л соответствует аддитивному характеру действия. Ниже этого значения эффект выше аддитивного.

Очевидно, что ионы хрома (VI) и никеля (II) взаимно влияют друг на друга, усиливая действие на клетку. Так при совместном присутствии ионов Сг(У1) в концентрации 5-Ю-4, вызывающей слабое цитостатиче-ское действие, и ионов N¡(11) в концентрации, обладающей цитонейт-ральным действием, наблюдается сильный цитостатическнй эффект. Совместное присутствие хрома и никеля в концентрациях, обладающих цитостатическим индивидуальным действием, приводит к полной гибели клеток — цитоцидному действию.

60 часов

Рис. 3. Бологралша "доза-ответ" для комбинированного действия серебра

(I) и меди (II)

60 часов

Рис. 4. Болограмма "доза-ответ" для комбинированного действия ионов хрома (VI), и никеля (II)

Комбинированное действие ртути (II) и органических соединений Нами было исследовано действие препарата "Витурид", проходящего доклинические испытания, на эукариотную клетку на модельной системе дрожжей Б. сегеу!Бгае шт. 776. Действие препарата изучали в сравнении с действием вина, на основе которого готовится препарат. Для сравнения был поставлен ряд опытов по изучению индивидуального действия на дрожжи хлорида ртути (II) (водный раствор), и комбинированного действия в паре ЩС12-вино (винный раствор).

По полученным результатам можно сделать вывод о том, что органические компоненты вина являются антагонистами по отношению к HgCl2. Так водный раствор сулемы (начальная концентрация 333 мг/л, разбавление в 50 раз) задерживает рост дрожжей на двое суток, тогда как винный раствор сулемы при том же разбавлении задерживает рост дрожжей на сутки по сравнению с контрольным вариантом.

Количественную характеристику комбинированного действия сулемы и вина можно получить, построив кривые "доза-ответ". Болограмма "доза-ответ" (рис. 5) наглядно демонстрирует, что эффект комбинированного действия HgCl2 и вйна ниже аддитивного. Все "экспериментальные" кривые лежат ниже "ожидаемых".

Таким образом, проведенное биотестирование препарата витурид, виноградного вина, водных и винных растворов сулемы с использованием дрожжей S. cerevisiae показало, что присутствующие в виноградном вине органические лиганды снижают токсичность ртути (II). Специальная обработка винных растворов (know how) при изготовлении препарата "Витурид" усиливает обнаруженный антагонистический эффект. При разбавлении "Витурвда" его токсичность резко снижается.

60 часов

Рис. 5. Болограмма "доза (И)-ответ (Л)" для комбинированного действия

ртути (II) и вина

выводы

1. Проведенный анализ литературных данных свидетельствует, что сведения о комбинированном действии неорганических соединений не позволяют количественно оценить и прогнозировать их биологическую активность.

2. Определены минимальные подавляющие концентрации (МПК) и минимальные цитоцидные концентрации (МЦК) ионов Ag(I), Cu(II), Cr(VI), Ni(II). Установлены концентрационные интервалы, соответствующие стимулирующим эффектам (табл. 1).

3. Разработан методологический подход количественной оценки комбинированного воздействия лекарственных препаратов неорганической природы, основанный на построении диаграмм "доза-ответ" одноком-понентных и бинарных систем.

4. Установлено, что эффект комбинированного действия ионов Ag(I), Cu(II) выше аддитивного в областях цитонейтрального и цитостатиче-ского действия и имеет аддитивный характер в области цитоцидного действия.

5. Установлено, что эффект комбинированного действия ионов Cr(VI) и Ni(II) выше аддитивного в областях цитонейтрального и цитостатиче-ского действия и аддитивный характер в области цитоцидного действия.

6. Установлено, что эффект комбинированного действия Hg(II) и органических соединений, содержащихся в виноградном вине, ниже аддитивного.

7. Установлено, что ионы серебра (I), меди (И), хрома (VI), никеля (И) действуют в первую очередь на молодые, интенсивно размножающиеся клетки, угнетают процесс почкования.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ершов Ю.А., Плетенева Т.В., Каптерева Ю.В., Слонская Т.К. Исследование действия ионов серебра и меди на культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae. — Серебро в медицине, биологии и технике.

Препринт №4, Новосибирск, 1995, с.131-137.

2. Слонская Т.К., Ершов Ю.А., Плетенева Т.В., Каптерева Ю.В. Комбинированное действие ионов серебра и меди на культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae. — Серебро в медицине, биологии и технике. Препринт №4, Новосибирск, 1995, с.138-145.

3. Слонская Т.К., ПлетеневаТ.В., Ершов Ю.А., Каптерева Ю.В., Иль-яшенко Н.Г. Действие ионов тяжелых металлов на пивные дрожжи. — Тез. докл. Международная конференция "Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК". Москва, 16-18 мая 1995, с.205.

4. Слонская Т.К., Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. Применение клеточных моделей для прогнозирования биологической активности лекарственных препаратов неорганической природы. — Тез. докл. Российская национальная конференция "Формирование приоритетов лекарственной политики". Москва, июнь 1995, с.143.

5. Pleteneva T.V., Ershov Y.A., Esmenskaya N.B., SlonskayaT.K. Biological test for electroplating effluents. — Internatinal conference "Ecology and metal electroplating". Romania, October, 1995, p. 104-106.

6. Ершов Ю.А., Плетенева Т.В., Слонская Т.К. Количественная оценка биоактивности токсичных агентов. — Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1996 - в печати.

7. Ершов Ю.А., Плетенева Т.В., Воробьева Т.В., Есменская Н.Б., Слонская Т.К. Комбинированное действие лекарственных препаратов на основе неорганических соединений. — Тезисы докл. Международный симпозиум "Человек и лекарства", Москва, апрель 1996.

8. Плетенева Т.В., Воробьева Т.В, Ершов Ю.А., Слонская Т.К., Есменская Н.Б. Оценка биологической активности препарата на основе координационных соединений ртути. — Тезисы докл. Международный симпозиум "Человек и лекарства", Москва, апрель 1996.

•M73U&T 'Jrmu/uiu/sM, ub? /¿? snct.1 /00 лa£ /0/£ - /уЖ

s , С ' * J

- 23 -