Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Молекулярная фармакология глюкокортикоидов на основе природных и синтетических структур наноразмеров

ДИССЕРТАЦИЯ
Молекулярная фармакология глюкокортикоидов на основе природных и синтетических структур наноразмеров - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Молекулярная фармакология глюкокортикоидов на основе природных и синтетических структур наноразмеров - тема автореферата по медицине
Малкин, Петр Александрович Москва 2014 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.03.06
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Молекулярная фармакология глюкокортикоидов на основе природных и синтетических структур наноразмеров

На правах рукописи

Малкин Петр Александрович

Молекулярная фармакология глюкокортикоидов на основе природных и синтетических структур наноразмеров

14.03.06 - «Фармакология, клиническая фармакология»

31 ИЮЛ 2014

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2014

005550938

005550938

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России) Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН, Шимановский Николай Львович

профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, Яворский Александр Николаевич

профессор, начальник научно-аналитического отдела ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России

Доктор медицинских наук, Макаров Владимир Александрович

профессор, заведующий лабораторией патологии и фармакологии гемостаза

ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова Минздрава России.

Защита состоится «_» _ 20_ г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.01 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте

http://rsmu.ru ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по

адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «..........»............................20_года

Ученый секретарь диссертационного Духанин Александр Сергеевич совета доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность

В настоящее время топические стероиды активно применяются при лечении различных воспалительных и аллергических заболеваний кожи атопического, контактного аллергического дерматитов, псориаза и других дерматозов. Использование гидрокортизона, первого препарата в данной группе, в дерматологической практике выявило недостаточную его эффективность при тяжелых и хронических процессах (Шимановский H.JI., 2005; Gessi S. et al., 2010). Поиск препаратов, имеющих более выраженный противовоспалительный эффект привел к созданию галогенизированных стероидов, вызывающих выраженные системные и местные побочные эффекты (синдром Кушинга, снижение иммунитета и скорости заживления, психозоподобные реакции и т.д.). Ранее считали, что противовоспалительный, противоаллергический, десенсибилизирующий, антитоксический и иммунодепрессивный эффекты стероидов реализуются через один рецептор и поэтому неотделимы друг от друга (Cidlowski JA. et al., 1998). Однако использование современных инновационных технологий открывает новые возможности в этом направлении, в частности применение нанотехнологий для разделения фармакологических эффектов глюкокортикоидных препаратов (Labeur M. et al., 2010). Заданное изменение свойств лекарственных веществ с помощью нанотехнологического подхода включает два основных способа (Шимановский Н.Л. и др., 2010). Первый подход - синтез лекарственных соединений, имеющих наноразмеры на основе полимерной модификации лекарственных веществ (конъюгация молекулы лекарственного вещества и полимера) (Wang, Y.S., 2002). Второй -включение лекарственного вещества в состав наноматериалов представленных мицеллами, дендромерами, сферами (фуллерены) (Boas U. et al., 2004). Одной из новых возможностей, связанной с получением синтетических структур глюкокортикоидов наноразмеров (наносгероидов), является изучение молекулярных механизмов ранних, мембранотропных

з

эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени. За последние годы появились серии публикаций, описывающих быстрые экстрагеномные мембранотропные эффекты стероидов ^аИп С. е! а1., 2008; Ьб\уепЬе^ М. е! а1., 2008; ЯеуоПо Ж, Cidlowski .ГА, 2009). К ним можно отнести инотропное и вазоконстрикторное действие альдостерона, быстрые нейрональные эффекты прогестерона, ранние эффекты витамина ДЗ на уровень кальция и цАМФ в клетках костной ткани. Получены также сведения об участии мембранных рецепторов эстрогенов и гестагенов в регуляции активности мембранносвязанных ферментов аденилатциклазы, протеинкиназы С, 5'-нуклеотидазы в норме и при опухолевом росте (ОтсПа Ь. е1 а1., 2012). Ранее было показано, что повысить тропность стероидных гормонов к плазматическим мембранам и модифицировать их генотропную активность можно с помощью комплексирования с полимерными материалами, в частности с поливинилпирролидоном (Духанин А.С. и др., 2003). Комплекс поливинилпирролидон-глюкокортикоид, не проникая в клетку, способен через мембранные структуры усиливать эффекты (пермиссивное действие) адреномиметиков (изадрина), и свободного глюкокортикоида на модели тимоцитов крыс - повышать уровень цАМФ и цитостатическую активность глюкокортикоидов. Создание комплексов, не проникающих в клетку, но потенцирующих, например, эффекты адреномиметиков и антиаллергических средств может позволить создать новые антиаллергические, противовоспалительные средства с избирательным типом действия.

Цель исследования

Целью данной работы было определение фармако-биохимических особенностей действия на фибробласты мономерных глюкортикоидов и наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.

В качестве объекта исследования были выбраны фибробласты кожи - клетки-мишени фармакологического действия глюкокортикоидов, участвующие в воспалительных и аллергических реакциях при дерматозах.

Задачи исследования

1. Разработать экспериментальную модель для изучения геномных и негеномных эффектов глюкокортикоидов с использованием культуры клеток фибробластов.

2. Определить фармако-биохимических маркеры начальных этапов апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами.

3. Провести сравнительное исследование геномного и негеномного действия глюкокортикоидов на фибробласты с помощью наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.

4. Провести исследование молекулярных механизмов влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса на обмен вторичных мессенджеров в культуре фибробластов кожи.

Научная новизна

Впервые показано, что ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением рН цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов. Впервые показано, что величина внутриклеточного рН может служить ранним дифференциальным маркером апоптотической и некротической форм гибели фибробластов. Впервые установлено, что в терапевтической области концентраций кортизол подавляет кальциевый ответ фибробластов на ангиотензин II (АН). В физиологическом диапазоне концентраций кортизол потенцирует действие АН, его эффект опосредован взаимодействием с мембранными рецепторами минералкортикоидов.

Практическая значимость

Предложен новый подход для изучения молекулярных механизмов ранних, мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени,

основанный на использовании наноразмерных глюкокортикоидов. Применение наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет избирательно регулировать функциональную активность фибробластов на уровне мембранной рецепторной системы, что открывает новые предпосылки дальнейшей эволюции топических глюкокортикоидов, применяемых в дерматологии, с помощью наноразмерного дизайна оригинальных молекулярных комплексов - разделение терапевтического и побочных эффектов гормонотерапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением рН цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Иа/Н-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.

2. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет разделить геномные и негеномные механизмы регуляции активности клетки-мишени.

3. Выявлены два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект АН, реализуемое через минералкортикоидные рецепторы; 2) антагонистический мембранотропный глюкокортикоидов, выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов.

Внедрение результатов исследования

Результаты настоящего исследования используются в учебной работе кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В.Сергеева ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на 7-ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», май 2010 г., Астрахань; на совместной научной конференции кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии и НИЛ молекулярной фармакологии РНИМУ им Н.И.Пирогова.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России. Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4-х глав собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 130 источников. Работа выполнена на 103 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков, 9 таблиц и 3 схемы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наноразмерный кортизол-полимерный комплекс синтезирован в Институте высокомолекулярных соединений РАН (С.-Петербург). По химической структуре полимерные производные кортизола (гидрокортизона) представляют собой водорастворимый тройной сополимер

винилпирролидона, малеиновой кислоты и монозамещенного малеата стероида.

Средний молекулярный вес сополимеров 24000; содержание гидрокортизона 4,4 мольн% (13,2 масс%). Сложноэфирная связь между макромолекулой и стероидом образована ангидридной группой полимера и гидроксильной группой при С(21) глюкокортикоида.

+СН -rw:l

fCH-CH4 {CH-CH4

o=< >=o o=< >=o

HO OH HO OR

где R: кортизол.

21CH,OH

I z

CO

H—OH

О

кортизол

Рис. 1. Структурные формулы изучаемых соединений.

В качестве объекта исследования использованы фибробласты кожи из биоптатов белых крыс линии Wistar весом 100-200г, взятых из питомника лабораторных животных «Столбовая» РАМН и содержащихся на стандартном рационе вивария в ЦНИЛе. Выведение животных из эксперимента проводили путем передозировки эфирного наркоза с соблюдением всех условий гуманности и в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных". Фибробласты получали из кожи крыс как описано в работе Lu and Finkel, 2008. Клетки культивировали в лунках 96-луночного планшета в атмосфере с 5% С02 при 37°С в среде DMEM, содержащей 10% ЭТС и пенициллин (100ед/мл) со стрептомицином (100 мкг/мл) фирмы "Gibco". Фибробласты стимулировали добавлением ангиотензина II в концентрации 100 нМ, время инкубации составляло 24 ч. Изучаемые соединения - препараты глюкокортикоидов в дипазоне конечной концентрации (10 нМ -1 мкМ) ПВП-ГК, кортизол, дексаметазон; антагонисты минералкортикоидных рецепторов спиронолактон, рецепторов глюкокортикоидов мифепристон, в конечной концентрации 10 мкМ - добавляли в среду за 1 ч до внесения АН. Внутриклеточный уровень свободных ионов кальция определяли с помощью

флуоресцентного индикатора Fura-2/AM. Нагружение фибробластов флуоресцентным зондом FURA-2. Полученную суспензию клеток (10-15 х 105 кл/мл) инкубировали с FURA-2/AM (конечная концентрация 5 мкМ) при 20 °С в течение 40. Невключившийся индикатор отделяли, дважды отмывая клетки свежим Кребс буфером, перед определением флуоресценции фибробласты переводили в HEPES-буфер следующего состава (мМ): 145 NaCl, 5 КС1, 1 Na2HP04, 1 СаС12, 0.5 MgS04, 5 глюкоза, 10 NaHEPES, рН 7.4 при 37 °С. Пробы объемом 1 мл помещали в ячейку спектрофлуориметра MPF-4 "Hitachi" и регистрировали флуоресценцию (500 нм) при длинах возбуждающего света 340 нм и 380 нм, соответствующих максимуму поглощения связанной с ионами и свободной формы зонда FURA-2. Изменение мутности среды, общей концентрации зонда в рабочем объеме и другие факторы, вызывающие пропорциональное изменение составляющих спектра, не влияют на конечный результат. Для подсчета количества клеток использовали камеру Горяева, жизнеспособность фибробласты оценивали по исключению трипанового синего (85-90 % жизнеспособных клеток на начало экспериментов). Пролиферативной активности фибробластов оценивали по включению [3Н] тимидина (Brilla С. et al., 1995), синтез коллагена определяли по включению [3Н] пролина (Touyz R. et al., 1996). По окончанию инкубации аликвоты проб (100 мкл) быстро переносили на фильтры GF/C "Whatman" и дважды отмывали 2 мл HEPES-буфера (t=4°C). Фильтры высушивали при комнатной температуре и помещали в кюветы для радиометрии. Величину цитоплазматического рН в клетках оценивали с помощью флуоресцентного зонда BCECF/AM (Патрашев Д.В. и др., 1999). Для индукции некротической формы гибели фибробластов использовали экспериментальную модель окислительного стресса. Клетки инкубировали в присутствии t-бутилгидропероксида (БГП) - химического вещества, вызывающего окислительную деструкцию клеток в течение 8-12 ч.

Статистический анализ полученных результатов. Расчет доверительных

интервалов значений и оценку достоверности различий между ними

9

проводили с использованием непараметрического парного критерия Вилкоксона (для статистической оценки эффективности лечения); для определения межгрупповых различий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. t-Критерий Стьюдента использовали для статистического анализа данных, полученных в опытах in vitro. Достоверными считали различия при р<0,05. Результаты в тексте представлены в виде М±т.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Определение молекулярных мишеней аиоитотического действия глнжокортикоидов на фибробласты кожи

В задачи первой части исследования входило изучение влияния глюкокортикоидов на величину рН„„ с помощью флуоресцентного зонда BCECF, сравнение закономерностей изменения рНв„ при апоптотической и некротической формах гибели фибробластов. Величина рНвн в контрольных образцах клеток, в отсутствие химического воздействия (контроль 1), составляла 7,12 ± 0,05 (и = 6) и незначительно изменялась в течение всего времени наблюдения. Через 1,5 ч значение рНв„ в контрольных пробах составляло 7,03 ± 0,05 (и = 3).

В стандартных условиях эксперимента значение рН инкубационной среды (рНвнеш) составляло 7,35 ± 0,02. В начальный момент времени значение рНвн в клетках, подвергшихся воздействию БГП, равнялось 7,09 ± 0,06 (п = 4) и достоверно не отличалось от такового в контрольных клетках. По мере увеличения времени инкубации с БГП величина рНвн плавно повышалась, выходя на плато к 75-й минуте наблюдения (рис. 2, кривая 1). При этом конечное значение рНвн составляло 7,35 + 0,04 (и = 4), что соответствовало величине рНв„еш. Можно предположить, что наблюдается выравнивание рН во внеклеточном и внутриклеточном пространствах.

Для проверки этого предположения была использована инкубационная

среда со значением рНвнеш, равным 7,5 ± 0,02. В новых условиях эксперимента

динамика изменений рНвн в целом имела сходный характер, однако конечные

ю

значения рНвн составляли уже 7,51 ± 0,07 (и = 3) (рис. 2, кривая 2). Следует отметить, что значения рНвн в контрольных образцах фибробластов (контроль 2), инкубируемых в среде с рНвнеш 7,5, колебались в пределах 7,02-7,16, достоверно не отличаясь от уровня рНвн в контроле 1.

Рис. 2. Динамика изменения рН; в фибробластах при некротической форме гибели (модель окислительного стресса). Обозначения: кривая 1 - в присутствии 100 мкМ БГП, рН инкубационной среды 7,35; кривая 2 - в присутствии 100 мкМ БГП, рН инкубационной среды 7,5; кривая 3 - в присутствии 100 мкМ БГП, 30 мМ 2-дезоксиглюкозы и 50 мкМ трифлуоперазина, рН инкубационной среды 7,5.

Таким образом, при некротической форме гибели клеток наблюдаются нарушения гомеостатической функции плазматической мембраны, выражающиеся в выравнивании рНвн и рНвнеш к 75-й мин после начала воздействия БГП. Маловероятно, что повышение рНвн связано с активацией Ыа+/Н+-обмена, так как добавление в суспензию клеток селективного ингибитора антипорта препарата амилорида (200 мкМ) не влияло на динамику изменения рН8„.

Внесение в среду инкубации, наряду с БГП, ингибитора синтеза АТФ 2-дезоксиглюкозы и блокатора киназных реакций трифлуоперазина усугубляло нарушения клеточного гомеостаза: выравнивание рНвн и рНвисш регистрировали к 60-й минуте инкубации (рис. 2, кривая 3).

7.70

X

о.

0 15 30 45 60 75 90

Время, мин

Апоптотическую форму гибели фибробластов индуцировали дексаметазоном (1 мкМ). Инкубация клеток с дексаметазоном приводила к закислению внутриклеточной среды. Достоверные изменения рНв„ регистрировали начиная с 45-й минуты инкубации (значение рНвн составляло 6,95 ± 0,04; п - 4). В последующий отрезок времени величина рН„„ плавно уменьшалась и достигала значения 6,87 ± 0,04 к концу наблюдения (рис. 3). Предварительное внесение в среду инкубации 2-дезоксиглюкозы и ТФП отменяло изменения рНвн, индуцированные дексаметазоном. Полученные данные указывают на участие в рН-ответе фибробластов энергетически-зависимых реакций.

Рис. 3. Динамика изменения рНвн в фибробластах при апоптотической форме гибели, индуцированной дексаметазоном. Обозначения: кривая 1 - в присутствии 1 мкМ дексаметазона; кривая 2 - в присутствии 1 мкМ дексаметазона, 30 мМ 2-дезоксиглюкозы, 50 мкМ ТФП.

Для изучения молекулярных механизмов действия дексаметазона на Ка+/Н+-обмен были использованы два экспериментальных подхода, включающих оценку влияния глюкокортикоида на активацию Ыа+/Н+-обмена в фибробластах с помощью ангиотензина II и активатора фосфоинозитидного обмена форболмеристатацетата (ФМА). Полученные данные суммированы в таблице.

7,20

О

15 30 45 00 75 90

Время, мин

Таблица. Влияние различных экспериментальных условий на рН, фибробластов

Экспериментальные условия Время инкубации, мин

0 15 30 45 60 75

Контроль 7,12±0,05 7,12+0,05 7,10+0,06 7,08±0,05 7,06±0,05 7,03+0,05

Дексаметазон, 1 мкМ 7,10±0,04 7,06±0,05 7,02±0,04 6,9510,04* 6,9210,04* 6,8910,05*

Ангиотензин И, 100 нМ 7,1210,05 7,17±0,05 7,20±0,06 7,2510,04* 7,3010,05* 7,2810,05*

Ангиотензин II, 100 нМ + амилорид, 200 мкМ 7,12±0,05 7,11±0,05 7,0810,05

Ангиотензин II, 100 нМ + дексаметазон, 1 мкМ 7,12±0,05 7,06±0,05 7,12±0,04 7,09+0,04** 7,0810,04** 7,1010,05**

ФМА, 20 нМ 7,11±0,05 7,18+0,05 7,21±0,04 7,26±0,05* 7,3010,06* 7,3210,05*

ФМА, 20 нМ + амилорид, 200 мкМ 7,1140,05 7,11±0,05 7,0810,05

ФМА, 20 нМ + дексаметазон, 1 мкМ 7,11±0,05 7,06±0,05 7,1010,04 7,0610,04*** 7,09+0,04*** 7,1110,05***

Условия: дексаметазон добавляли в инкубационную среду за 3-5 мин до внесения изучаемых препаратов (ФМА, ангиотензин II, амилорид). Отсчет времени в таблице указан с момента введения изучаемых препаратов. Обозначения: ФМА - форболмеристатацетат. *- достоверное отличие (р <0,05) от контрольных значений; ** - достоверное отличие (р <0,05) по отношению к действию ангиотензина II; *** - достоверное отличие (р <0,05) по отношению к действию ФМА.

Достоверное увеличение рНвн наблюдали, начиная с 45-й минуты инкубации с ангиотензином II (100 нМ) или ФМА (20 нМ). Подъем рНв„,

вызванный ангиотензином II или ФМА, блокировался амилоридом (200 мкМ): внутриклеточная среда защелачивалась, диапазон значений рНв„ составлял от 7,28 до 7,32. Дексаметазон (1 мкМ) ингибировал подъем рНвн на всех экспериментальных моделях (таблица).

Таким образом, ингибирующее действие дексаметазона на Ыа+/Н+-обмен в фибробластах может быть отнесено к ранним, негеномным эффектам

глюкокортикоидов, а ингибирование №+/Н+-обмена - к ранним проявлениям апоптотического пути гибели клеток, индуцированного дексаметазоном.

В задачи следующей серии экспериментов входило исследование динамики апоптотического изменения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме фибробластов с помощью флуоресцентного индикатора Р1ЖА-2. По нашим данным, базальный уровень [Са2+]цит в фибробластах составляет в среднем 105 ± 9 нМ. Влияние дексаметазона на уровень [Са2+]цит в фибробластах характеризуется дозовой и временной зависимостью (рис. 4).

0,5 1 1,5 2 2,5

Время инкубации, ч

Рис. 4. Изменение концентрации цитозольного кальция в фибробластах на ранних стадиях апоптоза, индуцированного дексаметазоном. * - достоверное

отличие (р <0,05) от контрольных значений; ** - достоверное отличие (р <0,05) по отношению к действию дексаметазона 1 мкМ.

При концентрациях дексаметазона 0,1 и 1 мкМ наблюдается плавное нарастание [Са2+]цит в течение всего времени наблюдения (0-2,5 ч). При концентрации дексаметазона 10 мкМ через 2 ч инкубации наблюдается резкое увеличение концентрации внутриклеточных ионов кальция до 187 нМ (178% от начальной величины), значение [Са2+]цит сохраняется и через 2,5 ч наблюдения.

При повторении эксперимента в бескальциевой среде увеличения [Са] щгг не наблюдалось. Это позволило предположить, что эффект дексаметазона реализуется на уровне плазматической мембраны клеток. По-

видимому, увеличение [Са2+]цит связано с изменением проницаемости мембраны для ионов Са2+, а не с мобилизацией их из внутриклеточных депо. Для определения механизма изменения проницаемости мембраны при действии дексаметазона были поставлены следующие эксперименты. Одновременно с дексаметазоном (10 мкМ) в суспензию клеток вносили блокатор синтеза РНК актиномицин D (1 мкМ) или ингибитор трансляции циклогексемид (30 мкМ). Указанные соединения достоверно изменяли динамику кальциевого ответа фибробластов на дексаметазон: отсутствовал резкий подъем уровня [Са2+]ц„т через 2 ч инкубации с дексаметазоном (рис. 5). Однако тот факт, что ответ не отменялся полностью, свидетельствует о вкладе как геномных, так и негеномных механизмов глюкокортикоидного эффекта.

220

200

I 180 ""гО

Ч 160 s

j

Л 140 &

§ 120 100 ■ 80

0,5 1 1,5 2 2.5

Время инкубации; ч

Рис. 5. Изменение концентрации цитозольного кальция в фибробластах в различных экспериментальных условиях.

Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса для изучения механизмов регуляции функциональной активности фибробластов кожи

Изучаемые геномные механизмы регуляции функциональной активности фибробластов включали: 1) влияние глюкокортикоидов на базальную и

■"•"»....... Дексаметазон (10 мкМ) +

актиномицин D (1 мкМ)

— - Дексаметазон (10 мкМ) * циклогексемид (30 мкМ) -:>— Дексаметазон (10 мкМ)

стимулированную ангиотензином II (АН) клеточную пролиферацию; 2) влияние глюкокортикоидов на базальный и индуцированный синтез коллагена, оцениваемый по включению меченного тритием пролина.

АН достоверно увеличивает инкорпорацию меченых предшественников: включение тимидина в среднем на 57%, пролина - на 31%. Пролиферативный эффект ангиотензина II (100 нМ) и его влияние на синтез коллагена в фибробластах опосредовано АТ|-типом мембранных рецепторов (НаГш Б. е1 а1., 1998), действие АН отменяется конкурентным антагонистом АТгрецепторов ирбесартаном (1 мкМ).

ГК во всем изученном диапазоне концентраций (1нМ - 10 мкМ) ингибировали включение [3Н]-тимидина в ДНК фибробластов. В концентрации ГК выше 10 нМ наблюдается достоверное снижение стимулированнго АН синтеза ДНК; начиная с концентрации 1 мкМ ГК подавляют и базальный уровень включения меченого тимидина (рис. 5А). Влияние ГК на синтез коллагена определяется в основном подавлением индуцированного АН уровня, базальный уровень включения меченого пролина снижается не более, чем 10-15%. Сравнение активности глюкокортикоидов свидетельствует о 4-5-кратном превосходстве дексаметазона по сравнению с кортизолом угнетать как пролиферацию клеток, так и синтез коллагена. Действие ГК отменяется в присутствии 10-кратного избытка антагониста внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидов мифепристона. НР-ГК не оказывал достоверного влияния на базальную и стимулированную АН синтетическую активность фибробластов (рис. 5Б).

Рис. 5. Влияние глюкокортикоидов на базальный и стимулированный ангиотензином II синтез ДНК (А) и коллагена (Б) в фибробластах. По оси ординат - включение [3Н] тимидина (А) или [3Н] пролина (Б), % от контроля; по оси абсцисс - logio конечной концентрации стероидов в среде инкубации, М.

Исследуемый в нашей работе эктрагеномный механизм функциональной активности фибробластов включал влияние ГК на базальный и стимулированный АН внутриклеточный уровень свободных ионов кальция ([Са2+]цит)- В качестве инструмента исследования негеномных мебраноопосредованных эффектов ГК использовали кортизол, модифицированный ПВП.

[Са2+]Ц11Т в покоящихся клетках не превышал значения 73 нМ (61±12 нМ). Внесение в суспензию клеток 100 нМ АН вызывало максимальное увеличение внутриклеточной концентрации кальция до величины 209+32 нМ (п=6) на 15-20 сек инкубации. Предварительное добавление к фибробластам ПВП-ГК приводило к достоверному изменению Са-ответа клеток на АН.

В наномолярном диапазоне концентраций (2-10 нМ) НР-ГК потенцировал кальций-стимулирующее действие АН: кривая доза-эффект смещалась влево (рис. 6). Логично предположить, что это действие ГК опосредовано мембранными рецепторами минералкортикоидов. В пользу этого свидетельствуют следующие факты: 1) потенцирующий эффект НР-ГК отменяет антагонист минералкортикоидных рецепторов спиронолактон; 2) минералкортикоид альдостерон в концентрации 0,5 нМ сходным образом

потенцирует действие АН (рис. 6). Следует отметить, что синтетический

17

глюкокортикоид дексаметазон значительно уступал по своей активности кортизолу.

Рис. 6. Влияние стероидов на ангиотензин-индуцированный

уровень ионов кальция в фибробластах.

По оси ординат - внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция, нМ; по оси абсцисс - 1о§ю конечной концентрации ангиотензина II в среде инкубации, М.

В микромолярном диапазоне концентраций 0,5-2 мкМ (область фармакологических концентраций) НР-ГК подавлял индуцированное увеличение [Са2+]цит и не влиял на базальный уровень кальция в фибробластах. Для проявления кальций-блокирующего эффекта ГК латентный период не требовался.

Полученные нами данные свидетельствуют, что в зависимости от концентрации экстрагеномный эффект ГК на [Са2+]щгг имеет четко выраженное двухфазное действие. Выявленное различие в действии гормона кортизола и синтетического глюкокортикоида дексаметазона на уровне мембранных рецепторов согласуется с ранее установленными фактами различной чувствительности мебранных рецепторов стероидов к природным гормонам и их синтетическим производным (ВоопуагаШакопкй V. й а1., 2007).

Таким образом, использование препарата кортизола наноразмеров

позволило выявить два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на

18

фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект АН, реализуемое через минералкортикоидные рецепторы; 2) антагонистический мембранотропный глюкокортикоидов, выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов.

Молекулярные механизмы влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса на обмен вторичных мессенжеров в культуре фибробластов кожи

Одним из критериев, свидетельствующих о чувствительности клеток к ГК, является антипролиферативное действие гормонов, которое обусловлено их способностью ингибировать ранние этапы активации клеток. К таким ранним этапам относятся изменения в системе вторичных мессенджеров (Са2+; цАМФ), являющиеся триггерными пусковым механизмам активации и деления клеток.

Внутриклеточный уровень ионов кальция ([Са2+]ш,т) в покоящихся клетках не превышал значения 110 нМ (98±12 нМ). Внесение в суспензию клеток 3 мкМ наноразмерного кортизол-полимерного комплекса (НР-ГК) (соответствует средней терапевтической концентрации гидрокортизона в дерме при топическом применении) не приводило к достоверному изменению концентрации Са2+.

В качестве стимуляторов активации фибробластов кожи в нашей работе был использован ангиотензин II (АН). Добавление к фибробластам 100 нМ All вызывало быстрое увеличение [Са2"]цит до 240 ± 25 нМ (р <0,05). Для того, чтобы определить, откуда ионы кальция поступают в цитоплазму клеток при действии АН, были проведены эксперименты в бескальциевой среде. Са2+ в инкубационной среде связывали ЭГТА (конечная концентрация 1 мкМ), что приводило к резкому снижению базального уровня флуоресценции (рис. 7,6). АН (100 нМ) на фоне ЭГТА вызывала увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция примерно на 55 ± 12 нМ (р<0,05), что примерно в два раза меньше реакции, наблюдаемой в инкубационной среде с

нормальным содержанием ионов кальция. Данный факт, а также характерная кинетика Са-ответа на АН в среде без Са позволяют предположить, что ангиотензин II индуцирует выход ионов кальция из внутриклеточных депо клеток. Если в среде с ионами Са2+ на фоне действия АН к суспензии клеток добавляли EGTA (1 мМ), наблюдалось резкое снижение уровня [Са2+]цит (рис. 7,а), который восстанавливался при добавлении СаС12 за счет поступления ионов кальция через каналы плазматических мембран. Таким образом, при действии АА на фибробласты Са-ответ является суперпозицией двух процессов: транспорта ионов Са из инкубационной среды в цитоплазму, а также выхода Са2+ из внутриклеточных депо.

|С«< 290

Рис. 7. Влияние ЭГТА на индуцированное ангиотензином II (АН) повышение уровня [Са2+]цит в среде, содержащей 1 мМ СаС12 (а) и в бескальциевом буфере (б). Обозначения: 1 - All (100 нМ), 2 - ЭГТА (1 мМ), 3 - СаС12 (4.5 тМ).

Добавление АН (100 нМ) на фоне действия НР-ГК (3 мкМ) приводило к росту

[Са ] дит на 52 ± 13 нМ (р<0,02) от базального уровня, что напоминает

увеличение Са2+ в бескальциевой среде (рис. 8). Полученные результаты

свидетельствуют о том, что в терапевтической области концентраций

наноразмерный кортизол-полимерный комплекс блокирует Са-каналы

плазматических мембран и препятствует индуцированному ангиотензинном

II входу Са2+ извне в клетки. В то же время наноразмерный кортизол-

20

полимерный комплекс практически не влияет на стимулированный АН выход Са2+ из внутриклеточных депо.

Исследование аденилатциклазного звена клеточного ответа фибробластов показало, что базальный уровень цАМФ составил в среднем 2.3 ± 0,6 пмоль/107 клеток (п=10). При определении влияния All на содержание цАМФ в фибробластах были обнаружены значительные индивидуальные различия. Добавление к суспензии фибробластов АН (100 нМ) в одних случаях (7 наблюдений) приводило к достоверному снижению уровня цАМФ (1.2 ± 0,4 пмоль/107 клеток), в других (6 наблюдений) вызывало увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ (3.1 ± 0,4 пмоль/107 клеток). Исследование влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса (ЗмкМ) на цАМФ-ответ клеток не позволило выявить какие-либо закономерности.

Рис. 8. Влияние ангиотензина II (АН) на уровень ионов кальция в фибробластах на фоне действия НР-ГК. Условия и обозначения как на рис. 7. АА - ангиотензин II (100 нМ), ГК - наноразмерный кортизол-полимерный комплекс (3 мкМ).

[Са2Ч„ НМ 200 Г

Полученные нами данные свидетельствуют, что наноразмерный кортизол-

полимерный комплекс в концентрации 3 мкМ подавлял индуцированное

увеличение [Са2+]цнт и не влиял на базальный уровень кальция в

фибробластах. Для проявления Са-блокирующего эффекта НР-ГК латентный

период не требовался. Механизмы регуляции активности клеток-мишеней,

включающие аденилатциклазную систему, по-видимому, не являются точкой

приложения негеномного действия ГК.

21

выводы

1. Предложена экспериментальная модель для изучения геномных и негеномных эффектов глкжокортикоидов в фибробластах кожи, основанная на определении внутриклеточного рН как раннего показателя апоптоза и изменения внутриклеточного гомеостаза.

2. Ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением рН цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Ыа/Н-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.

3. Ингибирующее влияние мономерных глюкокортикоидов на клеточную пролиферацию и синтез коллагена относится к проявлениям их геномного действия, опосредованного внутриклеточными рецепторами.

4. В терапевтической концентрации наноразмерный кортизол-полимерный комплекс блокирует Са-канапы плазматических мембран и препятствует индуцированному ангиотензинном II входу Са2+ извне в клетки. В то же время наноразмерный кортизол-полимерный комплекс практически не влияет на стимулированный АН выход Са2+ из внутриклеточных депо.

5. В физиологическом диапазоне концентраций наноразмерный кортизол-полимерный комплекс потенцирует действие ангиотензин II, его эффект опосредован взаимодействием с мембранными рецепторами минералкортикоидов.

Практические рекомендации

1. Фибробласты кожи могут быть использованы в качестве тест-системы для скрининга и изучения геномных и негеномных эффектов соединений, обладающих глюкокортикоидной активностью.

2. По результатам проведенного исследования модификация фармакологических свойств глюкокортикоидов на основе использования наноматериалов может быть рекомендована для разработки новых глюкокортикоидных препаратов с заданными свойствами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. МапкинП.А., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Определение молекулярных мишеней апоптотического действия глюкокортикостероидных гормонов на фибробласты кожи //Лекарственные средства: прикладная фармакология и персонализированная фармакотерапия, 2010, №1, с.60-64

2. Мапкин П.А., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса для изучения механизмов регуляции функциональной активности фибробластов кожи. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010, № 4,434-437.

3. Малкин П.А., Барышев П.М., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Поиск новых более безопасных препаратов с глюкокортикоидной активностью для геронтологических больных. // Клиническая геронтология, 2010, т.16, №9-10, с.48-49.

4. Барышев П.М., Малкин П.А., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Преимущества использования наноматериалов для изменения специфических фармакологических свойств топических глюкокортикоидов.//Клин фармакология и фармакоэкономика, 2010, т.З, №4, 11-12.

5. Малкин П.А., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Молекулярные маркеры геномных и негеномных эффектов топических глюкокортикоидов.// Астраханский медицинский журнал, 2010, т.5, №1,49-51.

6. Духанин А.С., Малкин П.А., Шимановский Н.Л. Внутриклеточный рН как ранний дифференциальный маркер глюкокортикоид-индуцированного апоптоза фибробластов кожи. // Вестник РГМУ. -2013. - № 1. - С. 54-57.

Список сокращений рНвн - внутриклеточный уровень рН рНвнеш - значение рН во внеклеточной среде

[Са2+]Ц11Т - концентрация свободных ионов кальния в цитоплазме клеток

АН - ангиотензин II

БГП - /-бутилгидропероксид

ГК - глюкокортикоиды

НР-ГК - наноразмерный кортизол-полимерный комплекс

ТФП - трифтроперазин

ФМА - форбол-12-миристат-13-ацетат

Подписано в печать: 19.06.14 Тираж: 100 экз. Заказ № 1126 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru

 
 

Текст научной работы по медицине, диссертация 2014 года, Малкин, Петр Александрович

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета имени академика П.В.Сергеева

04201460356

МАЛКИН ПЕТР АЛЕКСАНДРОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ ГЛКЖОКОРТИКОИДОВ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ СТРУКТУР

НАНОРАЗМЕРОВ

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Шимановский Николай Львович

Москва - 2014

СОДЕРЖАНИЕ

Раздел I. ВВЕДЕНИЕ.................................................................5

Раздел II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 2.1. Молекулярная фармакология глюкокортикоидов: механизмы преобразования гормонального сигнала в биологический ответ клеток-

мишеней...................................................................................10

Глава 2.2. Методы модификации лекарственных средств на наноуровне..21

Глава 2.3. Эволюция топических глюкокортикоидов, применяемых в

дерматологии............................................................................35

Раздел III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............43

Раздел IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 4.1. Идентификация и изучение свойств специфических «систем

узнавания», локализованных на плазматических мембранах фибробластов

кожи......................................................................................56

Глава 4.2. Определение молекулярных мишеней апоптотического

действия глюкокортикоидов на фибробласты кожи...........................62

Глава 4.3. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса для изучения механизмов регуляции функциональной

активности фибробластов кожи.....................................................69

Раздел V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ.....................77

ВЫВОДЫ................................................................................91

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................92

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5'-Н - 5'-нуклеотидаза 11-ДОК -11-дезоксикортикостерон АДФ - аденозиндифосфат АКТГ - адренокортикотропный гормон АМФ - аденозин 5'-монофосфат АТ - антитела АТФ - аденозин 5'-трифосфат АД - аденилатциклаза АЦС - аденилатциклазная система БАВ - биологически активные вещества БГП - 1>бутилгидропероксид ГДФ - гуанозин 5'-дифосфат ГК - глюкокортикоиды ГКР - глюкокортикоидный рецептор ГМФ - гуанозинмонофосфат ГРК - гормон-рецепторный комплекс ГТФ - гуанозин 5'-трифосфат ГЦ - гуанилатциклаза ДАГ - диацилглицерин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИЛ - интерлейкин ИМФ - инозинмонофосфат ИФ3 - 1,4,5-инозитолтрифосфат Кд - равновесная константа диссоциации КМ - кальмодулин ЛС - лекарственное средство мРНК - матричная РНК

НР-ГК - наноразмерный кортизол-полимерный комплекс

ПВП - поливинилпирролидон

ПГ - простагландин

ПК - протеинкиназа

ПМ - плазматическая мембрана

ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза

ПФЗ - потенциалчувствительные флуоресцентные зонды

ПЭГК - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

СКК - стволовая кроветворная клетка

СТГ - соматотропный гормон

Т3 - трийодтиронин

ТМП - трансмембранный потенциал

ТФП- трифлуоперазин

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФИА - фенилизопропиладенозин

ФИФг - фосфатидилинозитолдифосфат ФД - фармакодинамика

ФК - фармакокинетика

фл - фемтолитры (10'15 литра)

Фл - фосфолипиды

ФлА2- фосфолипаза А2

Фл С - фосфолипаза С

ФМА - форболмеристатацетат

Ф н - неорганический фосфат

ФНОа - фактор некроза опухоли альфа

цАМФ - аденозин 3',5'-циклический монофосфат

цГМФ - гуанозин-3,5-циклический монофосфат

Афм - митохондриальный трансмембранный потенциал

Аф„ - плазматический трансмембранный потенциал

[Са ] цит - внутриклеточная концентрация ионов кальция

Втах - концентрация участков связывания лиганда

БМРХ - диметилпропаргилксантин

в} - ингибирующий ГТФ-связывающий белок

- стимулирующий ГТФ-связывающий белок

- трансдуцин

в-белки - ГТФ-связывающие белки ТОТ-у - фактор некроза опухоли-гамма Укл - объем клетки

Раздел I. ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования

В настоящее время топические стероиды активно применяются при лечении различных воспалительных и аллергических заболеваний кожи - атопического, контактного аллергического дерматитов, псориаза и других дерматозов. Использование гидрокортизона, первого препарата в данной группе, в дерматологической практике выявило недостаточную его эффективность при тяжелых и хронических процессах [Шимановский Н.Л., 2005; Gessi S. et al., 2010]. Поиск препаратов, имеющих более выраженный противовоспалительный эффект привел к созданию галогенизированных стероидов, вызывающих выраженные системные и местные побочные эффекты (синдром Кушинга, снижение иммунитета и скорости заживления, психозоподобные реакции и т.д.). Ранее считали, что противовоспалительный, противоаллергический, десенсибилизирующий, антитоксический и иммунодепрессивный эффекты стероидов реализуются через один рецептор и поэтому неотделимы друг от друга [Cidlowski JA. et al., 1998]. Однако использование современных инновационных технологий открывает новые возможности в этом направлении, в частности применение нанотехнологий для разделения фармакологических эффектов глюкокортикоидных препаратов [Labeur M. et al., 2010]. Заданное изменение свойств лекарственных веществ с помощью нанотехнологического подхода включает два основных способа [Шимановский Н.Л. и др., 2010]. Первый подход - синтез лекарственных соединений, имеющих наноразмеры на основе полимерной модификации лекарственных веществ (конъюгация молекулы лекарственного вещества и полимера) [Wang, Y.S., 2002]. Второй -включение лекарственного вещества в состав наноматериалов представленных мицеллами, дендромерами, сферами (фуллерены) [Boas U. et al., 2004]. Так, конъюгация лекарственного вещества с полиэтиленгликолем или пэгилирование (ПЭГК) увеличивает растворимость лекарственного вещества за счет собственной гидрофильности, увеличивает размер и массу частицы,

снижая, таким образом, интенсивность почечной экскреции. ПЭГК уменьшает доступность лекарственного вещества для протеолитических ферментов и антител. Примеры препаратов такого рода, одобренных FDA: ПЭГ-аспарагиназа (Oncaspar®), предназначенная для лечения острой лимфоцитарного лейкоза и других лимфоидных опухолевых заболеваний; ПЭГ-аденозина деаминаза (Adagen®), для лечения тяжелых комбинированных иммунодефицитов.

В настоящее время ведутся разработки по модификации различных лекарственных веществ с помощью дендримеров. Наиболее интенсивно разрабатываются модификации следующих классов лекарственных веществ: НПВС, противомикробные и противовирусные препараты, противоопухолевые средства (цитостатики, радионуклиды, фоточувствительные соединения), что объяснимо не только особенностями их физико-химических свойств, но и эпидемиологической значимостью соответствующих патологий. Одной из новых возможностей, связанной с получением синтетических структур глюкокортикоидов наноразмеров (наностероидов), является изучение молекулярных механизмов ранних, мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени. За последние годы появились серии публикаций, описывающих быстрые экстрагеномные мембранотропные эффекты стероидов [Stahn С. et al., 2008; Lowenberg М. et al., 2008; Revollo JR, Cidlowski JA, 2009]. К ним можно отнести инотропное и вазоконстрикторное действие альдостерона, быстрые нейрональные эффекты прогестерона, ранние эффекты витамина ДЗ на уровень кальция и цАМФ в клетках костной ткани. Получены также сведения об участии мембранных рецепторов эстрогенов и гестагенов в регуляции активности мембранносвязанных ферментов аденилатциклазы, протеинкиназы С, 5'-нуклеотидазы в норме и при опухолевом росте [Dindia L. et al., 2012]. Ранее было показано, что повысить тропность стероидных гормонов к плазматическим мембранам и модифицировать их генотропную активность можно с помощью комплексирования с полимерными

материалами, в частности с поливинилпирролидоном [Духанин A.C. и др., 2003]. Комплекс поливинилпирролидон- глюкокортикоид, не проникая в клетку, способен через мембранные структуры усиливать эффекты (пермиссивное действие) адреномиметиков (изадрина), и свободного глюкокортикоида на модели тимоцитов крыс - повышать уровень цАМФ и цитостатическую активность глюкокортикоидов. Создание комплексов, не проникающих в клетку, но потенцирующих, например, эффекты адреномиметиков и антиаллергических средств может позволить создать новые антиаллергические, противовоспалительные средства с избирательным типом действия.

Цель исследования

Целью данной работы было определение фармако-биохимических особенностей действия на фибробласты мономерных глюкортикоидов и наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.

В качестве объекта исследования были выбраны фибробласты кожи - клетки-мишени фармакологического действия глюкокортикоидов, участвующие в воспалительных и аллергических реакциях при дерматозах. Задачи исследования

1) Разработка экспериментальной модели для изучения геномных и негеномных эффектов глюкокортикоидов с использованием культуры клеток фибробластов.

2) Определение фармако-биохимических маркеров начальных этапов апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами.

3) Сравнительное исследование геномного и негеномного действия глюкокортикоидов на фибробласты с помощью наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.

4) Изучение молекулярных механизмов влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса на обмен вторичных мессенджеров в культуре фибробластов кожи.

Научная новизна

Впервые показано, что ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением рН цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.

Впервые показано, что величина внутриклеточного рН может служить ранним дифференциальным маркером апоптотической и некротической форм гибели фибробластов.

Впервые установлено, что в терапевтической области концентраций кортизол подавляет кальциевый ответ фибробластов на ангиотензин II (All). В физиологическом диапазоне концентраций кортизол потенцирует действие АП, его эффект опосредован взаимодействием с мембранными рецепторами минералкортикоидов.

Практическая значимость

Предложен новый подход для изучения молекулярных механизмов ранних, мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени, основанный на использовании наноразмерных глюкокортикоидов.

Применение наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет избирательно регулировать функциональную активность фибробластов на уровне мембранной рецепторной системы, что открывает новые предпосылки дальнейшей эволюции топических глюкокортикоидов, применяемых в дерматологии, с помощью наноразмерного дизайна оригинальных молекулярных комплексов - разделение терапевтического и побочных эффектов гормонотерапии.

Положения выносимые на защиту

1. Ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются

уменьшением рН цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.

2. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет разделить геномные и негеномные механизмы регуляции активности клетки-мишени.

3. Выявлены два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект All, реализуемое через минералкортикоидные рецепторы; 2) антагонистический мембранотропный глюкокортикоидов, выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов.

Внедрение результатов исследования

Результаты настоящего исследования используются в учебной работе кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.Сепгеева РНИМУ им. Н.И.Пирогова г.Москвы. Апробация

Основные положения диссертации доложены на 7-ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», май 2010 г., Астрахань; на совместной научной конференции кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии и НИЛ молекулярной фармакологии РНИМУ им Н.И.Пирогова. Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

_ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ__10

Раздел II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 2.1. Молекулярная фармакология глюкокортикоидов: механизмы преобразования гормонального сигнала в биологический ответ клеток-мишеней.

Согласно классической «двухступенчатой» модели, рецепторный цикл состоит из нескольких этапов (рис. 1).

• Проникновение стероидов в клетку и связывание с внутриклеточными

(цитозольными или ядерными) рецепторами ГК, представляющими минорную

-12

фракцию протеинов (10 от общего количества клеточного белка) [Vig Е et al., 1994].

• Трансформация гормон-рецепторного комплекса в активную форму. Активация, возможно, осуществляется за счет фосфорилирования in vivo рецепторного белка с использованием АТФ в качестве субстрата [Tang Y, DeFranco DB, 1996].

• Взаимодействие комплекса "гормон-рецептор" с акцепторными сайтами в хроматине. После связывания освободившийся рецептор покидает ядро и возвращается в цитоплазму клетки [Голиков П.П., 1988, 2002]. Таким образом, биологическая роль рецепторов цитоплазмы сводится к захвату, первичной аккумуляции и доставке гормона в ядро.

Биохимические свойства внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидов. Рецепторы глюкокортикоидов (РГ) были первыми рецепторами стероидных гормонов, обнаруженными в различных тканях [Beato М., 1989]; предполагают, что они имеются в подавляющем большинстве органов и тканей [Розен В.Б., 1985, 1990]. Доказано наличие специфических рецепторов к ГК в коже, легочной ткани, печени и других органах.

Внутриклеточные рецепторы глюкокортикоидных гормонов представляют собой ядерные факторы транскрипции, которые относятся к суперсемейству рецепторов стероидных гормонов/тиреоидных гормонов/ретиноидов/витамина Дз. Они состоят из одной полипептидной цепи (рис. 2), содержащей около 700 аминокислотных остатков, в их третичной

Рис. 1. Классическая «двухступенчатая» модель действия глюкокортикоидов, опосредованная внутриклеточными рецепторами [Rang Н.Р., Dale М.М., Ritter J.M., 2005].

CBS

Nucleus

DNA -

Cytoplasm

Receptor activation

Transcription

mRNA

Translation

Mediator proteins

структуре выделяют домены, которые связывают глюкокортикоидную молекулу, ДНК, участки, ответственные за регуляцию транскрипции и димеризацию рецепторов (табл.1). Точечные мутации в центральной области 4 домена приводят либо к полной, либо к значительной потере способности рецептора связывать гормон [Sato A et al., 1996]. В отсутствие гормона рецепторы представляют собой неактивные гетеротетрамерные комплексы, содержащие белки теплового шока (hsp90 и hsp70) и иммунофилины (рис. 3).

Рис. 2. Структурно-функциональная карта рецептора глюкокортикоидов

[Miesfeld,Bloom,1996],

GCS ♦

C*IT tmmbrtn*

iUpeeortln-1

e,-Adr«noc«p(or» Cytoplaim

ЫиеЬиш +QRE ......... „ORE " вигоМ-гвшрвмШ

targrt gin*»

+ГЧЭ: ГГТАЦАпппТГТТЦТ^где n - любой нуклеотид -ГЧЭ: АТУАЦппТпТГАТЦп (15 bp)

Рис. 3. Схема взаимодействия глюкокортикоид-рецепторного комплекса с гормончувствительными элементами генома клеток-мишеней [Weigel NL, Zhang Y„ 1998].

Одна из функций белков теплового шока заключается в способствовании перехода гормонсвязывающего домена рецептора в конформацию, характеризующуюся высоким сродством к стероиду. Другим важным свойством комплексообразование рецепторов ГК с белками теплового шока является предотвращение гидролиза рецепторной молекулы специфическими протеазами [Сергеев и соавт., 1998].

В интактных клетках в отсутствии лиганда указанные гетерокомлексы 9S глюкокортикоидных рецепторов связаны с микротубулярным аппаратом (колхицин - вещество, разрушающее микротрубочки, ингибирует ряд геномных эффектов глюкокортикоидов). Иммунофиллины, взаимодействующие с гетерокомплексами рецепторов стероидных гормонов всех типов, имеют молекулярную массу около 59 кДа и принимают участие в разворачивании молекулы рецептора.

Число генов в клетке, экспрессия которых напрямую регулируется ГК, варьирует между 10 и 100, но транскрипция многих других генов опосредованно регулируется РГ путём их взаимодействия с другими факторами транскрипции. После активации рецепторы ГК образуют димер, который связывается соответствующим гормончувствительным элементом (ГЧЭ) ДНК, находящимся в 5-пр