Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Оценка токсикометрических характеристик индивидуальных и комбинированных лекарственных препаратов серебра с использованием биологических клеточных моделей

С.

су

■:• На правах рукописи

/

Есменская Наталья Борисовна

ОЦЕНКА ТОКСИКОМЕТРИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ИНДИВИДУАЛЬНЫХ И КОМБИНИРОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ СЕРЕБРА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЕЙ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И. М, Сеченова

Научные руководители:

- доктор химических наук, профессор Лобанов Ф.И.

- доктор химических наук, профессор Ершов Ю.А.

Официальные оппоненты:

доктор фары, наук, проф. Самылина И. А. доктор биол. наук, проф. Глущенко H.H.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский химико -фармацевтический институт

Защита диссертации состоится " UmsUJC 1996 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.074.05.06 при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (121019, Москва, Суворовский бульвар, 13). /

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии

Автореферат разослан "20" МCLJL 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук, доцент

Н.П.Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Высокая токсичность и иммунодепрессивное действие антибиотиков, резистентность к ним микроорганизмов, сильные аллергические реакции при их применении, а также высокая стоимость и сложный технологический процесс производства вновь вызвали интерес к лекарственным препаратам на основе серебра, широко применявшимся с древнейших времен до середины XX века.

Биологические эффекты воздействия серебра исследовались достаточно подробно. Несмотря на это многие детали молекулярных механизмов антибактериального действия серебра остаются невыясненными. Совершенно не изучены биохимические и токсикологические аспекты механизмов при комбинированных воздействиях препаратов серебра, меди и других лекарственных средств неорганической природы.

В последнее время возрос интерес к использованию культур простейших организмов в качестве модельных систем для исследования биологической активности и токсического действия неорганичес- , ких соединений и лекарственных препаратов. Это объясняется различными причинами: гуманным отношением к высшим организмам, стоимостью лабораторных животных, и одновременно, доступностью простейших. Следует отметить достаточно высокий уровень организации простейших. В частности, инфузории Paramecium caudatum имеют много общих свойств с нервной клеткой.

Существенным фактором является и то, что инфузории можно достаточно просто культивировать. Для этого применяют малокомпонентные питательные среды. Они не содержат органические составляющие, связывающие ионы металлов в прочные комплексы. Т.акие органические лиганды необходимы для культивирования большинства бактерий, но значительно снижают биологическую активность ионов металлов. Поэтому применение инфузорий для биотестирования позволяет дать более точную токсикологическую характеристику исследуемым

- г -

препаратам. Одним из достоинств этих модельных объектов является то, что уровнень их биологического развития соответствует патогенным микроорганизмам.

Таким образом, из сказанного выше следует, что исследования с применением клеточных моделей имеют ряд преимуществ перед традиционными методами. Результаты, полученные на клетках информативны и экономичны. Кроме того, эти результаты могут быть использованы для корреляционной оценки токсического действия различных соединений на клетки высших организмов. Последнее обстоятельство объясняется тем, что все биологические системы (от бактерий до человека) в качестве генетической матрицы используют ДНК. Следовательно, молекулярные механизмы генетической токсичности неорганических соединений часто одинаковы для биологических систем различного иерархического уровня.

Целью настоящего исследования являлась оценка токсикометри-ческих характеристик индивидуальных и комбинированных лекарственных препаратов серебра с применением культур простейших в качестве клеточных моделей.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: -разработать экспресс-методику для оценки биологической активности комбинированных лекарственных препаратов на основе органических и неорганических соединений серебра и меди;

-апробировать и модифицировать имеющиеся методики биотестирования водных сред с применением культур одноклеточных организмов для водных растворов соединений серебра,' меди, ртути, их комбинаций;

-на основе полученных феноменологических данных разработать общие подходы к оценке комбинированной токсичности;

-испытать разработанные методики для оценки антисептического действия отваров и водных настоев лекарственного растительного сырья.

Научная новизна работы.

Впервые клетки инфузорий Paramecium caudatum и Spirostomm ambiguum использованы в качестве молельных систем для сравнительной оценки биологической активности лекарственных препаратов на основе органических и неорганических соединений серебра: серебра нитрата; аммаргена, колларгола, протаргола, повиаргола, настоев лекарственного растительного сырья.

Впервые осуществлена оценка биологической активности лекарственных средств, на основе соединений серебра с учетом концентрации ионых форм.

Разработана методика оценки токсичности многократно вводимых доз веществ (на примере серебра нитрата и меди сульфата). Предложена формула расчета дозы при множественном поступлении исследуемого препарата с учетом времени его воздействия.

Установлены интервалы биологической активности ионов серебра (I) (10~9~10~гмоль/л) и меди (II) (5*10~5-2*Ю"гмоль/л) для инфузорий Paramecium caudatum.

Установлена концентрационная область для различных мольных соотношений солея AgN03 и CuS04, в которой усиливается биологическая активность ионов меди и серебра: (2.5*10" 5-1.0*10"4 )моль/л.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических

наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (N госрегистрации 0910039990), соответствует проблеме Научного совета АМН РФ N 48 "Фармация", частной проблеме 15.00.02 - "Фармацевтическая химия и фармакогнозия".

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Российской национальной конференции "Формирование приоритетов лекарственной политики", г.Москва, ишь 1995 г., на 23-ем конгрессе Европейского биохими-

ческого общества, г.Базэль, Швейцария, август 1995 г., на конгрессе "Экология и металлические покрытия", г. Синая, Румыния, октябрь 1995 г., на Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, апрель, 1996 г..научных семинарах кафедры токсикологической химии и неорганической» физической и коллоидной химии фармацевтического факультета ММА им.И.И. Сеченова.

Публикации

По материалам исследований опубликовано 8 печатных работ: статей - i, тезисов докладов - I.

Практическая значимость работы

Методика биологического тестирования водных растворов неорганических- и органических соединений серебра и меди с использованием культуры Paramecium Caudaturn внедрена на кафедре фармакогнозии фармацевтического факультета для сравнительной оценки бактерицидных настоев календулы и серебра нитрата, в А/0 "Москвич" для анализа сточных вод гальванического производства. Методика биотестирования с использованием инфузорий Spirostomum ambiguum для фармакологической оценки лекарственных препаратов серебра неорганической природы и препаратов,содержащих органические лиганды используется в лаборатории эволюции механизмов памяти кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ.

На защиту выносятся:- результаты исследования биологической активности ионов серебра (I). и меди (II) на культуру инфузорий Paramecium caudatum,

- результаты исследования комбинированного действия растворов серебра (I) и меди (II) на инфузории Paramecium caudatum при однократном и многократном поступлений исследуемых веществ,

- результаты по оценке токсикометрических характеристик лекарственных препаратов серебра (аммарген, серебра нитрат, колларгол, протаргол, повиаргол) на клеточных моделях Paramecium cauda-tum и Spirostomum ambiguum.

гол, протаргол, повиаргол) на клеточных моделях Paramecium cauda-tua и Splrostomum ambiguum,

- результаты по оценке биологической активности водного настоя цветков календулы.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения. 4 глав, выводов, списка литературы и приложения, изложена на iis страницах машинописного текста, включает 2.8 рисунка и 3S таблиц. Список цитируемой литературы составляет 154 наименования, из них 85 на иностранных языках.

В главе I "Литературный обзор" обобщены литературные данные по применению лекарственных препаратов серебра в России и за рубежом. В частности, приведены сведения, представленные в национальных Фармакопеях Британии, Франции, Германии, Италии, США, и Европейской Фармакопеи. Дано научное обоснование преимуществ использования лекарственных препаратов серебра в качестве антимикробных средств по сравнению с антибиотиками. Рассмотрены молекулярные механизмы антимикробного действия соединений серебра и меди в присутствии органических лигандов.

В главе 2 представлены объекты и методы исследования.

Глава 3 содержит результаты и их обсуждение по определению токсикометрических характеристик индивидуального и комбинированного действия ионов серебра, меди и лекарственных препаратов серебра.

Глава 4 посвящена обсуждению результатов по определению антисептического действия водного настоя цветков календулы, комплексов редкоземельного элемента празеодима с органическими лиган-дами, лекарственного препарата на основе ртути (II) (витурид).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования были использовали культуры простейших организмов Рагашеаши саида1ш, предоставленные кафедрой фармакологии фармацевтического факультета ММА им. И.М.Сеченова, и 5р1го51отша атЫеишп, предоставленные лабораторией эволюции механизмов памяти кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ им. Ломоносова.

1. Методика однократного введения токсиканта с использованием инфузорий Рагашес^иш саисШит.

Тест-реакцию регистрировали визуально с помощью бинокулярного микроскопа. !

На предметное стекло помещали 0.02 мл среды, в которой находились 10-15 парамеций. После установления регулярных движений инфузорий- в центр капли вносили 0.02 мл испытуемого раствора.

В течение 60 минут после внесения анализируемой пробы проводили наблюдения. О токсическом действии водных растворов судили по гибели всех особей в пробе.

Полученные результаты представляли графически в виде кривых "доза-ответ"-. По оси абсцисс ("доза") откладывали значения концентрации раствора (с, моль/л). На ординату ("ответ") наносили продолжительности жизни парамеций (Т, мин.) после внесения в пробу исследуемого препарата.

2, Методика многократного введения исследуемых веществ с

использованием инфузорий Paramecium caudatum.

После установления регулярных движений инфузорий в пробу (0.02 мл) по каплям с интервалом в 3 минуты вносили исследуемые растворы. В течение каждого трехминутного интервала подсчитывали число обездвиженных особей. Эксперимент считали завершенным, когда после добавления очередной капли исследуемого раствора инфузории полностью прекращали движения. Поскольку по данной методике концентрация не являлась постоянной величиной, дозу расчитывали по формуле:

D^c.^b-t. , Где .

D - суммарная доза введенного препарата

Ci- концентрация вещества в однократной дозе, мопь/л

t - время действия однократной дозы, мин.

За "ответ" принимали долю погибших инфузорий по отношению к их общему числу в пробе.

3. Методика биотестирования с использованием инфузорий fcpirostomum ambiguum.

В качестве тест-реакции Spirostomura ajabiguum использовали такой показатель жизнедеятельности инфузорий, как уровень спонтанной двигательной активности. Для его регистрации учитывали число пересечений инфузорией линии визира окуляра микроскопа за 5 минут опыта.

Кроме указанного функционального показателя, учитывали также выживаемость инфузорий и изменение формы клеток, которая в условиях сильной интоксикации становилась ретортообразной, грушевидной или шаровидной.

За меру токсичности принимали статистически достоверное раз-

личие двигательной активности у подопытных и контрольных спирос-том.

Из пробирки, где культивировали инфузорий, отливали 2-3 мл в часовое стекло. Дозаторной пипеткой (0.02 мл) под микроскопом отбирали инфузорий и помещали по 10 особей на другое часовое стекло, содержащее 0.2 мл исследуемого раствора. Контролем служили 10 особей, помещенных в обычную среду.

В течение часа периодически при помощи налобной лупы наблюдали за подопытными и контрольными инфузориями. Если за этот период не происходит гибели или заметной деформации подопытных особей, через 1 и 24 часа проводили исследование их функционального состояния. Для этого одну инфузорию отсаживали в плексигласовую камеру.

После адаптации инфузории к условиям камеры определяли уровень их спонтанной двигательной активности инфузорий.

Полученные данные обрабатывали статистически и оценивали по критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИОНОВ СЕРЕБРА НА КУЛЬТУРЕ ИНФУЗОРИЙ Paramecium caudatura

Биологическую активность серебра исследовали по методике однократного введения веществ в интервале концентраций серебра нитрата от 10"10 до 10 моль/л. Каждый опыт проводили для серии 10-кратных разбавлений, проверяя действие анализируемого раствора не менее трех раз. Результаты эксперимента представлены графически на рис. 1.

При концентрациях раствора от 10"2 моль/л и выше наблюдали моментальную гибель всех инфузорий в пробе. В более разбавленных

растворах продолжительность жизни инфузорий возрастала. Число погибших инфузорий менялась во времени. Полная гибель всех особей за 1 час наблюдения была обнаружена для растворов вплоть до .10"8моль/л. При концентрации препарата 10"10 моль/л инфузории оставались живы в течение всего периода наблюдения.

Таким образом, можно считать, что в исследованном диапазоне летальных концентраций серебра нитрата 10"2 моль/л является острой летальной, а 10"9 моль/л - минимальной летальной.

Для выявления более детального хода кривой "доза-ответ" были проведены дополнительные эксперименты с очень малым "шагом" по оси абсцисс и для более узкого интервала концентраций: 10"5 -10"4 моль/л. Обнаружено значение концентрации, в которой происходит резкое увеличение биологической активности ионов серебра: с(АеИОз)-в.2»10"5 моль/л (рис.1).

Биологическую активность ионов меди исследовали в интервале концентраций меди сульфата от 10"5 до 10"1 моль/л (рис.2).

Результаты свидетельствуют о значительно меньшей токсичности ионов меди (II) по сравнению с ионами серебра (I). Так. в условиях данного эксперимента зона летального действия меди сульфата находилась при концентрации выше 10"5 иоль/л. Концентрация 10"5 моль/л не оказывала заметного действия на парамеций в течение одночасового эксперимента. Интересно отметить, что как и в случае АвШз; концентрация 2x10"2 моль/л является остро летальной! В то ие время минимально летальные концентрации отличаются на несколько порядков: 10"9 и 5x10"5 моль/л соответственно.

Биологическое действие меди было исследовано и в более узком концентрационном интервале. Как и для ионов серебра (рис.1), дополнительная часть рис.2 выполнена в другом масштабе и для более узкого интервала концентраций" (10"4-10"3) моль/л. На пересечении касательных к двум участкам кривой "доза-ответ", определили значение концентрации, выше которого наблюдается резкое увеличение

Рис.< Зависимость прадолжгельнэсти жизни парзмешй от ксадзнгрвим

(о- мэдярая ктшл-рвдо соли, моль/л; рС»-1вС). .

тадоляплльности истни пдамеиий от кошекгиндт сц»4 (о- малярная ксшгнтташя сот, 'моль/л; рс-.1»с)

токсичности меди: c(CuS04)=>3.1*10"4 моль/л.

Таким образом, в данном эксперименте по оценке биологической активности серебра и меди на культуре инфузорий Paramecium cauda-tuiii было установлено:

Зона летального действия серебра находится в концентрацией-

_ Q _ О

ном интервале 10 <с<10 моль/л.

Диапазон летальных концентраций меди сульфата имеет следую-

„с _ о

щие границы: 5.0*10 <с<2.0*10 моль/л.

В условиях данного эксперимента концентрация серебра нитрата 1.0*10"10 моль/л и меди сульфата 1*10"5 моль/л не вызывают гибели и не оказывают заметного действия на жизнедеятельность парамеций.

Пороговые значения концентраций меди и серебра, соответствующие резкому изменению их активности, имеют близкие значения и составляют: c(AgN03) = 6.2x10"5 моль/л; c(CuS04)=3. lxlO"4 моль/л.

КОМБИНИРОВАННОЕ ДЕЙСТВИЕ РАСТВОРОВ. СЕРЕБРА (I) И МЕДИ (II) НА ИНФУЗОРИЙ Paramecium caudatum

Исследовано комбинированное действие растворов соединений серебра и меди на культуру инфузорий Paramecium caudatum.

Концентрации исходных растворов серебра нитрата и меди сульфата составляли 2.5х10"5, 5.0x10'5, 7.5x10"5 и 1.0x10"4 моль/л. Растворы каждой из указанных концентраций смешивали в соотношениях: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3. 8:2, 9:1.

На рис. 3 представлены экспериментальная кривая комбинированного действия серебра и меди для концентрации c(AgN03+CuS04) -10"4моль/л и предполагаемая кривая, полученная суммированием индивидуальных воздействий.

Для построения кривой в предположении аддитивного эффекта были проведены параллельные испытания индивидуальных растворов серебра и меди в изучаемом концентрационном интервале. Экспери-

Рис, 3 КшЕые "даа-отеет" »«.пивцуального к кшЗюдарзаажого действия сесебса и мел« г. коюекгрвнией с*1СГ*мсуп»// на ик*уэогми р

е!ия е«и4аСи»

1 - {«дивадуальное действие а«ж>3

2 - кснбыхравашсе дзйстше Авю3 и СиЭО^ (экспериментальная кривая)

3 - ингиЕилуальное действие сиэо4

4 - каЛф^тюеа**« ^йг-гвия Дв«03 и СиЭ04 (теоретическая кривая)

X - иэобала ксмбишровагмэго^аэйггЕИЯ раствора с жидентр®'«*« с(К&Ю-)-с1Си$0А)*г.Ьх10 шль/л

2 - юэбола момЗ»«роеаь«эгОвКйствия растворе с катггршиаы

с(А4И0э)-с(Си$04)« 5*10"" шль/л

3 - изобата юЛиютоованнсгокдействия раствора е кошпрадалм

С{А^ЯОл)*С(СиЗО^)«7.5x10 иаяь/л * - юобопа кшОинирсЕанногОхдайствия раствора с коодэтроиряш

е(АвН03)-с(Си8О4) • 10 -иОЛЬ/Л

менталькая кривая 2 лежит ниже предполагаемой (кривая 4). Наблюдается достоверно более низкая выживаемость, а значит, серебро и медь проявляют синергизм токсической активности.

На рис.4 представлена пространственная болограмма комбинированного действия серебра и меди. В горизонтальной плоскости по двум осям координат откладывали значения концентраций обоих компонентов исследуемых комбинаций.

По вертикальной оси "ответ"откладывали величину, характеризующую токсичность (гибель), выражая ее через 1/Т, мин. Образующуюся поверхность можно сравнять с парусом. Полученные кривые имеют вид выпуклых изобол и парус "надут". В этом случае эти кривые являются изоболами синергического действия.

На рисунке соединены линиями те точки, в которых комбинации серебра и меди дают одинаковый "ответ" -1/Т. Полученные таким образом кривые повторяют очертания "надутого" паруса.

Таким образом, установлено, что в концентрационном интервале от 2.5*10"5 до 10" * моль/л усиливается биологическая активность комбинаций ионов серебра и меди на культуру Рагааесшш саис^шп по сравнении с индивидуальным воздействием препаратов.

ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ИНФУЗОРИЙ Рагатес1иш саийаЬии МНОГОКРАТНЫХ ДОЗ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ И КОМБИНИРОВАННЫХ РАСТВОРОВ СЕРЕБРА И МЕДИ

Многократное индивидуальное воздействие на парамеций исследовали в диапазоне (10"11-10"5) моль/л для А8Ш3 и (10"7-10"3)моль/л для Си5>04.

Обнаружено, что минимально действующие концентрации составляют: с(АеРЮ3)=10"10 моль/л, с(Си304)-10"й моль/л.

При многократном воздействии на парамеций комбинированных растворов серебра и меди эксперимент проводили в интервале кон-

l/n X x 100

9 io iiimji»"Wi

otCuSOjixlO ,М0Л>/*

(с=10"6маль/л) и

Рис. 5 Зависимость числа ДОЗ, вызывающ« 100 # гибели инфузорий Paramecium caudatum (1/n 3(100) ОТ СООТНОШЗНИЯ AgNO^

cuso^ (с=10"4моль/л) контрольные точки ■ 1- экетдарименгальная кривая 2- теоретическая кривая

tie

5 4

центраций серебра нитрата от Ю-8 до.10"6 моль/л и меди сульфата - от 10"6 до 10"4 моль/л. Эти концентрационные интервалы соответствовали одинаковым эффектам обеих солей. Концентрации исходных AgN0з и СиБ04 при составлении комбинаций были равны: N серии с моль/л с (СиБ04), моль/л

1 10"6 10" 4

2 10"6 10'6

3 ю-7 ю-5

4 10"8 ю-5

Для исследования комбинированных эффектов ионов серебра и меди растворы их солей каждой из указанных серий смешивали в соотношениях: 2:8, 4:6, 5:5, 6:4, 8:2.

За "ответ""ответ" принимали.величину, обратную числу введенных доз (1/М.

Результаты исследования комбинированного воздействия представлены на рис.5. Кривая 1. получена экспериментально для первой серии комбинаций:с(АвИОз)-10"6 моль/л) и с(СиБ04МО"4 моль/л.

Кривая 2 построена путем сложения "ответов" на воздействие индивидуальных растворов серебра и меди в тех же количествах, соответствующих серии 1.

Аналогичные кривые были получены для комбинированного воздействия AgN0з и СчБОд всех четырех концентрационных серий.

Полученные в ходе эксперимента кривые лежат ниже теоретических. То есть, при многократном введении дозы препарата ионы серебра и меди проявляют антагонистический характер при воздействии на инфузории Рагашес1 шл саисЫшп.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ'ПРЕПАРАТОВ СЕРЕБРА НА КУЛЬТУРЕ Рагашесшш саисЗаШт

Определение биологической активности лекарственных препара-

тов на основе серебра было осуществлено для серебра нитрата, ам-маргена, колларгола, протаргола, повиаргопа.

Полученные результаты представлены графически в виде кривых "доза-ответ" (рис.6). Изломы на этих кривых позволили охарактеризовать дозы препаратов, соответствующие резкому изменению их активности: протаргол - 5.1*10"6%, аммарген - 6.0*10"6%, повиаргол - 5.6*10"®?5, серебра нитрат - 1.1*10~3%, колларгол - 3.5*10"?Х.

Расположив исследуемые препараты в ряд по пороговой концентрации эффекту в соответствии,с уменьшением их токсичности для парамеций: протаргол > аммарген > повиаргол > серебра нитрат > колларгол. мы попытались обосновать правомочность такой зависимости. Нам не удалось обосновать наблюдаемой последовательности, так как обнаруженный ряд был получен с использованием не молярных концентраций, а массовых долей препаратов, а также без учета их растворимости.

Известно, что биологические эффекты неорганических соединений зависят от растворимости веществ и возрастают с увеличением концентрации элемента. Поэтому была проведена оценка количеств ионных форм серебра, образующихся при растворении того или иного препарата. Для этого учитывали природу препарата и растворимость соединения серебра, входящего в состав лекарственного средства (таблица).

В связи с существованием гетерогенного равновесия Ае-Б-Ргч* ** + РгБТ, концентрация иона А£(Н20)2* в растворах повиарго-ла и колларгола должна сохраняться постоянной. Значительные количества прогеинатов серебра в этих препаратах, по-видимому, обеспечивают лишь пролонгированный эффект, а не увеличение концентрации действующей формы. Несовпадение значений наблюдаемых эффектов объяснено лишь разной токсичностью органических компонентов в этих препаратах.

Значительно более высокая токсичность протаргола связана с

Рио.С Зависимость продолжительности яизни (Т, мин.) инфузорий Рагшпео1ит саиаа^т от массовой дож (». О соеданения серебра в тестируемых растворах лекарственных препаратов. *- время зшзни парамеций в лабораторных условиях 1- А8Г<О3 3- протаргол

3- ажарген

4- повиаргол

5- колларгол

Таблица.' .

Форма и йизико-химичеспие характеристики соединений серебра, присутствующих в изучаемых лекарственных препаратах

№ Название препарата Форма серебра в препарате Характеристики . равновесий с участием Ав Концентрация ионов в препарате, моль/л

1. Серебра нитрат а8(н20)+ Соль полностью дассоидарована в водном раствора: 1.5-10"г-5.9-10": . (0.25%-10%)

2. Аммарген Мв(«Н3)2Г* Аг++21«э К^ 5.9-10-8 2.2-МГ14 *

3. Протаргол Аг2о 1/2А82°ТВ/ нг°" * Ае++ он^о К =1.6-10 а -4 * 1.26-10

4. Колларгол Ае-В-рг А^-в-Рг^^Ае*+Рт5~ К8(А828)=)г.о-ю"50 -17* 5.0,10 (в пересчете на Ай2б)

5. ГЬвиаргол к .-г.о-го 5.0. ю-17*

* - расчетные значения

присутствием в препарате серебра (I) оксида, растворимость которого на несколько порядков выше растворимости протеинатов (табл.).

Для препаратов, водные растворы которых являются гомогенными системами, оценку активности, дозы осуществляли, выражая концентрацию не в массовых долях, а в единицах молярной концентрации (с, моль/л). При этом кривая "доза-ответ" для аммаргена еще больше сместилась в область высоких значений рС по сравнению с Ag^J0з.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ СЕРЕБРА МЕТОДОМ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ПО УРОВНЮ ДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИНФУЗОРИЙ Бр^иинш атЫгиии.

При изучении действия лекарственных препаратов серебра на уровень двигательной активности инфузорий Бр^гозЮшиш аиМкиит обнаружена прямая зависимость между концентрацией воздействующих лекарственных препаратов и их биологической активностью.

В условиях эксперимента зоны летальных концентраций препаратов находились в пределах: для аммаргена 6*10"7 - 6*10'6%; для серебра нитрата 10'5 - 5*10"5%; для протаргола 2. 5*10~5 - 5*10"5%; для повиаргола 10~4 - 5*10"4%; для колларгола 2.5«10"3 - 5*10"3%.

В данных концентрационных интервалах более высокие значения доз вызывали полную гибель инфузорий в условиях эксперимента. При меньших значениях концентраций инфузории, напротив, не погибали в течение одночасового наблюдения, но их двигательная активность значительно снижалась по сравнению с контролем. Но через сутки инфузории, подверженные воздействию меньших концентраций, погибали.

На основе полученных результатов изучаемые лекарственные препараты серебра можно расположить в ряд в соответствии со снижением их биологичеекой активности:

аммарген > серебра нитрат > протаргол > повиаргол > колларгол

Расположение препаратов в данном ряду полностью совпадает с последовательностью, представленной в предыдущем разделе для Paramecium caudatum с учетом растворимости препарата и концентрацией его ионных форм.

ОЦЕНКА АНТИСЕПТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ВОДНОГО НАСТОЯ КАЛЕНДУЛЫ,

СОДЕРЖАЩЕГО ИОНЫ СЕРЕБРА НА КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЕ ИНФУЗОРИЙ Paramecium caudatum

Оценено антисептическое действие водного настоя календулы на инфузориях Paramecium caudatum.

Установлено, что исходный водный настой календулы, приготовленный в соотноншении 1:10, вызывал моментальную гибель инфузорий. Гибель всех особей в течение часового эксперимента была обнаружена для разведений исходного настоя вплоть до 1:100. 1

В сравнении с кривой "доза-ответ" для серебра нитрата (рис.1) "ответ" инфузорий на воздействие настоя календулы в соотношении 1:20 совпадал с "ответом" AgN03 с концентрацией 10"4 моль/л.

На рис.,? представлены кривые "доза-ответ" индивидуального и комбинированного действия настоя календулы (1:20) и серебра (c(AgN03)»10"4J моль/л на инфузорий. За "ответ" принимали величину, характеризующую токсичность (гибель), выражая ее через 1/Т, мин. Кривая комбинированного действия лежит выше кривых индивидуальных воздействий. Таким образом, наблюдается усиление "ответа", а значит ионы, серебра повышают антисептическую активность настоя календулы.

-а-

1_1_1_1—I—1—1—1—I-

О 0.5 1.0 *(А8К0э)

Рис. 7 Кришэ "доза-ответ" иадиввдалшого и комбинированного действия настоя капевд/лы (1:20) и серебра (с(Авяо3)=10"^ моль/л) на

ИН$узормИ Рагшпвс1ит саийаиш

1 - щдиввдуальное действие настоя календам

2 - индивидуальное действие Агж>3

•' 3 - комЗимрованное действие настоя калеццулы и AgNo3

х(калецц), х(ай!Ю3) - доля препарата в аналиидуешл растворе

вывода

1. Разработана методика оценки биологической активности лекарственных препаратов серебра и их комбинаций с компонентами разной природы на инфузориях Paramecium caudatum и Spirostomum ambiguum.

На основе этой методики:

2. Установлено снижение биологической активности лекарственных препаратов серебра для Paramecium caudatum и Spirostomum ambiguum в ряду:

аммарген > серебра нитрат > протаргол > повиаргол > колларгол

3. Показано, что концентрация свободных ионов Ag+ (активная форма) не зависит от дозы протаргола и колларгола. При этом присутствие белка обуславливает пролонгированное действие ионов серебра.

4. Установлены интервалы биологической активности ионов серебра с(AgN03)»10"8- 10"2моль/л и меди - c(CuS04)=5*10"5 -

2*10"2моль/л для инфузорий Paramecium qaudatun.

5. Определен концентрационный интервал от 2.5*10"5 до

10"4моль/л для растворов солей AgN03 и CuS04 в различных комбинациях, в котором усиливается действие ионов серебра и меди на культуру Paramecium caudatum^

6. Оценена токсичность препаратов, вводимых многократно и предложена формула расчета дозы при множественном поступлении веществ.

7. Установлено, что ионы серебра (c(AgN03)=10"4 моль/л) усиливают биологическую активность настоя цветков календулы 1:20.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Ершов Ю.А..Есменская Н.Б..Лобанов Ф. И., Плетенева Т.В. Бисирование водных растворов лекарственных препаратов серебра

парамециями // Сб. "Применение препаратов серебра в медицине". -препринт 3. -Новосибирск, 1994. -с.84-88.

2. Ершов Ю. А., Есменская Н. Б., Плетенева Т. В. Оценка токсического действия некоторых лекарственных препаратов серебра на культуре инфузорий Paramecium caudatum // Химико-фармацевтический журнал. -1995. - N 11. -с. 6-7.

3. Есменская Н. Б., Ершов Ю. А.,Плетенева Т. В. Применение лекарственных препаратов серебра за рубежом //Сб. "Серебро в медицине, биологии и технике", -препринт 4. -Новосибирск, 1995.

-с. 43-52.

4. Есменская Н. Б.,Ершов Ю. А., Плетенева Т. В., Тарнавская Н. С. Комбинированное действие растворов серебра и меди на инфузории Paramecium caudatum. //Сб."Серебро в медицине, биологии и технике", -препринт 4. -Новосибирск. 1995. с. 124-130.

5. Есменская Н. Б., Ершов Ю. А., Плетенева Т. В. Оценка токсического действия лекарственных препаратов серебра на культуре инфузорий // Рос. нац. конф. "Формирование приоритетов лекарственной политики", 1995. -с. 112-113.

6. Ершов D. А., Плетенева Т. В., Воробьева Т. В., Есменская Н. Б., Слонская Т. К. Комбинированное действие лекарственных препаратов на основе органических соединений // Рос. нац. конгресс "Человек и лекарство", М. -1996. -с. 264.

7. Плетенева Т. В., Воробьева Т. В., Ершов Ю. А., Слонская Т. К., Есменская Н. Б. Оценка биологической активности препарата на основе координационных соединений ртути // Рос. нац. конгресс "Человек и лекарство", М. -1996. -с. 279.

8. Pleteneva Т. V., Ershov У. А., Esmenskaya N. В., Slonskaya Т. К. Biological test for electroplating effluents. // Conf. Ecology and raetal electroplating. -Romania, 1995. -p. 104-106.

'<f,/x>'" а леи«™, a if. /П. r fei jb ; '0/f - ,