Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение ликорина гидрохлорида в химико-токсикологическом отношении

В/О СОЮЗФАРМЛЦИЯ ПРИ МИНИСТЕРСТВЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАЦИИ

На правах рукописи

ШУКИР6ЕКОВА Алма Ворамбсковна

УЧЕНИЕ ЛИКОРИНА ГИДРОХЛОРИДА В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ

0.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена в Чимкентском государственном фармаце тическом институте.

Научные руководители:

кандидат фармацевтических наук, профессор Икрамов Л.Т. доктор фармацевтических наук, профессор Ушбаев К. У.

Официальные оппоненты:

,'I/t!'¿ip.-

доктор фармацевтических каук> А. 3.Книжник

Кандидат фармацевтических наук Е.М.Солом&тин

и. May?. (¿1>7р ■

Ведущая организация:

Пятигорский фармацевтический институт

Защита состоится " Ь, " 1991 г. в /У часо

на заседании специализированного совета Д 074.28.01 при Все ном научно-исследовательском институте фармации Минздрава О (Москва, ул.Красикова, 34).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюз научно-исследовательского института фармации по адресу: Мое 117418, ул.Красикова, 34.

Ученый секретарь специализированного совета Д 074.28.01 кандидат фармацевтических наук, ст.науч.

сотр. Л.М.Боброва

Автореферат разослан

199I г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ликорин относится к числу лекарственных препаратов растительного происхождения. Производящим растением являются растения семейства амариллисовых и лилейных.

В медицинской практике нашел широкое применение для лечения острых и хронических воспалительных процессов легких, при бронхиальной астме и других заболеваниях дыхательных путей, как отхаркивающее средство. Передозировка ликорина проявляется токсическим эффектом на организм, несмотря на это, в химико-токсикологическом отношении он не изучен.

Для обнаружения ликорина предложено ограниченное число качественных реакций, отсутствуют высокочувствительные, специфические физико-химические методы, пригодные для идентификации и количественного определения ликорина, выделенного из объекта биологического происхоздения. Отсутствуют данные об экстракции ликорина органическими растворителями, влияние различных факторов на степень экстракции ликорина из водных растворов и биологического материала, а также условия связывания его с белками. Не изучены методы выделения, данные о распределении в органах и в биологических жидкостях, а также о сохраняемости ликорина в биологическом материале при его гниении.

В связи с указанным выше, разработка методов химико-токсикологического исследования ликорина в биологическом материале является одной из актуальных задач современного токсикологического анализа.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований явилась разработка методов химико-токсикологического анализа ликорина и изучение влияния различных факторов

на результаты отдельных этапов химико-токсикологического анализа.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- проанализировать имеющиеся химические и физико-химические методы и предложить наиболее чувствительные и специфические метода идентификации ликорина, пригодные для целей химико-токсикологического анализа;

- разработать современные физико-химические методы (фотометрический и спектрофотометрический методы и метод высокоэффективной жидкостной хроматографии) для количественного определения ликорина, выделенного из объектов биологического происхождения;

- изучить влияние различных факторов на степень экстракции ликорина органическими растворителями;

- обосновать и предложить методы очистки ликорина из вытяжек биологического материала от примесей белковых веществ и продуктов их гнилостного разложения;

- научно обосновать и разработать оптимальный метод выделения ликорина из объектов биологического происхождения;

- исследовать распределение ликорина в органах и биологических жидкостях отравленных животных;

- выявить степень влияния продолжительности хранения ликорина в трупном материале при его гниении.

Научная новизна работы. Для идентификации ликорина в объектах биологического происхождения предложены и научно обоснованы физико-химические методы: хроматография а тонких слоях сорбентов, спектроскопия в УФ-области, высокоэффективная жидкостная хроматография.

На основе предложенных методов и фотометрического метода обоснованы методики количественного определения ликорина, выделенного из объектов биологического происхождения, базирующиеся

на реакции образования ионного ассоциата с бромгимоловым синим и его последующим разрушением 0,1 н. раствором гидроксида натрия.

Обоснованы условия проведения количественного определения ликорина из объектов биологического происхождения метода!® высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофотометрии. Установлено, что спектрофотометрический метод при химико-токсикологическом исследовании ликорина может быть использован только после очистки методом гель-хроматографии вытяжек, полученных из биологического материала от примесей белковых веществ и продуктов их разложения.

Исследовано влияние различных факторов как: природа органических растворителей, значение рН среды, добавление электролитов, нрссгность экстракций на степень экстра.кции ликорина органическими растворителями. Установлено, что лучшим окстрагентом является хлороформ при значении рН 8-10. Природа и количесгзо электролитов при экстракции ликорина хлороформом значительного влияния не оказывает.

Научно обоснован метод выделения ликорина из объектов биологического происхождения, базирующийся на изолировании ликорина 0,02 н. р-ром серной кислоты с применением гель-хроматографии для очистки полученных вытяжек, с помощью которого выявлено количественное распределение и сохраняемость ликорина в различных органах животных.

Практическое значение работы.

Результаты химико-гонсикол.;гического исследования ликорина оформлены в виде информационного письма "Об определении ликорина в биологических объектах", которое находится да: алгсСоД;;:: ьс Всесоюзном научно-исследовательском институте судебно-медицинской экспертизы МЗ СССР(С4.04. Л №2?2/х).Методики, предложенные в информационном письме, внедрены в судебне-химических лабораториях

республиканских бюро судебно-медицинских экспертиз Казахской ССР, Узбекской ССР (акт внедрения от 3.10.90), в областных бюро судебно-медицинской экспертизы Чимкентской области Казахской ССР (акт внедрения от 10.12.1990), Ташкентской области (акт внедрения от 15.10.1990).

На защиту диссертации выносятся результаты следующих экспериментальных исследований и их теоретические обоснования:

- способы обнаружения ликорина в химико-токсикологическом анализе;

- методики количественного определения ликорина;

- методики ввделения ликорина из органов трупов, мочи и крови;

- распределение ликорина в органах животных (собак), отравленных этим препаратом.

Апробация работы. Основные результаты наших исследований по материалам диссертации доложены:

- на заседании общества судебных медиков и химиков в Узбекской ССР (Ташкент, 1987 г.);

- на заседании судебно-химического отделения областного бюро судебно-медицинской экспертизы (Чимкент, 1989 г.);

- на межкафедральном заседании кафедр токсикологической и фармацевтической химии (Ташкент, 1989 г.);

- на научно-практической конференции "Экология и здоровье" (Чимкент, 1990 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических н а -у к. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Чимкентского государственного фармацевтического института (№ государственной регистрации 01827022869) и связана с решением союзной проблемы 48.03 "Фармацевтическая химия" Научного Совета № 48 "Фармация" АМН СССР.

Объем и структура диссертации

«

I Диссертационная работа изложена на 178 страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц, 30 рисунков и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, включающего 187 источников, из которых 58 - работы зарубежных авторов.

Во введении раскрыта актуальность теш, определены цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость полученных результатов.

В первой главе приводится обзор литературы, посвященный современному состоянию анализа ликорина.

Вторая глава посвящена вопросам качественного анализа ликорина гидрохлорида с помощью химических (цветных и микрокристал-лоскопических) реакций, а также физико-химических методов: хроматографии в тонких слоях сорбента, высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектрсфотометрии в У£-области спектра.

В третьей главе приведены результаты исследований по разработке оптимальных условий количественного определения ликорина методами экстракционной фотоколориметрии, спектрофотометр™ в У5-области спектра, высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Последующие главы посвящены разработке методов выделения из биологического материала и биожидкостей способов очистки извлечений от мешающих определению примесей, и определения ликорина в биологическом материале- предложенными методами, а также вопросам распределения ликорина в различных органах и тканях, и сохраняемости в загнившем биалогическом материале.

В химическом отношении ликорин представляет собой 1,2 -дио-кси - 9,10 - метилендиокси - 7Н, 1,2,4,5,12,12а -гексагидропи-рроло /3,2,1 - cL , е/ фенантридина гидрохлорид.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНКЕ PABJM

.. б -

CI6HI7N04HCI Мол.me.323,77

В медицинской практике ликорин применяется как отхаркивающее средство при заболеваниях дыхательных путей.

Идентификация ликорин а. В связи с полным отсутствием систематических исследований в области хикико-токсикологического анализа ликорина, одним из основных этапов работы являлась разработка методов идентификации ликорина, выделенного из объектов биологического происхождения.

Для обнаружения ликорина нами предложены реакции окрашивания: с концентрированной серной кислотой, с реактивом Фреде и с реактивом Эрдмана, а также реакции осавдения с общеалкалоидными реактивами. Предел обнаружения 4,7 мкг ликорина в пробе.

Разработан метод хроматографии в тонких слоях сорбентов. Для исследований нами применялись пластинки: "Силуфол" (ЧНСР), "bctbÁ.L » (СССР), а также стеклянные пластинки с закрепленным слоем марки силикагеля ЛСЛ 5/40 с люминесцентным индикатором (ЧССР). Для хроматографирования использовали системы растворителей: этанол-ацетэн-25^-ный раствор аммиака (50:50:1); н-Бутанол-циклогексак-25& раствор аммиака (20:15:5); хлсроформ-этанол-253-

ный раствор аммиака (80:10:10) и н-Бутанол-гексан-25%-ный раствор аммиака (20:15:5). Проявление пятен ликорина на хроматограм-мах осуществляли в парах йода (зона желтого цвета) или же проводили детектирование в УФ-свете, при этом наблюдали характерное зеленовато-желтое свечение. Этот метод был применен для идентификации ликорина, выделенного из объектов биологического происхождения.

Изучены УФ-спектры ликорина в различных растворителях с целью дальнейшего использования их для идентификации ликорина, выделенного из биологического материала. В качестве растворителей использовали: воду, этиловый спирт, 0,1 н. раствор соляной кислоты и 0,02 н. раствор серной кислоты. Ликорин во всех растворителях имеет по две полосы светопоглощения в области длин волн 236-238 и 287-291 нм. Наиболее интенсивным является максимум светопоглощения этого препарата в воде и 0,02 н. растворе серной кислоты при длинах волн равных 287-291 км.

Нами разработана методика идентификации ликорина с помощь» высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для этой цели были использованы жидкостные хроматографы фирмы «Jelly - И " "

с УФ-спектрофотометрическим детектором на колонках "Сферисорб"и "Силасорб CI8". Обнаружение ликорина в элюатах проводили при длине волны 290 нм.

В качестве элюента или подвижной фазы в первом способе, с применением колонки Сферисорб, 5 им размерами 4,6 х 250 мм выбрали смесь ацегонитрила и 0,025 М боратного буфера (pH 9,2) в соотношении Z : 8. Анализ проводили со скоростью протекания элю-ата 1,5 мл/мин, движение ленты со скоростью 20 см/час. Результаты исследований представлены в таблице I.

Дальнейшее использование метода высокоэффективной жидкост-

Таблица I

Достоверность результатов количественного определения ликорина в сыворотке крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (среднее из 5 измерений)

Добавлено ( ликорина ; Высота \ пика ( найдено ликорина ¡Метрологические ¡характеристики

к I мл сыворотки ( крови 1 мкг \ ММ ( мкг ! % 1 | I \ }

6 22,0 4,98 83,00 X = 80,73

21,8 4,90 81,60 5 . 1,93

20,5 4,75 79,16 5*« 0,87

21,В 4,90 81,60 2,3$

20,0 4,70 78,30 ДХ= 2,4 Ь 2,9%

ной хроматографии в применении к ликорину проводили,как указывалось выше, на хроматографе фирмы на колонке сила-сорб Ст£ 5 мм (Чехословакия). Колонка размерами 25 см х 4,6 мм. Скорость потока элюента I мл/мин. Подэияная фаза 15%-тЙ метанол в 0,05 М аммиачно-фосфагном буферном раство'ре рН 3,5.

Идентификация ликорина, выделенного из биологического материала, осуществлялась сравнением времени удерживания (¿ц ) пиков на хроматограыме исследуемой пробы и рабочего стандартного образца ликорина. Бремя удерживания ликорина (для колонки "Сфс-рисорб") 5,84 мин и для колонки Силасорб 16 4,45 мин. Нижний предел обнаружения ликорина - 5 кг и 2,5 нг соответственно.

Количественное определение ликорина. Для количественного определения ликорина нами разработаны методики экстракционно-Фотометрические (в двух модифи-

нациях), УФ-спектрофотометрическая и с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Предложенные нами экстракционно-фотометрические методики количественного определения ликорина основаны на образовании ионного ассоциата с бромтимоловым синим (рН 6,2), который хорошо экстрагируется хлороформом.

Сущность первой модификации окстракционно-фотометрического определения заключается в переведении ионного ассоциата, окрашенного в желтый цвет, в хлороформный слой. Предел обнаружения ликорина 0,06-1 мг в 25 мл конечного объема; в пределах этих концентраций окрашенные растворы подчинялись закону Бугера-Ламбер-та-Бера. В связи с тем, что в данном случае оптическая плотность полученных растворов невелика, выделенный ионный ассоциат лико-рин-бромтимоловый синий разлагали раствором щелочи; при этом выделяется свободный брсмтимоловый синий в количестве эквивалентном количеству препарата, вступившего в реакцию (вторая модификация).

Методом изомолярных серий установили, что исследуемый препарат с красителем реагирует в соотношении 1:1.

Оптическую плотность, окрашенных в синий цвет растворов, измеряли с помощью фотоэлектроколориметра КФК - 2 - УХЛ 4.2 (светофильтр № 7, оранжевый, эфф 590 нм), кювета 10 мм). Све-топоглощение окрашенных растворов подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в пределах концентраций от 0,03 № до 0,5 мг в конечном объеме. Предел обнаружения 0,03 да препарата в 25 мл конечного объема. Чувствительность обнаружения ликорина по второй модификации более высокая, благодаря чему для анализа биологических объектов нами применялась эта модификация методики.

Расчет содержания ликорина в исследуемых пробах проводили по калибровочному графику.

Разработанные нами методики применялись для определения ликорина в лекарственных формах и объектах биологического происхождения. Относительная ошибка определения ликорина не превышает + 0,5855.

Ham была разработана УФ-спектрофотометрическая методика количественного определения ликорина по светопоглощению его растворов в воде и 0,02 н. растворе серной кислоты. Удельные и молярные коэффициенты поглощения ликорина в водных растворах при 290 нм = 127,15; £ = 4117, а в 0,02 н.растворе серной

кислоты при Я 287 нм = 129,06; ¿ = 4179. Границы подчине-

ния закону Бугера-Ламберта-Бера для водных растворов и сернокислых растворов составляет от 10 до 140 мкг. Расчет содержания препарата в исследуемой пробе проводили при помощи калибровочного графика и по удельным коэффициентам светопоглощения. Относительная ошибка составляет + 2,19$ в водном растворе и + 2,77^ в 0,02 н. растворе серной кислоты.

Предварительными опытами установлено, что при определении ликорина, выделенного из биологического материала, методом УФ-спектроскопии мешают примеси белковых веществ и продуктов их разложения, лоэтоцу требуется дополнительная очистка полученных вытяжек.

Предложена методика обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии для количественного определения ликорина б пробе. Условия хроматографирования ликорина приведены при описании способов идентификации препарата указанными методами (см. стр. 7-8). Детекция ликорина по указанной методике осуществлялась по светопоглощению в УФ-области спектра при длине волны 290 нм. Установлено, что линейная зависимость высоты хроматогра-■фического пика от количества ликорина имеет место от б до 30 мкг этого препарата в пробе.

Расчет содержания ликорина в пробе проводили методом абсолютной калибровки на основании зависимости высоты или площади хроматографического пика от количества ликорина. Зависимость имеет линейный характер в интервалах: 6-30 мкг и 0,5-10 мкг соответственно.

Наш использовалась также вторая возможность метода абсолютной калибровки, в соответствии с которой строили калибровочный график в зависимости площади пика ( 5 = мкВ.с) от содержания ликорина в пробе (в интервалах концентраций от 0,5 до 10 мкг/ мл). В указанных пределах зависимость имела линейный характер. Нижний предел определения 5 нг в пробе. Экстракция ликорина из водных растворов. Нами изучено влияние различных факторов (природа органических растворителей, рН среды, природа и количество электролитов) на степень экстракции ликорина органическими растворителями (хлороформ, 1,4-дихлорэтан, диэтиловый эфир, бензол). Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

Зависимость степени экстракции ликорина от природы органических растворителей, рН среды и присутствия электролитов

I ' ■ I

IОбласть зна-| - вьщеление ликорина, % Органический ¡чений рН со-) - |--г

растворитель |ответствую- ¡из раствора,|из раство-;из растворов ¡щих максимуме содержа- ¡ров содер-}содержащих ¡му экстрак- ¡щего элект- ¡жащих нат-;аммония суль-¡ции гтрепара-¡ролита ¡рия хлорид ¡фат _ра_|_|_|_

Хлороформ 8,3 - 10,1 95 - 96,3 97,0-98,5 95,0-99,5 1,2-дихлор-

этан 9,2 -10,1 34 - 37,0 39,0-42,5 55,0-57,5 диэтиловый

эфир 9,2 - 10,1 20 - 28,8 39,0-41,5 52,0-53,4

бензол 8,3 - 10,1 10 - I3,0 15,0-16,5 32,0-38,6

- 12 -

Полученные результаты показали, что степень экстракции ли-корина зависит от природы органических растворителей и рН среды. Электролиты на экстракцию ликорина хлороформом значительного влияния не оказывают.

Выделение ликорина из объектов биологического происхождения. В доступной нам литературе отсутствуют сведения о методах выделения ликорина из объектов биологического происхождения (органы трупов, кровь, моча). Поэтов перед нами была поставлена задача проверить пригодность описанных в литературе методов выделения алкалоидов и других азотистых соединений для изолирования ликорина из биологического материала (методы Стас-Отто; А.А.Васильевой, В.Ф.Нрамаренко). Результаты исследований (табл.2) показали, что с помощью указанных выше методов из биологического материала можно выделить от 12 до 20% ликорина, что объясняется потерями в ходе химико-токсикологического анализа, зависящими от ряда факторов (природы извлекающей жидкости, рН среды при изолировании ликорина из объектов биологического происхождения, от условий экстракции, условий очистки полученных вытяжек, от связи ликорина с белками).

В связи с этим нами было изучено влияние рН среды и природы извлекающей жидкости на изолирование ликорина из биологического материала. В результате проведенных исследований было показано, что при подкислении биологического материала минеральными (серной и соляной) кислотами выделяется большое количество ликорина, чем при подкислении органическими кислотами (уксусной, щавелевой).

Так как полнота изолирования ликорина из объектов биологического происхождения зависит от связывания его с биологическим материалом, перед нами была поставлена задача изучить влияние рН

среды на связь ликорина с биологическим материалом, а также условия высвобождения ликорина из этих комплексов, используя метод равновесного диализа.

Блла проверена возможность применения метода гель-хроматографии для очистки вытяжек полученных из биологического материала, содержащих ликорин. Для этой цели использовали гель сефадек-са G -25, которым заполняли стеклянную колонку высотой 30 см с внутренним диаметром 3 см. Полученные результаты показали, что белковые вещества и продукты их разложения элюируптся из колонки в I—15 фракциях, а ликорин - в 16-40 фракциях.

На основании проведенных исследований, посвященных изучению факторов, влияющих на полноту извлечения ликорина, предложен метод выделения этого препарата из материала биологического происхождения :

В колбу вместимостью 500 мл вносят 100 г тщательно измельченного биологического материала, содержащего 20 мг ликорина и заливают 0,02 н. раствором серной кислоты до получения слоя жидкости над биологическим материалом (рН 2,5-3,0). Содержимое колбы оставляют на 2 часа, постоянно перемешивая. Если рН среды превышает 2,5-3,0, то к смеси "биологический материал-препарат-подкисленная вода" по каплям добавляют 2С$-ный раствор серной кислоты до рН 2,5. Вытяжку, полученную из биологического материала, сливают, а затем процеживают через марлю. Твердые частицы биологического материала еще дважды настаивают 0,02 н. раствором серкой кислоты в течение часа, доводя рН до 2,5. Кислые водные вытяжки центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Центри-фугат сливают, а твердый осадок в центрифужных стаканах обрабатывают 0,02 н. раствором серной кислоты и опять центрифугируют в ■ тех же условиях. Центрифугаты объединяют, доводят 0,02 н. раствором серной кислоты до 250 мл.

50 мл полученного центрифугата пропускают через колонку с гелем сефадекса б- - 25. Из колонки ликорина элюируют 0,02 н. раствором серной кисло™. Элюаты собирают порциями по 10 ш. Первые фракции (150 мл), содержащие белковые вещества, продукты их разложения и другие цримеси, отбрасывают. Последующие фракции элюатов (250 мл), содержащие ликорин, используют при обнаружении и количественном определении ликорина.

Для концензрирования ликорина элюаг триады экстрагируют хлороформом при рН 9-10. Объем полученных хлороформных вытяжек доводят до 100 мл.

Для качественного обнаружения ликорина используют 50 мл, а оставшиеся 50 мл - для количественного анализа.

Сравнительная оценка результатов выделения ликорина из биологического материала с помощью различных методов приведена в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительная оценка результатов выделения ликорина из биологического материала

Метод изолирования ликорина

Выделено ликорина [%)

Этанолом, подкисленным щавелевой

кислотой 16,5 - 20,5 Водой, подкисленной щавелевой

кислотой 12,4 - 15,0

Водой, подкисленной серной кислотой 16,8 - 19,8

Предложенным нами методом 46,8 - 48,7

Из данных, приведенных в таблице 3, следует, что с помощью предложенного метода выделяется более значительное количество ликорина, чем с помощью методов Стаса-Огто, А.А.Васильевой и

В.Ф.Крамаренко.

Выделение ликорина из к в о в и. В стакан вносят 10 мл крови, к которой добавлено 5 мг ликорина в 5 мл воды. Содержимое стакана перемешивают и оставляют на 24 часа при периодическом перемешивании при температуре 18-20°С. После указанного времени к смеси добавляют 5 мл 0,02 н. раствора серной кислоты и доводят рН 20%-ным раствором серной кислоты до значения 2,5 (по универсальному индикатору) и оставляют на 3 часа при периодическом перемешивании. После истечения указанного времени содержимое центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Над-осадочную жидкость отделяют от осадков, еще раз обрабатывают 0,02 н. раствором серной кислоты и подвергают повторному центрифугированию. Центрифугаты объединяют, доводят рН до 2,5, используя 20у£-ный раствор серной кислоты. Объем центрифугата доводят до 100 мл 0,02 н. раствором серной кислоты.

50 мл полученного центрифугата пропускают через колонку, заполненную сефадексом С - 25 и собирают элюаты с 16 по 40 фракции. В собранном элюате рН среды доводят до 9-гЮ,0 с помощью 253-ного раствора гидроксида аммония (по универсальному индикатору). Подщелоченные элюаты пэреносят в делительную воронку и тргащы экстрагируют хлороформом по 30 мл. Хлороформные извлечения сливают в мерную колбу и доводят до 100 мл. Далее проводят очистку методом гель-хроматографии, как описано выше.

С помощью предложенного нами метода из крови выделяется от 63,8 до 65t ликорина.

Выделение ликорина из м о ч и. В стакан емкостью 500 мл вносили 50 щ мочи, содержащей 10 мг ликорина и оставляли на 24 часа при периодическом перемешивании. По истечении указанного времени рН жидкости доводили до 2,5 20^-ным раствором. серной кислоты и оставляли на 2 часа. Содержимое центрифу-

тировали при 3000 об/мин в течение 30 мин, доводили рН центрифу-гата до 9-10,0 25%-ным раствором аммиака (по универсальному индикатору). Затем трижды экстрагировали хлороформом (по 20 мл). Объединенные хлороформные вытяжки упаривали досуха на воздухе и сухой остаток использовали для обнаружения и количественного определения ликорина в моче.

С помощью разработанного метода из мочи выделяется от 72,3 до 73,5$ ликорина.

Распределение ликорина в органах собак, отравленных этим препаратом, изучено после введения его в желудок через зонд. Установлено, что наибольшее количество ликорина обнаруживается в желудке с содержимым, печени,'почках, крови и моче.

Сохраняемость ликорина в б и о л о -гическом материале. В связи с тем, что на судеб-но-химические исследования в ряде случаев поступает биологический материал, подвергшийся гнилостным изменениям, нами изучались сроки, в течение которых можно обнаружить и количественно определить ликорин в таких объектах. Результаты проведенных исследований показали, что через 6 месяцев выделяется 4,0-5,0$ ликорина.

Общие выводы:

1. Для предварительного обнаружения ликорина при проведении химико-токсикологического анализа рекомендованы цветные и микро-кристаллоскопические реакции. Предел обнаружения ликорина в пробе составляет от 4,7 ыкг до 150 мкг, граница обнаружения в тканях и биожидкостях - от 0,05 до I мг.

2. Для обнаружения ликорина, выделенного из биологического материала, рекомендована методика хроматографии в тонком слое сорбента (пластинки Силуфол, Сорбфил) в системах растворителей этанол-ацетон -25%-ный раствор гидроксида аммония (50:50:1); н-бутанол-циклогексан-25^-ный раствор гидроксида аммония (20:15:

о), хлороформ-эганол-25Й-ный раствор гидроксида аммония (80:10: 10). Локализацию зон ликорина обнаруживали в УФ-свете. Предел обнаружения составляет 1,8 мкг.

3. Обнаружение ликорина при проведении химико-токсикологических исследований предложено осуществлять методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Идентификация может быть проведена по относительному времени удерживания и с помощью метода добавок. Предел обнаружения - 5 нг (колонка Сила-сорб 18 со Сферисорбом) и 2,5 нг (колонка 4,5 х 250 мм с Сила-сорбом С2д, 5 мкм).

4. Рекомендована методика УФ-спектрофотометрии для обнаружения ликорина в вытяжках из объектов биологического происхождения.

5. Разработана экстракционно-фотометрическая методика количественного определения ликорина, основанная на образовании ионного ассоциата препарат-краситель (бромтимоловый синий), в двух модификациях. Предел определения составляет 0,03 ыг ликорина в 25 мл конечного объема (по второй модификации) при измерении оптической плотности на фотоэлектроколориметре (в кювете 10 мм).

6. Разработана методика количественного определения ликорина обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией. Расчет содержания в пробе может быть проведен с помощью абсолютной калибровки (по высоте и по площади пика). Относительная ошибка при определении ликорина (по высоте пика) не превышает

+ 2,53 и (по площади пика) не более +2,7*.

7. Изучено влияние на степень экстракции ликорина из водных растворов природы органических растворителей, рН среды и добавления электролитов. Экстрагирование хлороформом при рН 8-10 дает наилучшие результаты; влияние электролитов несущественно.

8. Разработана методика изолирования ликорина из объектов

- IS -

биологического происхождения с использованием в качестве изолирующей жидкости воды, подкисленной серной кислотой до pH 2-3. Методика позволяет выделить из крови 63,8-65%, мочи - 72,3-73,5% ликорина.

9. Разработан способ очистки извлечений из биологического материала от белковых веществ, продуктов их разложения и других примесей с помощью гель-хроматографии на Сефадексе С - 25.

10. Изучена сохраняемость ликорина в биологическом материале при его гнилостном разложении. Установлено, что по истечении 6 месяцев удается выделить 4,8-5,0% ликорина.

11. Изучено распределение ликорина в органах собак. На основании полученных данных, для проведения химико-токсикологического исследования рекомендуется брать желудок с содержимым, печень, почки, кровь, мочу.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Шукирбекова A.B., Икрамов Л.Т., Тегисбаев. Реакция обнаружения ликорина гидрохлорида.// Фармация. - 1985.- ДО I.-С.85-87

2. Щукирбэкова A.B., Икрамов Л.Т. Экстракция ликорина из водных растворов органическими растворителями в зависимости от pH среды. // "Повышение качества лекарственной помощи амбулаторным и стационарным больным на основе ускорения научно-технического прогресса в свете Отношений ЖУП съезда КПСС":Тез.докл. 1У Всесоюз.съезда фармацевтов, 18-20 ноября 1986. Казань, 1986. -С. 369.

3. Цукирбекова A.B. Экстракционно-фогомегрическое определение ликорина.// Сборник научных трудов - Ташкент, 1988,- C.I22-127.

4. ¡1^'кирбекова A.B., Икрамов Л.Г. Экстракционно-фотометри-ческое определение ликорина.//Сб.науч.трудов: "Химия, технологи