Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Стандартизация количественного тестирования индивидуального и комбинированного токсического действия солей меди(II), серебра(I), цинка(II), никеля(II) и клотримазола

На правах рукописи

РПЗ од 1 5 Ш 2002

СИНЮК ТАТЬЯНА ФЁДОРОВНА

СТАНДАРТИЗАЦИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ТЕСТИРОВАНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОГО И КОМБИНИРОВАННОГО ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СОЛЕЙ МЕДИ(П), СЕРЕБРА(1), ЦИНКА, НИКЕЛЯ(П) И КЛОТРИМАЗОЛА

15. 00. 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание учёпой степени кандидата фармацевтически! паук

Москва 2002

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ю. А. Ершов

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор В. А. Ермакова доктор биологических наук Д. А. Складнев

Ведущая организация:

Институт государственного контроля лекарственных средств Научного Центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств Минздрава России

Защита состоится «_»_2002 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: г. Москва, Никитский бульвар, 13

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ММА им. И.М. Сеченова (г. Москва, Зубовская площадь, д. 1)

Автореферат разослан «_»_2002 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета Д.208.040.09

Доктор фармацевтических наук Н.П. Садчикова

)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из направлений получепия новых лекарственных препаратов является создание многокомпонентных форм, что требует разработки объективных методов оценки активных компонентов в комбинациях и их оптимального соотношения. Изучение индивидуального действия компонентов и их комбинаций требует большого числа экспериментов в широком интервале концентраций с использованием лабораторных животных. В связи с этим представляется перспективной разработка способов предварительных исследований на модельных объектах, не требующих использования лабораторных животных, в частности, на микробных культурах.

Число известных разработок стандартных методик биотестирования химических веществ на микробных культурах пока невелико. В качестве показателей биологической активности различных веществ, как правило, используют суммарные характеристики, такие, как лаг-период, максимальная скорость роста, предельная ёмкость. При использовании таких величин количественная оценка биологической активности веществ затруднительна, особенно при изучении комбинированного действия двух и более веществ.

Поэтому стандартизация количественного тестирования биологически активных веществ на микробных культурах представляется актуальной.

Проблема взаимодействия одновременно назначенных лекарств, изменение характера действия лекарственных веществ как компонентов лекарств, так же, как и возможность прогнозирования реакций организма, составляет важную часть биофармацевтического поиска. Теоретически эти вопросы изучены недостаточно. Существующие взгляды на принципы количественной оценки комбинированного действия противоречивы. Особенно большие трудности представляет прогнозирование зависимости доза - эффект. В связи с этим разработка теории комбинированного действия и её экспериментальная апробация также актуальна.

Цель и основные задачи исследования.

Цель работы: разработка методики стандартизации количественного тестирования индивидуального и комбинированного действия веществ на микробных культурах Saccaharomyces cerevisiae, Caadida albicans, Paramecium caudatarn.

Поставленная цель определила следующие основные задачи исследования.

1. Обосновать выбор модельных микробных культур, осуществить выбор условий и способов тестирования.

2. Разработать методику стандартизации тестирования веществ на модельных микробных культурах.

3. Определить кинетические параметры экотоксикологической модели.

4. Исследовать влияние условий культивирования и активных добавок на параметры роста микробных культур.

5. Разработать количественные принципы оценки комбинированных эффектов на основе экотоксикояогической модем!. Установить эффекты комбинированного действия солей цинка и меди(11).

6. Для верификации предложенных принципов - разработать методы количественной оценки противогрибковой активности клотримазола и комбинации клотримазола с солью серебра(1) на рост Candida albicans.

7. Разработать метод расчёта цитоцидньк, цитостатических и ингабирующих концентраций химических веществ.

8. Разработать метод расчёта диаграмм «концентрации химических агентов -эффект» для прогнозирования комбинированного действия химических веществ.

Научная новизна. Впервые на оснюве экотоксикологической модели проведена стандартизация тестирования на микробных культурах Saccaharomyces cerevisiae, Candida albicans, Paramecium caudatum.

Показано влияние условий культивирования микробных культур на кинетические параметры экотоксикологической модели.

Разработана ультразвуковая методика приготовления стабильного гидрозоля клотримазола и проведена количественная оценка его биологической активности на культуре Candida albicans.

Апробированы оптические дифракционные методы для оценки биомассы, размеров и объёма клеток культуры Saccaharomyces cerevisiae.

Предложены количественные принципы оценки комбинированных эффектов: аддитивности, синергизма, антагонизма. Установлены эффекты действия комбинаций Z11SO4+CUSO4, клотримазол+AgNCb.

Проведен теоретический расчёт цйтоцидных, цитостатических и ингибнрующих концентраций и расчёт диаграмм «концентрации химических агентов - эффект» для прогнозирования комбинированного действия солей ZnSO« и C11SO4.

Практическая значимость. Разработана методика стандартизации тестирования на микробных культурах: Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Paramecium, caudatum.

Разработана ультразвуковая методика приготовления стабильного гидрозоля клотримазола. Показана целесообразность предложенного метода испытания гидрозоля клотримазола и оценки его биологической активности на культуре Candida albicans по сравнению с существующими методами.

Разработанный способ расчёта цигоцидных, цитостатических и шггибирующих концентраций индивидуальных веществ и их смесей может использоваться для выбора дозы компонентов лекарственного препарата.

Предложенные диаграммы «концентрации химических агентов - эффект» целесообразно использовать для прогнозирования комбинированных эффектов лекарственных препаратов.

Показано, что когерентно-оптический метод и выведенные соотношения могут успешно использоваться для оценки биомассы микробных культур.

Апробация работы. Результаты исследований представлены и доложены на V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998), на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998); на V Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 1998); на Международной конференции «Биохимическая физика на рубеже столетий» (Москва, 2000); на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000); на Международной конференции молодых учёных «Химия к технология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (Москва, 2000); на IX Международной конференции «Математика, компьютер, образование» (Дубна, 2002).

Публикации. Основные результаты работы отражены в 10 публикациях Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно- исследовательских работ Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (№ государственной

регистрации 0910039990), соответствует проблеме совета АМН РФ №48 "Фармация".

Положения, выносимые на защиту. " Результаты определения стандартных параметров роста микробных культур Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Paramecium caudatum.

■ Результаты по оценке действия комбинаций солей ZnSO,», CuSOí и по исследованию влияния солей ZnSO,» и CuSC>4 на изменение распределения по размеру и объёму клеток Saccharomyces cerevisiae.

■ Результаты определения стандартных параметров роста культуры Candida albicans в присутствии клотримазола, комбинаций клотримазола и AgNCh.

* Методы прогнозирования комбинированного действия солей Z11SO4 и CuSOn.

Структура и обьем диссертации. Работа состоит го введения, обзора литературы, трёх глав, отражающих результаты экспериментальных исследований, общих выводов, списка цитированной литературы и приложения. Работа изложена на 125 страницах, содержит 30 таблиц, 29 рисунков. Список литературы включает 144 источника.

Во введении сформулированы актуальность темы, цели и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

Глава I содержит обзор литературы, в котором проанализированы данные о современном состоянии проблемы стандартизации количественного тестирования биологической активности химических веществ.

В главе П охарактеризованы объекты и методы исследования. Изложена сущность разработанной методики стандартизации количественного тестирования.

Глава Ш посвящена определению кинетических параметров экотохсшсологической модели, стандартных параметров роста микробных культур для количественного тестирования индивидуального действия биологически активных веществ.

В главе IV предложены методы оценки комбинированного действия веществ. Приведены результаты по определению параметров роста микробных культур для количественного тестирования комбинированного действия биологически активных веществ, расчёты цитостатических, цитоцидных и ингибирующих концентраций солей металлов, диаграмм «концентрации химических агентов - эффект» для прогнозирования комбинированного действия веществ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования использовали чистые культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae nrr. 776 и Candida albicans ATCC 885-6S3 и инфузорий Paramecium caudatum. Культивирование дрожжей проводили на глюкозо-аммонийной питательной среде. Культуру инфузорий выращивали на среде Лозина-Лозинского с подкормкой - водным экстраюгом набухших зёрен овса, вносимым в равных количествах.

Использовали растворы ZaSO-t, CUSO4, NiSO,), AgN03 марки "хч", приготовленные на дистиллированной воде в диапазоне концентраций 1.0*10"1 - 1.0*10"9 моль/л, и субстанцию клотримазола с содержанием основного вещества 99.5 %.

В качестве поверхностно активных веществ (ПАВ) использовали натрийяаурил сульфат (ТУ 6-09-64-75), твин-80 - сорбитанмоноолеат (ВФС 42-167-72).

Исследование антимикробного действия химических веществ на рост и размпожеиие дрожжей и инфузорий

Для исследования антимикробного действия химических веществ на рост и размножение дрожжей из 48-ч культуры дрожжей, выращенной на скошенном агаре со средой того же состава, готовили исходную суспензию дрожжей. В пробирки с глюкозо-аммонийной средой добавляли растворы ZnSO-i, CuS04, AgNOa соответствующих концентраций, затем вносили микробную взвесь. Посевы Saccharomyces cerevisiae инкубировали при 25 °С, посевы Candida albicans при температуре 37 °С в течение 120 часов.

Через 0, 12, 36, 4S, 72, 96, 120 часов стерильно отбирали пробы. Оптическую плотность проб измеряли на фотоэлектроколориметре ФЭК-КФК-2. По калибровочным графикам определяли биомассу клеток Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans.

Для исследования влияния химических веществ иа рост Paramecium caudatum готовили растворы NiS04 на среде Лозина-Лозшюкого. Инфузорий переносили в колбы со средой в контрольном опыте и в приготовленные испытуемые растворы. Культивирование инфузорий проводили при 24 - 25 °С.

Периодически из колб отбирали пробы, и определяли число жизнеспособных инфузорий с использованием бинокулярного микроскопа МБИ - 9. Результаты опыта усредняли. Продолжительность опыта составляла 40 суток.

Оптические дифракционные методы

Анализ распределения клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae по размеру и объёму проводили на лазерном дифракционном анализаторе размера частиц "Malvern 3600 Ее" с помощью полученного набора дифференциальных и интегральных кривых распределения дрожжей по размеру.

Для измерения биомассы дрожжей в жидких пробах в присутствии исследуемых растворов использовался оригинальный когерентно-оптический метод.

Экспериментальные исследовалия проводили на базе гибридной оптико-цифровой системы.

Анализ 24 рабочих проб дрожжей показал, что интенсивность центрального максимума пробы пропорциональна квадрату концентрация (N) клеток дрожжей в пробе:

1

Jo

где 1=1(0,0} - интенсивность центрального максимума пространственно частотного спектра (ПЧС) пробы, 1о=1о (0,0) - регистрируемая в тех же условиях

интенсивность в отсутствие пробы; k¡, k¡ - коэффициенты, значения которых определяются экспериментально.

Результаты исследований показали, что в силу ограниченности динамического диапазона фотоприёмника целесообразно разбиение измеряемых концентраций на три диапазона: Ni = 1*10J - 1*104, N2 = 1*104 - 1*106, N3 = 1*10® - l*10s, для которых получены регрессионные зависимости определения биомассы дрожжей в пробах по относительному изменению центрального максимума ПЧС пробы:

xlOf; Ж =

4,1 М-0,04 .1 h

(Itf: JV,=

337J——--0,2

xlO .

Когерентно-оптический метод и предложенные соотношения позволяют оценить биомассу дрожжей в диапазоне (1*102 - 1*108 1/мл) с относительной погрешностью измерения, не превышающей ±9%.

Методика приготовления образца клотримазола

Образец клотримазола готовили ультразвуковым озвучиванием субстанции в присутствии ПАВ - натрийлаурилсульфата в водной среде на установке УЗДН-2Т. Суммарное время озвучивания составляло 40 минут, частота 22 кГц, интенсивность 5 Вт/см2. Степень дисперсности препарата контролировали под микроскопом с увеличением 8x40.

Предварительно осуществляли выбор ПАВ с учётом их физико-химических свойств и концентрации, ККМ поверхностно активного вещества. Для этого проводили ультразвуковое озвучивание образцов клотримазола (масса иавески 34.5 мг; 3.45 мг) с разными ПАВ: натрийлаурилсульфатом - 0.25 - 1.00 мг/мл и твином-80 - 25.0 - 50.0 мкл/мл.

Устойчивость образцов клотримазола с ПАВ определяли, анализируя кривые седиментации гидрозоля клотримазола, построенные в координатах "время седиментации - оптическая плотность образца".

Для готового образца клотримазола регистрировали время прекращения седиментации, измеряя оптическую плотность в течение 3 суток. Время прекращения седиментации составляло 48 ч. Из готового образца пипеткой отбирали слой гидрозоля над осадком. Полученный седиментационно устойчивый образец клотримазола использовали для определения массы клотримазола и добавления в сосуды с инкубируемыми дрожжами.

Массу клотримазола в устойчивом образце гидрозоля определяли гравиметрически.

Методика расчёта стандартных параметров роста тест-объекта Расчёт стандартных параметров роста тест-объектов в присутствии стандартных биологически активных веществ проводили на основе окотоксикологической модели роста.

Модель роста клеточной популяции в виде укороченной цепи из двух стадий роста (С> и Ст) в присутствии смеси химических веществ может быть представлена следующим образом:

С1»М1- >СЮ (р); Оп+Мг-АС, (Ь); (е); С^Сп^Сг+С, (а);

С1—»ЕЕ <\у,); С,+Х,-СХп (аи); С1+Х2—СХ12 (¿12); Ст+Х,-СХ2, (с)21). где М1 и Мг - наборы субстратов; Х[ и Хг - концентрации токсикантов; СХЧ - особи после действия токсикиттов X) и Х2; Са - погибшая особь; Са - особь, подвергшаяся автоингибированию.

Кинетические коэффициенты: { - размножения; р - роста цепи; Ь - рождения; а -автоингибирования; <1ц - токсического действия; § - гибели.

Кинетика цепного роста и ингибирования роста популяции, состоящей из особей, на стадиях С[ и Сш описьгаается системой двух дифференциальных уравнений:

ск|/(31=:-р1:сх+£Ьс„1+у/1, ¿ст/л=рс1-ьхст-ас1ст. (1)

Здесь сь Сц, - плотности растущих и зрелых особей С] и Ст; »! - мощность внешнего источника особей; а, Ь, р, Г - набор кинетических коэффициентов автоингибирования, рождения, роста и размножения популяционной цепи без ингибиторов при постоянном содержании субстратов М1 и М2. Коэффициенты рх и являются функциями концентрации ингибиторов.

Для индивидуального воздействия вещества коэффициенты р„ и Ьх равны: р«=р+с!пх, Ьк^МсЫх: (2а)

Для комбинированного воздействия веществ Х\ и Хз коэффициенты рх и Ьк равны: рх= р+(3],хи (512X2 , Ьх=Ь+а21х1+|322Х2. (26)

Здесь <!ц, г - коэффициенты вещества X: для особей стадий С1 и Сг„; (112, <1:г -коэффициенты вещества Х2 для особей стадий С) и Ст; XI и хг - концентрации X] и Х-, В стационарном приближении по Сп> система сводится к одному уравнению: дс1/&=рхС1(К1-С1)/(Кг+с1)+\У1 (3)

Здесь С1 - плотность особей С^ в момент 1; К) - предельная плотность особей С1 при равная:

К, =сГ =(й)р - РхЬхУ(арх); К2 =Ь*/а или К2=С/((1+К1/К2)1Я-1) (4)

Сг плотность С, в точке перегиба, когда скорость роста максимальна. Частное решение уравнения (3) имеет вид:

1(с,)=1п1(с1/со)((К1-со)/(КгС1))<1+п)]/(прх)

(5)

где 1(с]) - время достижения плотности Си п=а*К1 /Ьх; со - начальное число клеток. Динамика роста клеточной популяции без токсиканта может быть описана функцией С1(г):

Алгоритм расчёта стандартных параметров

Использование уравнения (3) для обработки результатов позволило провести верификацию экотоксиколошческой модели, т.е. определить кинетические коэффициенты роста популяций в различных условиях.

Значение коэффициента роста цепи р находили по начальной логарифмической фазе кривой роста клеток в контроле. Аналогично находили значения коэффициентов роста цепи в присутствии токсикантов р1и,. Угловые коэффициенты к представляют собой соответствующий наклон кривой роста цепи в полулогарифмических координатах: к=Ч£о: =с!1пС/&=р.

Коэффициент Г принимался равным 2, так как для исследованных тест-обьекгов характерен митоз с образованием двух особей.

Кинетический коэффициент рождения Ь находили из соотношения Ь=1Л, где I -время, за которое осуществляется 1 деление.

Процессы автоингибирования проявляются в замедлении роста при увеличении плотности популяции. Коэффициент автоингибирования а определяли в соответствии с тем, что предельное значение плотности популяции К в контроле равно К=Ь/а.

Значения полученных коэффициентов подставляли в уравнение (6) и строили теоретические кривые роста дрожжей и инфузорий в питательных средах без добавок биологически активных веществ.

На начальной фазе роста популяций микроорганизмов по условиям эксперимента имеют место неравенства С1«К), С1«Ка. Поэтому в соответствии с уравнением (3) можно написать:

с1(с)=К(1+Н(1)-(Н(1)(2+Н(1)))05, где Н(1)=0.5(К-Со)2ехр(-р1)/Ксо.

,0.5

(6)

с1с1/<11=р^(К1/К2)с1

Отсюда коэффициенты роста в присутствии ингибитора равны: рЬз! = р^СК./К;,); р1пг = рлО^'/Кг) На основе (8) получена система уравнений (9):

(7)

(8)

р1П1=(А5р-{р+бцХ])(Ы-с121Х)))/{Ь+41Х1) р1п2=(Й>р-(р+ааХ2)(Ь+ё21Х2)/(Ь+Й21Х2)

Подставляя коэффициенты роста цепи в присутствии токсиканта в систему уравнений (9), можно найти коэффициенты ингибировакия d,,.

Коэффициенты роста рг и размножегшя Ьк вычисляли по формулам (2а).

Полученные кинетические коэффициенты использованы для построения теоретических кривых роста дрожжей и инфузорий но экотокснколопиескому уравнению (5)

Для оценки эффектов комбинированного действия двух веществ Xj и Х2 вычисляли коэффициенты роста р* и Ь* по формулам (26), подставляя коэффициенты ингибирования d;j каждого вещества, составляющего смесь.

Используя полученные коэффициенты, строили теоретические кривые роста дрожжей в среде, содержащей смесь веществ, по экотоксикологическому уравнению (5).

Если теоретическая кривая согласуется с экспериментальной кривой при комбинированном действии, то действие ингибиторов аддитивно. Если теоретическая кривая располагается выше или ниже экспериментальной кривой, то действие ингибиторов соответственно выше (синергизм) или ниже аддитивного (антагонизм).

Обработку результатов исследований проводили с использованием программ Wgnuplot, Microcal Origin, Microsoft Excel.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

В качестве стандартов биологически активных веществ для стандартизации тестирования были выбраны соля биогенных элементов ZnSO-i, Си SO*, AgNOî, NiS04.

Стандартизация количественного тестирования проведена на основе параметров роста в присутствии стандартных биологически активных веществ. Параметры роста вычисляли с помощью экотоксякологической модели по описанному выше алгоритму расчёта.

Определение кинетических коэффициентов экотоксиколоппеской модели

Для стандартизации тестирования по модели необходимо иметь 4 независимых параметра a, b, р, f, характеризующих рост популяции в контрольной среде. Экотоксикологическая модель предполагает, что в кинетический коэффициент роста р входит постоянное количество субстрата. Поэтому была изучена кинетика роста дрожжей S. cerevisiae в глюкозо-аммонийной питательной среде с меняющейся концентрацией глюкозы (%): 8.0, 6.0,4.0, 2.0, 1.0, 0.5,0.2, 0.1.

По алгоритму расчёта вычислены кинетические коэффициенты роста дрожжей S. cerevisiae; коэффициент размножения £=2, коэффициент рождения Ь=0.8 ч~\ Результаты расчетов приведены в таблице 1.

Из данных табл. 1 следует, что уменьшение концентрации глюкозы приводит к уменьшению предельной плотности популяции Кик изменению коэффициента роста р: р = 0.32 ч при концентрации глюкозы 8.0 - 1.0%, при концентрации 0.5 - 0.1% р = 0.25 ч"1.

Таблица 1. Кинетические коэффициенты роста дрожжей ЗассЬаготусеэ

С ТЛОЮШ, Kj-lO^iS^Mn"1 р± S_, ч'1

% N Р

8.0 31.0±2.0 0.32±0.04

6.0 28.0 ±2.0 0.32±0.07

4.0 27.0±1.0 0.32±0.07

2.0 2б.0±1.0 0.3210.07

1.0 17.0±0.7 0.32±0.06

0.5 7.0±0.6 0.25±0.03

0.2 6.5±0.5 0.25±0.03

0.1 4.3±1.9 0.25±0.04

Постоянство значений р в интервале концентраций глюкозы 1.0-8.0% указывает на условия нелимигированного роста по субстрату. При уменьшении концентрации субстрата до 0.1 - 0.5% популяция растёт в условиях: лимитирования по глюкозе. При С глюкны<0.1% популяция быстро потребляет субстрат и прекращает рост.

Экспериментальные значения р, К использовали для построения теоретических кривых роста дрожжей в средах с глюкозой по зкотоксикояогической модели, применяя уравнение: c,(t)=K(l+H(t)-(H(t)(2+H(t)))°5, где H(t)=0.5(K-co)2exp(-pt)/Kco.

Экспериментальные точки и теоретические кривые согласуются в пределах экспериментальной погрешности. Отсюда следует, что экотоксикологическая модель правильно отображает зависимость процессов развития дрожжей от концентрации глюкозы в глюкозо-аммоншшой среде.

Значения коэффициентов роста р=0.32 ч'1, рождения Ь= 0.8 ч размножения f = 2, автоингибирования а=2. 9*10"* мл/ч, значение предельной плотности популяции дрожжей К=30*106 мл предлагается использовать в качестве стандартных параметров роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae в глюкоз о -аммонийной питательной среде с концентрацией глюкозы (4.0%).

Определение параметров роста культур дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans и инфузорий Paramecium caudatum

Изучена кинетика роста S. cerevisiae в средах с добавками солей Zn(H) и Cu(II) в интервале концентраций 1.0* 10'2 - 1.О*10"7 моль/л.

Экспериментальные значения коэффициентов: предельная плотность популяции в контроле К=28*106 мл коэффициент автоингибирования а=2.9*10"8 мл/ч, коэффициент рождения Ь=0.8 ч'1, коэффициент размножения £-2. Результаты расчётов приведены в табл. 2, 3.

Коэффициенты ингибирования <1 дают количественную характеристику токсичности вещества. Из сравнения коэффициентов ингибирования (табл. 2, 3) следует, что Си8С>4 для дрожжей является на порядок более токсичным веществом (¿ц-500, 621=60 л/моль* ч), чем гпЯО« (<112=20, (122=2 л/моль* ч).

Теоретические кривые роста дрожжей построены с использованием стандартных параметров роста культуры дрожжей и экотоксикологического уравнения (5):

1(с1)=1п[(с1/са)((К,-сп)/(К,-с,))(1*")]/(пр1)) где п-аК,/V Таблица 2. Стандартные параметры роста дрожжей Басскаготусе-ч

моль/л К,-106±8_, мл'1 к р1п±8_, ч1 р1п д/моль*ч а,. л/моль*ч £ >

контроль 27.51:1.6 0.32±0.06 0 0 0.32 0.800

1.0.10"5 25.3±2.0 0.32±0.07 20 2 0.32 0.800

5 0.1 (Г3 26.0±2.3 0.315±0.07 20 2 0.321 0.800

1.0.Ю"4 23.0±1.0 0.31±0.07 20 2 0.322 0.800

5.0.10"" 23.0±0.5 0.31 ±0.07 20 2 0.33 0.801

1.0.10"3 21.0±0.1 0.30±0.07 20 2 0.35 0.802

2.0.10'3 18.0±0.7 0.30±0.07 20 2 0.36 0.804

3.0.103 18.0±3.2 0.30±0.07 20 2 0.38 0.806

5.0.10'3 15.0±1.1 0.28±0.07 20 2 0.42 0.810

8.0.103 11.0±0.8 0.24±0.1 20 2 0.48 0.816

1.0.102 8.5±1.3 0.25±0.10 20 2 0.52 0.820

Таблица 3. Стандартные параметры роста дрожжей Яасскагптусея

сегеу'шае в контроле и в присутствии медь(П) сульфата

Ссияск, К, -Ю^Ьв , р!п ± , ч1 «1«, К

моль/л мл1 N р1п л/моль*ч л/моль*ч н1 Ч1

контроль 27.5±1.6 0.32±0.06 0 0 0.32 0.800

5.0.10"6 27.0±2.0 0.316±0.07 500 60 0.323 0.800

1.0.10"5 23.4±1.0 0.31±0.07 500 60 0.33 0.801

2.0.10"5 22.3 ±0.01 0.3110.07 500 60 0.33 0.801

3.0.10"5 22.4 ±0.1 0.31±0.06 500 60 0.335 0.802

5.0.10"5 18.0±1.0 0.30±0.07 500 60 0,35 0.803

8.0.10"5 12.811.3 0.29±0.07 500 60 0.36 0.805

1.0.10-4 13.0±1.7 0.28±0.08 500 60 0.37 0.810

3.0.10^ 7.0±0.3 0.21±0.07 500 60 0.47 0.818

5.0.10-4 6.6±0.8 0.26±0.10 500 60 0.55 0.830

Полученные данные показывают, что экотоксикологаческое уравнение с хорошей точностью отображает влияние токсикантов на рост популяции дрожжей.

Таким образом, в результате проведённых исследований идентифицированы стандартные параметры роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae в присутствии солей ZnSC>4 и CUSO4. Эти соли могут быть рекомендованы как стандартные при скрининговых испытаниях различных биологически активных веществ.

Исследования кинетики роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae при добавлении в питательную среду солей Z11SO4 (5.0*КГ1 моль/л) и CuS04 (l.OnO"4 моль/л) в 0, 24, 36, 48, 60, 72 ч от начала культивирования показали, что коэффициенты роста р* и рождения Ьх остаются постоязшыми. Они зависят от природы вещества и не зависят от времени его введения в инкубационную среду.

Для вычисления стандартных параметров роста культуры Candida albicans в качестве стандартного токсиканта использовали соль AgN03. Результаты вычислений представлены в табл. 4. Коэффициент а=7*10'9 мл/с вычислен с учётом значешм предельной плотности популяции К=106*10б мл

Коэффициенты ингибирования дают количественную характеристику токсичности AgNOj для стадий Ci и Сг dn=6*10 , i2i =2*104л/моль*ч.

Таблица 4. Стандартные параметры роста дрожжей Candida albicans в

контроле и в присутствии AgNOj

С д^'оз, моль/л N мл"1 pln±S_ ,ч1 р1и di, л/моль*ч л/моль*ч Р., К н1

контроль 106.011.2 0.28Ю.06 0 0 0.28 0.800

1.0.10"9 91.510.2 0.3310.07 6-Ю4 2-10" 0.28 0.800

1.0.10^ 85.0±1.0 0.32±0.06 б-10" 2-10" 0.281 0.800

5.0. Ю-8 84.0±2.1 0.3210.06 6-10" 2-104 0.29 0.801

1.0.10' 86.012.0 0.3210.06 6-10" 2-Ю4 0.31 0.802

5,0.10"7 77.013.2 0.3010.06 6-10" 2-Ю4 0.32 0.81

1.0.10^ 65.013.0 0.2810.06 6-!0" 2'10" 0.35 0.82

2.0.10"6 50.0±3.5 0.2710.08 6 •10'' 2-Ю4 0.36 0.84

3.0« Iff* 3.810.3 0.2110.07 6-Ю4 2-Ю4 0.44 0.86

Теоретические кривые роста дрожжей С. albicans в контроле и в присутствии AgN'03 рассчитаны по экотоксикологическому уравнению (5):

KciJHnKd/coXCKi-co )/(Ki-Ci ))(1+п)УШ

с использованием кинетических коэффициентов, указанных в табл. 4. Расчётные кривые согласуются с экспериментальными данными.

Полученные данные показали, что стандартные параметры тестирования количественно характеризуют рост дрожжей С. albicans в контрольной среде и в средах с добавлением соли AgN03. Эта соль может быть использована как стандартная в скрининговых испытаниях биологически активных веществ.

Для стандартизации тестирования, проводимого на инфузориях Paramecium caudatum, использовали стандартную соль NiS04. Была изучена кинетика роста инфузорий в контрольной среде и в средах с добавлением NiSOi в концентрациях 2.0*10"5, 5.0*10"6 моль/л.

Коэффициент автоингибирования а вычислен с учётом предельной плотности культуры К=115 мл'1 и равен 7*10'" мл/ч, коэффициенты ингибирования NiS05 для стадий Ct и Сг.' dn=1734; d2i=40 л/моль*ч. Результаты расчётов представлены в табл. 5. Определённые коэффициенты являются стандартными параметрами тестирования в данных условиях.

Экотоксикологяческое уравнение с хорошей точностью отображает действие токсиканта на рост культуры парамеций.

Рассчитаны стандартные параметры роста Paramecium caudatum в присутствии соли N1SO4. Соль NiS04 может быть рекомендована в качестве стандартной при испытаниях биологически активных веществ на инфузориях Paramecium caudatum.

Таблица 5. Стандартные параметры роста инфузорий Paramacium

caudatum в контроле и в присутствии иикель(П) сульфата

моль/л K,±S_, N мл pin ± S_, pin сут"1 dn, Л/.Ч0Л1»*Ч л/моль*ч сут Ьь сут"1

контроль 115±10 0.298±0.06 0 0 0.298 0.0830

5.0.10"6 12Ш5 0.250±0.08 1734 40 0.311 0.0832

2.0.105 71±13 0.220±0.08 1734 40 0.334 0.0837

Определение параметров роста культур Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans для количественного тестирования смесей биологически активных веществ

Оценка характера комбинированного действия заключается в анализе и сравнении экспериментальных кривых роста клеточной культуры при комбинированном действии и рассчитанных теоретических кривых. Теоретическая кривая для комбинированного действия строится по константам ингибирования dj индивидуальных компонентов.

В работе предложены кинетические критерии оценки комбинированных эффектов: аддитивности, синергизма, антагонизма совместного действия биологически активных веществ.

При эффекте аддитивности присутствие одного вещества в комбинации с другими не влияет на кинетические константы взаимодействия (константы ингибирования) другого вещества. Кинетические константы воздействия индивидуальных веществ на культуру в смеси не меняются. На графике экспериментальные точки роста совпадают с

теоретической кривой роста, такой эффект комбинированного воздействия оценивается как аддитивный.

В случае эффекта синергизма при действии смеси веществ кинетические константы воздействия этих веществ на культуру меняются таким образом, что эффект комбинации становится выше аддитивного. На графике экспериментальные точки роста располагаются ниже теоретической кривой роста, такой эффект комбинированного воздействия оценивается выше аддитивного (синергизм).

Эффект антагонизм сводится к тому, что при действии смеси веществ кинетические константы воздействия этих веществ на культуру меняются таким образом, что эффект комбинации оказывается ниже аддитивного. На графике экспериментальные точки роста располагаются выше теоретической кривой роста, такой эффект комбинированного действия оценивается ниже ад дитивного (антагонизм).

Экспериментальной моделью для оценки кинетических параметров комбинированного действия на культуру Б. сегете1ае служила смесь солей в интервале концентраций (моль/л) 2п504 (8 0* Ю3 - З.ОПО'3; 8.0* 10^ - 3.0*10"1) и СиЯСХ, (5.0П04 -1.0*10"4; 5.0*10"5- 1.0*10"5). Исследуемые смеси готовили таким образом, чтобы суммарная концентрация солей в них оставалась постоянной в пределах каждой серии: 1 серия -8.0* 10"3, 2 серия - 5.0*10"э; 3 серия - 3,0* 10'3; 4 серия - 8.0* Ю'4; 5 серия - 5.0*10"*; 6 серия - З.О^О"4 (моль/л).

Рассчитанные кинетические коэффициенты роста дрожжей в присутствии индивидуальных солей цинка и меди р, Ь, с! использовали для вычисления параметров роста р! и размножения Ь, в 6 сериях комбинаций 2пБ04+Си804. Результаты расчётов приведены в табл. 6, 7.

Расчёт теоретических кривых проводили на основе экотоксикологического уравнения (5): КсОЧпКс./соХ^гСо)/^- с,))(1+о)]/(пр„), где п=а1м/Ьх.

Результаты изучения 1-3 серии комбинаций солей 2п504тСиЯ04 аналогичны.

Экспериментальные точки в случае изучения роста культуры при действии смесей гпЗО^+СиЗО., (2 серия: С(гп)+С(Си)=4.9*10'3+1.0*10'4 моль/л) совпадают с теоретическими кривыми роста, которые описывают совместное ингабнрующее действие веществ при условии аддитивности биологической активности компонентов. Поэтому эффект комбинации относится к аддитивному.

Экспериментальные точка для случая роста культуры при действии смесей ZnSO^ + СиБ04(2 серая: С(гп)+С(Си)=4.7*10"3+3.0*10"4 моль/л) располагаются выше теоретических

кривых роста, поэтому влияние данных смесей соответствует эффекту ниже аддитивного, т.е. наблюдается антагонизм биологической активности ионов цинка и меди.

Экспериментальные точки, соответствующие случаю роста дрожжей в смесях солей 2пБ04+Си504 для 4-6 серий, совпадают с теоретическими кривыми, т.е. токсическое действие в данных интервалах концентраций смесей аддитивно.

Таким образом, в пределах одной суммарной концентрации солей гп8С>4+Сц504 в смеси эффект комбинированного действия может различаться. Наблюдаются эффекты аддитивный и ниже аддитивного, т.е. уменьшение повреждающего действия ионов меди на дрожжи в присутствии ионов цинка происходит лишь при определённом соотношении концентраций солей 2п(П) и Си(Н) в смесп.

Таблица 6. Кинетические коэффициенты роста дрожжей Яасскаготусеа сегеутае в контроле и в присутствии комбинаций циика(П) сульфата и медь(П) сульфата (моль/л): гя**[2.5»Ю'3-7.9»10'3], Си*~ {1.0«10'4-5.0»10'4|

Сммм, моль/л СОЙСМ, МСЩЬ/Л К,-10^*5, N мл"1 р1п±3_, р!п ч"' Ли. л/моль *ч 1«, л/мать "ч •«и. л/моль ««я. л/моль *ч 3* Ь5 ч1

кошролъ контроль 27.5±1.6 0.32±0.06 0 0 0 0 0.28 0.800

7.9'Ю"3 1.0.10-4 2.3±0.2 0.27±0.0б 20 500 2 60 0.53 0.822

7.7*10'3 3.0.10"4 1.2±0.2 0.265±0.07 20 500 2 60 0.62 0.833

7.5« Ю'3 5.0-10 4 4.5±0.2 0.265±0.07 20 500 2 60 0.72 0.845

4.9.10"3 Х.О^Ю-4 10.0±0.1 0.285±0.07 20 500 2 60 0.47 0.816

4.7.10-3 3.0-10"4 8.4±0.2 0.28±0.07 20 500 2 60 0.56 0.827

4.5.10"3 5.0-10"4 5.9±0.4 0.28±0.07 20 500 2 60 0.66 0.839

2.9.103 1.0.10-4 13.4±0.6 0.29±0.07 20 500 2 60 0.43 0.812

2.7»10"3 3.0.10-4 8.8±0.7 0.285±0.07 20 500 2 60 0.52 0.823

2.5.10"3 5.0« Ю-4 4.710.6 0.2Ш.07 20 500 2 60 0.62 0.835

Таблица 7. Кинетические коэффициенты роста дрожжей Иасскагатусгь сегЫ$Ше в контроле и в присутствии комбинаций цинка(Н) сульфата и

медь(П) сульфата (моль/л): гп^Р^Ю^.Э'КГ4!, Счг+ [1.0»105-5.0»10 5]

Сьйсм, маль/л Сс\йО*. моль/л N м.т1 р1л ± р1п ч1 ■Ч л/моль *ч <1.2, Л/моль *ч <1и, л/моль *ч <¡21, л/моль *ч Л- ь* ЧГ1

копгроль контроль 27.5±1.6 0.32±0.06 0 0 0 0 0.28 0.800

7.9»10"4 1.0.10'5 21.0±1.б 0.30±0.07 20 500 2 60 0.34 0.802

7.7*10ц 3.0-10"5 19.0+0.6 0.305±0.07 20 500 2 60 0.35 0.803

7.5«КГ* 5.0.10'5 18.8±0.3 0.30±0.07 20 500 2 60 0.36 0.805

4.9.10"4 1.0»1<Г5 23.0±0.2 0.305±0.07 20 500 2 60 0.34 0.802

4.7*10^ 3.0.10"5 21.5±0.4 0.305±0.0б 20 500 2 60 0.34 0.803

4.5.10-4 5.0.10'5 19.2±0.8 0.30±0.07 20 500 2 60 0,35 0,804

2.9.10-1 1.0« 10'5 24.2±0.7 0.305±0.07 20 500 2 60 0,33 0.801

2.7.10"4 3.0.10'5 23-2±0.6 0.3110.07 20 500 2 60 0.34 0.802

2.5.10"4 5.0.10"5 22.3±1.0 0.305±0.07 20 500 2 60 0,35 0.804

При оценке кинетических коэффициентов роста культуры под действием смеси сульфатов цинка(П) и меди(П) в качестве стандартной смеси использовали 2пБ04 (5.0*10"3; 5.0*10'5 моль/л) и СиБ04 (5.0*)О 4; 5.0*10^ моль/л).

По алгоритму расчёта проводили вычисление стандартных параметров тестирования смесей 2п804+Си504. Результаты расчётов приведены в табл. 8,

Таблица 8. Стандартные параметры роста дрожжей Басскаготусех сегетзше в контроле и в присутствии комбинаций цинка(И) сульфата и меди(Ц) сульфата (моль/л): Жи** {5.0»10"5,5.0»10'3], Сиг+[5.0«10"(|,5.0»)0'4|

Сгжнм. моль/л моль/л N мл1 р1п =ь р1п ч"1 Йц, л/моль *ч Йхг, л/моль *ч Чги л/моль *ч Й«, л/моль •ч РЧ ч Ь,. ч1

контроль 27.5±1.б 0.32±0.0б 0 0 0 0 0.28 0.800

5.0.10'3 5.0* Ю^ 4.2±0.4 0.26±0.10 20 500 2 60 0.67 0.840

5.0.105 5.0.10"4 7.7±0.3 0.27±0.10 20 500 2 60 0.57 0.830

5.0.10'3 5.0'Ю"6 15.0±0.6 0.28±0.06 20 500 2 60 0.42 0.810

5.0«10"5 5.0.10^ 25.5±1.0 0.32±0.06 20 500 2 60 0.32 0.800

Да1шые табл. 8 показывают, что коэффициенты р^ и Ь, увеличиваются, коэффициенты ингибирования остаются постоянными на ряду с постоянством коэффициентов р, Ь. Экотоксикологическая модель правильно описывает биологическую активность при совместном действии изученных солей.

Расчёт теоретических кривых комбинированного действия проводили на основе экотоксикологического уравнения (5), используя кинетические коэффициенты индивидуального действия гпБС^ и СиБСЬ. Эффекты комбинированного действия стандартных смесей обобщены в табл. 9.

Таблица 9. Характеристика эффектов комбинированного действия стандартных смесей солей гпвО^ и Си804 для дрожжей вассЪаготусе«

__сегеу!$!ае (К =К омкси^К конггразь)___

Сгим)*, моль/л Cc.sc«. моль/л Эффект комбинированного действия стандартной смеси К',%

5.0* 10"^ 5.0*10-" ниже аддитивного (антагонизм) 15.3

5.0* 10> 5.0*10'° ниже адщгагаого (антагонизм) 28.0

5.0*10' 5.0*10"4 адцшивныи 54.5

5.0*10' 5.0*10-" аддшшяшй 92.3

Для характеристики действия стандартных биологически активных веществ 2п804 и Си804 на морфо-функциональное состояние инкубируемой культуры применён метод исследования распределения дрожжей по размеру и по объёмной доле.

В работе получены гистограммы распределения дрожжей по размеру и по объёмной доле в контрольной среде, с добавками стандартных солей гп504 (5.0* Ю-3,

5.0*10"' моль/л ), CuSOí (б.О^О"4, 5.0*10"* моль/л ) и их смесей Cz» + Со, - 5.0*Ю"3 + 5.0П0"4 и 5.0*10"' + 5.0*10"4 моль/л.

Максимум распределения дрожжей в контроле на 72 ч. инкубации составляет приблизительно 2 мкм, а по «объёму» - 12 мкм. Введение в питательную среду стандартной соли ZnS04 (5.0*10"' моль/л) приводит к подавлению роста культуры, но вид гистограммы не отличается от контроля.

При увеличении концентрации ZnS04 до 5.0* 10"4 моль/л максимум распределения по «объёму» смещается до 65 мкм. Дальнейшее увеличение концентрации соли цинка до 5.0*10"' моль/л привело к появлению значительного количества частиц размером меньше 1 мкм.

Смещение максимума распределения по «объёму» означает появление или резкое увеличение числа новых колоний с большим количеством почек, а также увеличение размеров отдельных клеток.

Гистограммы распределения дрожжей в присутствии соли Cu(II) аналогичны гистограммам для соли Zn(II), за исключением того, что разрушение клеток дрожжей начинается уже при концентрации CuSOí 5.0* 10"4 моль/л .

Для стандартной смеси Czn + Ссч= 5.0*10"3 + 5.0* 10"4 моль/л массовое разрушение клеток не происходит, максимум распределения по «объёму» равен 30 мкм, по размеру 10 мкм. В смеси С& + Ссо = 5.0*10"' + 5.0*10"4 моль/л наблюдаются максимумы 5 мкм в распределении по размеру и 45 мкм в распределении по «объёму», разрушенные клетки отсутствуют.

Ионы Zn(II) защищают клетки дрожжей от разрушения, вызываемого ионами Cu(II).

Определение параметров роста культуры дрожжей Candida albicans в присутствии клотримазола и смеси клотримазола с солью AgN03

Стандартный образец клотримазола готовили озвучиванием его суспензии на установке УЗДП-2Т.

Поскольку гидрозоль содержит ПАВ - натрийлаурялсульфат, была приготовлена серия его растворов для введения в питательную среду в концентрациях, равных концентрациям в исследуемых образцах гидрозоля клотримазола. Экспериментальные результаты показали, что натрийлаурилсульфат в концентрациях, соответствующих составу образцов клотримазола, практически не оказывает влияния на рост С. albicans.

Значения коэффициентов роста найдены равными: предельная плотность популяции б контроле К=106*1С6 мл коэффициент автоингибирования а=7.0*10'9 мл/ч, коэффициент роста р=0.28 ч коэффициент рождения Ь=0.8 ч'1, коэффициент

размножения f=2. Коэффициенты di и являются индивидуальными количественными характеристиками противогрибковой активности гидрозоля клотримазола. С их помощью можно проводить количественное сравнение различных противогрибковых средств. Сравнение коэффициентов ингибирования клотримазола (di=4*104, dj=8500л/мо ль*ч), ZnS04 (di=20, di=2 л/моль*ч) и CuSOi (di=500, d2=60 л/моль*ч) показьшает, что гидрозоль клотримазола более токсичен для клеток дрожжей, чем сульфаты цинка и меди в исследованной области концентраций (табл. 10).

Минимальная цитоцидкая концентрация (МЦК) клотримазола равна 6.0* 10"6 моль/л, минимальная ингибирующая концентрация (МИК) равна 1.2*10"7 моль/л.

По вычисленным кинетическим коэффициентам и экотоксикологическому уравнению (5) построены теоретические кривые роста С. albicans в питательных средах, содержащих образцы клотримазола. Экспериментальные точки и теоретические кривые согласуются в пределах экспериментальной погрешности.

Таблица 10. Стандартные параметры роста дрожжей Candida albicans в

с моль/л K,-io-'±s_, N мл pin ± S_, pin ■i' л/моль*ч di, л/маль*ч $ Ь5 ч

контроль 106.0±1.2 0.28±0.06 0 0 0.28 0.800

1.2.10-' 90.0±1.0 0.33±0.06 4-10" 8500 0.29 0.801

2.4. Ю-1 85.0±1.6 0.33±0.07 4-Ю" 8500 0.31 0.802

6.0.10'' 83.0±1.0 0.33±0.07 4-10" 8500 0.32 0.805

1.2.10* 73.0±3.2 0.Л±0.08 4-104 8500 0.33 0.810

2.4.10-° 56.0±4.7 0.26 ±0.10 4-Ю" 8500 0.36 0.820

4.0.10-6 12.0±1.0 0.25±0.10 4-Ю"1 8500 0.43 0.83

6.0.10-* 1.7 ±0.1 0.24 ±0.07 4 • 104 8500 0.52 0.85

Биологическая активность субстанции клотримазола в отношении дрожжей Candida albicans может оцениваться в соответствии со стандартными параметрами тестирования (табл. 10). Клотримазол может быть рекомендован как стандартное вещество при скрининговых испытаниях веществ на противогрибковую активность.

В работе изучена биологическая активность серии смесей клотримазола (1.2*10"6 -1.2*10"7 моль/л) и AgNCb (1.0*10~7 - 1.0*10"8 моль/л). Интервал концентраций был выбран из области ингибирующего действия клотримазола и AgNCb. Результаты расчёта приведены в табл. 11.

Таблица 11. Кинетические коэффициенты роста дрожжей Candida albicans в

контроле и в присутствии комбинаций гидрозоля клотримазола с AgNtb

С клет., моль/л С ДцЯОЗ, моль/л KrlO'iS^, N мл"1 pin ± S_, pin ч1 du. л/моль *ч d«, л/моль л/моль *ч л/моль *ч P«, К ч'

контроль 106.0±1.2 0.28±0.06 0 0 0 0 0.28 0,800

1.2.10-6 1,0.10" 6б.0±4.6 o.3o±o.os 4-10'' 6-104 8500 г-ю4 0.33 0.811

1.2-107 1,0.10"' 60.0±1.3 0.24±0.01 4-104 6-Ю4 8500 2-104 0.29 0.803

Полученные экспериментальные точки, соответствующие росту С. albicans в питательной среде со смесью клотримазола (1.2*10"' моль/л) и AgN03 (1.0*10"7 моль/л), располагаются ниже расчётной кривой роста, поэтому смесь клотримазола и AgNCb в указанных концентрациях проявляет эффект выше адлигивпого, т.е. имеет место синергизм ингибирующего действия ионов серебра и клотримазола.

При увеличении концентрации клотримазола до 1.2*10"6 моль/л и уменьшении концентрации AgNCb до 1.0*10"' моль/л экспериментальные точки, соответствующие росту С. albicans в смеси, совпадают с расчётной кривой роста, поэтому ингабирующий эффект смеси при этих концентрациях относится к аддитивному.

Клотримазол и AgNCb являются ингибиторами синтеза компонентов клеточной стенки у С. albicans. Видимо, при совместном их действии в определенном сочетании концентраций эффект усиливается.

Из сравнения коэффициентов ингнбироваккя клотримазола (dj=4*10 , d2=8500 л/моль*ч) и AgNCb (di=6*104, ¿2=2*104 л/моль*ч) следует, что AgNCb более эффективно угнетает рост С. albicans, увеличение его концентрации в смеси ведёт к усилению эффекта по сравнению с аддитивным.

Расчёт цитостатическга, цитоцидных и ингабирующих концентраций солей ZnS04 и CuS04 для культуры Saccharomyces cerevisiae. Расчёт диаграмм «концентрации химических агентов - эффект» для прогнозирования комбинированного действия солей ZnSC>4 и C11SO4

Важная особенность экотоксихологической модели - возможность проводаггь теоретический расчет концентраций индивидуальных веществ и их комбинаций.

На основе экотоксико логической модели разработан метод расчёта цитостатических, цитоцидных и икгибирующих концентраций веществ на примере солей

Получены зависимости биомассы микробной популяции от различных концентраций комбинаций химических агентов Z11SO4 и CuS04- Эта зависимости рассматриваются как функции оклика системы на химическое воздействие. Функции отклика представляют собой характерную поверхность в пространстве «концентрации химических агентов - эффект». Полученные результаты представляют интерес как модели подавления роста патогенных микроорганизмов и могут быть использованы для выбора оптимальной дозировки комбинированных лекарственных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. На основании проведённых испытаний солей биогенных элементов, четырёх питательных сред, различных условий, способов культивирования на дрожжах Saccharomyces cerevisiae 776 шт., Candida albicans АТСС 885-653 и инфузориях Paramecium cavdatum предложены в качестве стандартов биологически активных веществ соли Z11SO4, CuSOn, AgNOj, N1SO4, а в качестве стандартпой питательной среды - глюкозо-аммонийная среда и среда Лозина - Лозинского.

2. Проведён анализ кинетических коэффициентов экотоксикологической модели и дана оценка адекватности модели при расчёте эффектов, влияющих на кинетику роста популяций Saccharomyces cerevisiae 776 шт., Candida albicans АТСС 885-653, Paramecium caudaium.

3. Разработан метод определения концентрации биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae 776 шт. когерентно-оптическим методом. Получены соотношения, позволяющие оценивать концентрацию дрожжей в диапазоне разведений 1*102 - 1*10® мл ~1 с погрешностью ±9%.

4. На основе экотоксикологической модели разработан метод определения стандартных параметров роста тест-культуры в контроле и в присутствии биологически активных веществ.

5. Определены стандартные параметры роста культур Saccharomyces cerevisiae 776 шт., Candida albicans АТСС 885-653, Paramecium caudatum в присутствии ZnS04, CUSO4, AgN03, N1SO4.

6. На основе экотоксикологической модели разработан метод определения стандартных параметров роста тест-культуры в присутствии комбинаций биологически активных веществ. Разработаны количественные принципы оценки комбинированных эффектов: аддитивный, ниже аддитивного, выше аддитивного.

¡еществ. Разработаны количественные принципы оценки комбинированных эффектов: аддитивный, ниже аддитивного, выше аддитивного.

7. Определены стандартные параметры роста культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae 776 шт. при комбинированном действии солей ZnSO^ +CuSO<. Установлено, что эффекты комбинированного действия носят аддитивный характер или ниже аддитивного в зависимости от выбранного интервала концентраций.

8. Получены гистограммами распределения дрожжей Saccharomyces cerevisiae 776 шт. по размеру и «объёмной доле» в средах с добавками солей ZnSC>4, CuSCU и их смесей. Показано, что ионы цинка защищают клетки дрожжей от разрушений, вызываемых ионами меди.

9. Разработана методика приготовления стандартного золя клотримазола на основе ультразвуковой обработки суспензии клотримазола с поверхностно активными веществами.

10. Определены стандартные параметры роста культуры Candida albicans АТСС 885-653 в присутствии золя клотримазола. Установлены минимальные цитоцидтше и минимальные ингибирующие концентрации клотримазола.

11. Измерена противогрибковая активность смеси клотримазола и АеМОз на рост культуры Candida albicans АТСС 885-653. Установлено, что эффекты комбинированного действия смеси носят аддитивный характер или выше аддитивного, в зависимости от выбранного интервала концентраций.

12. Разработан метод расчёта ингибирующих, цитостатических и цитоцидных концентраций биологически активных веществ.

13. Разработан метод расчёта диаграмм «концентрации химических агентов - эффект» для прогнозирования комбинированного действия биологически активных веществ.

По теме диссертации опубликованы следующие работы Ершов Ю.А., Плетенёва Т.В., Синюк Т Ф., Долгополова В.А. Определение параметров роста тест-модели Paramecium caudatum для стандартизации исследований по изучению биологической активности химических веществ. II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999.Т.127,№6.С.717-720.

Сыроешкин A.B., Плетенёв С.С., Плетенёва Т.В., Лебедев И.М., Синюк Т.Ф. Антагонизм в токсическом действии ионов меди и цинка в водных растворах. //Гальванотехника и обработка поверхности. 1999. Т.7,№З.С.48-51.

3. Ершов Ю.А., Плетенева ТВ., Синюк Т.Ф., Руленко H.A. Влияние хелатирующих агентов - полифенолов на биологическую активность ионов металлов. - Тезисы докладов V Российского национального конгресса «Человек и лекарство».Апрель 1998.С.395.

4. Сионская Т.К., Синюк Т.Ф. Определение параметров роста тест-модели для токсикометрических исследований. - Тезисы докладов XVI Менделеевского съезда по общей и прикладной химии.Май 1998.С. 146.

5. Ершов Ю.А., Плетенева Т.В., Тюкавкина H.A., Синюк Т.Ф., Воробьёва H.A. Влияние природных фенольных антиоксидантов на биологическую активность ионов металлов. -Тезисы докладов V международной конференции «Биоакгиоксиданг».Ноябрь 1998.

6. Синюк Т.Ф., Ершов Ю.А Определение параметров роста тест - модели Saccharomyces cerevisiae для стандартизации токсикометрических исследований. - Тезисы докладов международной конференции «Биохимическая физика на рубеже столетий» Апрель 2000.С.26.

7. Маркарян А.А, Синюк Т.Ф. Изучение токсичности желудочно-кишечного сбора и егс отдельных компонентов на одноклеточном организме Paramecium caudatum. - Тезись докладов VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство».Апрега 2000.C.42S.

8. Синюк Т.Ф., Алексеева Н.В., Воробьёва H.A. Регуляция параметров роста пивиыз дрожжей Saccharomyces cerevisiae различными добавками. - Тезисы докладо) международной конференции молодых учёных «Химия и технология пищевых веществ Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природньг ресурсов». Сентябрь 2000.С.145.

9. Сыроешкин AB., Синюк Т.Ф., Лебедев И.М., Плетенева Т.В., Кирьянов С.И. Изучени антагонизма в токсическом действии ионов меди и цинка в водных растворах дл разработки новых методов экологического мониторинга загрязнения природных во // Метеорология и гидрология. 2000.№10.С.55-61.

10. Ершов Ю.А., Котин В.В., Сшпок Т.Ф. К вопросу о верификации экотоксикологическо модели. - Тезисы докладов IX Международной конференции «Математика, шмпьютс; образование». Январь. 2002.С.145.

Подписано в печать 4.03.2002 г. Формат 60x90, 1/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 175.

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Русаковская, д.1. т. 264-30-73 Изготовление брошюр, авторефератов и переплет диссертаций.

Актуальность темы. Одним из направлений получения новых лекарственных препаратов является создание многокомпонентных форм, что требует разработки объективных методов оценки активных компонентов в комбинациях и их оптимального соотношения. Изучение индивидуального действия компонентов и их комбинаций требует большого числа экспериментов в широком интервале концентраций с использованием лабораторных животных. В связи с этим представляется перспективной разработка способов предварительных исследований на модельных объектах, не требующих использования лабораторных животных, в частности, на микробных культурах.

Число известных разработок стандартных методик биотестирования химических веществ на микробных культурах пока невелико. В качестве показателей биологической активности различных веществ, как правило, используют суммарные характеристики, такие, как лаг-период, максимальная скорость роста, предельная ёмкость. При использовании таких величин количественная оценка биологической активности веществ затруднительна, особенно при изучении комбинированного действия двух и более веществ.

Поэтому стандартизация количественного тестирования биологически активных веществ на микробных культурах представляется актуальной.

Проблема взаимодействия одновременно назначенных лекарств, изменение характера действия лекарственных веществ как компонентов лекарств, так же, как и возможность прогнозирования реакций организма, составляет важную часть биофармацевтического поиска. Теоретически эти вопросы изучены недостаточно. Существующие взгляды на принципы количественной оценки комбинированного действия противоречивы. Особенно большие трудности представляет прогнозирование зависимости доза - эффект. В связи с этим разработка теории комбинированного действия и её экспериментальная апробация также актуальна.

Цепь ■ основные задачи исследования.

Цель работы: разработка методики стандартизации количественного тестирования индивидуального и комбинированного действия веществ на микробных культурах Saccaharomyces cerevisiae, Candida albicans, Paramecium caudatum.

Поставленная цель определила следующие основные задачи исследования.

1. Обосновать выбор модельных микробных культур, осуществить выбор условий и способов тестирования.

2. Разработать методику стандартизации тестирования веществ на модельных микробных культурах.

3. Определить кинетические параметры экотоксикологической модели.

4. Исследовать влияние условий культивирования и активных добавок на параметры роста микробных культур.

5. Разработать количественные принципы оценки комбинированных эффектов на основе экотоксикологической модели. Установить эффекты комбинированного действия солей цинка и меди(П).

6. Для верификации предложенных принципов - разработать методы количественной оценки противогрибковой активности клотримазола и комбинации клотримазола с солью серебра(1) на рост Candida albicans.

7. Разработать метод расчёта цитоцидных, цитостатических и ингибирующих концентраций химических веществ.

8. Разработать метод расчёта диаграмм «концентрации химических агентов -эффект» для прогнозирования комбинированного действия химических веществ.

Научная новизна. Впервые на основе экотоксикологической модели проведена стандартизация тестирования на микробных культурах Saccaharomyces cerevisiae, Candida albicans, Paramecium caudatum.

Показано влияние условий культивирования микробных культур на кинетические параметры экотоксикологической модели.

Разработана ультразвуковая методика прип -овления стабильного гидрозоля клотримазола и проведена количественная оценка его биологической активности на культуре Candida albicans.

Апробированы оптические дифракционные методы для оценки биомассы, размеров и объёма клеток культуры Saccaharomyces cerevisiae.

Предложены количественные принципы оценки комбинированных эффектов: аддитивности, синергизма, антагонизма. Установлены эффекты действия комбинаций ZnS04+CuS04, клотримазола + AgN03.

Проведён теоретический расчёт цитоцидных, цитостатических и ингибирующих концентраций и расчёт диаграмм «концентрации химических агентов - эффект» для прогнозирования комбинированного действия солей ZnS04 и CuS04.

Практическая значимость. Разработана методика стандартизации тестирования на микробных культурах: Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Paramecium caudatum.

Разработана ультразвуковая методика приготовления стабильного гидрозоля клотримазола. Показана целесообразность предложенного метода испытания гидрозоля клотримазола и оценки его биологической активности на культуре Candida albicans по сравнению с существующими методами.

Разработанный способ расчёта цитоцидных, цитостатических и ингибирующих концентраций индивидуальных веществ и их смесей может использоваться для выбора дозы компонентов лекарственного препарата.

Предложенные диаграммы «концентрации химических агентов -эффект» целесообразно использовать для прогнозирования комбинированных эффектов лекарственных препаратов.

Показано, что когерентно-оптический метод и выведенные соотношения могут успешно использоваться для оценки биомассы микробных культур.

Апробация работы. Результаты исследований представлены и доложены на V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998); на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998); на V Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 1998); на Международной конференции «Биохимическая физика на рубеже столетий» (Москва, 2000); на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000); на Международной конференции молодых учёных «Химия и технология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» ( Москва, 2000); на IX

Международной конференции «Математика, компьютер, образование» (Дубна, 2002).

Публикации. Основные результаты работы отражены в 10 публикациях. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (№ государственной регистрации 0910039990), соответствует проблеме совета АМН РФ №48 "Фармация".

Положения, выносимые на защиту.

Результаты определения стандартных параметров роста микробных культур Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Paramecium caudatum.

Результаты по оценке действия комбинаций солей ZnS04, C11SO4 и по исследованию влияния солей ZnS04 и CuS04 на изменение распределения по размеру и объёму клеток Saccharomyces cerevisiae. Результаты определения стандартных параметров роста культуры Candida albicans в присутствии клотримазола, комбинации клотримазола и соли AgN03. Методы прогнозирования комбинированного действия солей ZnS04 и CuS04.

Структура я объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, трёх глав, отражающих результаты экспериментальных исследований, общих выводов, списка цитированной литературы и приложения. Работа изложена на 125 страницах, содержит 29 таблиц, 28 рисунков. Список литературы включает 145 источников.

выводы

1. На основании проведённых испытаний солей биогенных элементов, четырёх питательных сред, различных условий, способов культивирования на дрожжах Saccharomyces cerevisiae 776 шт., Candida albicans АТСС 885-653 и инфузориях Paramecium caudatum предложены в качестве стандартов биологически активных веществ соли ZnS04, CuS04, AgN03, NiS04, а в качестве стандартной питательной среды - глюкозо-аммонийная среда и среда Лозина - Лозинского.

2. Проведён анализ кинетических коэффициентов экотоксикологической модели и дана оценка адекватности модели при расчёте эффектов, влияющих на кинетику роста популяций Saccharomyces cerevisiae 776 шт., Candida albicans АТСС 885-653, Paramecium caudatum.

3. Разработан метод определения концентрации биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae 776 шт. когерентно-оптическим методом. Получены соотношения, позволяющие оценивать концентрацию дрожжей в диапазоне

J О I разведений 1*10 - 1 * 10 мл с погрешностью ±9%.

4. На основе экотоксикологической модели разработан метод определения стандартных параметров роста тест-культуры в контроле и в присутствии биологически активных веществ.

5. Определены стандартные параметры роста культур Saccharomyces cerevisiae 776 шт., Candida albicans АТСС 885-653, Paramecium caudatum в присутствии ZnS04, CuS04, AgNCh, NiS04.

6. На основе экотоксикологической модели разработан метод определения стандартных параметров роста тест-культуры в присутствии комбинаций биологически активных веществ. Разработаны количественные принципы оценки комбинированных эффектов: аддитивный, ниже аддитивного, выше аддитивного.

7. Определены стандартные параметры роста культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae 776 шт. при комбинированном действии солей ZnS04 +C11SO4. Установлено, что эффекты комбинированного действия носят аддитивный характер или ниже аддитивного в зависимости от выбранного интервала концентраций.

8. Получены гистограммами распределения дрожжей Saccharomyces cerevisiae 776 шт. по размеру и «объёмной доле» в средах с добавками солей ZnS04, C11SO4 и их смесей. Показано, что ионы цинка защищают клетки дрожжей от разрушений, вызываемых ионами меди.

9. Разработана методика приготовления стандартного золя клотримазола на основе ультразвуковой обработки суспензии клотримазола с поверхностно активными веществами.

10. Определены стандартные параметры роста культуры Candida albicans АТСС 885-653 в присутствии золя клотримазола. Установлены минимальные цитоцидные и минимальные ингибирующие концентрации клотримазола.

11. Измерена противогрибковая активность смеси клотримазола и AgN03 на рост культуры Candida albicans АТСС 885-653. Установлено, что эффекты комбинированного действия смеси носят аддитивный характер или выше аддитивного, в зависимости от выбранного интервала концентраций.

12. Разработан метод расчёта ингибирующих, цитостатических и цитоцидных концентраций биологически активных веществ.

13. Разработан метод расчёта диаграмм концентрации химических агентов - эффект для прогнозирования комбинированного действия биологически активных веществ.