Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармацевтический анализ производных ароматических аминов в мицеллярных средах

На правах рукописи

ВАХИТОВА ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОИЗВОДНЫХ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОВ В МИЦЕЛЛЯРНЫХ СРЕДАХ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

?1 ,ЛЯ 2Ш

Казань 2013

005539045

005539045

Работа выполнена на кафедре аналитической химии, сертификации и менеджмента качества в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Бакеева Роза Фаридовна

доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», зав. кафедрой фармацевтической и токсикологической химии Плетенева Татьяна Вадимовна

доктор фармацевтических наук, доцент, ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, профессор кафедры

фармацевтической технологии Насыбуллнна Наиля Марсовна

ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита состоится « 13 » декабря 2013 года в 12 ч 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68, А-330.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского национального исследовательского технологического университета

Отзыв на автореферат в двух экземплярах просим направлять по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68, КНИТУ, учёному секретарю диссертационного совета Д 212.080.07

Автореферат разослан « 12 » ноября 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Нугуманова Гульнара Наиловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Разработка, совершенствование и валидация методов контроля качества лекарственных веществ (ЛВ) играет важную роль в обеспечении безопасности и эффективности применения лекарственных средств (ЛС). При этом одним из методов, широко используемых в фармацевтическом анализе, является спектрофотометр™, что обусловлено ее проработанной методической базой, доступностью аппаратуры и универсальностью по отношению ко многим объектам фармации. Однако ее широкое использование часто ограничивается проблемой избирательности и чувствительности определений ЛВ. Очевидно, эти обстоятельства приводят к необходимости применения селективных реагентов, как правило, в органической или смешанной среде. Это усложняет процедуру анализа, требует обеспечения устойчивости реагентов и повышает стоимость анализа за счет использования органических растворителей.

В полной мере это относится к анализу ЛВ, содержащих первичные аминогруппы, которые широко применяются в фармации. При этом используются хромогенные реагенты (карбонильные соединения, диазотирование с последующим азосочетанием и др.), недостатками которых являются низкая чувствительность, малоизбирательность, многостадийность и длительность анализа.

Один из путей решения этой проблемы - использование в фармацевтическом анализе организованных сред. При этом в мицеллах поверхностно-активных веществ (ПАВ) происходит увеличение растворимости гидрофобных реагентов, повышение агрегативной устойчивости фотометрируемых систем, изменение скорости реакций реагентов с ЛВ, причем чаще всего имеет место совокупность всех этих эффектов. Реализация такого подхода позволит более широко использовать спектрофотометрию в водных средах при фармацевтическом анализе. Применение мицеллярных систем также позволяет создавать специфические носители ЛВ -наноконтейнеры.

Работа выполнена в решках тематического плана научно-исследовательских работ Минобрнауки РФ, выполняемой в рамках государственного заказа НГР НИР 01201253744.

Цель работы заключалась в разработке мицеллярных систем для фармацевтического анализа соединений, содержащих первичные аминогруппы при использовании 5,7-дихлор-4,6-

3

динитробензофуроксана (ДХДНБФО) как реагента для чувствительных и избирательных спектрофотометрических определений в водных и водно-органических средах.

Для достижения цели были решены следующие задачи:

■ установление физико-химических характеристик процесса солюбилизации ДХДНБФО в мицеллах ПАВ и выявление оптимальных композиций для эффективного повышения растворимости ДХДНБФО в водной среде;

■ разработка подходов по спектрофотометрическому определению JTB и их примесей (на примере производных 4-аминобензойной кислоты и 4-аминофенола) при использовании иммобилизованного мицеллами ДХДНБФО как хромогенного реагента;

" выявление факторов, обеспечивающих чувствительность и избирательность определений аминосодержащих JIB в спектрофотометрических системах, установление детекционных свойств спектрофотометрических систем, изучение влияния компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый сигнал;

■ определение метрологических характеристик разработанных способов для подтверждения их соответствия требованиям, принятым для фармацевтического анализа;

■ исследование биологической активности мицеллярных растворов ДХДНБФО.

Научная новизна. В данной работе впервые:

- показано, что эффективность растворения ДХДНБФО в сферических мицеллах меняется в ряду: ДСН< ЦТАБ< ТгХ-100< Brij56, а в ряду неонолов: АФ9.6 < АФ9.10 < АФ9.12 < АФ9.8.

- установлено, что растворимость ДХДНБФО увеличивается в среде смешанных мицелл и выявлен оптимальный состав композиций, повышающих эффективность спектрофотометрического определения содержания JIB и их примесей, содержащих первичные ароматические аминогруппы (на примере производных 4-аминобензойной кислоты и -/-аминофенола);

- разработаны иммобилизованные мицеллами реагентные смеси на основе 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана и обоснованы рабочие условия, обеспечивающие чувствительность и избирательность определений ЛВ, установлены их детекционные свойства, изучено

влияние компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый сигнал при проведении фармацевтического анализа;

-предложена унифицированная методика спектрофотометрического определения ЛВ и их примесей, содержащих первичные ароматические аминогруппы в организованных средах на основе ДХДНБФО для контроля качества JIC;

установлена противогрибковая активность насыщенных ДХДНБФО водных и мицеллярных растворов относительно Trichophyton mentagrophytes и Candida albicans. На защиту выносится:

• результаты определения характеристик солюбилизации 5,7-дихлор-4,6-диниробензофуроксана в системах ионных (доде-цилсульфат натрия, цетилтриметиламмоний бромид) и неионных (оксиэтилированные нонилфенолы общей формулы АФд-п, п=6,8,10,12; октилфенол-9 (Tr Х-100), цетиловый эфир полиоксиэтилена (10) (Brij56)) ПАВ;

• результаты разработки иммобилизованных реагентных смесей на основе 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана для определения ЛС и примесей в них на примере производных 4-аминобензойной кислоты и ¥-аминофенола;

• результаты исследования и подбор оптимальных условий проведения фармацевтического анализа аминосодержащих ЛВ в спектрофотометрических системах;

• обоснование роли растворителя и компонентов анализируемой матрицы в формировании аналитического сигнала при определениях аминосодержащих ЛВ веществ в виде их производных с ДХДНБФО в мицеллярной среде;

• результаты изучения и влияния состава смеси, pH, свойств используемых реагентов и определяемого вещества на выбор условий чувствительного и избирательного детектирования ЛВ и компонентов при спектрофотометрическом анализе; методики определения производных первичных ароматических аминов в модельных и лекарственных формах;

• результаты определения антигрибкового действия 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана в насыщенных водных и мицеллярных растворах.

Практическая значимость. Разработаны экспрессные и чувствительные методики спектрофотометрического определения ряда

аминосодержащих JIB и нормируемых примесей в них при использовании ДХДНБФО в мицеллярной среде.

Предложенный методологический подход может быть использован для расширения возможностей контроля качества JIC и рекомендован для применения в рамках проведения сертификации для обеспечения безопасности ЛС. Предложенные методики позволяют повысить эффективность фармацевтического анализа путем использования одностадийных, чувствительных и экспрессных

спектрофотометрических методик JIB, значительно упростить и ускорить процессы пробоподготовки анализируемых образцов лекарственных форм.

Внедрение результатов исследования. Разработанные методики прошли апробацию на ОАО «Татхимфармпрепараты» и внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО «КНИТУ».

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика - 2009» (Йошкар-Ола, 2009), III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2009), II Международной конференции Российского химического общества им. Д.И.Менделеева (Москва, 2010), I Всероссийском симпозиуме с международным участием по поверхностно — активным веществам "От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград,

2011), I Всероссийской конференции по жидким кристаллам (Иваново,

2012), IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа-Абзаково, 2013).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 5 статьях в журналах, рекомендованных для размещения материалов диссертаций, 9 тезисах докладов на конференциях.

Личный вклад автора состоит в выборе и обосновании методик эксперимента, непосредственном его личном проведении, обобщении полученных результатов, установлении закономерностей и формулировке выводов. Автор выражает искреннюю благодарность д.х.н., проф. Сопину В.Ф., д.х.н., проф. Гармонову С.Ю., к.х.н., доц. Горбуновой Т.С. за научные консультации и помощь в работе, д.х.н. проф. Юсуповой JI.M. за синтез 5,7-дихлор - 4,6-

динитробензофуроксана, д.б.н., проф. Зобову В.В. и м.н.с. Волошиной А.Д. за определение биологической активности ДХДНБФО.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; экспериментальной части, в которой описана аппаратура, объекты, техника эксперимента и основной части, в которой изложены результаты с их обсуждением; выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 123 страницах, содержит 25 рисунков, 27 таблиц и библиографию из 155 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава содержит обзор литературных данных по свойствам ДХДНБФО как биологически активного вещества и как реагента для фармацевтического анализа, солюбилизации ЛВ в мицеллярных средах, применению организованных (мицеллярных) сред в фармацевтическом анализе JÏB.

Во второй главе дано описание объектов, методов и средств исследования ЛВ, схем и методик проведения экспериментов и расчёта физико-химических параметров. В работе использованы поверенные приборы: спектрофотометр Agillent - 8453, тензиометр Дю Нуи с платиновым кольцом, рН-метр и др. При выполнении работы применяли ДХДНБФО высокой степени чистоты, лекарственные вещества фармакопейной чистоты.

В третьей главе представлены результаты исследований процесса солюбилизации ДХДНБФО в мицеллах ПАВ и разработки оптимальных композиций для эффективного повышения его растворимости в водной среде.

Известно, что ДХДНБФО обладает высокой реакционной способностью при получении окрашенных производных ароматических аминов, что может быть использовано для их избирательного и чувствительного определения в органических и смешенных средах. Однако, эффективность применения ДХДНБФО как реагента для определения аминосоединений, так и в составе биологически активных композиций на его основе во многом определяется его малой растворимостью в воде.

Проблема повышения малой водной растворимости ДХДНБФО решалась нами с помощью использования мицеллярных систем. Для выявления оптимального ПАВ исследован процесс растворимости

ДХДНБФО в мицеллярных системах ионных (додецилсульфат натрия, ДСН, цетилтриметиламмоний бромид, ЦТАБ) и неионных (оксиэтилированные нонилфенолы общей формулы АФ9_п,п=6,8,10,12, октилфенол-9, Тг Х-100, цетиловый эфир полиоксиэтилена (10), Вгу56) ПАВ.

Как было показано ранее многими авторами, в водных системах указанных выше ПАВ формируются мицеллы Г. Хартли (рис. 1). Для выбора оптимальной мицеллярной системы определялись мольная солюбилизация, Ят5, то есть количество ДХДНБФО (моль/л), солюбилизированного одним молем ПАВ в мицеллярной форме, коэффициент распределения мицелла-вода, Км; свободная энергия солюбилизации, ДО50(табл. 1).

Таблица 1. Характеристические параметры солюбилизации систем ПАВ

ПАВ 10°ККМ моль/л моль/л *Rmi **lgK„ кДж/моль **** КМ Sm

АФ 9-4 0,058 1,7 0,42 3,98 -22,81 464

АФ 9-8 0,098 2,39 2,09 4,20 -24,02 875

АФ 9-ю 0,224 1,75 0,68 4,11 -23,51 387

АФ ».12 од 1,529 0,82 4,21 -24,12 548

Тг Х-100 0,239 2,77 0,44 3,93 -22,57 158/42

Brij 56 0,038 1,50 0,46 4,07 -23,28 218/87

ДСН 8,3 3,28 0,11 3,24 -18,53 35/6

ЦТАБ 0,85 2,40 0,34 3,77 -21,58 143/21

*Rm,s = (St-SKKM)/(C,-KKM); **КМ = Хм/Ха; Хм = IWU+ Rm,s); Ха = Skkm-Vm; К, = Rm s/{

SKKM"Vm(l+ Rro,s)}; ***AGS = -RTlnKM; K/N находили по уравнению: из наклона

зависимости (ЗгЗцкмУЗккм^СгСккм)- При известном числе молекул ПАВ в мицелле, числе агрегации N среднее число молекул ДХДНБФО на мицеллу определяли по формуле . Значения Rm s находили из наклона зависимости St - SKKM = f(Ct - ККМ), где S, и SKKM растворимость ДХДНБФО полная и при ККМ; С, - общая концентрация ПАВ, (Ct - ККМ) - концентрация ПАВ в мицеллярной форме. %м - молярная доля солюбилизата в мицеллярной фазе, Ха - молярная доля солюбилизата в водной фазе; Vm - молярный объём воды, Vm =0,01805 (іт3/моль при 298 К.; R - газовая постоянная (8,314*10'3 кДж/град*моль), Т - абсолютная температура (в данной работе 298 С), Км - молярный коэффициент распределения солюбилизата между мицеллярной и водной фазой.

Для определения величины мольной солюбилизации, Кт>, снимались спектры насыщенных ДХДНБФО растворов ПАВ при концентрациях до и после ККМ (рис. 2). Растворимость ДХДНБФО определялась при длине волны 410 нм. Расчет концентрации ДХДНБФО в мицеллах (Б) проводился по градуировочному графику, полученному в этаноле:

^дхднбфо- (А/1+0,711)/2259 (п=8).

Растворимость ДХДНБФО в воде составила 1,59 10"3 моль/л.

Ядро, 10-28 А Слой Штерна. неск. А

Ионная мицелла Г. Хартли

Слой Гуи-Чапмена. неск. сотен А

а^} /_оксизтиленозые

Яш1

'/ о

Нйммшцми

Неполярно« лекарственное соединен««

Анфифипьнве лекарегвенно* соединение

Слабополярное лекарственное соединение

Маленький нон

Рис. 1 Схематическое представление мицелл и солюбилизации в изученных водных системах ПАВ

400 450 500

X, пт

Рис. 2. Зависимость интенсивности полос поглощения ДХДНБФО в системе Вгц 56 + вода от концентрации ПАВ, 25 °С

Во всех рассмотренных водных мицеллярных системах растворимость ДХДНБФО резко возрастает с образованием мицелл, что доказывает солюбилизацию ДХДНБФО мицеллами ЦТАБ, ДСН,

Вгу 56 и ТгХ-100 (рис. 3,4). Для ДСН, ЦТАБ, ТгХІОО, Вгу 56, среднее число молекул ДХДНБФО на мицеллу 8т соответственно равно 6, 27, 42 и 87.

ЦТАБ: ККМ=8,5*Ю"4 моль/л

Ц 0,004

о 2

Вгіі 56: ККМ = 3,80*10* моль/л = 2,83*101® моль/л

/^Ш | -»- Вгі) 56 -•-ТгХ-100

Тг Х-100: ККМ = 2.39Ч0"4 моль/л ^ = 2,77*10"3 моль/л

-0,001 0,003 0,001 0.002 0,003 0.004 0,005 0,006

Рис. 3. Зависимость растворимости ДХДНБФО, 5дхднбфо от концентрации ЦТАБ, ДСН. 25 °С

Рис. 4. Зависимость растворимости ДХДНБФО, Бдхднвфо от концентрации Вгу 56, Тг Х-100, 25 °С

Эффективность солюбилизации (7?тл) в ряду сферических мицелл происходит следующим образом: Л„,„„: ДСН<ЦТАБ<ТгХ-100<Вгу56. Аналогично меняется коэффициент распределения ДХДНБФО мицелла-вода: ДСН<ЦТАБ<ТгХ-1 00<Вгу 56. Для неонолов увеличивается в порядке: АФ9_б<АФгмо<АФ9_12<АФ^8, а : АФ9.6 < АФ9_ю< АФ9.12< АФд_8, Наиболее предпочтительными для растворения являются мицеллярные растворы неионных ПАВ.

В четвертой главе представлены результаты по разработке подходов по спектрофотометрическому определению ЛВ и их примесей на примере производных 4-аминобензойной кислоты и 4-аминофенола при использовании иммобилизованного мицеллами ДХДНБФО как хромогенного реагента.

Целесообразность использования мицеллярных систем в фармацевтическом анализе обусловлена улучшением аналитических характеристик определений: чувствительности и снижения нижнего предела обнаружения. Однако непрогнозируемый механизм действия организованных систем на солюбилизированные компоненты и реакции в фармацевтическом анализе делает необходимым проведение систематических исследований в этом направлении.

Спектрофотометрическое определение производных 4-амино-бензойной кислоты в среде смешанных мицелл с использованием ДХДНБФО. При реализации подхода по определению новокаина с использованием ДХДНБФО как хромогенного реагента первым этапом является выявление оптимальной мицеллярной системы. Для ускорения процесса солюбилизации ДХДНБФО использовали систему АФ9-ю + ДСН + Н20 (80% об.) + ДМСО (20% об.). Как показано выше, наиболее предпочтительным для солюбилизации ДХДНБФО является неонол АФ9.10. В системе, содержащей АФ9.ю и ДСН, формируются смешанные мицеллы. Изучение влияния состава смешанных мицелл на ККМ показало, что наиболее предпочтительной для модификации реагентов в фармацевтическом анализе является система, состоящая из смешанных мицели АФцо и ДОТ при соотношении адфмс/адзгй75/0,25, поскольку в этом случае достигаются минимальные значения ККМ (ККМ=7,91 * 10"5 моль/л).

Количество солюбилизированного ДХДНБФО увеличивается с ростом концентрации ПАВ и достигает максимальных значений при концентрациях ПАВ~2-Сккм(вдвое превышающих ККМ). Максимальная солюбилизационная ёмкость наблюдается для системы при аАф(9-ю): адсн = 0,75:0,25 (рис. 5).

В основе применения ДХДНБФО для спектрофотометрического определения производных ароматических аминов в лекарственных формах может быть использована реакция нуклеофильного замещения, представленная на схеме:

з

Рис. 5 Зависимость солюбилизации (Б) от концентрации ПАВ в системах: 1 -сеАф9_1о:адсн = 1,00:0;

а'

2 - аАф9.10:адСН = 0,25:0,75;

3 - С(АФ9-1СЬ йдсн = 0,75:0,25 в системе АФ^ю+ДСН+ВР

10-Сп„, моль/л

СІ

В результате реакции получен продукт замещения ДХДНБФО новокаином (ДХДНБФОН) красно-оранжевого цвета. В его электронном спектре наблюдаются полосы поглощения при Лтах1 = 320 нм; Ящах2= 420 нм; е і тах і= 15900 л/моль-см; вхтах2 = 9500л/моль-см). Оптимальные условия определения новокаина спектрофотометричес-ким методом подбирались в результате анализа интенсивности полосы поглощения ДХДНБФОН в области максимума второй полосы поглощения (Хщах = 420 нм).

Для установления стехиометрии реакции получены кривые насыщения при неизменной концентрации ДХДНБФОН (рис.6), на которых зафиксирован излом в области, соответствующей молярному соотношению реагирующих веществ (ДНДХБФО + новокаин) 1:1 при рН 4.03.

Рис. 6 Зависимость оптической плотности ДХДНБФОН от концентрации новокаина: 1 "С дхднбфо =на4 моль/л; 2-С дхднбфо = 2-10"4 моль/л (Спав = 4-10"4 моль/л; 1 = 0,5 см), Хтоах2=420 нм;

С * 10 , моль/л

На рис. 7 представлены спектры поглощения ДХДНБФОН при различных значениях рН.

340 360 360 400 «О «0

X, пт

«О 500 520

X, пт

Рис. 7 Спектры поглощения ДХДНБФО (а) и ДХДНБФОН (б) в присутствии ПАВ при различных значениях рН: 1 - 2,56 ; 2 - 3,46 ; 3 - 4,03 ; 4 - 7,20; 5- 11,41; (С Пав = 4,010'4 моль/л; аАф9.ш : адсн = 0,75 : 0,25; 1 = 0,5 см) в среде ДМСО (20% ) + вода (80%)

Смещение полосы поглощения при рН = 11 до 380 нм можно объяснить образованием 7-хлор-5-гидрокси-4,6-динитробензофурокса-на в результате гидролиза ДНДХБФО. Следовательно, увеличение рН до значений 7-11 осложняет протекание реакции.

Зависимость оптической плотности растворов ДНДХБФОН и ДНДХБФО от рН при 420 нм представлена на рис. 8. Изменение А42о=Й[рН) для ДНДХБФОН в системе ДХДНБФО - новокаин - носит линейный характер (А=1,5386 - 0,1267рН, г = 0,9995) в интервале рН 2,5 - 7. Оптимальный интервал значений рН для определения новокаина составляет 2,5 - 4,0 ед. рН, поскольку в этом случае наблюдается максимальная разница между поглощением продукта и реагента.

Для оптимизации расхода реагентов и ПАВ изучены зависимости оптической плотности растворов ДХДНБФОН от концентрации ДХДНБФО (рис. 9). Для количественного протекания реакции достаточно 2х-кратного избытка ДХДНБФО или соотношения молярных концентраций 1:2, что существенно ниже, чем при проведении этой реакции в среде ДМСО (в отсутствие ПАВ), где требуется 20-кратный избыток реагента. Большее количество реагента использовать экономически нецелесообразно, а меньшее приводит к нарушению стехиометрии реакции.

Рис. 9 Зависимость А420 раствора ДХДНБФОН от концентрации ДХДНБФО (Сновокшиа= НО'4моль/л; Спав=4,0-10'4 моль/л; 1=0,5 см).

Рис. 10 Зависимость А42о раствора ДХДНБФОН от концентрации ПАВ (Сновокаина=М04 моль/л; Сдхднбфо=2'Ю"4 моль/л; 1=0,5 см).

На рис. 10 представлена зависимость А420 от концентрации ПАВ. При концентрации ПАВ « Н0~4М, близкой к ККМ смеси ДСН-АФ9.10 состава аАф9-1о-'адсн=0,75:0,25 наблюдается рост А42о- Максимальное значение А42о достигается в мицеллярной среде при Спав~3-4-Ю"4 моль/л, что обусловлено концентрированием реагента (ДХДНБФО) в смешанных мицеллах ПАВ. Снижение А42о обусловлено ограниченным значением солюбилизационной ёмкости мицелл, поскольку количество ДХДНБФО в мицеллах ограничено, и дальнейшее его добавление не приводит к проникновению в мицеллы.

Оптимальной для ПАВ является концентрация, которая обеспечивает максимальную чувствительность определений новокаина, то есть, Спав =410"4 моль/л (~4 величины ККМ).

Таким образом, оптимальные условия спектрофотометрического определения новокаина следующие:

- состав организованной (мицеллярной) среды: АФ9.10 (0,75) + ДСН (0,25) +Н20(80% об.) + ДМСО (20 % об.), адсн: аЛФ9.,0=0,25: 0,75;

- общая концентрация ПАВ: 4-10"4 моль/л (~ 4 величины ККМ);

- оптимальный интервал значений рН составляет ~ 2,5-4,0 ед.

- оптимальная спектральная область: Л,пах = 420 нм (для рН 4);

- 2-кратный избыток реагента относительно определяемого вещества или соотношение молярных концентраций Сдщ©и> Ссккив = =2:1;

В данных условиях линейная зависимость оптической плотности от концентрации новокаина в растворе сохраняется в широком интервале определяемых концентраций:

А =-0,024 + (16,65 ± 0,71) С (мг/мл) ехшах=14000 л-моль"'-см"'(г = 0.9985; п=10)

Предел обнаружения составляет 0,30 мкг/мл. Проведение фармацевтического анализа в присутствии смешанных мицелл повышает чувствительность определений относительно стандартизованных методик, способствует снижению расхода ПАВ и ДМСО.

Для оценки селективности методики изучалось влияние компонентов пробы на результаты определений. Установлено, что спектрофотометрическому определению новокаина не мешает присутствие потенциальных компонентов и примесей в широких пределах (табл. 2).

В табл. 3 представлены результаты определения содержания новокаина в готовых лекарственных формах различных производителей. При этом важным приложением является возможность применения разработанного подхода для анализа новокаиновой соли бензилпенициллина в препаратах пенициллина пролонгированного действия. В условиях анализа ^Ы-дибензилэтилендиаминовая соль бензилпенициллина не оказывает мешающего влияния на результаты определений. Это позволяет проводить контроль качества препаратов пенициллина на основе новокаиновой соли бензилпенициллина. Полученные результаты удовлетворительны по своим метрологическим характеристикам.

Таблица 2. Исследование влияния компонентов - примесей и вспомогательных веществ на результаты определения новокаина (п = 5; Р = 0,95)

Компоненты Содержание Соотношение Введено Найдено

(А) компонента Сд/снов новокаина, новокаина,

Са, моль/л мкг/мл мкг/мл

4-Аминобензойная 0,50-Ю-4 0,5:1 27,28 27,25±0,31

кислота 1,00-И)-4 1:1 27,28 28,23±0,92

1,00'КГ1 1:2 54,56 55,6±1,4

Фенол 0,50-Ю"4 1:2 27,28 28,0±1,02

МаС1 0,145 1450:1 27,28 27,17± 0,54

СаС12 0,270 2700:1 27,28 27,21±0,45

Таблица 3.Определение новокаина в лекарственных формах (п = 5, Р = 0,95)

Лекарственная форма Фирма — изготовитель Дата изготовления / предельный срок хранения Содержание новокаина Содержание поНД

Новокаин (раствор для инъекций) ОАО «Органика» г.Новокузнецк 12.2008/ 01.2012 4,927 ±0,063 мг/мл 5 мг/мл

Новокаин (раствор для инъекций) ОАО «Биосинтез» г.Пенза 01.2009/ 02.2012 4,98±0,10 мг/мл 5 мг/мл

Новокаин (раствор для инъекций) РУП «Борисовсий завод медицинских препаратов», Республика Беларусь 01.2009 / 02.2012 20,43±0,81 мг/мл 20 мг/мл

Бициллин 5 ОАО «Синтез» г.Курган 01.2009/ 02.2012 19,99±0,54% 19,8 %

Новокаиновая соль бензнлпенициллина ОАО «Синтез» г.Курган 06.2007/ 06.2010 99,7±2,5% 99,9%

Новокаин (свечи ректальные) ОАО «Нижфарм» г.Нижний Новгород 11.2008/ 10.2012 0,109±0,012 0,1 г

Таким образом, на примере анализа ряда модельных растворов и готовых лекарственных форм показана возможность спектрофотометрического определения новокаина в исследуемых матрицах. Использование ДХДНБФО для получения производного в мицеллярной среде позволяет проводить чувствительные и избирательные определения производных 4-аминобензойной кислоты.

Спектрофотометрическое определение 4-алшнофенола в мицеллярных средах на основе ТгХ 100. Для определения примесей первичных ароматических аминов использовали мицеллярную систему Тг Х-100 + Н20 (80% об.) + ДМСО (20% об.). На рис. 11

показаны спектры поглощения продукта синтеза ДХДНБФО с 4-аминофенолом (ПАФ) и продукта взаимодействия этих соединений в мицеллярной среде Тг Х-100.

Спектр поглощения продукта реакции в присутствии Тг Х-100 содержит полосу поглощения в той же области длин волн, что и выделенный продукт, что подтверждает их идентичность и отсутствие влияния Тг Х-100 на направление реакции. При добавлении ДХДНБФО в раствор ПАФ течение 30 минут устанавливается окраска, которая сохраняется долгое время (интенсивность и положение полосы поглощения при 420 нм не меняется в течение 10 суток).

Рис. 11. Спектры поглощения:

1 - выделенного продукта синтеза ДХДНБФО с ПАФ (С = 1-Ю'4 моль/л);

2 - продукта взаимодействия ПАФ с ДХДНБФО в присутствии ТгХ-100 Сдхднбфо = 0,75-10"4 моль/л, Спаф = 3-Ю"4 моль/л, С тг-хюо = 1,25-10'3 моль/л , 1 = 1см)

Для оптимизации расхода реагента и Тг Х-100 изучались зависимости оптической плотности полосы поглощения продукта от концентрации ДХДНБФО и Тг Х-100 (рис. 12). Для количественного протекания реакции достаточно 2-кратного избытка реагента, в то время как проведение этой реакции в среде ДМСО в отсутствие ПАВ, требует 20 - кратного избытка реагента. Зависимость оптической плотности от концентрации Тг Х-100 выходит на предел при концентрациях ПАВ выше Сккм- Оптимальной является концентрация, равная ~ 2,5 - 5С исм-

Таким образом, использование мицеллярной среды для протекания реакции позволяет значительно снизить рабочую концентрацию реагента без потери эффективности анализа.

При проведении спектрофотометрических измерений для построения градуировочного графика готовили растворы ПАФ с концентрацией в диапазоне от 0,5-10"7 до 2Т0"5 моль/л. Линейность

17

0.0-1-"-1— ■*'■••■ -1-- I ' ■ I --1-■-1-р

360 400 420 440 460 480 500

к, НМ

градуировочных зависимостей сохраняется во всем диапазоне определяемых концентраций и имеет вид:

А = - 0,002 + (0,235 ± 0,010) С (мкг/мл); п=8

/

^ 0.«

С«»ЛН,.о"10 '. МОПЬ/Л

Ст,х-,оо*10".МОЛи/л

Рис. 12. Зависимость оптической плотности (А460) производного ПАФ с ДХДНБФО от концентрации: а) ДХДНБФО или соотношения Сдхднбфо/ СПАф Спаф = МО"4моль/л; СТг.хюо= 2,5-Ю"3 моль/л; 1 = 1 см; б) Тг-Х100; С ПАФ = 1-10 моль/л; Сдхднбфо = 2-10"4 моль/л; 1 = 1 см

Верхняя граница диапазона определяемых содержаний ПАФ - 0,11 мг/мл. Нижняя граница диапазона определяемых содержаний (Сн) составляет: 0,054 мкг/мл (0,50-10"6 моль/л) или ~ 0,0027 %, что на порядок ниже, чем при использовании стандартизированной методики с нитропруссидом натрия (0,50 мкг/мл).

На примере модельных растворов была проверена возможность спектрофотометрического определения ПАФ в присутствии различных лекарственных веществ. Полученные результаты удовлетворительны по своим метрологическим характеристикам (табл. 4). Это позволяет определять ПАФ в парацетамоле на уровне более низком, чем его предельно допустимое содержание. В таблице 5 представлены результаты определения содержания ПАФ в готовых лекарственных формах различных производителей.

Проверка линейности зависимости величины отклика от концентрации определяемого вещества осуществлялась в рамках валидационного процесса. Для методик определения нормируемых примесей в качестве критерия линейности использовались значения коэффициента корреляции г >0,98.

Линейность графика сохраняется в широком диапазоне определяемых концентраций ПАФ: З-Ю'^-Ю"4 моль/л и выше. Поскольку разрабатываемая методика предназначается для

определения примесей, то определение верхней границы не проводилось. Однако полученные данные говорят о том, что методику можно использовать и для определения содержания основного компонента (лекарственных средств на основе ароматических аминов - новокаин и др.).

Таблица 4. Исследование влияния компонентов - примесей и вспомогательных веществ на результаты определения л-аминофенола (п = 5; Р = 0,95)

Компоненты (А) Содержание компонента С(А),моль/л Соотношение С (А)/С(ПАФ) Введено ПАФ, мкг/мл Найдено ПАФ, мкг/мл V

Парацетамол 0,5(М(Г5 1:1 0,545 0,540±0,020 0,030

1,00-Ю-4 10:1 1,090 1,150±0,069 0,048

2,50-Ю"3 100:1 2,725 2,77±0,16 0,046

Аскорбиновая кислота 5-Ю"5 5:1 1,090 1,053±0,045 0,034

Ацетилсалици ловая кислота 5-105 5:1 1,090 1,093±0,046 0,024

Фенол S-IO"5 5:1 1,090 1,062^0,040 0,030

Таблица 5. Определение 4-аминофенола (ПАФ) в лекарственных формах (п=5, Р=0,95)

Лекарственная форма Фирма - изготовитель Дата изготовления / предельный срок хранения Содержание ПАФ, №І0\ %

Парацетамол ОАО «Фармстандарт Лексредств» 12.2007/ 01.2012 22,9±1,4

Панадол « Фамар С.А.»(Греция) для «Смит Кляйн БичемКонсьюмер Хелскер» (Великобритания) 10.2007/ 10.2011 4,709±0,060

Цитрамон П ЗАО «Меднсорб» (Пермь) 10.2007 / 11.2011 7,11±0,21

Колдрекс «СмитКляйн Бичем С.А.» для «Глаксо Смит Кляйнн Консьюмер Хелскер» 06.2007/ 06.2010 6,10±0,18

При оценке селективности изучено влияние вспомогательных веществ (плацебо) на результаты определений. Присутствие 100-кратного избытка парацетамола, 50-кратного избытка фенола, ацетилсалициловой и аскорбиновой кислот, 1000-кратного избытка

неорганических веществ не мешает анализу. Определению ПАФ также не мешает присутствие потенциальных компонентов и примесей в широких пределах.

В данных условиях зависимость оптической плотности от концентрации ПАФ в растворе линейна и описывается уравнением (1= 1см):

А=0,0419+56,03 С (мг/мл) (г=0,990; п=10)

Таким образом, разработана методика определения ПАФ с использованием мицеллярных систем Tr Х-100 в водно-диметилсульфоксидных средах.

Биологическая активность мицеллярных растворов ДХДНБФО. В связи с тем, что ДХДНБФО также является компонентом биологически активных смесей антимикробного и фунгицидного действия нами исследовано действие его растворов в мицеллярных средах на Staphilococcus aureus, Escherich, Bacillus cereus, Trichophyton mentagrophytes, Aspergillus niger, Candida albicans. При изученных концентрациях в водных системах ПАВ сформированы, мицеллы.

В мицеллах ЦТАБ ДХДНБФО снижает антибактериальное действие самого ЦТАБ. При этом ДХДНБФО проявляет одинаковое противогрибковое действие в водных и водно-мицеллярных средах. Причем в отношении дрожжеподобного гриба Candida albicans и Trichophyton mentagrophytes (возбудитель дерматозов человека и животных) наблюдается полное угнетение тест-микроорганизмов, а в случае фитопатогенного гриба Aspergillus niger происходит лишь незначительное замедление его роста.

Таким образом, антигрибковая активность ДХДНБФО сохраняется в мицеллярных системах. Учитывая данные по солюбилизации, мицеллярные системы неионных ПАВ можно рекомендовать в качестве наноконтейнеров для ДХДНБФО при разработке систем транспорта JIC, предпочтительными из которых являются мицеллы неионных ПАВ: Brij 56 и Tr Х-100 вследствие их меньшей токсичности и большой солюбилизационной ёмкости.

ВЫВОДЫ

1. Разработан унифицированный подход по спектрофотометричес-кому определению производных ароматических аминов при использовании иммобилизованного мицеллами 5,7-дихлор-4,6-

динитробензофуроксана как реагента. Показано, что эффективность его солюбилизации меняется в ряду прямых сферических мицелл: ДСН< ЦТАБ<ТгХ-100<Вгц56, в ряду неонолов: АФ9.6<АФ9.1о<АФ9.12< АФ9.8.

2. Установлен оптимальный состав мицеллярных систем при определениях производных -/-аминобензойной кислоты и 4-аминофенола, а также состав продуктов с 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксаном (1:1), их спектральные характеристики и влияние рН на интенсивность поглощения, условия количественного образования окрашенных производных с фотометрическим реагентом в организованной среде.

3. Обоснованы и установлены условия спектрофотометрического определения новокаина в виде производного с 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксаном (Хтах = 420 нм) с пределом обнаружения 0,3 мкг/мл. Выявлены факторы регулирования избирательности, чувствительности и экономичности определений подбором мицеллярной среды (АФ9-10 (0,75) + ДСН (0,25) +Н20 (80% об.) + ДМСО (20 % об.), адсн: аАф9.ю=0,25:0,75; концентрации ПАВ 4-Ю"4 моль/л; рН 2,5-4,0 и молярного соотношения Сдхднбфо : СНОВОкаиН = 2:1), устойчивости во времени. Методика использована для анализа новокаиновой соли бензилпенициллина в препаратах пенициллина пролонгированного действия.

4. Установлены условия спектрофотометрического определения 4-аминофенола в лекарственных формах на основе парацетамола при использовании мицеллярной системы Tr Х-100 + Н20 (80% об.) + ДМСО (20% об.). При этом валидационные параметры соответствуют требованиям фармацевтического анализа нормируемых примесей ЛС. Нижняя граница определяемых содержаний составляет 0,054 мкг/мл или 0,002 %. Определению не мешает присутствие 100-кратного избытка парацетамола, потенциальных примесей и вспомогательных веществ. Методика апробирована при контроле качества многокомпонентных лекарственных форм парацетамола различных производителей.

5. Установлено проявление антигрибковой активности ДХДНБФО относительно культур Trichophyton mentagrophytes и Candida albicans в мицеллярных растворах в присутствии неионных ПАВ (Brij 56, Тг X-100).

Публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных для размещения материалов диссертаций:

1. Бакеева, Р.Ф. Спектрофотометрическое определение я-аминофенола в лекарственных препаратах при использовании 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана как реагента в мицеллярной среде / Р.Ф.Бакеева, Т.С. Горбунова, O.E. Вахитова, А.И. Гайсина, JI.M. Юсупова, С.Ю. Гармонов, В.Ф.Сопин // Химико-фармацевтический журнал. - 2010,- Т.44,-№ 4. - С. 35-39.

2. Бакеева, Р.Ф. Модификация 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана для применения в качестве аналитического реагента и компонента биологически активных композиций. 4.1 Иммобилизация смешанными мицеллами / Р.Ф. Бакеева, Т.С. Горбунова, Л.И. Сафиуллина, O.E. Вахитова, С.Ю. Гармонов, JI.M. Юсупова, В.Ф. Сопин // Вестник Казанского технологического университета. - 2010. - №5. - С.48-54.

3. Бакеева, Р.Ф. Модификация 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана для применения в качестве аналитического реагента и компонента биологически активных композиций. Ч.Н Солюбилизация в смешанных мицеллах / Р.Ф. Бакеева, Т.С. Горбунова, Л.И. Сафиуллина, O.E. Вахитова, С.Ю. Васютина, Л.М. Юсупова, В.Ф. Сопин // Вестник Казанского технологического университета. - 2010. - №5. - С.60-65.

4. Бакеева, Р.Ф. Использование наноструктурированных мицеллярных сред для модификации 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана при определении ароматических аминов / Р.Ф. Бакеева, Т.С. Горбунова, O.E. Вахитова, Л.И. Сафиуллина, С.Ю. Гармонов, Л.М. Юсупова // Вестник Казанского технологического университета. - 2010. - №10. - С.37-45.

5. Бакеева, Р.Ф. Солюбилизационная способность неионных ПАВ по отношению к биологически активному 5,7-дихлор-4,6-динитробензофроксану / Р.Ф. Бакеева, O.E. Вахитова, Л.М. Юсупова, В.Ф. Сопин // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. -Т16. -№4. -С.73-77.

Материалы конференций:

1. Бакеева, Р.Ф. Спектрофотометрическое определение л-аминофенола в лекарственных препаратах при использовании 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана как реагента в мицеллярной среде / Р.Ф. Бакеева, Т.С. Горбунова, O.E. Вахитова, А.И. Гайсина, Л.М. Юсупова, С.Ю. Гармонов, В.Ф.Сопин // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика - 2009». -Йошкар-Ола, 2009. - С.33-34.

2. Бакеева, Р.Ф. Спектрофотометрическое определение л-аминофенола в лекарственных препаратах на основе парацетамола в мицеллярной среде / Р.Ф. Бакеева, Т.С. Горбунова, O.E. Вахитова, А.И. Гайсина, Л.М.

Юсупова, В.Ф. Сопин, С.Ю. Гармонов // Материалы III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России». -Краснодар, 2009. - С. 376.

3. Бакеева, Р.Ф. Солюбилизация компонента лекарственного препарата 5,7— дихлор-4,6-динитробензофуроксана в смешанных мицеллах неонола и додецилсульфата натрия Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и биопродуктов / Р.Ф. Бакеева, Т.С. Горбунова, O.E. Вахитова, JIM. Юсупова, В.Ф. Сопин // Материалы II Международной конференции РХО им. Д.И.Менделеева. - Москва, 2010. -С. 201-203.

4. Вахитова, O.E. Иммобилизация смешанными мицеллами 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана для применения в качестве аналитического реагента Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и биопродуктов / O.E. Вахитова, Р.Ф. Бакеева, Т.С. Горбунова, Л.М. Юсупова, В.Ф. Сопин // Материалы II Международной конференции РХО им. Д.И.Менделеева. - Москва, 2010. - С. 214-216.

5. Бакеева, Р.Ф. Эффект солюбилизации фуроксана на аналитическое определение аминосодержащих лекарственных препаратов / Р.Ф. Бакеева, Т.С. Горбунова, O.E. Вахитова, С.Ю. Гармонов, Л.М. Юсупова, В.Ф. Сопин, В.П. Барабанов // Материалы I Всероссийского симпозиума по поверхностно - активным веществам с международным участием "От коллоидных систем к нанохимии». - Казань, 2011. - С. 56.

6. Бакеева, Р.Ф. Спектрофотометрическое определение новокаина в среде смешанных мицелл / Р.Ф.Бакеева, Т.С. Горбунова, O.E. Вахитова, С.Ю. Гармонов, Л.М. Юсупова, В.Ф. Сопин // Материалы XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. - Волгоград, 2011. -Т.4. - С.316.

7. Бакеева, Р.Ф. Влияние смешанных мицелл на взаимодействие лекарственных препаратов 5,7-дихлор-4,6-динитробензфуроксана с новокаином / Р.Ф. Бакеева, О.Е Вахитова, Л.М. Юсупова, В.Ф.Сопин // Тезисы докладов I Всероссийской конференции по жидким кристаллам. -Иваново, 2012.-С.134.

8. Бакеева, Р.Ф. Солюбилизация 5,7-дихлор-4,6-динитробензфуроксана в мицеллах неонолов / Р.Ф. Бакеева, O.E. Вахитова, Д. Мустафина, В.Ф. Сопин // Тезисы докладов I Всероссийской конференции по жидким кристаллам. - Иваново, 2012. - С. 135.

9. Бакеева, Р.Ф. Исследование возможности использования самоорганизованных мицеллярных сред на основе неионных ПАВ в качестве векторов биологически активного соединения 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана / Р.Ф. Бакеева, O.E. Вахитова // Тезисы докладов IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии. Уфа-Абзаково, 4-8 июня 2013. -

Уфа. - Изд-во ФГБОУ ВПО "Башкирский национальный исследовательский технологический университет", 2013, с.44.

Соискатель

Вахитова О. Е.

Заказах.

Тираж /Ор

экз.

Офсетная лаборатория КНИТУ, 420015, Казань, К.Маркса, 63