Автореферат диссертации по медицине на тему Фармакологическое изучение гастропротекторных свойств аминосахаров и их производных
На правах рукописи
ПРОПИСНОВА Виктория Владимировна
Г Г 5 ОД * 1 ОПТ ш
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГАСТРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ АМИНОСАХАРОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ
14.00.25 — ФАРМАКОЛОГИЯ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Купавна -1999
Работа выполнена в Украинской фармацевтической академии (г. Харьков
Научный руководитель —
Официальные оппоненты —
Заслуженный деятель науки и технию Украины, доктор медицинских наук, профессор И.А.Зупанец
доктор медицинских наук, профессор А.Г.Муляр
доктор химических наук, профессор СЛ.Скачилова
Ведущая организация - НИИ фармакологии Российской
Академии медицинских наук
Защита состоится "_"_ 1999 г. в_час. на заседг
нии Диссертационного совета Д 098.01.02 во Всероссийском Научно] Центре по безопасности биологически активных веществ (142450, Мое ковская область, пос. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского На учного Центра по безопасности биологически активных веществ.
Автореферат разослан "_"_1999 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
доктор биологических наук Т.Н.Робакидзе
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время язвенная болезнь желудка (ЯБЖ) является одним из ведущих заболеваний в гастроэнтерологии, поскольку данная патология чаще затрагивает лиц наиболее трудоспособного и активного возраста, вызывая тяжелые осложнения, снижение трудоспособности, ухудшение качества жизни (В.ХВаснленко, АЛГребенев, А.А.Шептулин, 1987; И.И.Деггя-рева, Н.В.Харченко, 1995; М.ВЛеонова, Ю.Б.Белоусов, 1996). Стремительное распространение ЯБЖ связывают с урбанизацией, эмоциональным перенапряжением, нарушением ритма жизни, нерациональным питанием и загрязнением окружающей среды (А.Ю.Евтеев и соавт., 1995; 8Хеуепз1ет ег а1., 1998).
В терапии ЯБЖ применяют разнообразные группы лекарственных препаратов (антисекреторные, антибактериальные, гастроцитопротекторы и др.), большинство из которых являются ксенобиотиками, обладают гепато- и нефро-токсическим действием, вызывают диспепсические, вестибулярные расстройства и т.д. (Ю.Б.Белоусов и соавт., 1997).
Указанные недостатки обусловливают поиск высокоэффективных лекарственных препаратов, способных воздействовать на различные звенья патогенеза ЯБЖ. В связи с этим, перспективным направлением при создании эффективных противоязвенных средств является использование веществ природного происхождения и создание препаратов на их основе.
В последние годы внимание ученых привлек аминосахар 2-Е)-(+)-глю-козамин и его производные, обладающие широким спектром фармакологической активности. Являясь неотъемлемым структурным элементом желудочной слизи, глюкозамин активно включается непосредственно в процесс ее образования (М.М.Богер, 1986), обладает выраженным противовоспалительным, мем-бранозащитным и антиоксвдантным действием (С.М.Дроговоз и соавт., 1989; И.А.Зупанец, 1993, 1995, 1999). Учитывая, что аминосахара играют важную роль в патогенезе ЯБЖ, внимание химиков-синтетиков и фармакологов направлено на проведение дальнейшего целенаправленного синтеза и фармаколо-
гического скрининга с целью создания более эффективных и менее токсичных фармакологических веществ для рациональной фармакотерапии ЯБЖ.
Вышеизложенное послужило основанием для фармакологического изучения гастропротекторной активности 18 веществ ряда производных аминоса-хара 2-Б-(+)-глюкозамина.
Работа выполнена в соответствии с планами НИР Украинской фармацевтической академии "Химический синтез, выделение и анализ новых фармакологически активных веществ, установления связи "структура-активность", создание новых лекарственных препаратов" (№ гос. регистр. 0198Ш07011).
Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось изучение гастропротекторных свойств аминосахара 2-Б-(+)-глюкозамина, его производных и установление зависимости фармакологической активности от химического строения в данном ряду соединений.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести поиск эффективных и малотоксичных соединений с противоязвенной активностью среда 2-1)-(+)-глюкозиламмонийных солей этиловых эфиров 11-М-оксамоилгидразидов щавелевой кислоты и производных 2-Б-(+)-глюкозамина, установить элементы зависимости противоязвенного действия исследуемых соединений от химической структуры.
2. Провести изучение отобранных на этапе скрининга веществ на различных моделях экспериментальной язвы желудка у лабораторных животных.
3. Изучить возможные механизмы противоязвенной активности наиболее перспективного вещества
4. Определить роль и значение эндогенного М-ацетилглюкозамина (Ы-АГА) при эрозивно-деструктивных процессах в слизистой оболочке желудка (СОЖ).
Научная новизна исследований. Впервые проведен фармакологический скрининг противоязвенной активности 18 производных 2-0-(+)-глюкозамина и 2-0-(+)-глюкозиламмонийных солей этиловых эфиров Я->7-оксамоилгидрази-дов щавелевой кислоты. Установлена зависимость "структура-активность". Для углубленного изучения отобрана 2-0-(+)-диглюкозиламмонийная соль этило-
вого эфира 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида щавелевой кислоты (диоксаглю-камин), обладающая противоязвенной активностью.
Определены возможные механизмы противоязвенного действия диоксаг-люкамина: активация процессов слизеобразования в СОЖ, стимуляция синтеза простагландина Ei в крови, нормализация содержания эндогенного N-ATA в сыворотке крови и СОЖ. Установлена антибактериальная активность в отношении Helicobacter pylori в опытах in vitro.
В экспериментах на животных установлена зависимость содержания эндогенного N-ATA от тяжести эрозивно-деструктивных процессов в СОЖ.
Практическая значимость результатов работы. На основании анализа зависимости "структура-токсичность" и определения некоторых закономерностей зависимости противоязвенного эффекта от химического строения в ряду производных аминосахара 2-Е)-(+)-глюкозамина даны рекомендации для дальнейшего направленного синтеза новых соединений с противоязвенной активностью.
Предложен и внедрен в экспериментатьные исследования и клиническую практику модифицированный метод определения концентрации эндогенного N-ATA в биологических жидкостях и тканях организма в качестве критерия оценки тяжести патологического процесса и процесса заживления язвенного дефекта.
По результатам доклинического исследования диоксаглюкамнна в Госпатент Украины подана заявка на изобретение №99010441 от 27.01.1999 г.
Результаты изучения противоязвенной активности аминосахара 2-D-(+)-глюкозамина и его производных используются в учебном процессе на кафедрах клинической фармации, фармакологии и фармакотерапии Украинской фармацевтической академии.
Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на совместном заседании кафедры клинической фармации, фармакологии, фармакотерапии, биохимии, микробиологии, физиологии с основами анатомии Украинской фармацевтической академии. Отдельные фрагменты работы были пред-
ставлены на I KoHrpeci СвгговоТ федераци Укра'шських фармацевтичних това-риств (Львов, 1993); ювшейнш конференци "Школа академ'ша ОД.Черкеса: ifle'i, розвйток, перспективи" (Киев, 1994); Республжанськш науково-практичнш конференци "Сучасм проблеми фармащ'Г (Харьков, 1994); I Украшсысому KOHrpeci гастроентерололв (Днепропетровск, 1995); Международной научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова (Харьков, 1995); Международной научно-практической конференции "Современные аспекты создания, исследования и апробации лекарственных средств" (Харьков, 1995); науковш конференци "Актуалып питания теоретично! та клшчноТ медицини на сучасному piBHi" (Полтава, 1996); 5th United European Gastroenterology Week (Paris, 1996), Республ1канськш науково-практичнш кон-ференцй' "Досягнення та невиршет питания гастроентеролоп'Г (Харьков, 1998); V нащональному з1зд1 фармацевта Укра'ши "Досягнення сучасноТ фар-маци та перспективи iT розвитку у новому тисячолтГ' (Харьков, 1999).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 6 статьях, 1 справочнике, 10 тезисах докладов, 1 информационном письме, заявке на патент.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включая 21 таблицу, 1 схему, 10 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 240 наименований, из них 109 отечественных и 131 зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования были проведены на белых нелинейных крысах массой 170-250 г и белых нелинейных мышах массой 18-22 г.
Этапы и основные методы исследований представлены на схеме 1.
В качестве объектов исследования были использованы 18 химических соединений: 2-0-(+)-глюкозиламмонийные соли этиловых эфиров R-N-окса-
Схема 1. Этапы и основные методы фармакологических исследований.
моилгидразидов щавелевой кислоты (1 группа) и производные 2-0-(+)-глю-козамина (2 группа).
В качестве препаратов сравнения были использованы "Ранитидин" ("KRKA", Словения), "Misoprostol" ("Searle", США).
Фармакологическую активность соединений изучали при пероральном введении. Соединения, трудно растворимые в воде, вводили животным в виде суспензии, стабилизированной твином-80 (концентрация 0,1%).
Острую токсичность соединений изучали на белых мышах массой 18-22 г при пероральном введении по методу Т.В.Пастушенко и соавт. (1986). Оценку токсичности проводили по общепринятой классификации (Н.С.Но-dge, L.H.Sterner, 1943).
Скрининговые исследования противоязвенной активности соединений проводили на модели алкогольно-преднизолонового поражения желудка у крыс (И.А.Зупанец н соавт., 1989, 1998). С целью определения EDjo, которую рассчитывали по методу наименьших квадратов (Г.Ф.Дакин, 1990), изучаемые вещества вводили в диапазоне доз от l/400LDJO, 1/200LD30 и 1/1 OOLDjo-
Стрессовую модель язвенного поражения желудка воспроизводили по методике Г.В.Оболенцевой и соавт. (1995). Степени тяжести поражения оценивали по шкале EMarazzi-Uberti, C.Turba (1961).
Изучение влияния соединений на желудочную секрецию животных проводили на модели перевязки привратника желудка у крыс (H.Shay et al., 1954) путем определения показателей общего объема желудочного сока, связанной и свободной кислотности (В.Е.Предтеченский, 1960).
Моторно-эвакуаторную функцию желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) исследовали по методу J.S.Stickney et al. (1951) путем регистрации скорости продвижения активированного угля по пищеварительному каналу.
Антибактериальную активность веществ исследовали в опытах in vitro с использованием метода диффузии в агар и метода серийных разведений (Б.М.Даценко и соавт., 1989; С.М.Навашин и соавт., 1982).
Углубленное изучение 2-0-(+)-диглюкозиламмонийной соли этилового эфира 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида щавелевой кислоты проводилось на модели субхронического эрозивно-геморрагического повреждения желудка ацетилсалициловой кислотой по методике Г.В.Оболенцевой и соавт. (1974).
При гистохимическом определении нейтральных и кислых гликопро-теинов в СОЖ использовалась реакция с Шифф-йодной кислотой и реакция Хейла (Г.А.Меркулов, 1969).
Определение эйкозаноидов (простациклияа PGI2, простагландинов PGEj, PGF)a и PGF2a, тромбоксана ТхВ2) проводили с помощью наборов для радиоиммунологических исследований фирмы "Dode" (США).
Содержание эндогенного N-ацетилглгокозамина в биологических жидкостях (сыворотке крови, слюне) и ткани СОЖ определялось методом, основанном на взаимодействии гексозаминовых соединений с п-диметиламино-бензальдегидом в спиртовой среде (И.А.Зупанец и соавт., 1996).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием методов вариационной статистики. Достоверность различий между показателями средних определяли в соответствии с t-критерием Стыо-дента (Г.ФЛакин, 1990).
скрининговые исследования противоязвенной активности производных аминосахара 2-ю-(+>глюкозамш1а
В результате исследований, проведенных на лабораторных животных, изучена острая токсичность и противоязвенное действие 2-0-(+)-глюкозилам-монийных солей этиловых эфиров R-N-оксамоилгидразидов щавелевой кислоты и производных 2Л)-(+)-глюкозамина.
Анализ полученных данных показал, что соединения первой группы относятся к группе малотоксичных - параметры токсичности (LDjo) находились в пределах 1870-5220 мг/кг. Из веществ данной группы наибольшей противоязвенной активностью (рис. 1) обладали: 2-0-(+)-ппокозиламмонийная соль этилового эфира 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида щавелевой кислоты [оксаглю-
1/400 Ы);» 1/200 Ы)50 1/1001Л>5о
Рис. 1. Противоязвенная активность диоксаглюкамина, оксаглюкамица и глюкозамина гидрохлорида на модели алкоголыю-иреднизолонового поражения слизистой оболочки желудка у крыс при пероральиом введении
Й=96)
— контроль (язвы),§- контроль + ранитидин 40 мг/кг,
РД — контроль + диоксаглюкамин, В—контроль + оксаглюкамин,
— контроль + глюкозамина гидрохлорид;
* - р<0,02, ** - р<0,01, *** - р<0,001 по сравнению с контролем.
камин] и 2-1>(+)-диглюкозяламмонийная соль этилового эфира 4-карбэтокси-оксанилоилгидразида щавелевой кислоты [диоксаглюкамин], отличающиеся количеством молекул глюкозамина в их структуре (1 и 2 соответственно). Их ЫЭзо по противоязвенному действию составляют 15 и 12 мг/кг, 1Л)50 - 3850 и 5220 мг/кг, соответственно.
Из второй группы соединений наиболее высокую противоязвенную активность (рис. 1) проявил глюкозамина гидрохлорид (ЕО50 = 30 мг/кг, ЬБ50 >10000 мг/кг).
Указанные соединения по выраженности противоязвенного действия превосходили препарат сравнения ранитидин в дозе 40 мг/кг, который широко используется в клинике для лечения язвенной болезни.
Изучение противоязвенной и антибактериальной активности диокса-
глюкамина, оксаглюкамина, глюкозамииа гидрохлорида и их влияния на функциональную активность желудочно-кишечного тракта
На следующем этапе исследований изучалось влияние диоксаглюкамина, оксаглюкамина и глюкозамина гидрохлорида на некоторые звенья патогенеза язвенного поражения желудка у крыс.
По результатам экспериментов-было установлено, что в условиях экспериментальной язвы, вызванной стрессовым воздействием, оксаглюкамин не оказывает значимого гастропротекторного эффекта (рис. 2).
Рис. 2. Противоязвенная активность диоксаглюкамина, оксаглюкамина н глюкозамина гидрохлорида на модели стрессового поражения слизистой оболочки желудка у крыс при пероралыюм введении (п=80) К - контроль (язвы), Р-40 - контроль + ранитидин 40 мг/кг, Д-12 и Д-24 -контроль + диоксаглюкамин 12 и 24 мг/кг, 0-15 и О-ЗО - контроль + оксаглюкамин 15 и 30 мг/кг, ГА-30 и ГА-60 — контроль -I- глюкозамина гидрохлорид 30 и 60 мг/кг;
* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 по сравнению с контролем.
Глюкозамина гидрохлорид и диоксаглюкамин проявили противоязвенный эффект, сопоставимый с эффектом препарата сравнения - ранитидином, что выражалось в достоверном снижении индекса изъязвления (р<0,001). Наиболее выражено индекс изъязвления в сравнении с контролем уменьшался в случаях применения диоксаглюкамина в дозе 12 мг/кг, а также глюкозамина гидрохлорида в дозе 60 мг/кг (в 3,0 раза и 2,2 раза соответственно).
Приведенные результаты свидетельствуют о наличии значимого противоязвенного действия у изучаемых соединений в условиях стресса. Возможно, наблюдаемый гасгропротекторный эффект глюкозамина гидрохлорида в дозе 60,0 мг/кг и, особенно, диоксаглюкамина в дозе 12,0 мг/кг, осуществляется опосредовано за счет их включения в биохимические процессы на молекулярном уровне и механизмы гастропротекции: стимуляция синтеза простагландинов группы Е, увеличение выработки слизи, включение в состав гликопротеинов желудочной слизи, а также устранение гипоксии и снижение уровня недоокис-ленных продуктов перекисного окисления гапидов- как универсальный механизм их мембрано- и цитопротекторного действия (И.А.Зупанец, 1993; СЛПшощ, 1995).
Изучение влияния соединений на спонтанную желудочную секрецию у крыс показало, что диохсаглюкамин и оксаглюкамин, вводимые в дозе равной ЕОх| по противоязвенному действию, не оказывали существенного влияния (рис. 3). Вместе с тем, диоксаглюкамин проявил тенденцию к снижению выделения желудочного сока на 18,5% от значений интактного контроля. Однако в сравнении с действием известных ^-блокирующих средств и ингибиторов "протонной помпы", способных снижать кислотопродукцию на 60-90%, эффект диоксаглюкамина не представляет практического значения. Глюкозамина гидрохлорид, в огличие от диоксаглюкамина, способствовал достоверному повышению объема желудочного сока в сравнении с контролем (р>0,05).
Таким образом, изучаемые соединения не обладали существенной антисекреторной активностью, то есть механизм их антиульцерогенного действия не был связан с угнетением агрессивных факторов. Однако они оказывали выраженный противоязвенный эффект, сопоставимый с эффектом ранитидина, что позволяет предположить наличие у соединений способности повышать защитные свойства слизистой оболочки - гастропротекции.
Согласно данным литературы, процесс ульцерогенеза сопровождается значительным усилением гастродуоденальной моторики (У-И-воге^ 1989; КЛакеисЫ & а]., 1986; С.В.Кузнецов и соавт., 1997). Также установлено, что
2 -1,61,20,8 -0,4 ■ 0 -
А - объем желудочного сока, мл/100 г; Б - общая кислотность, мл 0,Ш №ОН/ 100 мл желудочного сока; В — свободная кислотность, мл 0,Ш N»011/ 100 мл желудочного сока; I |-контроль,^ - ранитцдин 40 мг/кг, 1-й- диоксаглюкамин 12 мг/кг, И - оксаглюкамин 15 мг/кг, - глюкозамина гидрохлорид 30 мг/кг; * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 по сравнению с контролем.
Рпс. 3. Влияние диоксаглюкампна, оксаглюкамина и глюкозамина гидрохлорида на показатели секреторной актнвпостн желудка крыс при перораль-вом введении (п=40)
средства, обладающие способностью расслаблять гладкую мускулатуру желудка (папаверин, простагландины), предотвращают язвообразование в условиях моделирования этаноловой язвы (К.ТакеисЫ е1 а1., 1985). Поэтому, следующим этапом нашего исследования было изучение влияния диоксаглкжамина, оксаглюкамина и глюкозамина гидрохлорида на двигательную активность ЖКТ.
На основании экспериментальных данных установлено, что диоксаглюкамин и оксаглюкамин в дозах, равных ЕБ}о, а глюкозамина гидрохлорид в дозе 2Е05о по противоязвенному действию, оказывают угнетающее действие на моторику ЖКТ, снижая ее активность на 14,1%, (р<0,02); 15,9%, (р<0,05) и
17,7%, (р<0,02), соответственно. Способность диоксаглюкамина, оксаглюками-на и глюкозамина гидрохлорида подавлять моторику ЖКТ может служить одним из компонентов их гастропротекторного действия.
Учитывая мировую тенденцию к признанию кислотоустойчивой бактерии Helicobacter pylori, как важного патогенетического фактора язвообразова-ния, представляло интерес определить, обладают ли диоксаглюкамин, оксаг-люкамин и глюкозамина гидрохлорид антибактериальной активностью в отношении Helicobacter pylori и кишечных кампилобактеров (Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus).
Результаты изучения антибактериальных свойств исследуемых соединений в сравнении с метронидазолом и коллоидным субцитратом висмута (табл. 1 и 2) показали, что диоксаглюкамин и оксагдюкамин угнетают процесс роста и развития колоний всех трех тест-культур. Однако этот эффект достигался лишь в концентрации 1%. При изучении антибактериальной активности референс-препаратов отмечали высокую эффективность метронидазола уже в концентрации 0,01% и слабую антимикробную активность коллоидного субцитрата висмута. Оригинальные синтетические вещества превосходили коллоидный субцитрат висмута, что выражалось в увеличении диаметра зоны задержки роста микроорганизмов в 1,7 раза.
Сравнивая антимикробную активность изучаемых соединений и препаратов сравнения по величине минимальных подавляющих концентраций (МПК) следует отметить тот же порядок уровня эффективности. Метронидазол подавлял рост Helicobacter pylori уже в концентрации 25 мкг/мл и превосходил по данному показателю оксаглюкамин и диоксаглюкамин в 25 раз. Однако оксаг-люкамин и диоксаглюкамин были эффективнее, чем коллоидный субцитрат висмута, что выражалось в снижении МПК для Helicobacter pylori в 2 раза.
Наличие антибактериальной активности у исследуемых оригинальных соединений, по-видимому, определяется синтетической частью их молекулы. В то же время включение в их состав глюкозамина обусловливает тропность данных веществ к бактериальной стенке. Можно предположить, что благодаря
Таблица 1. Угнетение зоны роста тест-культур при воздействии диоксаглюкамн-на, оксаглюкамина и глюкозамина гидрохпорвда
Препараты Концентрация Диаметр мик зоны задержки роста роорганизмов, мм
Н. pylori С. jejuni С. fetus
Диоксаглюкамин 1% 0,1% 30 рост 30 рост 30 рост
Оксаглюкамин 1% 0,1% 32 рост 32 рост 30 рост
Диметилформамид (растворитель) - рост рост рост
Глюкозамина гидрохлорид 10% 1% 0,1% рост рост рост рост рост рост рост рост рост
Метронидазол 0,01% 18 18 19
Коллоидный субцитрат висмута 1% 0,1% 18 рост 17 рост 18 рост
Таблица 2. Чувствительность Helicobacter pylori к дноксаглюкамнну, оксаглюк-амииу в сравиепия с метронндазолом и коллоидным субцитратом висмута
Условия опыта Минимальная подавляющая концентрация, мкт/кг
Диоксаглюкамин Оксаглюкамин Метропидазол Коллоидный субцитрат висмута
Helicobacter pylori 625 625 25 1250
аминосахару происходит "узнавание" аналогичного структурного элемента рецепторами бактериальной стенки и вхождение его в мембрану, после чего происходит разрушение мембраны под действием агликона- этилового эфира 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида щавелевой кислоты.
По результатам I и II этапов исследований для углубленного изучения был отобран диоксаглюкамин [2-В-(+)-диглюкозиламмонийная соль этилового эфира 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида щавелевой кислоты], как соединение, наиболее полно отвечающее требованиям, предъявляемым к противоязвенным
средствам. Диоксаглюкамин обладает выраженной противоязвенной актив» стыо на двух моделях экспериментальных язв, низкой токсичностью, спосо! ностью тормозить моторику ЖКТ и антихеликобактерным действием.
Принимая во внимание высокую противоязвенную активность глюкоз мина гидрохлорида, а также его структурную близость к природному аминос; хару, это соединение также включили в углубленные исследования.
Углубленные исследования диоксаглюкамина
В процессе развития и течения ЯБЖ ведущую роль отводят ослаблени защитных свойств СОЖ: снижению выработки желудочной слизи, секреци бикарбоната, скорости регенерации поверхностных эпителиальных клеток, н; рушению микроциркуляции, нарушению функционирования простагландш циклазной системы. Поэтому, на III этапе исследований было изучено влияш диоксаглюкамина на защитные свойства СОЖ.
С этой целью нами была воспроизведена методика экспериментально язвы желудка, вызванной ацетилсалициловой кислотой (АСК). Выбор модел объясняется многофакторным механизмом повреждения СОЖ, включающи местные (прямое повреждающее действие на поверхностный эпителий) и chi темные патогенетические звенья, указанные выше (Г.В.Цодиков и соавт., 197< А.В.Ткачев, 1995; A.Lanas et al., 1997).
Было проведено гистологическое и гистохимическое изучение состоянк поверхностного эпителия слизистой желудка и его ниже лежащих отделов *.
В группе животных, получавших АСК на протяжении 5 суток, при moj фолошческом изучении отмечалось 100% поражение СОЖ (табл. 3), проя] ляющееся в геморрагических эрозиях и точечных язвах. Ульцерогенное дейс вие АСК, подтвержденное гистологическим исследованием, выражалось в н; личии дефектов СОЖ, полной деструкции ткани, дистрофических и десква-
* Гистологические и гистохимические исследования проведены в лаборатории возрастнс фармакологии Государственного научного центра лекарственных средств (ГНЦЛ* г. Харьков) под руководством проф. ГЛЗ.Оболенцевой,
Таблица 3. Противоязвенная активность дноксаглюкамина на модели поражения слизистой оболочки желудка, вызванного ацетилсалициловой кислотой
№ п/п Условия опыта п Доза, мг/кг Процент животных с язвами Количество язв на одно животное Средний балл язвенного поражения Индекс изъязвления Коэффициент противоязвенной активности, индекс изъязвления индекс изъязвления 011Ь1Т
1. Интактные Животные 7 - 0 0 0 0 -
2. Контрольные животные 7 - 100 6,0±0,57 3,57±0,28 3,57 0
3. Диоксаглюкамин 7 12,0 85,7 3,7±0,56 р<0,02 1,29±0,28 р<0,001 1,10 3,25
5. Глкжозамина гидрохлорид 7 30,0 71,4 4,0±0,37 р<0,02 2,29±0,28 р<0,01 Р1<0,05 1,63 2,19
6. Мисопростол 7 0,3 71,4 1,2±0,28 р<0,001 Р1<0,002 1,29±0,14 р<0,001 0,92 3,88
р - достоверность разности различий по отношению к контрольной группе животных;
Р! - достоверность разности различий по отношению к группе животных, получавших диоксаглюкамин.
мативных процессах в поверхностно-ямочном эпителии. Пониженное в сравнении с интактной группой количество секреторных гранул свидетельствовало об угнетении процесса слизеобразования.
На модели ацетилсалицилового поражения СОЖ, как и в предыдущих сериях экспериментов, установлена выраженная противоязвенная активность диоксаглюкамина. Применение данного вещества в дозе 12 мг/кг способствовало снижению индекса изъязвления на 62,5% (р<0,001). По данным гистологической оценки под влиянием препарата отмечались существенные отличия в состоянии поверхности СОЖ от контроля: размеры и количество пораженных участков были значительно снижены, равно как и выраженность десквамативно-дистрофических процессов, захватывающих лишь поверхностные зоны. На повышение интенсивности слизеобразования указывали данные гистохимии - в препаратах отмечалось яркое ШИК-положительное окрашивание (как в глубо-колежащих клетках, так и в клетках поверхностного эпителия). Данное явление характеризует повышенную выработку гликопротеинов, в состав которых входит и глюкозамин.
Введение глюкозамина гидрохлорида приводило к нормализации состояния поверхности СОЖ, хотя в сравнении с предыдущей 1руппой, эти изменения носили менее выраженный характер.
Приведенные данные показали, что диоксаглюкамин и глюкозамина гидрохлорид способствуют индукции слизеобразования и тем самым повышают защитные свойства СОЖ. Учитывая дозу диоксаглюкамина, которая в 2,5 раза меньше среднеэффективной для глюкозамина гидрохлорида (12 и 30 мг/кг соответственно), а также степень выраженности гастропротекторного действия, подтвержденную как морфологически, так и гистологически, можно сделать вывод о более выраженной противоязвенной активности диоксаглюкамина в сравнении с глюкозамина гидрохлоридом.
Возможно, диоксаглюкамин действует одновременно в двух направлениях: усиление процесса синтеза слизи обеспечивается синтетической состав-
ляющей диоксаглюкамина, а его глюкозаминовая часть оказывает заместительное действие, непосредственно включаясь в состав гликопротеинов СОЖ.
В сравнении с эффектами изучаемых соединений, препарат сравнения мисопростол (синтетический аналог лростагландина Еь широко применяемый как гастроцитопротектор при НПВС-гастропатиях) проявил наиболее высокую противоязвенную активность. Индекс изъязвления при его применении уменьшался по отношению к контрольной группе почти в 4 раза, а количество язв на одно животное в 5 раз (табл. 3); по среднему баллу язвенного поражения мисопростол приближался к диоксаглюкамину в дозе 12 мг/кг. Полученные результаты гистологического и гистохимического исследования показали, что слизе-образующие клетки имели сохраненную структуру, процесс слизеобразования поддерживался tía- интенсивном уровне, о чем свидетельствовало ярко выраженное ШИК-положительное окрашивание.
Сходство в результатах гистохимического исследования и морфологической оценки СОЖ при применении диоксаглюкамина (12 мг/кг) и мисопросто-ла (0,3 мкг/кг) в условиях модельной язвы, вызванной АСК, которая ингибиру-ет синтез простагландинов, позволило предположить наличие у диоксаглюкамина способности влиять на синтез эйкозаноидов. Поэтому было изучено изменение содержания простагландинов Et, Fi0, F2a, простациклина 12 и тромбок-сана В2 в сыворотке крови под действием диоксаглюкамина и глюкозамина гидрохлорида в сравнении с интактными животными.
Диоксаглюкамин и глюкозамина гидрохлорид оказывали неоднозначное воздействие на обмен эйкозаноидов. Так, введение диоксаглюкамина способствовало увеличению в сыворотке крови лабораторных животных количества PGI2 и PGEi на 88,9% и 50,9% и снижению содержания ТхВ2, PGF|0 и PGF2a на 41,7% 76,2% и 45,8% соответственно. Глюкозамина гидрохлорид достоверно снижал концентрацию ТхВ2 и PGF2aHa 70,8% и 32%, соответственно и повышал содержание PGEi на 50,1% (рис. 4). Можно предположить, что препараты опосредовано способствовали интенсификации слизеобразования (стимулируя образование PGEi), улучшению микроциркуляции, кровоснабжения и трофики
РвЬ
ТхВ2
РвЕ,
РвР^ РвР^
Рве. 4. Влияние диоксаглюкамина в глюкозамина гидрохлорида на синтез эй-козаноидов в сыворотке крови у крыс при пероральном введении (а=28) I I-иитакт,РА- интакг+двоксаглюкамин, ^ - интакт + глюкозамина гидрохлорид;
* - р<0,05, ** - р<0,91, *** - р<0,001 по сравнению с контролем.
СОЖ (угнетая синтез вазоконстрикторов - ТхВ2 и РСР2а), повышая тем самым защитные свойства СОЖ.
Следует также отметить, что угнетение синтеза простагландинов опосредовано приводит к угнетению синтеза белков (Л.И.Аруин, 1993). В связи с тем, что в работе В.Н.Сокрут, И.А.Зупанец (1991) было доказано наличие у глюкозамина и его производных способности стимулировать синтез белка, то можно предположить, что наряду с гастропротекторным действием изучаемых соединений имеет место и активация процессов репарации.
Принимая во внимание тот факт, что изучаемые фармакологические препараты- диоксаглкжамин и глюкозамина гидрохлорид - являются структурными аналогами эндогенного, аминосахара, входящего в структуру желудочной слизи, представляло интерес изучить их влияние на уровень эндогенного Ы-АГА
в условиях экспериментальной язвы, полагая, что они могут служить исходными веществами для его образования.
Изучение уровня эндогенного N-АГА в сыворотке крови и ткани СОЖ показало, что на всех трех моделях язвенного поражения СОЖ отмечалось повышение концентрации данного показателя в связанной и общей фракциях сыворотки крови экспериментальных животных. Кроме того, наблюдалось недостоверное увеличение значений эндогенного N-АГА в интактных участках стенки желудка и его резкое снижение в области поражения (рис. 5). Можно предположить, что происходил переход эндогенного N-АГА из разрушенной ткани в кровеносное русло, а за счет связывания свободной фракции N-АГА активировался синтез гликопротеидов в интактной СОЖ.
Пероральное введение диоксаглюкамина и глюкозамина гидрохлорида способствовало нормализации концентрации эндогенного N-АГА, что особенно ярко проявлялось в отношении свободной фракции данного показателя в сыворотке крови и в месте язвенного дефекта на всех трех моделях язвенного поражения. Данный эффект, по-видимому, вызван заместительным действием изучаемых препаратов, их включением в процессы заживления язвенного дефекта.
Полученные данные свидетельствуют, что в механизме развития экспериментальной язвы желудка у крыс имеет место процесс нарушения обмена эндогенного N-АГА: его "вымывание" в плазму крови и дефицит в поврежденной слизистой, приводящие к снижению защитных свойств СОЖ. Введение животным диоксаглюкамина и глюкозамина гидрохлорида компенсирует указанные нарушения.
Таким образом, исследования, проведенные на различных моделях экспериментальной язвы желудка и нарушений функции ЖКТ, позволили выявить у диоксаглюкамина наличие противоязвенных свойств, основанных на способности препарата повышать защитные свойства СОЖ: стимулировать процесс слизеобразования и синтез простагландина Е], нормализовать обмен эндогенного N-АГА, а также оказывать антибактериальное действие против Helicobacter pylori.
Алкогольно-преднизолоновая язва (п=52)
ОФ
СвяФ СвоФ
Стрессовая язва (п=50)
ИС
Язва, вызванная ацетилсалициловой кислотой (п=38)
Рис. 5. Содержание эндогенного 1Ч-ацетилглюкозам1ша в сыворотке крови и ткани желудка при модельной язвенной патологии у крыс ОФ - общая фракция, СвяФ — связанная фракция, СвоФ - свободная
Й акция, ИС - интакггная слизистая, ЯД - язвенный дефект; - интактные животные, Ц - контроль (язвы), 03—контроль + диокса-глюкамин, - контроль +- глюкозамина гвдрохлорид,^- контроль + ра-ннтидин, ЦЛ - контроль + мисопростол;
* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 по сравнению с контролем.
Сравнивая фармакологическую активность изученных соединений на различных моделях патологических состояний можно сделать вывод о преимуществе диоксаглюкамина над глюкозамина гидрохлоридом и рекомендовать его для дальнейшего углубленного изучения при язвенно-деструктивных поражениях слизистой оболочки желудка.
ВЫВОДЫ
1.При экспериментальном язвообразовании в желудке крыс имеет место нарушение обмена эндогенного N-ацетилглюкозамина в сыворотке крови и слизистой оболочке желудка. Изменение уровня эндогенного N-ацетилглюкозамина в сыворотке крови является показателем степени повреждения слизистой оболочки желудка и может быть использовано для оценки тяжести патологии и процесса заживления язвенного дефекта в эксперименте и клинике.
2. Производные аминосахара 2-D-(+)-глюкозамина оказывают противоязвенный эффект на модели алкогольно-преднизолонового поражения слизистой оболочки желудки при относительно низкой острой токсичности. Наиболее высокой противоязвенной активностью и низкой токсичностью обладают ди-оксаглюкамин (EDs0=12 мг/кг, LD}(p5220 мг/кг) и глюкозамина гидрохлорид (EDJO=30 мг/кг, 1£>5о>10000 мг/кг).
3. Диоксаглюкамин и глюкозамина гидрохлорвд не оказывают антисекреторного действия на модели перевязки привратника желудка у крыс и умеренно ингибируют моторно-эвакуаторную активность желудочно-кишечного тракта у мышей. Диоксаглюкамин в опытах in vitro оказывает умеренный антихелико-бактерный эффект (МПК=625 мкг/мл), уступающий эффекту метронидазола (МПК=25 мкг/мл) и превосходящий эффект коллоидного субцитрата висмута (МПК=1250 мкг/мл).
4. По данным гистохимических исследований диоксаглюкамин и глюкозамина гидрохлорид стимулируют слизеобразование в желудке крыс при язве желудка, вызванной ацетилсалициловой кислотой.
5. Диоксаглюкамин и глюкозамина гидрохлорид повышают содержание простагландина PGEi, простациклина PGI: и снижают уровень тромбоксана ТхВ2, простагландинов PGFia и PGFîa в сыворотке крови интактных крыс.
6. Диоксаглюкамин и глюкозамина гидрохлорид нормализуют содержание эндогенного N-ацетилглюкозамина в сыворотке крови и слизистой оболочке желудка крыс с язвой желудка, вызванной сочеганным введением этанола и преднизолона, стрессом или ацетилсалициловой кислотой.
7. Диоксаглюкамин и глюкозамина гидрохлорид являются перспективными потенциальными противоязвенными средствами гастропротекторного типа действия.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Дослцркення противиразковоГ та репарацшноТ ефективност! Д-(+)-глюкозамшу //Школа академика ОЛ.Черкеса: ineï, розвиток, перспективи: Тези доп. наук, конф., присвяч. ЮО-ргсчю з дня народження академ1ка ОЛ.Черкеса. -Ктв, 1994. - С.80-81. (Соавт. Ал^феров О.В.).
2. Вплив оксаглюкамшу на стан сурфактантно! система легеневих екст-ракпв при набряках легенш у щур1в /Л конгрес cbîtoboï федераци Украднських фармацевтичних товариств: Тези доп.- jlbbîb, 1994,- С.345-346. (Соавт. Плющ C.I., Мкж>р£ова СВ., Зупанець I.A.).
3. Вивчення впливу екзо- та ендогенного глюкозамшу на розвиток та nepeßir виразковоУ хвороби шлунка //Сучасщ проблеми фармаци: Тези доп. Респ. наук.-практ. конф.-Харюв, 1994.-С.265-266. (Соавт. Зупанець I.A.).
4. Клшшо-прогностичш аспекти вивчення BMicry ендогенного глюкоз-ам1ну при запально-д1строф1чних процесах внутр^шшх оргашв //Тези доп. наук, конф. - Харив, 1994. - С.4. (Соавт. Ahïcïmob C.B., Попов С.Б.).
5. Биологическая активность солей на основе 0-(+)-глкжозамина и R-глугараниловых кислот //Деп. В ГНТБ Украины 16.06.95, №1550-Ук95.-
Харьков, 1995.- 8 с. (Соавт. Исаев С.Г., ЗупанецИ.А., Жегунова Г.П., Пав-лий А.И., Яременко В.Д., Ткач A.A.).
6. Изучение влияния аминосахара Д-(+)-глюкозамина на развитие и течение язвенной болезни желудка //Вестник научных исследований. -1995. - №6.
7. Пор1вняльний анал1з противиразкового ефекту похдаих D-(+)-nmo-козам1ну та оксамшових кислот //Перший Украшський конгрес гастроентеро-лопв: Тези доп.- Дншропетровськ, 1995.- С.27. (Соавт. Павлш O.I., Зупа-нець I.A.).
8. Сравнительная оценка репаративной активности глкжозамина и обле-пихового масла при язве желудка //Междунар. науч. конф., посвящ. 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова: Тез. докл. - Харгав, 1995.- С.360-361. (Соавт. Шляева И.Е.).
9. Глюкозамин. Распространение в природе, метаболизирование, физико-химические свойства и биологическая активность //Деп. в ГНТБ Украины 22.01.96, №349-Ук96. - Харьков, 1996.- 34 с. (Соавт. Яременко В.Д., Исаев С.Г., Павлий А.И., Зупанец И. А.).
10. Метод определения N-ацетилглюкозамина в биологическом материале //Информац. письмо. - Харьков: РПК "Фармация", 1996. - Вып.З. - 4 с. (Соавт. Зупанец Й.А., Дроговоз С.М., Марван Мансур, Исаев С.Г., Плющ С.И., Семенов А.Н., Жегунова Г.П., Павлий А.И., Яременко В.Д., Ткач A.A.).
11. Исследование влияния производных глюкозамина на секреторную функцию желудка //Лекарства - человеку: Междунар. сб. науч. статей. - Харьков, 1996. - Т. 1. - С.329. (Соавт. Яковлева JI.B., Зупанец И. А.).
12. Вивчення впливу амшоцукру Д-(+)-глюкозам1ну на nepeöir процесш перекисного окисления лшццв при виразковш хвороб! шпунку /АЫзюлоля i патолопя перекисного окисления, гемостазу та ¡муногенезу: Тези доп. наук, конф. - Полтава, 1996. - С.42-43. (Соавт. Зупанець I.A., Алхферов О.В.).
13. Gastroprotective Properties of Aminosugar Glucosamine and its Derivates //Gut. - 1996. - Vol.39, Suppl. №3. - P.A156 (Соавт. Zupanets I.A., Chernych V.P.).
14. К вопросу об антихеликобактерной терапии язвенной болезни желудка производными глюкозамина //Досягнення та невиршет питания гастроен-терологй": Мат. наук, праць Республ. наук, практ. конф. - Харюв, 1998.- С.87. (Соавт. Зупанец И.А.).
15. Роль эндогенного глюкозамина в развитии патологии органов пищеварения //Актуальш проблеми юитчног фармакологи: П Укр. наук. конф. з М1жнар. угасло. - Вшниця: Мшан-ЛТД, 1998. - С. 185-186. (Соавт. Зупанец И.А., Мисюрева С.В., Бездегко Н.В.).
16. Обгрунтування викорисгання комбшацп етанол-предшзолон у скри-ншгу гастропротектор1в /ЖлЫчна фармащя. - 1998. - Т.2, №3. - С.29-33. (Соавт. Зупанець I.A., Яковлева JI.B.).
17. Основы внутренних болезней: справочник. - Харьков: Прапор, 1999. -80 с. (Соавт. Зупанец И.А., Коваленко В.Н., Бездетко Н.В., Попов С.Б., Жму-ро AB.).
18. Перспективы поиска гастропротекторов в ряду аминосахаров // "Досягнення сучасно! фармацй та перспектива н розвитку у новому тисячолггп": Мат. Y нац. зЧзду фармацевтов Украши. - XapKiB, 1999. - С.711. (Соавт. Бездетко Н.В.).