Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Молекулярная фармакология глюкокортикоидов на основе природных и синтетических структур наноразмеров

На правах рукописи

Малкин Петр Александрович

Молекулярная фармакология глюкокортикоидов на основе природных и синтетических структур наноразмеров

14.03.06 - «Фармакология, клиническая фармакология»

31 ИЮЛ 2014

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2014

005550938

005550938

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России) Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН, Шимановский Николай Львович

профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, Яворский Александр Николаевич

профессор, начальник научно-аналитического отдела ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России

Доктор медицинских наук, Макаров Владимир Александрович

профессор, заведующий лабораторией патологии и фармакологии гемостаза

ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова Минздрава России.

Защита состоится «_» _ 20_ г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.01 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте

http://rsmu.ru ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по

адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «..........»............................20_года

Ученый секретарь диссертационного Духанин Александр Сергеевич совета доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность

В настоящее время топические стероиды активно применяются при лечении различных воспалительных и аллергических заболеваний кожи атопического, контактного аллергического дерматитов, псориаза и других дерматозов. Использование гидрокортизона, первого препарата в данной группе, в дерматологической практике выявило недостаточную его эффективность при тяжелых и хронических процессах (Шимановский H.JI., 2005; Gessi S. et al., 2010). Поиск препаратов, имеющих более выраженный противовоспалительный эффект привел к созданию галогенизированных стероидов, вызывающих выраженные системные и местные побочные эффекты (синдром Кушинга, снижение иммунитета и скорости заживления, психозоподобные реакции и т.д.). Ранее считали, что противовоспалительный, противоаллергический, десенсибилизирующий, антитоксический и иммунодепрессивный эффекты стероидов реализуются через один рецептор и поэтому неотделимы друг от друга (Cidlowski JA. et al., 1998). Однако использование современных инновационных технологий открывает новые возможности в этом направлении, в частности применение нанотехнологий для разделения фармакологических эффектов глюкокортикоидных препаратов (Labeur M. et al., 2010). Заданное изменение свойств лекарственных веществ с помощью нанотехнологического подхода включает два основных способа (Шимановский Н.Л. и др., 2010). Первый подход - синтез лекарственных соединений, имеющих наноразмеры на основе полимерной модификации лекарственных веществ (конъюгация молекулы лекарственного вещества и полимера) (Wang, Y.S., 2002). Второй -включение лекарственного вещества в состав наноматериалов представленных мицеллами, дендромерами, сферами (фуллерены) (Boas U. et al., 2004). Одной из новых возможностей, связанной с получением синтетических структур глюкокортикоидов наноразмеров (наносгероидов), является изучение молекулярных механизмов ранних, мембранотропных

з

эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени. За последние годы появились серии публикаций, описывающих быстрые экстрагеномные мембранотропные эффекты стероидов ^аИп С. е! а1., 2008; Ьб\уепЬе^ М. е! а1., 2008; ЯеуоПо Ж, Cidlowski .ГА, 2009). К ним можно отнести инотропное и вазоконстрикторное действие альдостерона, быстрые нейрональные эффекты прогестерона, ранние эффекты витамина ДЗ на уровень кальция и цАМФ в клетках костной ткани. Получены также сведения об участии мембранных рецепторов эстрогенов и гестагенов в регуляции активности мембранносвязанных ферментов аденилатциклазы, протеинкиназы С, 5'-нуклеотидазы в норме и при опухолевом росте (ОтсПа Ь. е1 а1., 2012). Ранее было показано, что повысить тропность стероидных гормонов к плазматическим мембранам и модифицировать их генотропную активность можно с помощью комплексирования с полимерными материалами, в частности с поливинилпирролидоном (Духанин А.С. и др., 2003). Комплекс поливинилпирролидон-глюкокортикоид, не проникая в клетку, способен через мембранные структуры усиливать эффекты (пермиссивное действие) адреномиметиков (изадрина), и свободного глюкокортикоида на модели тимоцитов крыс - повышать уровень цАМФ и цитостатическую активность глюкокортикоидов. Создание комплексов, не проникающих в клетку, но потенцирующих, например, эффекты адреномиметиков и антиаллергических средств может позволить создать новые антиаллергические, противовоспалительные средства с избирательным типом действия.

Цель исследования

Целью данной работы было определение фармако-биохимических особенностей действия на фибробласты мономерных глюкортикоидов и наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.

В качестве объекта исследования были выбраны фибробласты кожи - клетки-мишени фармакологического действия глюкокортикоидов, участвующие в воспалительных и аллергических реакциях при дерматозах.

Задачи исследования

1. Разработать экспериментальную модель для изучения геномных и негеномных эффектов глюкокортикоидов с использованием культуры клеток фибробластов.

2. Определить фармако-биохимических маркеры начальных этапов апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами.

3. Провести сравнительное исследование геномного и негеномного действия глюкокортикоидов на фибробласты с помощью наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.

4. Провести исследование молекулярных механизмов влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса на обмен вторичных мессенджеров в культуре фибробластов кожи.

Научная новизна

Впервые показано, что ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением рН цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов. Впервые показано, что величина внутриклеточного рН может служить ранним дифференциальным маркером апоптотической и некротической форм гибели фибробластов. Впервые установлено, что в терапевтической области концентраций кортизол подавляет кальциевый ответ фибробластов на ангиотензин II (АН). В физиологическом диапазоне концентраций кортизол потенцирует действие АН, его эффект опосредован взаимодействием с мембранными рецепторами минералкортикоидов.

Практическая значимость

Предложен новый подход для изучения молекулярных механизмов ранних, мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени,

основанный на использовании наноразмерных глюкокортикоидов. Применение наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет избирательно регулировать функциональную активность фибробластов на уровне мембранной рецепторной системы, что открывает новые предпосылки дальнейшей эволюции топических глюкокортикоидов, применяемых в дерматологии, с помощью наноразмерного дизайна оригинальных молекулярных комплексов - разделение терапевтического и побочных эффектов гормонотерапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением рН цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Иа/Н-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.

2. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет разделить геномные и негеномные механизмы регуляции активности клетки-мишени.

3. Выявлены два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект АН, реализуемое через минералкортикоидные рецепторы; 2) антагонистический мембранотропный глюкокортикоидов, выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов.

Внедрение результатов исследования

Результаты настоящего исследования используются в учебной работе кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В.Сергеева ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на 7-ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», май 2010 г., Астрахань; на совместной научной конференции кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии и НИЛ молекулярной фармакологии РНИМУ им Н.И.Пирогова.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России. Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4-х глав собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 130 источников. Работа выполнена на 103 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков, 9 таблиц и 3 схемы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наноразмерный кортизол-полимерный комплекс синтезирован в Институте высокомолекулярных соединений РАН (С.-Петербург). По химической структуре полимерные производные кортизола (гидрокортизона) представляют собой водорастворимый тройной сополимер

винилпирролидона, малеиновой кислоты и монозамещенного малеата стероида.

Средний молекулярный вес сополимеров 24000; содержание гидрокортизона 4,4 мольн% (13,2 масс%). Сложноэфирная связь между макромолекулой и стероидом образована ангидридной группой полимера и гидроксильной группой при С(21) глюкокортикоида.

+СН -rw:l

fCH-CH4 {CH-CH4

o=< >=o o=< >=o

HO OH HO OR

где R: кортизол.

21CH,OH

I z

CO

H—OH

О

кортизол

Рис. 1. Структурные формулы изучаемых соединений.

В качестве объекта исследования использованы фибробласты кожи из биоптатов белых крыс линии Wistar весом 100-200г, взятых из питомника лабораторных животных «Столбовая» РАМН и содержащихся на стандартном рационе вивария в ЦНИЛе. Выведение животных из эксперимента проводили путем передозировки эфирного наркоза с соблюдением всех условий гуманности и в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных". Фибробласты получали из кожи крыс как описано в работе Lu and Finkel, 2008. Клетки культивировали в лунках 96-луночного планшета в атмосфере с 5% С02 при 37°С в среде DMEM, содержащей 10% ЭТС и пенициллин (100ед/мл) со стрептомицином (100 мкг/мл) фирмы "Gibco". Фибробласты стимулировали добавлением ангиотензина II в концентрации 100 нМ, время инкубации составляло 24 ч. Изучаемые соединения - препараты глюкокортикоидов в дипазоне конечной концентрации (10 нМ -1 мкМ) ПВП-ГК, кортизол, дексаметазон; антагонисты минералкортикоидных рецепторов спиронолактон, рецепторов глюкокортикоидов мифепристон, в конечной концентрации 10 мкМ - добавляли в среду за 1 ч до внесения АН. Внутриклеточный уровень свободных ионов кальция определяли с помощью

флуоресцентного индикатора Fura-2/AM. Нагружение фибробластов флуоресцентным зондом FURA-2. Полученную суспензию клеток (10-15 х 105 кл/мл) инкубировали с FURA-2/AM (конечная концентрация 5 мкМ) при 20 °С в течение 40. Невключившийся индикатор отделяли, дважды отмывая клетки свежим Кребс буфером, перед определением флуоресценции фибробласты переводили в HEPES-буфер следующего состава (мМ): 145 NaCl, 5 КС1, 1 Na2HP04, 1 СаС12, 0.5 MgS04, 5 глюкоза, 10 NaHEPES, рН 7.4 при 37 °С. Пробы объемом 1 мл помещали в ячейку спектрофлуориметра MPF-4 "Hitachi" и регистрировали флуоресценцию (500 нм) при длинах возбуждающего света 340 нм и 380 нм, соответствующих максимуму поглощения связанной с ионами и свободной формы зонда FURA-2. Изменение мутности среды, общей концентрации зонда в рабочем объеме и другие факторы, вызывающие пропорциональное изменение составляющих спектра, не влияют на конечный результат. Для подсчета количества клеток использовали камеру Горяева, жизнеспособность фибробласты оценивали по исключению трипанового синего (85-90 % жизнеспособных клеток на начало экспериментов). Пролиферативной активности фибробластов оценивали по включению [3Н] тимидина (Brilla С. et al., 1995), синтез коллагена определяли по включению [3Н] пролина (Touyz R. et al., 1996). По окончанию инкубации аликвоты проб (100 мкл) быстро переносили на фильтры GF/C "Whatman" и дважды отмывали 2 мл HEPES-буфера (t=4°C). Фильтры высушивали при комнатной температуре и помещали в кюветы для радиометрии. Величину цитоплазматического рН в клетках оценивали с помощью флуоресцентного зонда BCECF/AM (Патрашев Д.В. и др., 1999). Для индукции некротической формы гибели фибробластов использовали экспериментальную модель окислительного стресса. Клетки инкубировали в присутствии t-бутилгидропероксида (БГП) - химического вещества, вызывающего окислительную деструкцию клеток в течение 8-12 ч.

Статистический анализ полученных результатов. Расчет доверительных

интервалов значений и оценку достоверности различий между ними

9

проводили с использованием непараметрического парного критерия Вилкоксона (для статистической оценки эффективности лечения); для определения межгрупповых различий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. t-Критерий Стьюдента использовали для статистического анализа данных, полученных в опытах in vitro. Достоверными считали различия при р<0,05. Результаты в тексте представлены в виде М±т.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Определение молекулярных мишеней аиоитотического действия глнжокортикоидов на фибробласты кожи

В задачи первой части исследования входило изучение влияния глюкокортикоидов на величину рН„„ с помощью флуоресцентного зонда BCECF, сравнение закономерностей изменения рНв„ при апоптотической и некротической формах гибели фибробластов. Величина рНвн в контрольных образцах клеток, в отсутствие химического воздействия (контроль 1), составляла 7,12 ± 0,05 (и = 6) и незначительно изменялась в течение всего времени наблюдения. Через 1,5 ч значение рНв„ в контрольных пробах составляло 7,03 ± 0,05 (и = 3).

В стандартных условиях эксперимента значение рН инкубационной среды (рНвнеш) составляло 7,35 ± 0,02. В начальный момент времени значение рНвн в клетках, подвергшихся воздействию БГП, равнялось 7,09 ± 0,06 (п = 4) и достоверно не отличалось от такового в контрольных клетках. По мере увеличения времени инкубации с БГП величина рНвн плавно повышалась, выходя на плато к 75-й минуте наблюдения (рис. 2, кривая 1). При этом конечное значение рНвн составляло 7,35 + 0,04 (и = 4), что соответствовало величине рНв„еш. Можно предположить, что наблюдается выравнивание рН во внеклеточном и внутриклеточном пространствах.

Для проверки этого предположения была использована инкубационная

среда со значением рНвнеш, равным 7,5 ± 0,02. В новых условиях эксперимента

динамика изменений рНвн в целом имела сходный характер, однако конечные

ю

значения рНвн составляли уже 7,51 ± 0,07 (и = 3) (рис. 2, кривая 2). Следует отметить, что значения рНвн в контрольных образцах фибробластов (контроль 2), инкубируемых в среде с рНвнеш 7,5, колебались в пределах 7,02-7,16, достоверно не отличаясь от уровня рНвн в контроле 1.

Рис. 2. Динамика изменения рН; в фибробластах при некротической форме гибели (модель окислительного стресса). Обозначения: кривая 1 - в присутствии 100 мкМ БГП, рН инкубационной среды 7,35; кривая 2 - в присутствии 100 мкМ БГП, рН инкубационной среды 7,5; кривая 3 - в присутствии 100 мкМ БГП, 30 мМ 2-дезоксиглюкозы и 50 мкМ трифлуоперазина, рН инкубационной среды 7,5.

Таким образом, при некротической форме гибели клеток наблюдаются нарушения гомеостатической функции плазматической мембраны, выражающиеся в выравнивании рНвн и рНвнеш к 75-й мин после начала воздействия БГП. Маловероятно, что повышение рНвн связано с активацией Ыа+/Н+-обмена, так как добавление в суспензию клеток селективного ингибитора антипорта препарата амилорида (200 мкМ) не влияло на динамику изменения рН8„.

Внесение в среду инкубации, наряду с БГП, ингибитора синтеза АТФ 2-дезоксиглюкозы и блокатора киназных реакций трифлуоперазина усугубляло нарушения клеточного гомеостаза: выравнивание рНвн и рНвисш регистрировали к 60-й минуте инкубации (рис. 2, кривая 3).

7.70

X

о.

0 15 30 45 60 75 90

Время, мин

Апоптотическую форму гибели фибробластов индуцировали дексаметазоном (1 мкМ). Инкубация клеток с дексаметазоном приводила к закислению внутриклеточной среды. Достоверные изменения рНв„ регистрировали начиная с 45-й минуты инкубации (значение рНвн составляло 6,95 ± 0,04; п - 4). В последующий отрезок времени величина рН„„ плавно уменьшалась и достигала значения 6,87 ± 0,04 к концу наблюдения (рис. 3). Предварительное внесение в среду инкубации 2-дезоксиглюкозы и ТФП отменяло изменения рНвн, индуцированные дексаметазоном. Полученные данные указывают на участие в рН-ответе фибробластов энергетически-зависимых реакций.

Рис. 3. Динамика изменения рНвн в фибробластах при апоптотической форме гибели, индуцированной дексаметазоном. Обозначения: кривая 1 - в присутствии 1 мкМ дексаметазона; кривая 2 - в присутствии 1 мкМ дексаметазона, 30 мМ 2-дезоксиглюкозы, 50 мкМ ТФП.

Для изучения молекулярных механизмов действия дексаметазона на Ка+/Н+-обмен были использованы два экспериментальных подхода, включающих оценку влияния глюкокортикоида на активацию Ыа+/Н+-обмена в фибробластах с помощью ангиотензина II и активатора фосфоинозитидного обмена форболмеристатацетата (ФМА). Полученные данные суммированы в таблице.

7,20

О

15 30 45 00 75 90

Время, мин

Таблица. Влияние различных экспериментальных условий на рН, фибробластов

Экспериментальные условия Время инкубации, мин

0 15 30 45 60 75

Контроль 7,12±0,05 7,12+0,05 7,10+0,06 7,08±0,05 7,06±0,05 7,03+0,05

Дексаметазон, 1 мкМ 7,10±0,04 7,06±0,05 7,02±0,04 6,9510,04* 6,9210,04* 6,8910,05*

Ангиотензин И, 100 нМ 7,1210,05 7,17±0,05 7,20±0,06 7,2510,04* 7,3010,05* 7,2810,05*

Ангиотензин II, 100 нМ + амилорид, 200 мкМ 7,12±0,05 7,11±0,05 7,0810,05

Ангиотензин II, 100 нМ + дексаметазон, 1 мкМ 7,12±0,05 7,06±0,05 7,12±0,04 7,09+0,04** 7,0810,04** 7,1010,05**

ФМА, 20 нМ 7,11±0,05 7,18+0,05 7,21±0,04 7,26±0,05* 7,3010,06* 7,3210,05*

ФМА, 20 нМ + амилорид, 200 мкМ 7,1140,05 7,11±0,05 7,0810,05

ФМА, 20 нМ + дексаметазон, 1 мкМ 7,11±0,05 7,06±0,05 7,1010,04 7,0610,04*** 7,09+0,04*** 7,1110,05***

Условия: дексаметазон добавляли в инкубационную среду за 3-5 мин до внесения изучаемых препаратов (ФМА, ангиотензин II, амилорид). Отсчет времени в таблице указан с момента введения изучаемых препаратов. Обозначения: ФМА - форболмеристатацетат. *- достоверное отличие (р <0,05) от контрольных значений; ** - достоверное отличие (р <0,05) по отношению к действию ангиотензина II; *** - достоверное отличие (р <0,05) по отношению к действию ФМА.

Достоверное увеличение рНвн наблюдали, начиная с 45-й минуты инкубации с ангиотензином II (100 нМ) или ФМА (20 нМ). Подъем рНв„,

вызванный ангиотензином II или ФМА, блокировался амилоридом (200 мкМ): внутриклеточная среда защелачивалась, диапазон значений рНв„ составлял от 7,28 до 7,32. Дексаметазон (1 мкМ) ингибировал подъем рНвн на всех экспериментальных моделях (таблица).

Таким образом, ингибирующее действие дексаметазона на Ыа+/Н+-обмен в фибробластах может быть отнесено к ранним, негеномным эффектам

глюкокортикоидов, а ингибирование №+/Н+-обмена - к ранним проявлениям апоптотического пути гибели клеток, индуцированного дексаметазоном.

В задачи следующей серии экспериментов входило исследование динамики апоптотического изменения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме фибробластов с помощью флуоресцентного индикатора Р1ЖА-2. По нашим данным, базальный уровень [Са2+]цит в фибробластах составляет в среднем 105 ± 9 нМ. Влияние дексаметазона на уровень [Са2+]цит в фибробластах характеризуется дозовой и временной зависимостью (рис. 4).

0,5 1 1,5 2 2,5

Время инкубации, ч

Рис. 4. Изменение концентрации цитозольного кальция в фибробластах на ранних стадиях апоптоза, индуцированного дексаметазоном. * - достоверное

отличие (р <0,05) от контрольных значений; ** - достоверное отличие (р <0,05) по отношению к действию дексаметазона 1 мкМ.

При концентрациях дексаметазона 0,1 и 1 мкМ наблюдается плавное нарастание [Са2+]цит в течение всего времени наблюдения (0-2,5 ч). При концентрации дексаметазона 10 мкМ через 2 ч инкубации наблюдается резкое увеличение концентрации внутриклеточных ионов кальция до 187 нМ (178% от начальной величины), значение [Са2+]цит сохраняется и через 2,5 ч наблюдения.

При повторении эксперимента в бескальциевой среде увеличения [Са] щгг не наблюдалось. Это позволило предположить, что эффект дексаметазона реализуется на уровне плазматической мембраны клеток. По-

видимому, увеличение [Са2+]цит связано с изменением проницаемости мембраны для ионов Са2+, а не с мобилизацией их из внутриклеточных депо. Для определения механизма изменения проницаемости мембраны при действии дексаметазона были поставлены следующие эксперименты. Одновременно с дексаметазоном (10 мкМ) в суспензию клеток вносили блокатор синтеза РНК актиномицин D (1 мкМ) или ингибитор трансляции циклогексемид (30 мкМ). Указанные соединения достоверно изменяли динамику кальциевого ответа фибробластов на дексаметазон: отсутствовал резкий подъем уровня [Са2+]ц„т через 2 ч инкубации с дексаметазоном (рис. 5). Однако тот факт, что ответ не отменялся полностью, свидетельствует о вкладе как геномных, так и негеномных механизмов глюкокортикоидного эффекта.

220

200

I 180 ""гО

Ч 160 s

j

Л 140 &

§ 120 100 ■ 80

0,5 1 1,5 2 2.5

Время инкубации; ч

Рис. 5. Изменение концентрации цитозольного кальция в фибробластах в различных экспериментальных условиях.

Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса для изучения механизмов регуляции функциональной активности фибробластов кожи

Изучаемые геномные механизмы регуляции функциональной активности фибробластов включали: 1) влияние глюкокортикоидов на базальную и

■"•"»....... Дексаметазон (10 мкМ) +

актиномицин D (1 мкМ)

— - Дексаметазон (10 мкМ) * циклогексемид (30 мкМ) -:>— Дексаметазон (10 мкМ)

стимулированную ангиотензином II (АН) клеточную пролиферацию; 2) влияние глюкокортикоидов на базальный и индуцированный синтез коллагена, оцениваемый по включению меченного тритием пролина.

АН достоверно увеличивает инкорпорацию меченых предшественников: включение тимидина в среднем на 57%, пролина - на 31%. Пролиферативный эффект ангиотензина II (100 нМ) и его влияние на синтез коллагена в фибробластах опосредовано АТ|-типом мембранных рецепторов (НаГш Б. е1 а1., 1998), действие АН отменяется конкурентным антагонистом АТгрецепторов ирбесартаном (1 мкМ).

ГК во всем изученном диапазоне концентраций (1нМ - 10 мкМ) ингибировали включение [3Н]-тимидина в ДНК фибробластов. В концентрации ГК выше 10 нМ наблюдается достоверное снижение стимулированнго АН синтеза ДНК; начиная с концентрации 1 мкМ ГК подавляют и базальный уровень включения меченого тимидина (рис. 5А). Влияние ГК на синтез коллагена определяется в основном подавлением индуцированного АН уровня, базальный уровень включения меченого пролина снижается не более, чем 10-15%. Сравнение активности глюкокортикоидов свидетельствует о 4-5-кратном превосходстве дексаметазона по сравнению с кортизолом угнетать как пролиферацию клеток, так и синтез коллагена. Действие ГК отменяется в присутствии 10-кратного избытка антагониста внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидов мифепристона. НР-ГК не оказывал достоверного влияния на базальную и стимулированную АН синтетическую активность фибробластов (рис. 5Б).

Рис. 5. Влияние глюкокортикоидов на базальный и стимулированный ангиотензином II синтез ДНК (А) и коллагена (Б) в фибробластах. По оси ординат - включение [3Н] тимидина (А) или [3Н] пролина (Б), % от контроля; по оси абсцисс - logio конечной концентрации стероидов в среде инкубации, М.

Исследуемый в нашей работе эктрагеномный механизм функциональной активности фибробластов включал влияние ГК на базальный и стимулированный АН внутриклеточный уровень свободных ионов кальция ([Са2+]цит)- В качестве инструмента исследования негеномных мебраноопосредованных эффектов ГК использовали кортизол, модифицированный ПВП.

[Са2+]Ц11Т в покоящихся клетках не превышал значения 73 нМ (61±12 нМ). Внесение в суспензию клеток 100 нМ АН вызывало максимальное увеличение внутриклеточной концентрации кальция до величины 209+32 нМ (п=6) на 15-20 сек инкубации. Предварительное добавление к фибробластам ПВП-ГК приводило к достоверному изменению Са-ответа клеток на АН.

В наномолярном диапазоне концентраций (2-10 нМ) НР-ГК потенцировал кальций-стимулирующее действие АН: кривая доза-эффект смещалась влево (рис. 6). Логично предположить, что это действие ГК опосредовано мембранными рецепторами минералкортикоидов. В пользу этого свидетельствуют следующие факты: 1) потенцирующий эффект НР-ГК отменяет антагонист минералкортикоидных рецепторов спиронолактон; 2) минералкортикоид альдостерон в концентрации 0,5 нМ сходным образом

потенцирует действие АН (рис. 6). Следует отметить, что синтетический

17

глюкокортикоид дексаметазон значительно уступал по своей активности кортизолу.

Рис. 6. Влияние стероидов на ангиотензин-индуцированный

уровень ионов кальция в фибробластах.

По оси ординат - внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция, нМ; по оси абсцисс - 1о§ю конечной концентрации ангиотензина II в среде инкубации, М.

В микромолярном диапазоне концентраций 0,5-2 мкМ (область фармакологических концентраций) НР-ГК подавлял индуцированное увеличение [Са2+]цит и не влиял на базальный уровень кальция в фибробластах. Для проявления кальций-блокирующего эффекта ГК латентный период не требовался.

Полученные нами данные свидетельствуют, что в зависимости от концентрации экстрагеномный эффект ГК на [Са2+]щгг имеет четко выраженное двухфазное действие. Выявленное различие в действии гормона кортизола и синтетического глюкокортикоида дексаметазона на уровне мембранных рецепторов согласуется с ранее установленными фактами различной чувствительности мебранных рецепторов стероидов к природным гормонам и их синтетическим производным (ВоопуагаШакопкй V. й а1., 2007).

Таким образом, использование препарата кортизола наноразмеров

позволило выявить два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на

18

фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект АН, реализуемое через минералкортикоидные рецепторы; 2) антагонистический мембранотропный глюкокортикоидов, выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов.

Молекулярные механизмы влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса на обмен вторичных мессенжеров в культуре фибробластов кожи

Одним из критериев, свидетельствующих о чувствительности клеток к ГК, является антипролиферативное действие гормонов, которое обусловлено их способностью ингибировать ранние этапы активации клеток. К таким ранним этапам относятся изменения в системе вторичных мессенджеров (Са2+; цАМФ), являющиеся триггерными пусковым механизмам активации и деления клеток.

Внутриклеточный уровень ионов кальция ([Са2+]ш,т) в покоящихся клетках не превышал значения 110 нМ (98±12 нМ). Внесение в суспензию клеток 3 мкМ наноразмерного кортизол-полимерного комплекса (НР-ГК) (соответствует средней терапевтической концентрации гидрокортизона в дерме при топическом применении) не приводило к достоверному изменению концентрации Са2+.

В качестве стимуляторов активации фибробластов кожи в нашей работе был использован ангиотензин II (АН). Добавление к фибробластам 100 нМ All вызывало быстрое увеличение [Са2"]цит до 240 ± 25 нМ (р <0,05). Для того, чтобы определить, откуда ионы кальция поступают в цитоплазму клеток при действии АН, были проведены эксперименты в бескальциевой среде. Са2+ в инкубационной среде связывали ЭГТА (конечная концентрация 1 мкМ), что приводило к резкому снижению базального уровня флуоресценции (рис. 7,6). АН (100 нМ) на фоне ЭГТА вызывала увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция примерно на 55 ± 12 нМ (р<0,05), что примерно в два раза меньше реакции, наблюдаемой в инкубационной среде с

нормальным содержанием ионов кальция. Данный факт, а также характерная кинетика Са-ответа на АН в среде без Са позволяют предположить, что ангиотензин II индуцирует выход ионов кальция из внутриклеточных депо клеток. Если в среде с ионами Са2+ на фоне действия АН к суспензии клеток добавляли EGTA (1 мМ), наблюдалось резкое снижение уровня [Са2+]цит (рис. 7,а), который восстанавливался при добавлении СаС12 за счет поступления ионов кальция через каналы плазматических мембран. Таким образом, при действии АА на фибробласты Са-ответ является суперпозицией двух процессов: транспорта ионов Са из инкубационной среды в цитоплазму, а также выхода Са2+ из внутриклеточных депо.

|С«< 290

Рис. 7. Влияние ЭГТА на индуцированное ангиотензином II (АН) повышение уровня [Са2+]цит в среде, содержащей 1 мМ СаС12 (а) и в бескальциевом буфере (б). Обозначения: 1 - All (100 нМ), 2 - ЭГТА (1 мМ), 3 - СаС12 (4.5 тМ).

Добавление АН (100 нМ) на фоне действия НР-ГК (3 мкМ) приводило к росту

[Са ] дит на 52 ± 13 нМ (р<0,02) от базального уровня, что напоминает

увеличение Са2+ в бескальциевой среде (рис. 8). Полученные результаты

свидетельствуют о том, что в терапевтической области концентраций

наноразмерный кортизол-полимерный комплекс блокирует Са-каналы

плазматических мембран и препятствует индуцированному ангиотензинном

II входу Са2+ извне в клетки. В то же время наноразмерный кортизол-

20

полимерный комплекс практически не влияет на стимулированный АН выход Са2+ из внутриклеточных депо.

Исследование аденилатциклазного звена клеточного ответа фибробластов показало, что базальный уровень цАМФ составил в среднем 2.3 ± 0,6 пмоль/107 клеток (п=10). При определении влияния All на содержание цАМФ в фибробластах были обнаружены значительные индивидуальные различия. Добавление к суспензии фибробластов АН (100 нМ) в одних случаях (7 наблюдений) приводило к достоверному снижению уровня цАМФ (1.2 ± 0,4 пмоль/107 клеток), в других (6 наблюдений) вызывало увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ (3.1 ± 0,4 пмоль/107 клеток). Исследование влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса (ЗмкМ) на цАМФ-ответ клеток не позволило выявить какие-либо закономерности.

Рис. 8. Влияние ангиотензина II (АН) на уровень ионов кальция в фибробластах на фоне действия НР-ГК. Условия и обозначения как на рис. 7. АА - ангиотензин II (100 нМ), ГК - наноразмерный кортизол-полимерный комплекс (3 мкМ).

[Са2Ч„ НМ 200 Г

Полученные нами данные свидетельствуют, что наноразмерный кортизол-

полимерный комплекс в концентрации 3 мкМ подавлял индуцированное

увеличение [Са2+]цнт и не влиял на базальный уровень кальция в

фибробластах. Для проявления Са-блокирующего эффекта НР-ГК латентный

период не требовался. Механизмы регуляции активности клеток-мишеней,

включающие аденилатциклазную систему, по-видимому, не являются точкой

приложения негеномного действия ГК.

21

выводы

1. Предложена экспериментальная модель для изучения геномных и негеномных эффектов глкжокортикоидов в фибробластах кожи, основанная на определении внутриклеточного рН как раннего показателя апоптоза и изменения внутриклеточного гомеостаза.

2. Ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением рН цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Ыа/Н-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.

3. Ингибирующее влияние мономерных глюкокортикоидов на клеточную пролиферацию и синтез коллагена относится к проявлениям их геномного действия, опосредованного внутриклеточными рецепторами.

4. В терапевтической концентрации наноразмерный кортизол-полимерный комплекс блокирует Са-канапы плазматических мембран и препятствует индуцированному ангиотензинном II входу Са2+ извне в клетки. В то же время наноразмерный кортизол-полимерный комплекс практически не влияет на стимулированный АН выход Са2+ из внутриклеточных депо.

5. В физиологическом диапазоне концентраций наноразмерный кортизол-полимерный комплекс потенцирует действие ангиотензин II, его эффект опосредован взаимодействием с мембранными рецепторами минералкортикоидов.

Практические рекомендации

1. Фибробласты кожи могут быть использованы в качестве тест-системы для скрининга и изучения геномных и негеномных эффектов соединений, обладающих глюкокортикоидной активностью.

2. По результатам проведенного исследования модификация фармакологических свойств глюкокортикоидов на основе использования наноматериалов может быть рекомендована для разработки новых глюкокортикоидных препаратов с заданными свойствами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. МапкинП.А., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Определение молекулярных мишеней апоптотического действия глюкокортикостероидных гормонов на фибробласты кожи //Лекарственные средства: прикладная фармакология и персонализированная фармакотерапия, 2010, №1, с.60-64

2. Мапкин П.А., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса для изучения механизмов регуляции функциональной активности фибробластов кожи. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010, № 4,434-437.

3. Малкин П.А., Барышев П.М., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Поиск новых более безопасных препаратов с глюкокортикоидной активностью для геронтологических больных. // Клиническая геронтология, 2010, т.16, №9-10, с.48-49.

4. Барышев П.М., Малкин П.А., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Преимущества использования наноматериалов для изменения специфических фармакологических свойств топических глюкокортикоидов.//Клин фармакология и фармакоэкономика, 2010, т.З, №4, 11-12.

5. Малкин П.А., Духанин A.C., Шимановский Н.Л. Молекулярные маркеры геномных и негеномных эффектов топических глюкокортикоидов.// Астраханский медицинский журнал, 2010, т.5, №1,49-51.

6. Духанин А.С., Малкин П.А., Шимановский Н.Л. Внутриклеточный рН как ранний дифференциальный маркер глюкокортикоид-индуцированного апоптоза фибробластов кожи. // Вестник РГМУ. -2013. - № 1. - С. 54-57.

Список сокращений рНвн - внутриклеточный уровень рН рНвнеш - значение рН во внеклеточной среде

[Са2+]Ц11Т - концентрация свободных ионов кальния в цитоплазме клеток

АН - ангиотензин II

БГП - /-бутилгидропероксид

ГК - глюкокортикоиды

НР-ГК - наноразмерный кортизол-полимерный комплекс

ТФП - трифтроперазин

ФМА - форбол-12-миристат-13-ацетат

Подписано в печать: 19.06.14 Тираж: 100 экз. Заказ № 1126 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru