Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование и применение реакций комплексообразования дигиланида с ионами металлов и ω-циклодекстрином

Р Г Б ОД

I I и ин МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ 1 • г чпг- И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ I ¡3 лНВ 1903 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ИЛЬЯШ

Оксана Юрьевна

УДК 541.49:615.322

ИССЛЕДОВАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИЙ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ ДИГИЛАНИДА С С ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ И р-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ

15.00.02 — ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических паук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Диссертационная работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.

Научный руководитель — доктор химических наук, профессор ЕВСТРАТОВЛ К. И.

Официальные оппоненты: кандидат фармацевтических наук, профессор БЛИНОВА К. Ф. доктор химических наук, профессор ЛЕБЕДЕВА Л. И.

Ведущая научная организация: Ботанический институт им. В. Л. Комарова РАН.

Защита состоится « /Ц » февраля 1995 года в « » часов в аудитории 37 на заседании специализированного совета Д 084.63.01 по присуждению ученой степени кандидата фармацевтических наук Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, СПХФИ, ул. проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.

Автореферат разослан « 29

1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат фармацевтических наук

РУСАК А. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Дигиланид С является сердечным гликозндом и применяется для лечения разных типов сердечной недостаточности. Существенным недостатком дигиланида С является его плохая растворимость в воде, что создает определенные трудности при производстве и применении этого ценного лекарственного средства. Получают дигиланид С экстракцией этилацетатом из листьев наперстянки шерстистой. При анализе исходного сырья дигиланид С извлекают 70% раствором этанола в воде (ФС 42-614-89). Поскольку в листьях наперстянки шерстистой кроме дигиланида С содержится еще 54 гликозида, то экстракт получается сложным по составу и трудным для анализа. Его подвергают очистке петролейным эфиром или тетрахлоридом углерода (удаляют пигменты), а затем сопутствующие вещества осаждают ацетатом свинца. После очистки сумму полученных сердечных гликозидов разделяют хромато графически.

Фармакопейный метод определения дигиланида С и другие методы, описанные в литературе, длительны и трудоемки. Поэтому актуальными являются исследования, направленные на разработку новых методов селективной экстракции дигиланидов из сырья, обеспечивающих сохранность дигиланида С и выделение его в чистом виде, при резком сокращении времени анализа и повышении точности результатов.

Цель работы состояла в изучении возможности селективной экстракции дигиланида С из растительного сырья, препаративного выделения его в чистом виде из экстракта, повышения растворимости и стабильности изучаемого соединения путем изменения физико-химических свойств в результате реакций комплексообразования.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи: 1. Подобрать соединения, которые способны образовывать с дигиланпдом С комплексы, растворимые в воде и водно-спиртовых средах,

а также выбрать наиболее подходящие методы исследования реакций комплексообразования.

2. Изучить методами потенциометрии и растворимости реакции комплексообразования дигиланида С с ионами Са^ +", Мд2 +, Си2 +, _РЬ>2 +, Ц+ в метаноле, водно-метанольном и водно-этанольном растворах, на основании полученных данных выбрать комплексующий экстрагент для извлечения дигиланидов из растительного сырья.

3. Изучить методами растворимости и дифференциальной сканирующей калориметрии процесс комплексообразования дигиланида С с р-циклодекстрином в воде и твердой фазе.

4. Исследовать физико-химические свойства дигиланида С в комплексе с р-циклодекстрином.

5. На основании полученных экспериментальных данных разработать метод экстракции дигиланидов из листьев наперстянки шерстистой новым комплексующим экстрагентом.

6. Разработать методику препаративного выделения дигиланида С из полученного экстракта.

Научная новизна исследования состоит в том, что впервые изучено комплексообразование дигиланида С с ионами Са^ + , Мд2 +, Си^ +, РЬ^ +, 1л + и Р-циклодекстрином в воде, водно-метанольных и водно-этанольных растворах, определен стехиометрический состав и рассчитаны константы устойчивости комплексов. Также впервые изучены физико-химические свойства полученных комплексов (растворимость, скорость растворения, степень гидролиза в кислой среде).

Практическая значимость. Разработан способ экстракции дигиланидов из листьев наперстянки шерстистой новым комплексующим экстрагентом, который обеспечивает возможность препаративного выделения из экстракта чистого дигиланида С (отвечающего требованиям целанида-стандарта) методом жидкостной колоночной хроматографии без

предварительного отделения сопутствующих веществ. На основании полученного комплекса дигиланида С с |3-циклодекстрином возможна разработка нового состава вспомогательных веществ лекарственной формы дигиланида С.

Апробация работы. По теме диссертации имеется 4 публикации. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

1. На Всероссийской научной конференции "Химия и технология лекарственных веществ" (Санкт-Петербург, 1994).

2. На научно-практическом семинаре "Организация аналитической службы экологического контроля н современные методы экоанализа". (Санкт-Петербург, 1993).

Объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (гл. 1), четырех глав экспериментальных исследований, выводов, списка использованной литературы и приложения.

Работа изложена на 165 страницах, содержит 35 таблиц и 19 рисунков. Библиография включает 135 источников, из которых 60 на иностранных языках.

На защиту выносятся:

1. Результаты исследования комплексообразования дигиланида С с ионами Ц + , Са2+, Мд2 + , Си2+, РЬ2+ в 20% водном растворе СН3ОН и с Са2+, Мд2 + , Си2+ в СН3ОН, 10% и 20% водых растворах СН3ОН, в 20% водном растворе С2Н5ОН.

2. Результаты исследования комплексообразования дигиланида С с р-циклодекстрином в водном растворе и твердой фазе.

3. Экспериментальные данные по изменению параметров растворимости, гидролиза, хроматографической подвижности дигиланида С в результате комплексообразования с р-циклодекстрином.

4. Способ экстракции дигиланида С из листьев наперстянки шерстистой новым комплексующим экстрагентом: 20% раствором СаС12 в 20% водном растворе СН3ОН.

5. Способ препаративного выделения дигиланида С из полученного экстракта методом жидкостной колоночной хроматографии.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность исследования, формулируются его цель и задачи, оценивается научная новизна основных результатов, дается общая характеристика работы.

В первой главе изложены литературные данные по изучаемым вопросам. В частности, приведены строение и свойства сердечных гликозидов, методы их экстракции из растительного сырья, способы очистки экстрактов. Описаны свойства неорганических Мд2+, Си2 + , +) и органических (р-циклодекстрин)

комплексообразователей, а также спирто-водных растворов, которые применялись для изучения реакций комплексообразования и экстракции дигиланидов из растительного сырья. Рассмотрены методы растворимости, потенциометрии, дифференциальной сканирующей калориметрии и тонкослойной хроматографии, которые применялись для исследования процессов комплексообразования. Изучение литературы показало, что не имеется данных о взаимодействиях дигиланида С с нонами металлов и |3-циклодекстрином. На основании выводов из литературного обзора сформулированы задачи исследования.

Во второй главе описаны методы, реактивы и аппаратура, которые применялись при проведении экспериментов.

В третьей главе представлены результаты изучения реакций комплексообразования дигиланида С с ионами

Са2+, Мд2+, Си2+, РЬ2+, 1л + в метаноле и в 20% водном растворе метанола с применением метода растворимости. На рис. 1 представлены зависимости растворимости

дигиланида С от содержания солей в 20% метаноле. Подобные зависимости наблюдаются при изучении растворимости дигиланида С в присутствии солей в чистом метаноле. Обнаружено, что дигиланид С образует комплексы с ионами Са2 + , Mg2 + , Сц2 + , Pb2 + в метаноле и в 20% метаноле, в связи с чем изменяется растворимость дигиланида С в этих растворителях. Во всех изученных системах растворимость дигиланида С возрастает с увеличением концентрации соли в среднем в 1.4 раза, проходит через максимум и далее уменьшается до некоторого постоянного значения. Такой вид зависимостей означает, что в системах сначала образуется растворимый комплекс, затем происходит насыщение по содержанию иона металла и комплекс переходит в твердую фазу. Исключением является кривая растворимости дигиланида С в присутствии LiCl (кривая 5). В этой системе растворимость дигиланида С сначала имеет постоянное значение, а затем постепенно уменьшается. Такое явление можно объяснить либо высаливанием дигиланида С из раствора, либо образованием нерастворимого комплекса.

Полученные экспериментальные данные использовали для расчета стехиометрического состава комплексов. Применяли следующее соотношение:

m/n=(Ss-Sa)/(La-Lb), (1)

где m/n - отношение стехиометрических коэффициентов дигиланида С и иона металла в комплексе;

Ss - исходная концентрация дигиланида С в точке максимума, моль/л; Sa - растворимость дигиланида С в точке максимума, моль/л; La и Lb - концентрация иона металла соответственно в начале и конце участка кривой, на котором растворимость дигиланида С имеет максимальное значение, моль/л;

Рис. 1. Зависимость растворимости дигиланида С в 20% метаноле от концентрации солей: 1 - МдОД; 2 - СиС12; 3 - СаС12; 4 - РЬ(СН3СОО)2; 5 - УС1.

Расчеты показали, что в метаноле образуются комплексы ДигМд2+, ДигСа24+, ДигСи24 +, а в 20% метаноле: ДигМд24 + , ДигСа43+, ДигСиз^ +, ДигРЬ^ +. На основании указанного стехиометрического состава комплексов, а также по аналогии с литературными данными об образовании устойчивых комплексов между ионами металлов и сахарами, можно предположить, что в чистом метаноле происходит взаимодействие ионов металлов с сахарной частью молекулы дигиланида С, а в 20% метаноле в комплексообразовании участвует как сахарная часть, так и агликон.

Данные, полученные методом растворимости, не полностью характеризуют процесс комплексообразования. Чтобы установить, с каким ионом и в каком растворителе дигиланид С образует наиболее устойчивый комплекс, были проведены исследования реакциий комплексообразования дигиланида С с ионами Мд2 +, Са^ +, Сц2 + потенциометрическим методом. Измерение концентраций не связанных в комплекс ионов металлов проводили с помощью ионоселективных электродов, функция которых в изучаемых растворах строго выполнялась. Расчет общих констант устойчивости комплексов осуществляли по методу Ледена. Этот метод позволяет рассчитать константы устойчивости комплексов разного состава. Вероятность образования таких комплексов определяется величиной константы устойчивости. Полученные значения представлены в табл.1. На основании данных табл.1 можно предположить, что в водно-спиртовых смесях возможно образование комплексов, содержащих 1 и 2 иона 1, 2 и 3 иона Сц2"Ь и от 1 до 4 ионов Са2 + . Константы

устойчивости у них одного порядка. Из данных табл.1 также видно, что наиболее устойчивые комплексы образуются в 20% метаноле и 20% этаноле. В 10% метаноле константа устойчивости в среднем в 2 раза меньше. Вероятно, уменьшение устойчивости комплексов в 10% метаноле объясняется особенностями структуры спирто-водных растворов,

Таблица 1.

Значения констант устойчивости комплексов дигиланида С с ионами Са2 + , + , Си2 + в 20% этаноле, 20% метаноле, 10% метаноле.

К'10"2, л/моль

Комплекс 20% метанол (по объему) 20% этанол (по объему) 10% метанол (по объему)

ДигСа2 + 9.3±0.7 8.5±0.8 4.5±0.5

ДигСа?4 + 8.6±0.5 7.9±0.4 4.7±0.5

ДигСаз6 + 1.8Ю.1 1.5±0.1 4.5±0.5

ДигСа48 + 9.1±0.7 8.4±0.5 4.6±0.5

ДигМд2 + 6.2±0.3 3.6±0.5 2.8М.4

ДигМд24 + 6.2±0.2 2.9±0.4 2.9±0.4

ДигСи2 + 7.3±0.2 4.9±0.5 3.9±0.5

ДигСц24+ 1.3±0.1 1.2±0.1 0.4±0.1

ДигСиз6 + 7.9±0.2 5.0±0.6 3.9±0.5

ДигСи48 + 0.8±0.1 1.0±0.1 0.4±0.1

содержащих малые количества спирта. Следует отметить, что из всех вероятно образующихся комплексов наиболее устойчивыми являются ДигСа2+ и ДигСа^ +. Этот факт использован нами в дальнейшем при разработке состава комплексующего экстрагента для извлечения дигиланидов из растительного сырья.

В четвертой главе приведены результаты исследования методами растворимости, дифференциальной сканирующей калориметрии и тонкослойной хроматографии реакции комплексообразования дигиланида С с р-циклодекстрином. Зависимость растворимости дигиланида С в воде при 20°С от концентрации р-циклодекстрина похожа на кривые растворимости в системах дигиланид С - ионы металлов - растворитель. То есть с увеличением концентрации р-циклодекстрина растворимость возрастает в 77 раз, проходит через максимум и далее снижается до

некоторого постоянного значения. По данным растворимости, с использованием соотношения (1) был рассчитан стехиометрический состав образующегося комплекса. Установлено, что в водном растворе дигиланид С с (3-циклодекстрином образует комплекс в молярном соотношении 1:4. На основании литературных данных можно утверждать, что этот комплекс является соединением включения. Так как молекула р-циклодекстрина представляет собой полый цилиндр, внутренняя поверхность которого гидрофобна, в растворе обычно существуют ассоциаты, состоящие из двух и более молекул. В результате реакции комплексообразования молекула дигиланида С помещается внутри полости ассоциата из четырех молекул р-циклодекстрина.

Была рассчитана общая константа устойчивости соединения включения, для этого использовали следующее соотношение:

К = 1дЫ/50(1-1дН), (2)

где tgN - тангенс угла наклона линейного участка кривой растворимости;

Б0 - растворимость дигиланида С в воде в отсутствии р-циклодекстрина (величина определена экспериментально и равна 9.1642> 10-5 моль/л).

Значение общей константы устойчивости равно К = (3.5±0.2) -юЗл/моль. Дигиланид С образует соединение включения с р-ЦД не только в растворе, но и в твердой фазе, что было доказано методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Сущность этого метода заключается в следующем: исследуемый образец и вещество сравнения помещают в дифференциальный сканирующий калориметр и нагревают. Тепло подается на образец таким образом, чтобы разность температур между образцом и веществом сравнения равнялась нулю. Тепло, затрачиваемое на выполнение этого требования, выраженное в микроджоулях в секунду, записывается на графике в координатах:

изменение теплового потока (сШЛИ) - температура (Т). В этих условиях площадь пика на кривой прямо пропорциональна энтальпии (Н) фазового перехода. Исчезновение пиков, характерных для исходных веществ, или появление новых пиков однозначно свидетельствует «^образовании нового соединения. На рис. 2 представлены кривые зависимости (ШЛИ - .Т для: дигиланида С (кривая 5), Р-циклодекстрина (кривая 4), механических смесей дигиланид С - р-циклодекстрин составов 1:2 (кривая 3) и 1:4 (кривая 2) и смеси дигиланид С - Р-циклодекстрин состава 1:4, полученной отгонкой растворителя (кривая 1). Как видно, на кривых наблюдаются эндотермические эффекты. Были определены следующие температуры начала фазовых переходов: для дигиланида С - 424.7 К, р-циклодекстрина -445.5 К, механических смесей дигиланид С - р-циклодекстрин состава (1:2)

- 410.0 К, состава (1:4) - 418.6 К, а также смеси дигиланид С - р-циклодекстрин (1:4), полученной отгонкой растворителя - 418.6 К. Определение температуры осуществлялось с точностью 0.1 К. Такое существенное изменение температур фазовых переходов указывает на протекание реакции комплексообразования и образование соединений включения составов 1:4 и 1:2. На кривой механической смеси дигиланид С

- р-циклодекстрин (1:2) отсутствует пик р-циклодекстрина, но присутствует четкий пик дигиланида С. Это свидетельствует о наличии незакомплексованного дигиланида С, что связано с недостаточным количеством взятого р-циклодекстрина. Увеличение его количества в два раза приводит к образованию соединения включения состава 1:4. Можно сделать вывод, что при достаточном количестве исходных компонентов образуется соединение включения состава 1:4 как в растворе, так и в твердой фазе. Для получения соединения включения в твердом виде достаточно слить растворы компонентов и отогнать растворитель. Для получения соединения включения в твердой фазе необходимо смешать компоненты и растереть смесь до порошкообразного состояния.

Рис. 2. Кривые дифференциальной сканирующей калориметрии: 1 - смеси дигиланид С - р-циклодекстрин (1:4), полученной отгонкой растворителя; 2 - механической смеси дигиланид С - р-циклодекстрин (1:4); 3 - механической смеси дигиланид С - р-циклодекстрин (1:2); 4 - р-циклодекстрин; 5 - дигиланид С.

Факт образования соединения включения при смешении дигиланида С и р-циклодекстрина (1:4) подтвержден также методом тонкослойной хроматографии. Обнаружена более высокая хроматографическая подвижность соединения включения (в 1.6 раза) по сравнению с хроматографической подвижностью незакомплексованного дигиланида С, хотя более полярное соединение включения должно лучше адсорбироваться на силикагеле. Такое необычное явление можно объяснить тем, что в процессе комплексообразования наружные гидроксильные группы молекулы р-циклодекстрина ориентируются внутрь полости и образуют водородные связи с молекулой дигиланида С, 0 результате чего наружная поверхность ассоциата становится менее полярной.

Было установлено, что под влиянием комплексообразования с р-циклодекстрином изменяются физико-химические свойства дигиланида С. На рис.3 приведены зависимости концентрации дигиланида С от времени растворения в воде при 37 °С соединений включения, полученных различными способами. Видно, что при растворении соединений включения концентрация дигиланида С в растворе возрастает по сравнению с незакомплексованным дигиланидом С. Однако, максимальная концентрация дигиланида С достигается при растворении соединения включения, полученного механическим смешением компонентов (1:4), и в 57 раз превышает концентрацию несвязанного дигиланида С (кривые 1 и 6). При этом время достижения максимальной концентрации сокращается в 2 раза. При растворении соединений включения, полученных механическим смешением компонентов, концентрация дигиланида С в растворе выше, чем при растворении комплексов, полученных отгонкой растворителя. Вероятно, в процессе отгонки растворителя молекулы комплекса образуют прочную структуру и в результате уменьшается растворимость соединения включения.

Рис. 3. Зависимость концентрации дигиланида С от времени растворения в воде при 37°С соединений включения:

1 - дигиланид С - ß-циклодекстрин (1:4 - механическое смешение компонентов); 2 - дигиланид С добавили в раствор ß-циклодекстрина (1:4); 3 - дигиланид С - ß-циклодекстрин (1:4 -отгонка растворителя); 4 - дигиланид С - ß-циклодекстрин (1:2 -механическое смешение компонентов); 5 - дигиланид С - ß-циклодекстрин (1:2 - отгонка растворителя); 6 - дигиланид С.

Такое объяснение подтверждают результаты опыта, при котором в раствор р-циклодекстрина добавляли дигиланид С (кривая 2). Как видно, экспериментальные точки кривой 2 практически (в пределах 5%) совпадают с точками кривой 1 для соединения включения дигиланид С - р-циклодекстрин, полученного смешением компонентов (1:4). На основании полученных данных можно сделать вывод, что лучше всего получать соединение включения дигнланид С - р-циклодекстрин механическим смешением компонентов, в соотношении 1:4.

Дигиланид С является лабильным соединением, легко гидролизуется в кислой среде с образованием агликона и сахарных остатков, в связи с чем изменяется его терапевтическая активность. Поэтому представлялось интересным изучить влияние комплексообразования на процесс гидролиза дигиланида С. Было установлено, что в солянокислой среде при рН=2 степень гидролиза дигиланида С в виде соединения включения с р-циклодекстрином уменьшается в 1.7 раза по сравнению со степенью гидролиза незакомплексованного дигиланида С. Значения константы скорости реакции гидролиза рассчитывали по тангенсу угла наклона зависимости 1/С - I, где С - концентрация дигиланида С; I - время гидролиза. Константы скорости реакций гидролиза дигиланида С и дигиланида С в комплексе с р-циклодекстрином равны К = 290±15 л'моль'1-мин"!, К^ = 93±6 л'моль'1-мин"' соответственно. Следовательно, комплексообразование с р-циклодекстрином замедляет гидролиз дигиланида С в три раза.

Поскольку комплексообразование изменяет физико-химические свойства дигиланида С, то возникает вопрос, изменяется ли при этом биологическая активность дигиланида С. Она была проверена на кафедре фармакологии СПХФИ в эксперименте на половозрелых лягушках-самцах. Установлено, что комплексообразование не уменьшает кардиотонический

эффект дигиланида С, причем скорость развития эффекта у закомплексованного дигиланида С выше, чем у препарата-стандарта.

Полученные результаты исследования процесса комплексообразования дигиланида С с р-циклодекстрином и проверки биологической активности дигиланида С в виде соединения включения с р-циклодекстрином являются основанием для разработки нового состава вспомогательных веществ лекарственной формы целанида.

В пятой главе описаны результаты разработки методики экстракции дигиланида С из листьев наперстянки шерстистой 20% раствором СаС12 в 20% водном растворе метанола и способа препаративного выделения дигиланида С из экстракта методом жидкостной колоночной хроматографии.

При изучении комплексообразования дигиланида С с ионами металлов (гл. 3) установлено, что в системе дигиланид С - СаС12 - 20% СН3ОН достигается максимальная растворимость дигиланида С и образуется наиболее устойчивый комплекс. И тому же, хлорид кальция является дешевым реактивом. Поэтому предложен в качестве нового комплексующего экстрагента раствор СаС12 в 20% метаноле. Было изучено влияние на полноту экстракции дигиланида С концентрации СаС12, продолжительности экстракции и величины гидромодуля. Выяснено, что оптимальная концентрация СаС12 равна 1.87 моль/л, что соответствует 20% раствору, общее время трехкратной экстракции составляет 60 мин, а величина гидромоду Ля равна 1/10. Для инактивации ферментов и ускорения процесса экстракции сырье предварительно обрабатывали минимальным количеством 96% этанола. При проведении экстракции в указанных условиях остаточное содержание дигиланида С ; в шроте составляет (9.0±0.8)'10_4%, что укладывается в пределы погрешности количественного определения (8%). В итоге проведенного исследования

предложена методика выделения дигиланида С из растительного сырья, состоящая из следующих стадий:

1. Набухание сырья в минимальном количестве 96% С2Н5ОН.

2. Трехкратная экстракция 20% раствором СаС1з в 20% СН3ОН.

3. Пятикратное извлечение дигиланидов из экстракта смесью хлороформ -метанол (9:1), с целью их концентрирования и отделения от сопутствующих веществ.

4. Осушение полученного извлечения, путем пропускания его через слой безводного Ыа25С>4.

5. Отгонка растворителя на ротерном испарителе при 60°С.

Преимуществами предлагаемой методики экстракции дигиланидов из растительного сырья по сравнению с традиционно применяемой экстракцией 70% С2Н5ОН являются: сокращение времени и числа операций; уменьшение потерь дигиланида С, так как исключаются стадии очистки экстракта от пигментов путем экстракции петролейным эфиром и осаждения сопутствующих веществ ацетатом свинца; экстрагент дешевый; получение достаточно чистого экстракта.

Последнее преимущество особенно важно, поскольку оно является основой для разработки методики препаративного выделения чистого дигиланида С с применением метода жидкостной колоночной хроматографии без предварительной трудоемкой очистки полученного экстракта. В качестве адсорбента был выбран силикагель, так • как он обладает большой адсорбционной емкостью, дешевый и широко используется в промышленности. Из силикагелей двух марок КСК (фракции 0.16-0.25) и Ь 40/100 оказался наилучшим последний. В качестве подвижной фазы использовалась смесь растворителей: хлористый метилен (80) - метанол (18) - вода (2), которая оказалась эффективной при разделении смеси дигиланидов методом тонкослойной хроматографии. Было изучено влияние на очистку экстракта и разделение дигиланидов

различных факторов. В табл. 2 и 3 представлены параметры хроматографирования при которых достигаются наиболее полные очистка и разделение. На основании полученных данных предложены следующие оптимальные условия очистки извлечения и выделения чистого дигиланида С: колонка - диаметром 1 см; адсорбент - силикагель Ь 40/100 - масса 13 г, элюент - смесь: СН2С12 (80) - СН3ОН (18) - Н2О (2). Объем отбираемой пробы 2.2 мл, время отбора одной пробы 5 мин.

В итоге проведенного исследования предложена методика препаративного выделения чистого дигиланида С, отвечающего требованиям целанида-стандарта. Она заключается в следующем: сухой остаток после отгонки растворителя (последняя операция при экстрагировании) растворяют в смеси СН2О2 (80) - СН3ОН (18) - Н2О (2) и вводят в колонку, заполненную силикагелем Ь 40/100. Собирают фракции с N 25-31, которые содержат дигиланиды В, С и Д. Растворитель отгоняют на роторном испарителе до объема примерно 1 мл. Полученный раствор суммы дигиланидов вводят в колонку, у которой длина, диаметр и заполнение такое же, как у колонки, на которой проводили первое хроматографирование. При тех же условиях проводят второе хроматографирование и отбирают фракции с N 37-41. Растворитель отгоняют досуха, получают порошок белого цвета.

Подлинность полученного соединения доказана ИК-спектрами, на которых полосы поглощения выделенного дигиланида С и целанида-стандарта совпадают в интервале 400 см"1 - 4000 см"'. Анализ на присутствие других гликозидов и посторонних органических соединений проводили методом тонкослойной хроматографии. При анализе на присутствие других гликозидов пластинку со стандартом и полученным дигиланидом С проявляли нагреванием в сушильном шкафу при 120°С. При рассмотрении пластинки в УФ-свете на хроматограмме целанида-стандарта обнаруживается слабо флуоресцирующее пятно дигиланида Д, • в

Таблица 2.

Влияние различных факторов на степень очистки экстракта методом _жидкостной колоночной хроматографии._

Марка Масса Диаметр Объем Номер Состав фракций после

силика- силика- колонки, пробы, фрак- очистки экстракта.

геля. геля, г см. мл. ции

КСК 16 1.0 2.2, 1-18 дигиланидов нет

(0.16- 21-25 дигиланиды А, В

0.25) 26-32 дигиланиды В, С, Д

2.5 1-17 дигиланидов нет

18-24 дигиланиды А, В и С

25-31 дигиланиды А, В, С, Д

Ь 13 1.0 2.2 1-16 дигиланидов нет

40/100 17-21 дигиланид А, следы В

22-24 дигиланид В

25-31 дигиланид С, следы В,Д

2.5 1-15 дигиланидов нет

16-20 дигиланид А, В

21-23 дигиланид В

24-30 дигиланид С, В, Д

то время как на хроматограмме выделенного дигиланида С дополнительные пятна не обнаруживаются. При анализе на присутствие посторонних органических соединений пластинку опрыскивали известным реагентом на органические соединения: 35% водным раствором Ь^С^ в смеси с 0.5% раствором анисового альдегида. Пластинку нагревали в сушильном шкафу при 120°С. На хроматограмме выделенного дигиланида С не были обнаружены другие пятна, кроме дигиланида С. Чистота выделенного дигиланида С составляет 98.6±0.5%.

Таблица 3.

Влияние различных факторов на степень разделения дигиланидов _методом жидкостной колоночной хроматографии._

Марка Масса Диаметр Объем Номер Состав фракций после

силика- силика- колонки, пробы, фрак- разделения

геля. геля, г см. мл. ции дигиланидов.

КСК 13 1.0 2.2 33-37 дигиланид В

(0.16- 38-41 дигиланиды В, С

0.25) 2.5 32-36 дигиланид В, следы А

37-40 дигиланиды В, С

16 1.0 2.2 34-38 дигиланид В

39-42 дигиланид С, следы В

2.5 33-37 дигиланид В

38-41 дигиланиды В, С

I. 10 0.5 2.2 31-35 дигиланид В, следы С

40/100 36-39 дигиланид С

2.5 30-34 дигиланид В

35-38 дигиланид С, следы В

13 1.0 2.2 31-36 дигиланид В

37-41 дигиланид С

2.5 30-35 дигиланид В

36-39 дигиланид С, следы В

Содержание дигиланида С после очистки и разделения по сравнению с исходным содержанием дигиланида С в сырье составляет 83±5%. В известных регламентах химико-фармацевтических заводов выход готового продукта от содержания дигиланида С в сырье составляет 40.8-41.4%. Получаемый дигиланид С-фабрикат содержит 91.6% основного вещества. Следовательно, выделенный дигиланид С может использоваться в качестве целанида-стандарта в лабораторных условиях. Методы экстракции и

препаративного выделения дигиланида С апробированы и внедрены на кафедрах фармакогнозии и ботаники Украинской фармацевтической академии и в ОТК Чимкентского химико-фармацевтического завода.

ВЫВОДЫ.

1. Изучены методом растворимости реакции комплексообразования дигиланида С с ионами Са^ +, Мд2 +, Си2 +, рь2 +, Ц + в метаноле и 20% водном растворе метанола при 20°С. Установлено, что во всех системах, кроме системы с 1л +, возрастает растворимость дигиланида С в среднем в 1.4 раза. По данным растворимости установлено образование комплексов:

в метаноле: ДигМд^ +, ДигСа2^ , ДигО^ +; в 20% метаноле: ДигМдз^ , ДигСа^ +, ДигСиз® +, ДигРЬ.48 +. Растворимость дигиланида С в присутствии 1лС1 плавно уменьшается до постоянного значения, что связано либо с высаливанием дигиланида С, либо с образованием нерастворимого комплекса.

2. Потенциометрическим методом определены константы устойчивости комплексов дигиланида С с ионами Са2 + , Мд2+ и Сц2+ в 10% и 20% водных растворах метанола, а также в 20% водном растворе этаноле. По устойчивости образующихся с дигиланидом С комплексов ионы распологаются в следующей последовательности: Са^ + >Си^ + >Мд2 +. Поскольку с ионом Са2+ дигиланид С образует наиболее устойчивый комплекс в 20% метаноле и СаС12 является дешевым реактивом, был предложен в качестве комплексующего экстрагента раствор СаС12 в 20% СН3ОН для извлечения дигиланидов из листьев наперстянки шерстистой.

3. Методом растворимости изучен процесс комплексообразования дигиланида С с р-циклодекстрином в воде при 20°С. Установлено, что в результате комплексообразования растворимость дигиланида С увеличивается в 77 раз. По данным растворимости рассчитан стехиометрический состав соединения включения, дигиланид С взаимодействует с р-циклодексгрином в молярном соотношении 1:4.

Рассчитана общая константа устойчивости комплекса, она равна К = (3.5±0.2)-103 л/моль.

4. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии исследован процесс комплексообразования дигиланида С с р-циклодекстрином в твердой фазе. Установлено, что в твердой фазе, как и в растворе, образуется соединение включения дигиланнд С - р-циклодекстрин в молярном соотношении 1:4. Соединение включения можно получать путем сливания растворов дигиланида С и р-циклодекстрина с последующей отгонкой растворителя или механическим смешением компонентов в соотношении 1:4.

5. Образование соединения включения дигиланида С с р-циклодекстрином подтверждено методом тонкослойной хроматографии. Значение соединения включения увеличивается по сравнению с !<,[ дигиланида С в 1.6 раза.

6. Изучена скорость растворения дигиланида С в виде комплекса включения с р-циклодекстрином в воде при 37°С. Установлено, что максимальная концентрация дигиланида С при растворении соединения включения в 57 раз выше чем концентрация несвязанного дигиланида С и достигается в 2 раза быстрее. Обнаружено, что лучше всего получать соединение включения днгиланид С - р-циклодекстрин, мехашгческим смешением компонентов, в соотношении 1:4.

7. Проведена сравнительная оценка гидролиза дигиланида С в свободном виде и в виде соединения включения в солянокислой среде (рН = 2) при 37°С. Выяснено, что степень гидролиза и константа сдорости гидролиза дигиланида С в виде соединения включения с р-циклодекстрином ниже в 1.7 и 3 раза соответственно. Значения констант скорости гидролиза дигиланида С и дигиланида С в виде соединения включения с Р-циклодекстрином равны К = 290+15 л моль" 1 мин" I, К^ = 93+6 л-моль"''Мшг' соответственно.

8. Определена биологическая активность соединения включения дигиланида С с Р-циклодекстрином. Установлено, что комплексообразование с р-циклодекстрином не уменьшает кардиотонический эффект дигиланида С по сравнению с целанидом-стандартом, причем скорость развития эффекта у закомплексованного дигиланида С выше.

9. Впервые предложен новый комплексующий экстрагент для выделения дигиланидов из листьев наперстянки шерстистой (20% раствор СаС12 в 20% водном растворе СН3ОН) и разработана методика экстракции, которая позволяет полностью исключить длительный и трудоемкий процесс очистки экстракта от сопутствующих веществ.

10. Разработан метод препаративного выделения чистого дигиланида С, удовлетворяющего требованиям целанида-стандарта с применением жидкостной колоночной хроматографии. Экспериментально определены оптимальные условия хроматографирования. Методами тонкослойной хроматографии и ИК-спектроскопии доказана подлинность полученного соединения и отсутствие посторонних гликозидов и органических соединений.

Основные положения диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Евстратова К.И., Сташуленок В.К., Ильяш О.Ю. / Влияние комплексообразования с р-циклодекстршюм на физико-химические свойства дигиланида С. // Прикладная химия. 1994. Т 67. В 4. С. 682-684.

2. Евстратова К.И., Сташуленок В.К., Ильяш О.Ю. / Исследование комплексообразования дигиланида С с ионами кальция, магния, меди в водно-спиртовых растворах. // Общая химия. 1994. Т 64. В 8. С. 1298-1300.

3. Ильяш О.Ю., Евстратова К.И., Сташуленок В.К., Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е. / Влияние комплексообразования с р-циклодекстрипом на растворимость, гидролиз и биологическую активность дигиланида С. //

Химия и технология лекарственных веществ. Тез. докл. Всероссийской конференции. - С. Петербург.: 1994. - С. 14.

4. Ильяш О.Ю., Евстратова К.И., Сташуленок В.К. / Новый экстрагент для извлечения дигиланидов из листьев наперстянки шерстистой. // Химия и технология лекарственных веществ. Тез. докл. Всероссийской конференции. - С. Петербург.: 1994. - С. 101.