Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование по использованию хроматографических методов для контроля качества и стандартизации целанида в стандартном образце, субстанции, сырье и лекарственных формах

На правах рукописи

Смирнова Татьяна Васильевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЦЕЛАНИДА В СТАНДАРТНОМ ОБРАЗЦЕ, СУБСТАНЦИИ, СЫРЬЕ II ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ

15.00.02-фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва 1999

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте фармации Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

профессор Д.М.Попов

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, старший научный сотрудник

кандидат фармацевтических наук, доцент

З.П.Костенникова

Н.П. Садчикова

Ведущая организация:

Рязанский государственный медицинский университет им.И.П. Павлова

Защита состоится « » _ 1999 г

в 'т часов на заседании Диссертационного Совета Д 074.28.01 при Научно-исследовательском институте фармации МЗ РФ ( 117418, Москва, Нахимовский проспект,45)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института фармации Министерства здравоохранения Российской Федерации Автореферат разослан «С-** л 1999 г

Учёный секретарь

Диссертационного совета Д.074.28.01, Кандидат фармацевтических наук,

старший научный сотрудник Л.М.Боброва

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сердечные гликозиды, в том числе лекарственные средства , получаемые из наперстянки шерстистой в виде индивидуальных гликозидов: целанид, дигоксин, дигитоксин и суммы гликозидов (лантозид), на сегодняшний день, продолжают сохранять терапевтическую ценность в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Причем потребность в данных лекарственных средствах растет с каждым годом. Если в 1998 г потребность по Российской Федерации составляла в тыс.упак.: в таблетках целанида 2163,427, в растворах для инъекций 67,766, то в 1999 г было заявлено в тыс.упак.: 2314,444 для таблеток, и 92,922 для инъекционных растворов.

Офииинальными методами оценки качества препаратов содержащих сердечные гликозиды, в России, в основном остаются биологические методы. В зарубежных фармакопеях для стандартизации препаратов сердечных гликозидов используют: для количественного определения фотометрический метод, основанный на измерении оптической плотности продуктов реакции сердечных гликозидов с натрия пикратом; для определения чистоты - метод хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ). Для оценки качества сырья и препаратов наперстянки шерстистой были предложены и другие физико-химические методы, в том числе высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Следует, однако, отметить, что многие попытки внедрить эти методы для стандартизации и контроля качества препаратов, сердечных гликозидов заканчивались неудачей, в основном из-за отсутствия корреляции при сопоставлении результатов испытаний с биологической активностью. Даже метод ВЭЖХ не нашел применения в анализе препаратов целанида (таблетках, растворе) и сырье наперстянки шерстистой, т.к. нет методик, дающих достоверные результаты. Предлагаемые разными исследователями хроматорафические условия проведения анализа не дают хорошего разрешения пика целевого вещества и сопутствующих. При работе с сырьем требуется длительная, многостадийная очистка извлечения от

сопутствующих веществ. Все это вносит дополнительный вклад в ошибку определения.

Учитывая вышеизложенное, исследования по использованию хроматографических методов для контроля качества и стандартизации целанида в стандартном образце, субстанции, сырье и лекарственных формах является актуальной задачей.

Цель настоящего исследования заключалась в исследовании по использованию хроматографических методов для идентификации, определения чистоты и количественного содержания целанида; разработке методик его анализа в стандартном образце, субстанции, лекарственных формах (таблетки) и сырье наперстянки шерстистой.

Постановка задач и выбор средств для ее решения

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:'

1. Изучить поведение СГ при хроматографии на сорбентах различной полярности в разных условиях методами ВЭЖХ и хроматографии в тонком слое сорбента.'

- 2.Подобрать условия и разработать методики идентификации целанида и определения примесей. Рассмотреть возможность использования их для анализа субстанции, стандартного образца, таблеток.

" 3.Провести исследования возможности использования метода ВЭЖХ для определения однородности дозирования целанида и высвобождения его из таблеток. Разработать соответствующие методики.

4.Исследовать зависимости извлечения сердечных гликозидов наперстянки шерстистой от вида экстрагента, степени измельченности сырья, соотношения сырья и экстрагента, времени и температуры процесса экстрации.

5.Изучить возможность использования метода ВЭЖХ для установления сроков годности целанида в стандартном образце, субстанции и таблетках.

6.Провести сравнение разработанных методик стандартизации целанида с методиками нормативной документации.

7.Подготовить нормативную документацию на стандартный образец, субстанцию, таблетки целанида с включением разработанных методик.

Научная новизна. Исходя из особенностей хроматографического поведения сердечных гликозидов наперстянки шерстистой на сорбентах различной полярности и используя методы ВЭЖХ и ТСХ, оптимизированы условия идентификации и количественного определения целанида при анализе стандартного образца, субстанции и таблеток, явившихся основой для разработки соответствующих методик, дающих сопоставимые результаты с биологическим официнальным методом.

Учитывая физико-химические особенности сердечных гликозидов (размеры молекулы, полярность, растворимость, и др.) определена возможность использования для очистки извлечения из сырья наперстянки шерстистой гельпроникающей хроматографии, позволяющей исключить длительный многостадийный процесс постадийного уменьшения сопутствующих веществ, применяемый в настоящее время.

На основе исследования адсорбции соизвлекаемых с сердечными гликозидами веществ, подобраны условия использования для очистки извлечения из растительного сырья концентрирующих патронов типа «Диапак», для последующего количественного определения целанида методом ВЭЖХ.

В процессе изучения хроматографического поведения сердечных гликозидов наперстянки шерстистой, содержащихся в извлечении из растительного сырья, установлена возможность использования градиентного элюирования для количественного определения индивидуальных гликозидов, подобран режим хроматографирования.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

-методики качественного и количественного определения целанида в стандартном образце целанида (Проект ФС "Целанид стандартный образец" Письмо Фармакопейного комитета № 29-251/2568 от 07.07.99);

-методики качественного и количественного определения целанида в субстанции (Проект ФС "Целанид " Письмо Фармакопейного комитета № 29-251/2568 от 07.07.99);

-методики идентификации, определения чистоты, количественного определения , однородности дозирования, высвобождения целанида в таблетках (Проект ФС "Таблетки целанида 0,00025г " Письмо Фармакопейного комитета № 29-251/2568 от 07.07.99).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных статей.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на I, II и III научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов "Современные проблемы фармации", посвященные памяти М.Т.Алюшина (Москва, 1996,1997,1998гг), IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство " ( 18-22 апреля 1997 г), на V Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство " (21-25 апреля 1998 г).

Связь задач исследования с проблемным планом института

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом НИИ Фармации "Разработка и усовершенствование методик анализа сырья и препаратов, содержащих витамины, гликозиды, иридоиды и флавоноиды"(номер государственной регистрации 01.9.70.001594.), тематикой проблемной комиссии по фармации № 36.08 РАМН, МЗ РФ

На защиту выносятся:

-методики идентификации целанида и определения чистоты в стандартном образце, субстанции и таблетках с использованием методов ВЭЖХ и хроматографии в тонком слое сорбента;

-методики количественного определения целанида в стандартном образце, субстанции, таблетках и сырье наперстянки шерстистой с использованием метода ВЭЖХ;

-методики определения однородности дозирования и высвобождена целанида из таблеток методом ВЭЖХ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литература, трех экспериментальных глав, общих выводов, списка литературы включающего 175 источников. Экспериментальные данные сведены в 30 табл. Работа иллюстрирована 32 рис.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основе анализа литературных источников дается характеристика сердечных гликозидов, их роль и место в современной фармакотерапии, проанализированы методы, используемые в анализе.

Вторая глава посвящена разработке методик идентификации, определения чистоты и количественного определения целанида в стандартном образце и субстанции методами ВЭЖХ и ТСХ на пластинах с обращенно-фазным сорбентом.

В третьей главе даны результаты исследования по подбору условий и разработке методик идентификации методом ТСХ и количественного определения целанида в таблетках с использованием ВЭЖХ , а так же результаты исследований по разработке методик количественного определения целанида в одной таблетке и высвобождения.

В четвертой главе приведены результаты исследования по использованию метода ВЭЖХ для контроля качества и стандартизации растительного сырья наперстянки шерстистой.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, на рисунках, выражены в соответствующих формулах, которые приведены в тексте диссертации.

Содержание работы Использование хроматографических методов для идентификации, определения чистоты и количественного анализа целаннда

Многие физико-химические и биологические методы анализа лекарственных средств связаны со сравнительной оценкой испытуемой пробы по отношению к веществам, химический состав или активность которых установлены, имеющие квалификацию «стандартные образцы». К чистоте веществ-стандартов предъявляются особо жесткие требования. Для их контроля используют тайге методы анализа, как определение температуры плавления, величины удельного вращения (поляриметрия), спектрофотометрия в УФ- и ИК- областях спектра. Наличие и идентификация примесей чаще всего проводиться методом ТСХ. В настоящее время, все большую популярность приобретает метод ВЭЖХ, т.к. позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ основного вещества и примесей одновременно.

По существующей НД подлинность целанида контролируется с помощью качественных реакций: с натрия нитропруссидом в щелочной среде на а,р-ненасыщенное лактонное кольцо и с железа окисного хлоридом в кислой среде на дезоксисахара. При исследовании цветных реакций было установлено, что с их помощью невозможно определить конкретный сердечный гликозид в присутствии родственных и сопутствующих гликозидов, а также продуктов их деструкции.

Примеси в стандартном образце и субстанции целанида определяются методом ТСХ в слое силикагеля на пластинах приготовленных вручную.

Процесс трудоемкий, требует определенных навыков в работе, занимает много времени.

Количественное определение целанида проводится фотоколориметриметрическим методом по реакции с натрия пикратом. Этот метод не дает достоверных данных, т.к. результаты не всегда согласуются с данными биологической активности.

В связи с изложенным выше, целью данной работы заключалась в оценки методов используемых для идентификации, определения чистоты и количественного содержания целанида, разработке методики с использованием современных методов анализа с включением их в проект переработанной НД.

Характеристика "зона адсорбции", как известно, является специфичной для веществ в определенных стандартизованных условиях и может служить для их идентификации. По интенсивности флюоресценции зон на хроматограмме веществ можно, так же сравнительно оценить количество вещества "более" или "менее" его, чем на хроматограмме раствора стандарта в сравнении с зонами примесей.

Исследования проводились на хроматографических пластинах как с обычными фазами, так и модифицированными (-СН2)Х группами разных производителей на модельной смеси, возможных сопутствующих целаниду сердечных гликозидов наперстянки шерстистой. Результаты представлены в табл.1

Таблица 1

Результаты испытаний тонкослойных пйастин с полярными и неполярными фазами

Название, ЮБе^иг Сорбфил ИР 8 ЯР 18

фирма ^"254 1^254 ПТСХ-П-А-УФ (Мерк, (Мерк,

произво- (Мерк, "Кавалиер" "Сорбполимер" Германия) Германия)

дитель Германия) Чехия Россия

"1 2 3 4 5 6

Система хлороформ хлороформ хлороформ- метанол- метанол-

элюирования -метанол- -метанол- метанол-вода вода вода

вода вода 84:15:1 9:1 9:1

75:24:1 84:15:1

1 1 2 1 3-1 4 1 5 1 6

ЯГА* 0,93 0,33 0,21 0,75 0,58

я® 0,90 0,25 0,18 0,82 0,67

К-гс 0,86 0,21 0,16 0,90 0,75

Яго 0,85 0,20 0,15 0,96 0,79

Чувствительность (по целаниду),

мкг_ОД_ОЛ_ОД_ОДМ_0,04

*11гА -Ланатозид. А; Ящ-ланатозид В; Кгс-целанид; Ят-ланатозид О Из представленных данных табл.1 видно, что лучшее разделение смеси

ланатозидов достигнуто при использовании пластин ЯР 18. Обращеннофазные

пластины дают более воспроизводимые результаты (отклонение в Я г от

среднего результата ±0,02), практически не дают "краевого эффекта",

обладают более высокой чувствительностью, не требуют предварительного

импрегнирования неподвижной фазы в отличие от пластин для нормально-

фазовой хроматографии.

Все вышесказанное, позволяет заключить, что оптимальными для

определения подлинности и посторонних примесей в целаниде, являются

пластины ЯР-18 размером 10 х 20 см. При проведении элюирования в системе

метанол/вода в соотношении 9:1. Проявляли смесью : 25% раствора

трихлоруксусной кислоты и 3% хлорамина в соотношении 4:1 с нагреванием

при температуре 100°С в течение 10 мин. Просматривают в

ультрафиолетовом свете при длине волны 366 нм. Гликозиды

идентифицируют по Я г и индивидуальной флюоресценции (целанид-голубая,

ланатозид А-желтая, ланатозид В зелено-голубая, ланатозид Д-темно-желтая).

На основе полученных данных, разработаны 'методики определения

подлинности и чистоты целанида в стандартном образце и субстанции

целанида.

. Во всех исследованных сериях целанида примеси не превышают 3% для субстанции целанида и 2% для стандартного образца.

На следующем этапе подбирались условия для анализа целанида методом ВЭЖХ. Были проведены исследования по подбору сорбентов, элюирующих систем, условий хроматографирования. Оптимальное

разделение было получено при использовании: колонки размером 150x3,0 мм с Нуклеосил С-18, размером частиц 5 мкм. Элюирующая система: метанол/ацетонитрил /вода(12/52/36). Скорость подачи элюента - 1 мл/мин. Детектирование при 220 нм. Были получены следующие времена удерживания, мин: ланатозид А -4,9; ланатозида В-2,7; ланатозида С-1,4; ланатозид 0-0,8. Рис.1

Хроматограмма модельной смеси раствора ланатозидов А,В,С,Б

1-ланатозида Д; 2- ланатозида С; 3- ланатозида В; 4- ланатозид А.

Рис.1

Полученные результаты были использованы при составлении методики для определения подлинности и чистоты целанида-рубстанции и целанида стандартного образца, а также для разработки методики количественного определения.

Суммарная площадь пиков родственных соединений при анализе методами ВЭЖХ и ТСХ не превышает в субстанции целанида 3%, в стандартном образце 2%, что удовлетворяет требованиям нормативной документации.

Разработанные методики были апробированы на 5 образцах стандартного образца и субстанции целанида. Полученные результаты количественного определения целанида субстанции представлены в табл.2

Таблица 2

Метрологическая характеристика методики количественного определения целанида в субстанции

Дата анализа Серия Взято целанида,г Найдено целанида 8 ; Д; Е,%

х, г х,%

30.09.97 10294 0,0250 0,0244 97,63 0,3630 ±2,26 ±2,31

30.09.97 10494 0,0248 0,0246 99,36 0,4550 ±2,82 ±2,84

30.09.97 10194 0,0253 0,0252 99,53 0,2742 ±1,70 ±1,71

30.09.97 10996 0,0246 0,0242 98,35 0,4015 ±2,25 ±2,54

30.09.97 20996 0,0245 0,0247 100,66 0,6664 ±2,82 ±2,80

Из табл. 2 следует, что с помощью метода ВЭЖХ можно определять

цела'нид в субстанции с относительной ошибкой определения не превышающей ± 3% при доверительной вероятности 0,95.

Результаты, полученные по разработанной методике, были сопоставлены с результатами количественного определения фотометрическим методом и данными, полученными при определении биологической активности. Табл.3

Таблица 3

Сравнительные результаты анализа целанида методами ВЭЖХ, фотометрическим и биологическим

Серия Найдено целанида,%

препарата Методом ВЭЖХ Фотометрическим Биологическим

методом методом

ЛЕД/1г | %

10294 97,63 98,12 14600 97,33

10494 99,36 99,97 14800 98,67

10194 99,53 99,69 14800 98,67

10997 98,35 99,03 14800 98,67

20997 100,66 101,10 15100 100,67

Как видно из табл.3, результаты, полученные методом ВЭЖХ ближе к данным биологического определения. Результаты фотоколориметрического метода несколько завышены.

Аналогичные результаты получены при анализе стандартного образца.

В отличие от субстанции целанида и стандартного образца, исследование таблеток целанида представляется более объемным и сложным. Во-первых, целанид в таблетку входит в очень малых количествах, и каждая таблетка содержит большое количество наполнителей. Во- вторых, согласно общей статье "Таблетки" ГФ XI издания в таблетках дополнительно определяется растворение и точность дозирования.

Для количественного определения целанида в таблетках использовали условия хроматографирования, предложенные для количественного определения целанида в субстанции.

При составлении методики были подобраны количественные соотношения навески и растворителя, проведены исследования полноты извлечения целанида от времени.

При однократной экстракции 8 мл спирта метилового и концентрации целанида в пробе 0,005г, извлечение происходит полностью в течение 15мин.

Полученные данные были использованы при составлении методик количественного определения.

Предлагаемые методики разрабатывались на модельных образцах таблеточных масс.

Результаты, полученные для методики количественного определения целанида в таблетках 5 образцов в 10 повторностях, представлены в табл.4

Таблица 4

Результаты количественного определения целанида в модельных образцах таблеточных масс методом ВЭЖХ

Номер Навеска Взято Метрологическая характеристика

образца препарата, г целанида в расчете на 1табл., мг Найдено целанида, мг( х) S ; Д;

1 2,0950 0,243 0,245 8,9* 10*7 +6,5* 10"6 ±3,63

2 2,0210 0,247 0,244 7,9*10"7 ±5,2* Ю-6 ±3,07

3 1,9860 0,250 0,252 8,1* 10"7 ±4,8*10'6 ±2,75

4 1,9790 0,253 0,257 8,6*10'7 ±5,5* 10"6 ±3,12

5 2,0105 0,245 0,241 8,4*10'7 ±6,0* 10"6 ±3,71

Как следует из таблицы 4, с помощью метода ВЭЖХ можно

количественно определять целанид в таблетках с относительной ошибкой определения не превышающей ±4% при доверительной вероятности 95%.

Промышленные образцы таблеток целанида были проанализированы как методом ВЭЖХ, так и методами фотоколориметрии и биологическим. Полученные результаты представлены в табл.5

Таблица 5

Результаты анализа промышленных образцов таблеток целанида методом ВЭЖХ, фотометрическим и биологическим

Серия Найдено целанида,мг/1 табл.

препарата Методом Фотометрическим Биологическим методом

ВЭЖХ методом, ЛЕД/1 табл. В пересчете на 1 табл., мг

1 2 3 4 5

260597 0,247 0,250 3,90 0,245

250597 0,227 0,239 3,85 0,240

330897 0,239 0,254 4,00 0,250

360897 0,237 0,251 3,85 0,240

701097 0,250 0,251 4,00 0,250

1 I 2 [ 3 I 4 | 5

10998 0,232 0,245 3,60 0,225

20998 0,227 0,237 3,60 0,225

40998 0,244 0,250 4,00 0,250

50998 0,239 0,247 3,60 0,225

90998 0,230 0,248 3,60 0,225

Как показано в табл.5 все методы дают сравнимые результаты, однако, данные фотометрического метода имеют тенденцию к завышению.

Как было выяснено в процессе работы, методом ВЭЖХ можно проводить анализ целанида с высокой точностью и чувствительность. В связи с этим, были разработаны методики однородности дозирования и растворения целанида в таблетках с использованием данного метода.

Воспроизводимость методики количественного определения целанида в одной таблетке в 10 последовательностях, рассчитанная с доверительной вероятностью 95%, представлена в табл.6

Таблица 6

Метрологическая характеристика методики однородности дозирования целанида

{ X 8 8 х Дх Ах е Е

9 0,000251 2,2*10"6 2,9*10"' +2,9*10"6 ±6,6*10"6 ±4,31 ±1,03

Как следует из табл.6 количественный анализ целанида в одной таблетке можно проводить с относительной ошибкой определения не превышающей ±5%.

Испытания однородности дозирования по предлагаемой методике проведены в соответствии с ГФ XI изд., вып. 2, стр. 156 на 20 таблетках серии 330897 производства Опытного завода ГНЦЛС, Украина и представлены в табл.7

Таблица 7

Показатели однородности дозирования цеданида в таблетках

Содержание Содержание целанида в Отклонение от среднего

целанида одной таблетке, содержания

г г г | %

0,000254 0,000239 0,000015 -5,91

0,000246 0,000008 -3,15 0,000254

0,000241 0,000013 -5,12

0,000267 0,000013 +5,12

0,000279 0,000025 +9,84

0,000227 0,000027 -10,63

0,000283 0,000029 +11,42

0,000219 0,000035 -13,78

0,000274 0,000020 +7,87

0,000232 0,000022 -8,66

0,000250 0,000004 -1,57

0,000226 0,000028 -11,02

0,000248 0,000006 -2,36

0,000221 0,000033 -12,99

0,000276 0,000022 +8,66

0,000217 0,000037 -14,57

0,000262 0,000008 +3,15

0,000255 0,000001 +0,40

0,000243 0,000011 -4,33

Из табл.7 видно, что содержание целанида в 20 таблетках одной серии, не отклоняется от среднего содержания более чем на +15%, что удовлетворяет требованиям ГФ XI.

Была так же разработана методика определения высвобождения целанида из таблеток.

Испытание на растворение проводилось согласно ГФ XI изд., вып. 2, стр. 156, Приложение 4. с использованием прибора типа "Вращающаяся корзинка". Было определено, что оптимальное соотношение количества таблеток к объему среды растворения - 2 таблетки в 500 мл воды. Стандартная скорость вращения 100 об/мин. Температура термостата 37+1°С.

Как видно из графика, количество целанида, перешедшее в раствор через 30 и 45 минут отличается не более 5% и значительно превышает

необходимые 75%, следовательно, время растворения можно ограничить

30 мин.

По результатам проведенных исследований была разработана методика, метрологические характеристики которой преведены в табл.8

Таблица 8

Метрологическая характеристика методики "Растворение"

Г X Б 8 ; Дх Д ; Е Е

9 0,000247 7,4*10"6 2,3*10"7 ±1,7*10'6 ±5,3*10"6 +5,78 +2,65

Как видно из табл.8, относительная погрешность определения, рассчитанная с доверительной вероятностью 95% не превышает 5,8 %.

В связи с истечением срока действия ФС 42-2260-84 на целанид-стандартный образец, ФС 42-2261-84 на целанид субстанцию, ФС 42-2384-85 на таблетки целанида 0,00025 г, были разработаны проекты новой нормативной документации с включением разработанных методик. Документы находятся на рассмотрении в Фармакопейном комитете.

Применение методов ТСХ и ВЭЖХ для анализа сырья наперстянки шерстистой

Источником получения целанида, дигоксина и сложного препарата лантозид является наперстянка шерстистая. Наперстянка шерстистая отличается сложным и изменчивым химическим составом. Содержание целевых компонентов в сырье, колеблется в пределах 0,03-0,6% в зависимости от генетических факторов, условий выращивания, переработки, хранения.

В НД на лист наперстянки шерстистой предусмотрено разделение частично очищенной суммы гликозидов методом бумажной хроматографии с последующим определением фотоколориметрическим методом по реакции с ксантгидролом. В настоящее время, с развитием инструментальной аналитической химии, является нецелесообразным использование этого трудоемкого, длительного, не всегда воспроизводимого метода. Наиболее селективными методами являются ТСХ и ВЭЖХ, которые позволяют

определять основные компоненты в присутствии продуктов их деструкции и сопутствующих соединений.

В связи с этим на следующем этапе были подобраны условия и разработаны методики идентификации и количественного определения целанида в сырье наперстянки шерстистой.

Для подбора сорбентов была приготовлена модельная смесь сердечных глнкозидов наперстянки шерстистой следующего состава: Ланатозиды А, В, С(целанид), дигоксин и дигитоксин, с концентрацией в смеси каждого компонента 0,1 мг/мл.

Подобраны условия для разделения модельной смеси растворов СГ наперстянки на пластинах с неполярным сорбентом, получено хорошее разрешение с дискретностью - 0,1. Однако, при получении хроматограмм очищенных извлечений из сырья по методике нормативной документации, цветные' зоны сопутствующих веществ накладываются на целевые зоны гликозидов, что мешает четкому детектированию. При проведении очистки на концентрирующих патронах с "Диапак С8", "Диапак С16", целевые зоны достаточно различимы для идентификации. Однако, при сравнения ТСХ пластин разной полярности, показано, что применение пластин с немодифицированным слоем силикагеля более оправдано, так как требует менее дорогостоящей пробоподготовки с удовлетворительными результатами. Рис.2

Схема хромагограмм модельной смеси сердечных гликозидов и извлечения из сырья наперстянки шерстистой на пластинах с полярным сорбентом "Силуфол" "Кизельгель"

Система растворителей: хлороформ/метанол/вода в соотношении 85/14/1 Растворы СГ, Яг около: Ланатозида А (0,33); 2-ланатозида В (0,25);3-ланатозида С (0,21); 4-дигоксина (0,36); 5- дигитоксин (0,47);6- модельной смеси СГ 7-извлечение из сырья наперстянки шерстистой.

Система растворителей: хлороформ/метанол/вода в соотношении 85/14/1. Растворы СГ Дг около: Ланатозида А (0,24); 2- ланатозида В (0,19);3- ланатозида С (0,16); 4-дигоксина (0,38); 5-Раствор дигитоксин (0,50);6-Раствор

модельной смеси СГ;7-экстракт из сырья наперстянки шерстистой.

Рис.2

Как видно из рис.2, пластины с полярными сорбентами дают достаточное разрешение для идентификации и могут быть использованы для определения подлинности сырья. На основе полученных данных разработана методика идентификации целанида в сырье наперстянки шерстистой на пластинах "Силуфол", "Кизельгель"с элюированием смесью растворителей : хлороформ/метанол/вода в соотношении 85/14/1, используя в качестве проявителя смесь: 25% раствора трихлоруксусной кислоты и 3% хлорамина в

соотношении 4:1 с нагреванием при температуре 100°С в течение 10 мин. Просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм. Гликозиды идентифицируют по и индивидуальной флюоресценции.

При разработке методики количественного определения целанида в сырье наперстянки шерстистой, было доказано, что для более полного извлечения сердечных гликозидов из сырья оптимальным условиями являются: степень измельченности менее 1 мм, при экстракции смесью метанол-хлороформ в соотношении 1/9, соотношение сырье/экстрагент -1/20, при проведении процесса в течение 1,5 часов при температуре 60°С, с перемешиванием.

В настоящее время, для пробоподготовки, широко используются так называемые "концентрирующие" патроны с различными сорбентами. В связи с этим, были проведены исследования по возможности применения для очистки извлечения из сырья наперстянки шерстистой патронов с сорбентами разной полярности. Для этого растительное сырье анализировали с применением очистки на патронах "Диапак". Результаты представлены в табл.9

Таблица 9

Результаты количественного определения ланатозида С методом ВЭЖХ с использованием для очистки патронов "Диапак"

Показатели Марка патрона

"Диаиак С" "Диапак С8" "Диапак С16"

Привитые фазы Si -С8Н15 -С16Н31

Определено

целанида, % 0,037 0,221 0,216

Определено

целанида в сливах с

патронов,% 0,180

Как видно из табл.9, целанид в большом количестве не удерживается

на патроне"Диапак С". Количество удерживаемого целанида составляет лишь

около 20 % по сравнению с полярными сорбентами. Большой разницы в

количестве определяемого целанида по результатам применения патронов

"Диапак С8" и "Диапак С16" не обнаружено. Следовательно, возможно использование патронов обоих марок.

Хроматограмма экстракта, очищенного на патроне "Диапак С8"

1-ланатозид С

Рис.3

При контроле методом "добавок" с раствором целанида 0,2%, было выявлено, что около 3-5% целанида теряется при использовании патронов с обращенно-фазным сорбентом. Следовательно, концентрирующие патроны обеспечивают хорошую очистку от сопутствующих веществ, и не вносят большой погрешности в количественное определение целанида.

Как вариант работы с сырьем был шробован варгшгг очистки методом препаративной хроматографии. Для работы был использован хроматограф "Милихром-4" оборудованный для работы с гельхроматографией. УФ-детектор, настроенный на длину волны 220 нм. Разделение спиртового экстракта из сырья проводилось на биогеле марки "Р-2" производства Bio-Rad Laboratories (USA), подходящий по характеристикам для поставленной задачи. Использовалась предварительно подготовленная колонка размерами 0,45x4,2 см (определенный рабочий объем Vt =2,67 см3), буфер 0,05М NaCl, расход элюирующего растворителя t=llмл/час, объем наносимой пробы ЮОмкл. Для идентификационного определения были собраны 3 фракции полученные при гельхроматографировании. Фракции проанализированы методом ВЭЖХ. Установлено, что пик целанида, присутствует только в первой фракции.

«

В разработанных условиях было проанализировано несколько образцов сырья наперстянки шерстистой . Результаты представлены в табл.10

Таблица 10

Результаты количественного определения целанида с применением гельхроматографии

. № Место и год сбора Дата Содержание

образца анализа целанида,%

1 ВИЛАР-ЦЕНТР, 1996 г 10.96 0,055

2 Сорт"Спектр",ВИЛАР, 1996 12.97 0,142

3 Сорт"Стандарт",ВИЛАР, 1996 12.97 0,177

4 ВИЛАР-ЦЕНТР, 1997 г 12.97 0,282

Подобранные условия гель-фракционирования с последующим анализом методом ВЭЖХ можно использовать для количественного определения ланатозида С.

При исследовании влияния температуры на хроматографическое разделение, выяснено, что при используемой системе элюирования, применение нагрева до 50°С лишь смещает время выхода пиков и не влияет на разрешение.

По результатам исследований разработана методика идентификации и количественного определения целанида в сырье методом ВЭЖХ.

Воспроизводимость методики проверена на одном образце сырья в 10 повторностях. Результаты представлены в табл.11

Таблица 11

Метрологическая характеристика методики количественного определения целанида

f X Б 8 х Дх Д х е г 1

9 1,32 0,00094 0,00064 ±0,0099 ±0,0031 ±5,64 ±2,12

Используя разработанную методику, были проанализированы 6 образцов растительного сырья разных мест произрастания. Результаты количественного определения целанида по разработанной методике представлены в табл.12.

Таблица 12

Результаты количественного определения целанида в сырье наперстянки шерстистой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

№ Год и место заготовки Дата Содержание

образца анализа целанида,%

1 ВИЛАР-ЦЕНТР, 1996 г 10.96 0,093

2 Северокавказская ЗОС ВИЛАР, 1995 10.96 0,431

3 Заводское сырье Украина, 1995 10.96 0,407

4 Сорт"Спектр",ВИЛАР, 1996 10.97 0,132

5 Сорт"Стандарт",ВИЛАР, 1996 10.97 0,106

6 ВИЛАР-ЦЕНТР, 1997 г 10.97 0,303

Как видно из полученных данных, содержание целанида колеблется от 0,093 до 0,431% (в расчете на абсолютно сухое сырье). Значительная разница наблюдается как в образцах разных мест произрастания, так и одного места сбора в разные годы.

Таким образом, в результате проведенных исследований. Были разработаны методики идентификации сердечных гликозидов в сырье наперстянки шерстистой методом хроматографии в тонком слое сорбента и количественного определения целанида методом ВЭЖХ. Разработанные методики могут быть рекомендованы для включения в НД и использованы для анализа сырья наперстянки шерстистой в контрольно-аналитических лабораториях.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны оптимальные условия хроматографического разделения гликозидов наперстянки шерстистой методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках с обращенной фазой RP-18; разработаны методики идентификации и определения чистоты целанида в стандартном образце, субстанции и таблетках. Система растворителей метанол/вода (9:1). Смесь для проявления: 25% раствора кислоты трихлоруксусной с 3% хлорамина, в соотношении 4/3.

2. Методом ВЭЖХ разработаны методики идентификации и определения примесей в стандартном образце, субстанции и таблетках целанида. Показана возможность применения данного метода, как для идентификации примесей, так и для установления количественного содержания.

3. Разработана методика количественного определения целанида в стандартном образце и субстанции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке размером 150 х Змм, заполненной октадецилсшшкагелем типа Нуклеосил С-18, размером частиц 5 мкм, подвижной фазой ацетонитрил/метанол/вода (12:52:36) при температуре 25° С, расход подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование при длине волны 220 нм.

4. Показано, что разработанные для анализа целанида в субстанции условия хроматографирования, могут быть использованы для количественного определения целанида в таблетках. Относительная ошибка методики количественного определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает + 4%.

5. Разработана методика для определения однородности дозирования целанида в таблетках с использованием метода ВЭЖХ, показана перспективность ее использования для определения малых количеств целанида в одной таблетке. Разработана методика определения растворения целанида в таблетках. Установлено, что время для

определения растворения можно ограничить 30 мин, нормировать количество целанида перешедшего в раствор не менее 75%.

6. Изучены и оптимизированы условия извлечения из сырья наперстянки шерстистой и его очистки. Оптимальными являются: степень измельченности менее 1 мм, при экстракции смесью метанол-хлороформ (1:9), соотношение сырье/экстрагент - 1/20, при проведении процесса в течение 1,5 часов при температуре 60°С, с перемешиванием и очистке извлечения на патронах «Диапак С8».

7. С учетом особенностей хроматографического поведения индивидуальных гликозидов , разработана методика определения ланатозида С в сырье наперстянки шерстистой методом ВЭЖХ. Методика обеспечивает точность проведения эксперимента с доверительной вероятностью 95% в пределах 6% . Условия хроматографировання: Колонка -250x3мм,Силасорб ЭРЫ С-8, 9мкм, термостатирование при 25°С, система элюирования ацетонитрил/метанол/вода (20:15:65). УФ-детектор с рабочей длиной волны 220 нм.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Смирнова Т.В., Попов Д.М. Количественное определение ланатозида С в листьях наперстянки шерстистой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.-Фармация,№6,1997,с.23-25.

2. Смирнова Т.В. Перспективы использования метода ВЭЖХ для контроля качества и стандартизации растительного сырья наперстянки шерстистой . Труды научной конференции молодых ученых"Соврменные проблемы фармации, деп.ГЦНМБ№Д-25492 от 21.03.97.

3. Пархоменко О.В., Смирнова Т.В., Дементьев С.П., Попов Д.М., Беляков К.В, Колпакова М.В., Приступа Е.А Совершенствование методов анализа лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов,- /Тез.докл. IV Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" 8-12 апреля, М.,1997г.

4. Смирнова Т.В.Современные методы (ВЭЖХ и ВЭТСХ) для контроля качества и стандартизации целанида- субстанции. Труды научной конференции молодых ученых"Соврменные проблемы фармации", деп.ГЦНМБ№ Д-25923 от 08.06.98.

5. Пархоменко О.В., Смирнова Т.В., Дементьев С.П., Попов Д.М. Использование современных методов анализа для стандартизации сердечных гликозидов ландыша, наперстянки. /Тез.докл. V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" 21-25 апреля М.,1998г.

6. Смирнова Т.В., Попов Д.М. Количественное определение ланатозида С и оценка содержания примесей в целаниде субстанции методом ВЭЖХ."Фармацевтическая наука в решении вопросов лекарственного обеспечения",науч.труды T.XXXVII, ч.Н,М.1998,с.79-86.

7. .Смирнова Т.В., Попов Д.М. Сравнительный анализ применения хроматографических пластин с полярным и неполярным тонким слоем при определении посторонних гликозидов в анализе чистоты субстанции целанида. "Фармацевтическая наука в решении вопросов лекарственного обеспечения", науч.труды T.XXXVII, ч.И,М.1998,с.65-69.

8. Смирнова Т.В., Попов Д.М. Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения содержания и однородности дозирования целанида в таблетках "Современные проблемы фармацевтической науки и практики ", науч.труды t.XXXVIII, ч.И,М.1998,с.117-123.

9. Смирнова Т.В. Перспективы использования метода ВЭЖХ для контроля растворения целанида в таблетках. Труды научной конференции молодых ученых "Соврменные проблемы фармации, деп.ГЦНМБЛзД-26231 от 0505.99.

Ю.Попов Д.М., Беляков К.В., Смирнова Т.В и др. Исследование по созданию методик анализа лекарственного сырья и фитопрепаратов. /Тез.докл. VI Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" 19-23 апреля, М.,1998г.

Печатно-мнр/кительное производство МПС Новая Басманная , 6, зак.7^тир.'^~ 99 г.