Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение сырья и путей получения кардиотонических гликозидов из наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh

Актуальность темы. В последнее время заболевания, связанные с нарушением сердечно-сосудистой деятельности получают все большее распространение среди людей зрелого возраста. Причинами являются сложная экологическая обстановка, постоянные стрессы, а также многие факторы окружающей среды. В связи с этим важность лекарств, оказывающих кардиотоническое воздействие на сердечную мышцу трудно переоценить.

Среди основных лекарственных средств, оказывающих избирательное кардиотоническое действие и применяемых для лечения сердечной недостаточности, издавна были представлены суммарные препараты из растений семейства норичковых (Scrophulariaceae), содержащих сердечные гликозиды, и выделенные из этих растений индивидуальные гликозиды.

Наиболее эффективными из них признаны индивидуальные гликозиды из наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh., такие как ланатозид С (целанид) и дигоксин.

В настоящее время из наперстянки шерстистой в России на основе ланатозида С выпускается препарат целанид (в различных лекарственных формах). Кроме того, на фармацевтическом рынке имеется дигоксин, который отличается от ланатозида С отсутствием глюкозы и ацетильной группы, и стал сейчас наиболее популярным у потребителей.

Сегодня российский рынок наполнен препаратами из наперстянки шерстистой зарубежных фирм: «Ciech-Polfa Group» (Чехия-Польша), «Gedeon Richter» (Венгрия), «Опоп» (Финляндия), «Nicomed» (Дания), «Таллиннский фармацевтический завод» (Эстония), «Teva» (Израиль), «Pliva» (Хорватия), «Glaxo Wellkome» (Великобритания), «Eii Lilly» (Швейцария)

Единственным отечественным производителем целанида является ВИЛАР РАСХН.

В настоящее время известны и хорошо освоены для получения субстанции целанида методы выделения сердечного гликозида из растительного сырья. Однако выделение ланатозида С все еще связано с рядом проблем, по этой причине работа по совершенствованию технологии остается актуальной.

Не менее важной проблемой является также и отработка оптимальных условий для получения дигоксина - продукта ферментативной деградации ланатозида С.

В связи с потребностями технологии переработки необходимо иметь информацию об активности в сырье ферментов, способных трансформировать первичные гликозиды во вторичные и, исходя из этого, определять пути его переработки.

В последнее время большинство специалистов в области кардиологии рекомендуют отказаться от использования ланатозида С в пользу дигоксина. С точки зрения технологии выделения данных веществ из растительного сырья предпочтение также отдается дигоксину.

Цель и задачи исследования. На основе углубленного фитохимического исследования сырья наперстянки шерстистой оптимизировать процесс выделения первичных гликозидов (абицина) и разработать технологию получения вторичного гликозида - дигоксина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Провести изучение и анализ исходного сырья - наперстянки шерстистой (Digitalis lanata Ehrh.) с различными условиями заготовки с целью определения его пригодности для переработки на дигоксин или целанид.

Отработать методы качественного количественного анализа сырья, получаемых продуктов и постадийного контроля.

Оптимизировать процессы выделения суммы первичных гликозидов наперстянки (ланатозидов А, В и С).

Разработать технологию получения вторичных гликозидов наперстянки с ориентацией на дигоксин и осуществить ее масштабирование.

Исследовать полученные продукты и содержащиеся в них примеси, выявить причины их появления и пути утилизации.

Научная новизна. Сырье наперстянки шерстистой исследовано на предмет активности содержащихся в нем нативных ферментов с использованием хроматографических методов, в результате чего предложен принцип оценки его качества с целью определения способа его переработки.

Усовершенствовано выделение первичных гликозидов из наперстянки шерстистой до стадии получения абицина (суммы ланатозидов А, В и С), предложены варианты дальнейшего разделения ланатозидов и разработана новая методика получения вторичного гликозида наперстянки - дигоксина.

Теоретически и экспериментально обосновано применение в разработанных способах получения сердечных гликозидов новых методов, таких как использование альтернативных экстрагентов, растворителей для выделения и очистки, современных хроматографических методов, перекристаллизации, объяснена их роль для обеспечения оптимального проведения процесса.

Разработана методика с использованием ТСХ для постадийного контроля производства целанида и дигоксина.

Методом сравнительного анализа 'Н-ЯМР-спектров, ВЭЖХ, ТСХ с образцами стандартов проведены идентификация конечных продуктов производства и их качественно-количественный анализ. На основании данных, полученных с использованием аналитических методов установлен характер примесей в конечных и промежуточных продуктах, установлены причины их присутствия.

Предложено применение физико-химических методов анализа для контроля технологического процесса.

Практическая значимость. Предложен принцип определения ферментативной активности в сырье наперстянки шерстистой. В лабораторных условиях усовершенствована методика получения абицина (суммы ланатозидов А,В и С), составлена методика для получения абицина в производственных условиях. Результаты проведенных исследований в виде разработанной технологии включены в патент РФ №2186069 от 20.06.2001 на «Способ получения технического дигоксина». Проведено масштабирование процесса получения дигоксина. Разработана технология получения дигоксина в производственных условиях и опробована в цехе фитохимии производственно-экспериментального завода ВИЛАР.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на II Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Казань, 2002 г.), на 6-ом Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт- Петербург, 2002 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы и получен патент РФ.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с Ф/П развития медицинской промышленности до 2005 г, приоритетным направлением ОМБН РАМН - «Создание современных перспективных лекарственных средств», планом НИР и ОКР ВИЛАР.

На защиту выносятся следующие положения.

- Способ оценки активности ферментов в сырье наперстянки шерстистой для выявления оптимального способа его переработки.

- Результаты исследований по совершенствованию выделения суммы ланатозидов А, В и С.

Результаты исследований по разработке технологии получения дигоксина.

- Результаты исследований по использованию физико-химических методов для идентификации целевых продуктов, определения характера примесей, причин их появления.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 5 схем и 22 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1. Предложен принцип определения активности ферментов в сырье различного происхождения, что позволяет оценить пригодность конкретного сырья для переработки на целанид или на дигоксин.

2. Показано, что при ферментативном гидролизе из ланатозида С сначала образуется ацетилпроизводное вторичного гликозида — ацетилдигоксин, которое при дальнейшем проведении процесса превращается в дигоксин.

3. Предложена 3-х стадийная схема выделения суммы ланатозидов А, В и С (абицина) из наперстянки шерстистой, осуществленная в крупнолабораторном масштабе, позволяющая в ходе производства оптимизировать расходные нормы сырья, растворителей и трудозатрат при улучшении качества целевого продукта и эффективности его выделения. Содержание ланатозида С в смеси составило 70- 80 % (в ранее предложенной технологии 60- 65 %).

4. Предложена оригинальная схема получения дигоксина в шесть стадий, которая была масштабирована до опытно-промышленных загрузок при сохранении показателей качества и выхода субстанции.

5. При совершенствовании технологии получения гликозидов наперстянки использованы преимущества «флеш» - техники при сорбционной очистке гликозидов, оптимизировано количество сорбента на данной стадии, а также разработаны удобные условия ТСХ и ВЭЖХ — контроля за ходом процесса выделения.

6. На стадии хроматографического разделения вторичных гликозидов выделены побочные вещества и охарактеризованы с помощью ТСХ, ВЭЖХ и 'Н-ЯМР-спектроскопии как продукты неполного ферментативного гидролиза — ацетилдигоксин и ацетилдигитоксин

1.3.6. Заключение.

Современные методы анализа сердечных гликозидов основаны на предварительном разделении и последующем количественном определении с помощью спектральных, либо хроматографических методов. Спектральные методы в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасных областях спектра, обладая достаточной точностью не дают возможности однозначно идентифицировать вещество, установить его однокомпонентность, тогда как метод ЯМР- спектроскопии позволяет определять положения, характер и число функциональных групп. Среди хроматографических методов наиболее длительными и трудоёмкими являются методы колоночной и бумажной хроматографии, что обосновывает попытки исследователей заменить их на другие методы, такие как тонкослойная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография. Тонкослойная хроматография обеспечивает высокую скорость разделения, возможность применения различных сорбентов и агрессивных реагентов в составе подвижных фаз и при проявлении хроматограмм. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами, такими как высокая чувствительность, быстрота и точность получаемых результатов, возможность определения индивидуальных гликозидов, содержащихся в смесях.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ СЫРЬЯ НАПЕРСТЯНКИ ШЕРСТИСТОЙ С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПУТИ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ.

При осуществлении предлагаемой в данной работе технологии принципиальным становится не только определение содержания ланатозида С в перерабатываемом сырье, но и оценка активности ферментных систем листа, сниженная высушиванием, уровня ее регенерации при замачивании.

На активность гидролаз (гликозидаз и эстераз) листа наперстянки, служащего сырьем для производства кардиотонических препаратов, должны оказывать влияние такие факторы как фаза вегетации, условия сбора, сушки и хранения, сроки хранения сырья.

Так, было проанализировано сырье наперстянки шерстистой урожаев 2000 (второй год вегетации) и 2001 (первый год вегетации) гг.

ТСХ- контроль за ходом ферментации показал, что через 24 часа процесс преврощения ланатозида С в дигоксин проходит полностью. Ланатозид С исчезает уже через 2 часа. В качестве продукта ферментативного превращения ланатозида С вначале образуется ацетилдигоксин, а затем дигоксин. Исходя из этого можно сделать предположение о том, что скорость действия гликозидаз выше, чем скорость действия эстераз. Т.о. процесс ферментативного превращения первичных гликозидов во вторичные проходит, главным образом, через стадию образования дезгликозилированных производных (схема 1).

На базе данных ТСХ-анализа, подтвержденных данными ВЭЖХ-анализа, проведенными совместно с Балакиной М. В., нами установлено, что скорость ферментативного гидролиза выше в сырье урожая 2001 г. Это связано или с тем, что срок хранения сырья урожая 2000 г больше, или с тем, что сушка его велась при более высокой температуре, или с тем, что активность ферментов у растения второго года вегетации существенно ниж

Если при переработке сырья на целанид желательно дезактивировать ферменты, подавить автоферментацию, то при получении дигоксина, напротив, на первой стадии недостаточная нативная активность гидролаз снижает полноту превращения ланатозида С в дигоксин, усложняет условия очистки за счет появления примесей, являющихся продуктами неполного гидролиза исходных первичных гликозидов листа — дезацетилированн ых и дезгликозилированных производных ланатозидов, в частности дезацетилланатозида С (продукт отщепления ацетильной группы) и ацетилдигоксина (продукт отщепления глюкозы) (схема 1).

Схема 1.

Переход ланатозида С в дигоксин под действием ферментативных систем.

СНз гО

Н Н Н нотЧ^уЗу-о н н

I снгон Н

Ланатозид С глякозндазы| эстеразы|

СНз

OCt° н

Ацетилдигоксин rSLl Н

ОН

Дезацетилланатозид С эстеразы) гликозидазы) он н

Дигоксин

Таким образом, в связи с потребностями технологии переработки необходимо иметь информацию об активности в сырье ферментов, способных трансформировать первичные гликозиды во вторичные.

Нами предложен принцип оценки ферментативной активности сырья наперстянки шерстистой с использованием ВЭЖХ-метода. Определение базируется на измерении концентрации ланатозида С в сырье через 15 минут после замачивания при соблюдении стандартных условий (температуры, начальной концентрации субстрата, условий пробоподготовки). Изменение концентрации, переведенное в число микромолей ланатозида С, гидролизуемых в этих условиях ферментами, присутствующими в 1 г сырья за 1 минуту, соответствует ферментативной активности, выраженной согласно ГФ XI, т.2, стр. 28 в Международных единицах активности (см. табл. 11)

В ходе работы с сырьем разного качества было показано, что активность ферментов, определенная таким способом, варьирует в довольно широких пределах (таблица 11).