Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование адсорбентов аффинного типа для разделения, очистки и анализа кумаринов, их производных и кумаринсодержащих лекарственных средств

Ш г 5

> (

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИИ

ИНСТИТУТ

ИССЛЕДОВАНИЕ АДСОРБЕНТОВ АФФИННОГО ТИПА ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ, ОЧИСТКИ И АНАЛИЗА КУМАРИНОВ, ИХ ПРОИЗВОДНЫХ И КУМАРИНСОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

На правах рукописи

¡ШКАРЕНДА Вадим (Васильевич

УДК 615.074:547.814

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ — 1992

Работа выполнена в Кемеровском государственном медицинском институте.

Научный -руководитель: кандидат химических наук, доцент П. В. Кузнецов.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор А. 3. Абышев, кандидат фармацевтических наук, доцент Л. С. Теслов.

Ведущее учреждение: Институт биологической и медицинской химии Академии медицинских наук СССР.

Защита состоится 2-3 и^Сон^Я- 1999 года ч ']^2-СЮЧя. сов на заседании специализированного Совета Д 084.63.01 при Санкт-Петер1бу,ргском химико-фармацевтическом институте .по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в -библиотеке Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института (Санкт-Петер'бург, ул. Профессора Попова, 4/6).

Автореферат разослан .»_уХуЛЗ-^Й-__1992 г.

Ученый секретарь

специализированного Совета, кандидат фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ ■ Актуальность темы. Лекарстзенные средства, лроизводнио

;/кумарина, благодаря высокой терапевтической эффективности широко применяются в медицинской практике в качество препаратов антикоагулянтного, фотосенсибилиэирушцего и спазмолитического действия. Обнаруженные в последнее десятилетие антиаритмичео-кое действие, ингибирущее действие на вирус иммунодефицита человека у природных кумаринов, а также противоопухолевая, ан-тиаллергаческая активность у некоторых синтетических производных кумарина указывает на большие перспективы дальнейшего изучения кумарииовых соединений.

Вместе с тем остро ощуааетоя недостаток способов Цитохимического анализа кумаринсодержащих лекарственных растений, методов контроля качества и биофармацевтичёской оценки комплексных кумаринеодержащих лекарственных средств, основаниях на разделении сложных смесей кумаринов, в' том числа с другими низкомалекулярными соединениями. Таким образом разработка новых аффективных и экономичных способов резделения и выделения . кумаринов является важной задачей химических и фармацевтических исследований.

В связи с этим большой интерес вызывает метод, жидкостной , колоночной хроматографии, сочетающий процедуру разделения сложных смесей, с выделением индивидуальных компонентов. Однако удовлетворительные результаты, при использовании традиционных полимерных адсорбентов полиамидной и декстрановой структуры достигаются лишь на больших препаративных чолонках, а кремнезёмные адсорбенты (ешшкагель и его химически модифицированные аналоги) для аналитического разделения эффективны только

. - г-

8 режиме Ьлсокого давлений. Поэтому проблема поиска универсальных адсорбентов для хроматографии как в аналитическом, так у. препаративном масштабе при обычно» и низком давлении остаётся актуальной.

I

! Новые перспективы в этом отношении открывают методы хи-/иической модификации полимерных матриц, на основе стратегии I1 синтеза классических аффинных адсорбентов, В настоящее время I известные адсорбенты аффинного типа со специфическими лиганда-I ии (альбумин сыьоротки крови человека, орозомукоид, цикло-' декстрины и др.) применимы только для разделения оптических ' изомеров некоторых производных кумарина, что существенно ограничивает их практическое использование.

Аффинные адсорбенты о фенольными и полифенолыщми лиган-дами имеют высокую эффективность при выделении и очистке некоторых биополимеров (фенол-, полифенолзависимых ферментов, стероидных рецепторов), но их применения для разделения низкомолекулярных фенольных соединений, в том числе кумаринов не осуществлялось.

Таким образом создание.адсорбентов по стратегии аффинного синтеза и изучение влияния их структурных фрагментов (мат. рицы, вставки, лигандов) на эффективность хроматографического разделения производных кумарина в области неклассической аффинной хроматографии имеет больаое теоретическое и практическое значение, позволяет существенно расширить возможности современных методов фармацевтического и фитохимйческого анализа.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась з получении адсорбентов аффинного типа для жид-.

костной колоночной хроматографии производных кумарина и изучении возможностей их применения з области фотохимического и фармацевтического анализа кумаринов и их производных.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1.' Изучить йозможность использования некоторых ^модифицированных полимерных хроматографических матриц в анализе кумаринов методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления.

2. Синтезировать на основе выбранных матриц адсорйснты о фенольными и полифенольными лигандами.

3. Изучить влияние особенностей методов химической модификации полимерных носителей, тонкой структуры синтезированных адсорбентов на эффективность разделения кумаринов.

и. Исследовать характер взаимодействия кумаринов о полученными адсорбентами, разработать условия разделения многокомпонентных смесей производных кумарина, в том числе с другими типами низкомолекулярных биологически активных веществ,

5. Разработать простые, альтернативные способы выдзления кумаринов из растительных экстрактов, методики их анализа в фитопрепаратах и комбинированных лекарственных средствах:.

Научная новизна работы. Впервые для разделения кумаринов методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления-использованы химически немодифицированныв лоливинильные и по-ликетакрилатниз носители, адсорбенты аффинного типа. Синтезировано более 70 новых азоадсорбёнтов с различными структурными фрагментами системы: матрица-вставка-лиганд.

Впервые разработана альтернативные пути получения проме-

х^точных аминоадсорбентов черев гидразииопроизводные триазик-актавированных носителей, поззолявщие получать бинарные адсорбента для разделения низкомолекулярных биологически активных веществ.

I Показана возможность одностадийного группового разделения ¡различных по химической структуре низкомолекулярных соединений: / кумаринов, феколокислот, фенолов, азотсодержащих веществ. I Впервые установлен феномен влияния концевых гидразиновых групп на адсорбции произяэдных 4-охсикуыарина (фепромарон, на-одккумарин и др.) и фенолокислот.. Обнаружен и изучен эффект изменения хроматографической подвижности производных 4-окси-кумарина на фоне сладовых количеств нейтральных солей и минеральных кислот в подвижной фазе. Впервые показано селективное изменение хроматографической подвижности неодикумарина при содержании в подвижной фазе или импрегнации адсорбентов ионами двухвалентных металлов (кальция, меди и др.).

На основа разработанных способов разделения и выделения кумаринов из растительных экстрактов предложены альтернативные к известным методы анализа рада кумаринсодерлсадих лекарственных средств.

Новизна исследований защищена авторским свидетельством § 1481985, на две заявка на изобретения получены положительные решения ШИШИ (от 29.07.91 и от 28.03.91).

Практическая значимость работы. Сунтезированыгполимерные азоадсорбенты с фенольными и полифенольными лигандаш и способы разделения производных кумаринй, а также других полифеноль-

них соединения могут быть рекомендованы для использования в области фармацевтического и фотохимического анализа. Разработанный способ очистки танина и конденсированных дубильных веществ может применяться для получения вепеотв-стандартов.

Результаты проведённых исследований внедрены во Всесоюзном НИИ химии и технологии лекарственных средств (акт внедрения от 20.03,91), внедрены и вклвчены в материалы лекций, семинарских и практических занятий для студентов фармацевтического факультета Кемеровского государственного медицинского института (акт внедрения от 15.03.92).

Основные положения, зынооимыа на защиту.

1. Скрининг немодифицированных полимерных носителей для разделения производных кумарина методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления. •

2. Синтез и хроматографический скрининг ппдиморных адсорбентов аффинного типа о фенольными и полифеколья ими лигандами.

3. Результаты определения влияния структурных фрагментов и концентрации лигакда на адсорбентах аффинного типа на эффективность разделения куиаринов. Результаты оптимизации условий разделения производных кумарина.

4. Методики разделения многокомпонентных смасеД, содержащих различные группы растительных биологически активных веществ - кумарины, фенолы, фенслокислоты, флавоноиды, дубильные и азотсодержащие вещества.

5. Методики разделения, выделения куиаринов из растительных экстрактов и анализа кумаринсодерявщих. фитопрепаратов.

- б -

i Апробация работы. Основные результаты диссертации доло-иены на Всесоюзной, распубликансшх, областных научных конференциях: "Новыа лекарственные препараты из растений Сибири и Дельного Востока" (Томск, 1989), "Реализация научных достижений в практической фармации" (Харьков, 1991), "Резервы совер-

1"'енсгаования лекарственного обеспечения населения РСФСР" (Вла-^имир, X99I), "Соотояние и перспективы развития фармации в Си-еири и на Дальнем Востоке" (Томск, 199I), "Применение современных методов аналитической химии на предприятиях Кузбасса" (Кемерово, 1969), "Актуальные проблемы фармации Кузбасса" (Кеые-' рово, 1989), "Молодые учёные Кузбасса - народному хозяйству" (Кеиерово, I9SO), "Здоровье человека в Сибири" (Красноярск, 1990), "Вопроси теоретической и практической медицины" (Кемерово, 1991), "Актуальные вопросы фармацевтической науки и практики" (Курск, 1991).

. Публикации. Основные материалы исследований опубликованы в 15 работах, в том числе в авторской свидетельстве на изобретение С* -1*81965).

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов работы, экспериментальной частиц выводов.

Работа изложена на Iii страницах машинописного текста, содержит i-5" таблиц, А 8 рисунков, список литературы включает источников, из них 11Ъ на иностранных языках.

_ 7 -СОДЕРЖАНИЙ РАБОТУ

I. Выбор полимерной матрицы и синтез адсорбентов аффинного типа

Разделение кумаринов проводили не хронатографических колонках фирмы "iKcLtmazia" (Швеция): 150 х 5 мм (аналитическая), 250 х 12 wm (препаративная), которые подключали к перистальтическому насосу и коллектору фракций нЛ!афрак - 002" (СССР), Де-тектировение осуцейтвдяли на спектрофотометре СФ-26 (СССР). Полноту разделения кумаринов определяли методом ТСХ (Георгиевский В.П. о ооавт., 1990, SatnesTv^n BoWttM., 1971). Идентификацию пиков проводили методом ТСХ и УФ-спектрофотоиетрш (Перельсон М.Е. с соавт., 1975 ). Расчёт значений ёмкостных факторов кумаринов и разрешения пиков, проводили по известным методикам (Схун-макеро П., Г989).

3 качества полимерных носителей для последующей химической модификации нами исследованы как известные в жидкостной колоночной хроматографии кумаринов полиамидные (полиамид), полисахэрид-ные (сефадеко,. сефароза, агароза) адсорбенты, так и нетрадиционные поливинильНы8 (тойопэрл, Япония) и полиметакрилатныв (сферой, Чехословакия) матрицы. Способность.'к аналитическому разделению модельных смесей кумаринов: 4-оксикумарин-эокулетии- 4-метилум-бэллиферон (!i I); ^-оксикунарин-мармезин-ксантотоксо^'(№ 2) в условиях жидкостной колоночной хроматографии низкого давления проявилась лишь у адсорбентов тоЯопзрл HW-40 - HW-75 а сферой CL -300, а также у аминосфероновых адсорбентов (сферой Ача-1000) разных лет выпуска (серия-1, сёрия-2).

С целью более детальной, характеристики выбранных полимерных адсорбентов были установлены значения ёмкостного фактора для

4-метилумбеллиферона ( Ран86 Уке использованного в хро~

морографических исследованиях (2)uxe(iK42>ieR6 Н., 1986), определена динамика его изменения в зависимости от концентрации полярного модификатора (этанол) в подвижной фазе (рис. I).

i

о ■ Тойопёрл HW -50 • • Тойопзрл HW-65 д ■ Тойопзрл Ш-40 а Тойопзрл mi-75 Сфэрон Ача-ЮОО: а оерия-1 х серия-2

к»

w ¡>>

я •в-

и р

20*° Ч'О Концентрация атенола в подвижной фазе (#)

Рис. I. Динамика изменения

В табл. I представлены результаты определения разрешения пиков (^ ) .компонентов модельных смесей кумаринов: эскулетин-¡»-ыэтилумбеллиферон (№ Э); кумарин- 4-ыэтилумбеллиферон (» 4).

Исследования показали, для разделения производных кумарина на тоЯопорлоЕых адсорбентах в качестве подвижной фазы может быть использована дистиллированная вода. Для достижения оптимального соотношения между временем разделения и значением модельной смеси кумяринов на более гидрофобных сфероновых адсорбентах рекомендуется использовать изократическнй градиент злюции 20^-ным. этанолом. Хроматографией трёхкомпонентных модельных смесей В I .и В 2 были выявлены более тонкие различия в селективности немо-дифидарованных тоИопёрловых матриц. Полное разделение кумаринов наблвдалоеь только на —40 и 1ГМ-50, но серьЗзным ограничени-

- 9 - ' ■

ом практического применения первого может <3ыть ухудшение динамических свойств, вследствии сильного уплотнения адсорбента со временем. На тойопЗрло НЧУ -65 иШ0-75 происходило перекрывание пиков 4-оксикумарйна о эскулетипом, или мармезином, но по значениям модельных смесэй № 3 и эффективность эшэ у Ш-75.

Таблица I.

Значения Л уу^ на немодифицированных полимерных носителях и разрешения пиков ) модельных смесей № 3 и № Ч. Подвижная фаза - Ю$-ный этанол.

№ п/п Полимерный носитель . Ид . модельных смесей

й 3 ш ц ■••

I ТоПопзрл #-50 1,98 0,70 0,46

2 ТойопЗрл НК/-65 2,73 0,56 0,91

3 Тойбперл Н» -40 3,47 0,92 Г, 60

и. Тойог1§рл Н^-75 5,02 0,75 ■ Г,27

Сферой;Ача-ЮОО

5 серия-I 8,85 0,78 * -----

б серия-2 11,71 0,76 *

7 Сферой -300 10,38 ' 0,64

* Подвижная фаза: 20^-ныЙ этанол Таким образом.предварительный скрининг позволил определить наиболее эффективные из полимерных адсорбентов при разделении кумаринов методом жидкостной колоночной хроматографии иизкого давления. Для последупщей химической модификации, о целью повышения селективности адсорбентов, наибольший интерес представляют тойопорл Н^-50 (аналитический или микрогтрепаративный масштаб) и обе серил'сферона Ача-1000 (препаративный масштаб разделения).

, На первой атепе химической модификации полимерных аосигмей к а различных типов тойопарла (1ь) нами били получены опоксипро-йз1|олние (16) по кодифицирован).ому методу Аксена к триазинактивц-роранные производные (1в) по модифицированному методу Турковой (ом. схску 1.1). . ' '

I Затем проводили иммобилизацию вставки, с помовдю извистшм реакций производных (I а,б) с гидразидами карбоновых кислот: пиштробочзгкАразидрм, гадразидом Л/-(п-нитробензол л)-6 -аьыао-кАшроновой кислоты (Клпвдцкий Б.А. и сотр., 1986), а также.с ■п-иитроатцином (Гузов В.М., Усааов G.A., 1988), 3 результате поучены нитропроизводше (II а-в) с различными по длине вставками, одержащиыи в структуре оксипропилышв группы. Аналогично были олучеьы производные (Иг) триазинактивированного тойопйрла (Г.в), схема 1.1.

Далее нитронроизведнкз (II а-г) воертанавливали с помощью дитионита натрия по методу Кемпбола до аминопроизводных (ПГа-г), см. схему 1,2,

Для получения ешнолроиззодных был разработал альтернативный путь, через гидразинопроизводные триаэн накопированного той-опарла (I в), которые вводили.в реакцию•непосредственно с некоторыми сложными афирами п-аминобензойной кислоты (новокаин), или вкидали суль$аниловой кислоты.(сульфадимезин), см. схему 1.3. Upj стон вар)акте синтеза устраняется стадия »орстановяения нит-ролроизводных, облегчается отмывка адсорбентов. Поскольку гидразин болае реакционоспособен, чем гидразиды кислот, то в. данном варианте возможно замещение обоих атомов,хлора в триазиновом остатке. Поэтому полученние аиинопроизводные (ГЦ д,е) могут с одер- '

ОН

I б II а-з *

ОН

. се

.. ' . I в Иг.

II , 2~ — (а); (б); -ЫН-рСН^ЫН-^ (в )•

Схема 1.1.

* Эта.часть рабсты выполнена совместно с П.З.Кузнецовым я.ассистентом кафедры ч/.и. Борсегяном.

кать.'В структуре некоторое количество нёпрореагировавших гидра- . экно^их групп,

i II а-г III а-г

jll, -c^tKH^WfHfH-g- СО;

I (в); j^jjT - ^g (г)

Для иммобилизации фзнольных и полифенольных /лигандов нами Ьспользовалаоь роакция азосочетания, после предварительного диа-/зотирования аииноцрокзводных (III а-в), см. схему 1.4.

Азоадсорбенты на основе иолииетахрилатной матрицы синтезированы нами из сфероиа Ача-IOOO (III ж) по схеме 1.5.

В качестве лигандов для азоадоорбентов использовали следующие группы фвнольиих. и полифенольных соединения: I. Фенолы (фен л, резорцин, пирогаллол и др.); 2. Фенолокислоты'(галловая, н-аминосалициловая кислота); 3. Кумарины (4-оксикумарин, 4-мбтил-уибеллиферон и др.); 4. Флавоноиды (рутин, кверцетин, квтехик и др.); Дубильные вецества: а) гидролизуемые (танин), б) конденсированные (из листьев брусники, коры акации й др.).

Дубильные вещества, осаждали из во Днях экстрактов раствором желатина (Блажей А., Шутый Л., 1977), затем очищали и выделяли хроматографией на сефадексе. €•-50, а также на синтезированных адсорбентах с резорциновым и катехиновым лигандами. Некоторые образиы полифенольных лигандов получали методом конденсации ду-

бйлышх веществ коры дуба. Отсутствие низкомолекулярных примесей в образцах танина, дубильных веществ контролировали методом ТСХ (Кемертелидзе Э.П. и сотр., 198% ,Tiu.tomu.H.eiaß.,1986 ).

III а-е Ц 17 a-a

ГУ, 2 = -CHsCH-CHrN4-W- "CHgCH-CHfWH'AÍH-jJ-

он ОИ О

(ö);

Схема LA. . Ь

^ НО.

Схема 1.5.

- 15 -

Качественный и количественный анализ на стациях синтеза адсорбентов проводили классическими методами, использувлимися в аффинной хроматографии (Буркова Я., 1960). Концентрация связанного лигйнда, на тойопорловых адсорбентах (1У а-г, и 1Уд,в ), которая была установлена по результатам количественного определения иммобилизованных зпоксигрупп н триязияовых групп, на превышала соответственно б-Ю мкМ/мл и 9-16 мкМ/мл. Концентрации ли ганда после заключительной огадии синтеза определяли спактрофотометрическин методом. На сфероновцх адсорбентах (серииг! и серии-2),для резорцинового лиганда данная величина составила соответственно - 5С и 95 мкМ/мл, а для лиганда - п-аминооалицйловой кислоты - 58 и 275 мкМ/мл. Столь значительная ровница на адсорбентах серии-2, на наш взгляд,вызвана образование^ бис-азокрасителей в виде майроциклов на поверхности адсорбентов, •

2. Влияние структурнах фрагментов системы; матрццо-вртавка-лиганд на оффективнооть разделения кумаринов

Влияние метода активации матричн; структуры вставки и ли-гаьдов на эффективность разделения кумаринов определяли по величинам В§ модельных смесей > 3 и К V. Установлено, что адсорбенты группы 1У а-г имели незначительный разброс . , Наибольшей селективностью срзди них обладают!зпокскактивдрованнне адсорбенты. 1У е-в. Улучшение разделения модельных смесей №1, № 2, а также метоксипроизйодных псоралена наблюдалось.яа адсорбентах 1У б, в. Данную группу адсорбентов исследовали'по структуре лигандов, что позволило рекомендовать для аналитического раздоления кумаринов ' адсорбенты 1У б,в с резорциновом и катехиновым ^лигавдом. .■

На сфероновых адсорбентах ГУ ж различных' серий, в отличий от

тойопорловых, посла химической модификации значения воз-

растали в 1,4-1,6 раз (серия-I) и болвб чем в 3 раза (серия-2). Значения Rg на первых достигали 1,1-1,2, на вторых были ниже, чем на исходном III к. Тем.не менее, ввиду высоких значений (jyjjjj некоторые из них (с лкгандами - катохин, фенол) ногут применяться для препаративной хроматографии кумаринов.

После частичного гидролиза фрагмента "вставка-лиганд" у малоэффективных адсорбентов 17 » (серия-2 с концентрацией лиганда 95-275 мкМ/мл) достигало,! удовлетворительный уровень значений 1?д, аналогичный адсорбентам серая-!. .Таким образом оптимальный уро- -вонь концентрации иммобилизованного лиганда на сфероновыг: адсорбентах составляет 50-58 мкМ/мл. •

3. Хроматографические свойства адсорбентов аффинного типа На всех типах адсорбентов легко разделяется смеси оксикума-риноз и их гликозкдов (эскулин~аскулетин и др.), ко только некоторые адсорбенты показали удовлетворительные результаты разделения модельных смесей № L и i 2. В аналитическом масштабе на адсорбентах группы 1У е-г разделения скополешна, эскулетина, герниа-рина не происходило, но становилось.возможным, при использовании адсорбентов группы' 1У д,е (например смеси: гернийрин-эскудетин, ксантотоксин-ксантотоксол и др.)« Указанные снеси разделялись и ■ на сфероиавых адсорбентах 1У ж, серии-I. Общее количество кумари-нов в модельной смеси может, достигать 4-5. соединений, например: мармезкн-ксантотоксШгизопимпинеллин-бергаптен-императ'орИй или' аскулин-эскулетин-ангелицин-виснадан-императорин. При хроматографии кумаринов с .резко выраженными липофильными свойствами (оотол, кмператорин, атамангин.и др.) необходимо увеличение элюирусией • силы, подвижной фазы. 3 зависимости от гндрофобйооти адсорбента.

содержалиэ этанола л адвенте нояег ¡варировать от 10 до 50#. Установлено, что увеличение объёма адсорбента в 2,5 раза позволяет пятикратно увеличить нагрузку на колонку, при которой величина снижалась лишь иа 30$. На рис. 2. показано разделение ыестикомпонентной смеси кумаринов:..эскулин(1)~кумарин(2)-эскуле-тин(З)- 4-метилуыбеллиферон(4)-ксантотокскн(5)-пеуцвнидан(б).

-х-х~ А 250* --^275* — ^ 320 нм'

Объём подвижной фазы.(мл) Рис. 2. Хроматография модельной смеои кумаринов но колонке 250 х 5 мм. с адсорбентом группы 1У б. Детек£мрова~ иие:

время разделения 3,1 часа. Комплексная оценка адсорбентов показала возможность разделения кумаринов в смеси о другими природными полифенольными и азотсодержащими соединениями (например: 4-метилумбеллифэрон, бер-гаптен, салициловая кислота, кверцетан, тиамин). В отношении модельной смеси, содержащей: пирокатехин(1)-кофэйнуп кйслоту(2)-кумарин(3)~зскулетин(4) болеэ эффективными оказались адсорбенты группы 1У е,д, полученные через гидразинопроизводныз триазинакти-вированного тойопарла (рис. ?.). Таким образом сочетание распределительного и адсорбционного механизмов разделения является важным преимуществом синтезированных адсорбентов, по сравнении с традиционными кремнезёмными адсорбентами.

- 18 -

4. Хроматографическое поведение производных кумарша Анализ результатов хроыатографичесхого поведения производных кумарина на сферонових и тойопёрловых (1У а-г) адсорбентах позволил определить порядок элюции кумаринов:

4-окоикумарин - Мармезкн - Кумарин - Скополетин - Герниарин -Эскулин ■• ■• Зокулетин

б-метилкумарин - 4-метилумбеллиферон - Ксантотокоол - Псорален -

.Ангелицин

Ксантотоксин - Изопимпинеллин - Бергаптен - Саыидин - Пеуцени-дин - Императорин - Остол - Атамантин - Изоимператорин

Таким образом,злюирование кумаринов происходит в порядке увеличения их липофильных свойств, ко при этом наблюдается более слабое удержвакие незамеченного кумарина и псоралена, в отличии от их ркси- илиметоксийроизводных.

На тойопэрловых адсорбентах. 1У д,в величины удерживаний эо-' кулетина,;скополетииа, ксантогоксола были в 1,5-3,0 раза выша. Кроме этого едоррбировьлиоь 4-оксикумарин, его производные (нео-д'ихумарин, фепроыарон и др.)»" а также фенолокислоты (кофейная, коричная,, бензойная и др.). Для'из элгарования использовали 0,4 М раствор хлорида натрия' или его смесь с этанолом (до 20,?).

, ■' Применение в качестве подвижной фазы растворов нейтральных орлей или соляной кислот4 на.адсорбентах 1У а-г,.по отношению к производным 4-гОксикумарина приводило, к противоположному эффекту -адаорбции. Полученные .результаты- свидетельствуют о. существенных . различиях в механизмах взаимодействия, кумаринов о адсорбентами, что определяется'спецификой химической структуры последних.

Порядок злпирования производных 4-оксикумарина на адсорбен-,тах;с тойоп3]рловой матрицей (ХУ а-г) имеет оледусций вид:

4-оксикумарин - Зарфарик - '¿епромарон - Аценокумарин

Неодикумарш

Влияние добавок соляной кислоты в элюент, приводящее к резкому усилении удерживания всех соединений, начинало проявляться с концентрации £0"^ - 1,5 х 1С"11 М. При концентрации 2,5 х Ю-1* И значения ёмкостного фактора (К ) у всех производных, кроме не. одикумарина стабилизировались. При добавлении растворов хлорида

натрия значения К. варфарина и фепромарона стабилизировались на

■' ? '

уровне концентрации 2 х 10 М, а емкостный фактрр неодикумарина ' продолжал увеличиваться. В отличии от остальных производных у.неодикумарина возрастало удерживание (в 2 и болев раз) после импрегнации адсорбенгов ±У а-г ионами двухвалентных металлов (кальция, меди и др.). На основании полуденных результатов нами разработана методика разделения модельной смеси кумариновых антикоагулянтов и карбокромена (рис. 4.).

■ Анализ х'роматографического поведения производных кумарина, с использованием следующих типов подвижной фазы: I - К)~50$-ныЙ этанол; 2 - 0,4-1,0 М. растворы хлорида натрия; 3 - 0,5-2,0 М растворы мочевины, позволил установить, что.в механизме взаимодействия кумаринов ей сфероновымм и тойопёрловыии адсорбентами (1У а-г) главну.й роль играют гидрофобные взайнодейсгвия .и. водородные связи, а.азотсодержащих соединений (харбокромен и Др.) ионный тип связи. Адсорбенты 1У д,е проявляет слабые ионообменные свойства, которые появлялись со стадии образования гидразинопро-изводных. После блокировки гидразиновач групп, формальдегидом резко изменялись значений К§ модельных смесей кумаринов, хотя эф~ : фект адсорбции фенологаслот и производных 4-оксикумарина сохранялся.

- ги-

л я 3>

о , я . 1,0

g Т>1

и с Ы2 .

S 1.0- iVI iif

к о •в 'Air

ir s О 1/lV g í 1 54 ^

Ё О

I 50 100 (V , мл) Рис. 3. Хроматография модельной смеси кумаринов, фенолов, фенолокислот на-адсорбентах: а) |У а-г; б) 1У д,е. Подвижная фаза: А - дистиллированная вода; Б -Ю^-йый этанол; В - 20^-ныЯ этанол; Г - 0,4 М раствор хлорида натрия. Детектирование: *—^320 ' ---"К 275 ни' ВРеМя анализа 1,0-1,5 часа

л ^

о о

§

. о я

es

ем

Рис. 4

1.0

A )3 3 г

J i

<0 я о

Л

4

50

¡у

100 (V , мл;

, Хроматография смеси:, кумарин(1)- 4-о:ссикумарин(2)-неодикумарин{3)-фепромарон(4)-карбокромен(5), Подвижная фаза: А- ГнМ раствор соляной кислоты; Б -дистиллированная вода; В - 65#-ны8 этанол; Г - 2 М

.раствор хлорида натрия.

В - 65#-ны8 этанол; Г Адсорбент - ЗУ б,

Э

'3. Применение полифеноллкгандной хроматографии в гибридных методах анализа лекарственных фитопрепаратов

С использованием известных фитопрепаратов из кумаринсодержа-щих растений (экстракт красавки густой, настойка полыни) разработаны методики микропрепарагивного разделения кумаринов, препаративного выделения фракций оксикумаринов (эскулетин, скополетин и др.). По сравнении с работами других авторов (1Йалк1 1?., ,КшпдтУ.

,1987) установлено, что синтезированные адсорбенты превосходят по эффективности кремнезёмные адсорбенты.

Разработанный метод определения фурокумаринов в препаратах "Аммифурин","Лсоберан" отличаются от известных простым техническим оснащением, позволяет концентрировать и выделять минорные компоненты препаратов. Предложен метод анализа препарата "Эскузан", в основа которого лежит одностадийное разделение и определение основных действующих компонентов - кумаринов, флавоноидоэ- и др.»количественное определение тиамина. Разработанные способы рекомендуются также для аналогичных по составу препаратов, как альтернативные известным методам анализа. Таким образом показаны пути практического применения новых полимерных адсорбентов в' области фитохимического и фармацевтического анализа.

.ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено разделение кумаринов методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления на поливинильных и поли-метакрилатных адсорбентах. На основе эпокси- и триазинактивиро-ванных носителей впервые синтезир ваны азоадсорберты аффинного типа о фенольными'и полифенольнымй.лигандами.

2. Сравнительное исследование влияния типа матрицы, химической структуры вставки и лигандов адсорбентов на разделение кумаринов позволило рекомендовать для аналитического и микропрепарагивного разделения эпоксиактйвярованные адсорбенты с матрицей

- 22 -

НЧ*/-55 о резорциновым и катехиновым лигандами. 3 отношении сложных смесей фенольных соединений лучшие результаты показали адсорбенты на основе гидразимопроизводных тойопэрла Н\*/-75, с резорциновым лигандом. ].

3. Для препаративной хроматографии кумаринов рекомендуются эпок-сиактивированные адсорбенты с матрицами тойопёрл НФ/ -65, Ш-75 (лиганд - резорцин), и сфероновые адсорбенты с концентрацией лигандов - 50-58 мкМ/мл.

Разработаны методики разделения многокомпонентных смесей кумаринов, а также включмщих фенолы, фенолокислоты, флавоноиды, азотсодержащие вещества. Адсорбенты полученные через гидраэи-нопроизводные тойопёрла избирательно повышают удерживание эс-кулетина, скололетина,. ксанготоксола, адсорбируют производные 4-оксикумарина и фбнолокислоты.

5. Элюирование кумаринов происходит главным образом в порядке увеличения липофильных свойств, при этом наблюдается более слабое удерживание незамещённых кумарина и псоралена, в отличии от окси- или метокеипроизводных. 3 механизме удерживания кумаринов на адсорбентах преобладают гидрофобные взаимодейст-

. вия, учавотвуют водородные связи. Установлено, что причиной проявления ионообменных свойств некоторыми адсорбентами является присутствие в структуре гидразиновых групп.

6. Оптимальное разделение кумаринов достигается при изокретичес-ком градиенте элюции. 3 качестве подвижной фазы.могут использоваться дистиллированная вода, водный зтанол, растворы минеральных кислот, нейтральных солей и их комбинации. Обнаружена элшрухщая способность к кумаринам у растворов мочевины.

7. Разработаны методики аналитической и микропрепаративной колоночной хроматографии низкого давления для исследования экстрактов кумаринеодержащ'их растений, превосходящие по эффективности аналогичные методы с применением кремнезёмных адсорбентов.

8. Предложены хромато-спектрофотометрические методы анализа компонентов кумаринсодержащих фитопрепаратов "Аммифурин","Псобе-ран" и комбинированного лекарственного средства "Эскузан". Они рекомендуется для аналогичных,по составу препаратов, как альтернативные известным методам анализа.

- 23 -

Основные результаты исследовьний опубликованы в следующих paf этах:

1. A.c. 1481985 СССР. Способ получения полимерных адсорбентов для выделения и очистки азотсодержащих алкалоидов / Кузнецов П.З., Вавилихина И.Б., Барсегян С.С., Шкаренда З.В., Фёдоров И.В. - •

б с. - от 22.01.89.

2. Решение ЛШГПЭ от 29.07.91, Способ очистки таника / Кузнецов П.В., Шкаренда В.В.

3. Решение ¿ШШГПЭ от 28.03.91. Способ разделения и выделения куыаринов 1 Кузнецов П.З., Шкаренда 3.3.

4. Кузнецов П.З., Шкаренда 3.3. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ. I. Определение фурокумариьов в фитопрепаратах // Хим.-фарм. журнал, - 1991, -» 4. - 0. 72-75.

5. Кузнецов П.В., Шкаренда 3.13. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследования физиологически активных вецеотв. II; Новые подходы г. разделению, выделению и очистке оксикумаринов // Химия пр1род. соедин. - 1991. - * 4. - С. 475-481.

6. Кузнецов П.В., Шкаренда 3.3., Фёдоров И,В. Жидкостная'микро-полу препаративная хроматография на адсорбентах аффинного типа -перспективная область фармацевтических исследований // Резервы, совершенствования лекарственного обеспечений населения РСФСР; Тез.докл. научно-практической конференции и пленума Всероссийского научного общества фармацевтов. - Секция 3. - Владимир, 1991, - С. 40-41. " -

7. Кузнецов П.В., Шкаренда 3.3., Суптелова О.В.' Синтез адсорбентов аффинного типа для полифеноллигандкой хроматографии биологически активных веществ // Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Дальнем Востоке: Тез.докл. научна-практической конференции. - Ч. 2. - Томок, - 1991. - С. 148-149. •

8. Кузнецов П.З., Фёдоров И.З,, Шкаренда В.В. Хроматография на адсорбентах аффинного типа - перспективное направление в фитохимии // Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока: Тез.докл. Всесоюзной научной конференции. - Т. 2. -Томск, - 1989. - С. 89-90.

9. Жидкостная колоночная хроматография лекарственных средств на полимерных адсорбентах / Барсегян И.Б., Барсегян С.С., Фёдоров И.В., Шкаренда В. В., Махлав А,3. // Молодые учёные Кузбасса -народному хозяйству: Тез.докл. областной научно-практической конференции. - 41. 1. - Кемерово, ¿990. - С. 29.

10. Шкаренда 3.3., Кузнецов П.В. Влияние параметров системы "матрица-вставка-лигакд" адсорбентов аффинного типа на хромато-графическое поведение оксикумаринов // Реализация научных достижений в практической фармации: Те.докл. республиканской научной конференции. - Харьков, 1991. -С. 177-178.

11. Шкаренда. В.В., Кузнецов П.£1. Применение полимерных адсорбентов аффинного типа.для очистки и выделения полифевольных соединений // Актуальные вопросы фармацевтической науки и практики: Тез.докл. научно-практической конференции. - Ч. 2. - Курск, 1991, 0. 101-105.

12,.Шкаренда В.В., Кузнецов П.З. Выделение дубильных веществ на полимерном адсорбенте аффинного типа // Актуальные проблемы фармации Кузбасса: Тез.докл. областной научной конференции фармацевтов. - Кемерово, 1989. - С. £09-1II.

13. Шкаренда В.В., Кузнецов П.В. Анализ лекарственных средств содержащих растительные биологически активные вещества на адсорбентах аффинного типа //.Применение современных методов аналитической химии на предприятиях Кузбасса; Тез.докл. научно-практического совещания. - Кемерово, 1988. - С. 91.

14. Шкаренда В.В. Методы разделения кумаринов на полимерных адсорбентах //Вопросы теоретической и клинической медицины: Тез. докл. научно-практической конференции. - Кемерово, I99I.-C. 49-50

15. Шкаренда В,В. К исследованию механизмов связывания неодику-марина " In trittd', хроматографией на адсорбентах аффинного типа // Здоровье человека в Сибири: Тез.докл. 5-ой конференции молодых учёных. - Красноярск, 1990. - С. 139-140.

КемПК, löö^r. Зак .1170.