Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследования по стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего дубильные вещества

На правах рукописи

Гринько Елена Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО ДУБИЛЬНЫЕ

ВЕЩЕСТВА.

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 6 ЯНЗ 2012

Москва-2011 г.

005009541

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

член-корр. РАМН, профессор Самылина Ирина Александровна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна

Доктор фармацевтических наук Потанина Ольга Георгиевна

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита диссертации состоится «/¿7» 12 г. в т на заседании

Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время ассортимент лекарственных средств растительного происхождения в России составляет более 40%. Лекарственное растительное сырье (ЛРС), содержащее дубильные вещества широко применяется для получения лекарственных препаратов, обладающих вяжущим, кровоостанавливающим, противовоспалительным действием. Эта группа растительного сырья включена в ГФ XI, ГОСТы, ФС.

Измельченное ЛРС, содержащее дубильные вещества, отпускается из аптечных учреждений без рецепта для приготовления настоев и отваров в домашних условиях. ЛРС должно быть стандартизированным и соответствовать высоким нормам фармакопейных требований.

В Государственную Фармакопею XI издания (ГФ XI) включено 11 статей на ЛРС, содержащее дубильные вещества, а также общая фармакопейная статья «Определение содержания дубильных веществ в ЛРС», которые требуют совершенствования и гармонизации с международными фармакопейными требованиями.

Актуальным является разработка и совершенствование методик по идентификации ЛРС, в том числе измельченного и порошка, определения содержания действующих веществ; создание проектов современной нормативной документации на ЛРС, содержащее дубильные вещества.

Цель исследования. Проведение комплексных теоретических и экспериментальных исследований по стандартизации фармакопейного ЛРС, содержащего дубильные вещества.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• провести анализ требований отечественной и зарубежной нормативной документации и научных данных по стандартизации ЛРС, содержащего дубильные вещества;

• изучить вариабельность диагностических признаков цельного,

измельченного и порошка ЛРС с использованием микроскопического метода;

• изучить спектральные и хроматографические характеристики ЛРС;

• разработать характеристики подлинности ЛРС с использованием современных физико-химических и микроскопических методов анализа;

• оптимизировать фармакопейные методики определения содержания дубильных веществ в ЛРС с использованием современных физико-химических методов анализа.

• изучить возможность использования нового реактива осаждения для определения содержания дубильных веществ в ЛРС.

Научная новизна. На основании микроскопического анализа разных морфологических групп сырья, получены новые данные по вариабельности диагностических признаков при измельчении сырья, позволяющие идентифицировать порошки 9 видов ЛРС, содержащего дубильные вещества.

При сравнительном изучении диагностических признаков измельченного сырья корневищ бадана, змеевика, лапчатки, имеющих пучковый тип строения; корневищ (беспучковый тип строения) и корней (вторичное строение) кровохлебки, выявлены отличия в строении и размерах сосудов ксилемы, механических волокон (змеевик, лапчатка), особенностей формы и размеров кристаллических включений оксалата кальция.

Диагностическое значение в измельченном сырье коры дуба и калины имеют лубяные волокна и каменистые клетки.

Измельченное сырье плодов черники, черемухи, ольхи имеет характерные особенности в строении эпидермиса, каменистых клеток, формах кристаллических включений оксалата кальция.

Разработаны характеристики подлинности для 13 видов ЛРС на основе изучения морфолого-анатомических особенностей сырья и физико-химических свойств биологически-активных веществ (БАВ), содержащихся в ЛРС.

На основании изучения анатомического строения измельченного ЛРС различных морфологических групп предложены оптимальные условия пробоподготовки ЛРС для получения ИК- и КР-спектров. Впервые получены и описаны ИК- и КР-спектры 11 видов сырья и 8 стандартных образцов; подобраны оптимальные условия проведения тонкослойной хроматографии (ТСХ) для 11 видов сырья.

На основании результатов реакции взаимодействия 1% раствора коллагена с комплексом дубильных веществ, содержащихся в водных извлечениях 13 видов сырья, предложен способ определения содержания дубильных веществ в сырье, включенный в Патент, подтвержденный Заявкой на изобретение № 2010 141622 от 12.10.2010г.

Практическая значимость работы.

Полученные результаты по идентификации 11 видов ЛРС с использованием микроскопического и физико-химических методов предложены для включения в проекты фармакопейных статей.

Методика определения содержания суммы дубильных веществ методом спектрофотометрии предложена для включения в проект ОФС «Определение содержания дубильных веществ в ЛРС».

Полученные данные микроскопического изучения измельченного сырья и ТСХ внедрены в учебный процесс на кафедре фармакогнозии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Основные положения, выдвигаемые на защиту. Вариабельность и сравнительное изучение диагностических признаков цельного, измельченного сырья и порошка ЛРС, содержащих дубильные вещества; ТСХ-характеристики, спектральные характеристики (ИК, КР) и обоснование оптимальных условий пробоподготовки ЛРС для их получения; результаты определения содержания дубильных веществ и отдельных компонентов в ЛРС методом спектрофотометрии и ВЭЖХ; совершенствование фармакопейной методики определения содержания дубильных веществ в ЛРС.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на Научно-практической конференции "Стандартизация готовых лекарственных средств", г. Москва, 25.05.2010г.; Итоговой Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием "Татьянин день", г. Москва, 24-26.01.2011г.; XXI Московской международной гомеопатической конференции "Развитие гомеопатического метода в современной медицине", г. Москва, 28-29.01.2011г.; Научно-методической конференции "Гаммермановские чтения", г. Санкт-Петербург, 1-3.02.2011г.; Всеукраинской научно-практической конференции студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств", г. Харьков, Украина, 20-21.04.2011г.

Личный вклад автора. Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику. Автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 5 и 6 паспорта фармацевтической химии, фармакогнозии.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (№ государственной регистрации 012.20606352). Тема включена в план научных

исследований кафедры фармакогнозии «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учетом влияния антропогенных факторов, оценки качества и сертификации».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 3 в ведущих изданиях, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на № страницах и содержит 34 таблицы, 78 рисунков.

Работа состоит из введения, обзора литературы, четырех экспериментальных глав, общих выводов, списка литературы и приложений. Библиографический указатель включает 162 источника литературы, из них 36 зарубежных.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе приведены результаты информационно-аналитического исследования библиографических данных о химическом составе, уровне стандартизации лекарственного растительного сырья, фармакологической активности, применении лекарственного растительного сырья, содержащего дубильные вещества.

В «Экспериментальную часть» включены главы 2-5. Во второй главе «Объекты и методы исследования» приведены данные об объектах исследования, используемых методах, приборах и реактивах, другие сведения методического характера.

В третьей главе представлены результаты изучения вариабельности диагностических признаков различных морфологических групп сырья при измельчении, проявляемости диагностически значимых признаков, дана информация о размерах диагностических признаков для 9 видов ЛРС, а также приводятся сравнительные характеристики подлинности цельного, измельченного сырья и порошка при микроскопическом изучении.

Четвертая глава посвящена разработке характеристик подлинности

сырья, основанных на физико-химических свойствах БАВ и включает разработку методики идентификации дубильных веществ в ЛРС, хроматографические и спектральные (ИК и КР) характеристики сырья.

В пятой главе излагаются результаты исследований по разработке современных методик определения содержания дубильных веществ с использованием спектрофотометрии, ВЭЖХ, потенциометрии.

Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в таблицах, проиллюстрированы графиками, рисунками и фотографиями.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили кора дуба, кора калины, корневища змеевика, корневища бадана, корневища лапчатки, корневища и корни кровохлебки, плоды черники, плоды черемухи, соплодия ольхи, листья сумаха, листья скумпии, собранные в Ботаническом саду Первого МГМУ имени И.М.Сеченова в 2008 - 2010 годах, а также измельченное сырье, фасованное в пачки и порошок в фильтр-пакетах, выпускаемое фармацевтическими предприятиями.

Отбор проб для анализ проводили в соответствии с ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб». Микроскопический анализ проводили в соответствии со статьей «Техника микроскопического анализа» (ГФ XI, вып.2, с.277 - 285).

Микроскопическое исследование проводили на микроскопе ЛОМО МИКМЕД-5 (Россия) с окуляром хЮ, объективами х4, хЮ, х40, хЮО. Фотосъемка велась цифровой камерой Panasonic DMC-LC80 (Япония).

Хроматографическое изучение веществ полифенольной природы проводили методами тонкослойной хроматографии на пластинках "Сорбфил" 10x15см и высокоэффективной жидкостной хроматографии на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1100 (США). Сбор и обработку хроматограмм осуществляли с помощью программы "ChemStation В.03.01".

КР-спектры порошков растительного сырья измеряли на КР-

спектрометре с РАМАН-модулем Thermo Nicolet FT-Raman (США) с детектором InGaAs при мощности лазера 40 W.

ИК-спектроскопию порошков проводили на ИК-спектрометре Thermo Nicolet 6700 с приставкой неполного внутреннего отражения (НПВО) (США). ИК- и КР-спектры получали в диапазоне 4000 - 100 см"'. Обработку данных проводили с помощью программы OMNIC Software Version 7.3 Thermo Electron Corporation.

Определение содержания дубильных веществ методом перманганатометрического титрования в пересчете на танин проводили по методике ГФ XI, вып. 2.

Спектрофотометрическое определение дубильных веществ в JIPC проводили на спектрофотометре Varian CaryUV 4000 UV-Vis Spectrophotometer (США).

Потенциометрическое определение дубильных веществ проводили на портативном рН-метре рН-410 (Россия) с использованием реакции окислительно-восстановительных взаимодействий. Использовали платиновый электрод-детектор и хлорсеребряный электрод сравнения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Изучение вариабельности диагностических признаков различных морфологических групп сырья при измельчении.

В существующей нормативной документации микроскопические характеристики измельченного ЛРС и порошка исследуемой группы описаны неполно или отсутствуют. Для составления характеристик подлинности нами была изучена вариабельность диагностических признаков в разных морфологических группах сырья при измельчении.

Установлено, что наиболее вариабельными являются те элементы, размеры которых в результате технологического процесса претерпевают наибольшие изменения: проводящие пучки и их части, механические волокна, цепочки друз оксалата кальция в подземных органах; конгломераты каменистых клеток и лубяные волокна в корах; фрагменты проводящих

пучков и эндокарпия в плодах. Для определения подлинности нами предложено использовать фракции порошков с размером частиц от 2,0 до 0,5 мм, в которых встречаются диагностические признаки.

Проведено сравнительное изучение диагностических признаков цельного, измельченного сырья и порошка коры дуба и калины, корневищ змеевика, корневищ бадана, корневищ лапчатки, корневищ и корней кровохлебки, плодов черники и черемухи, соплодий ольхи. Охарактеризованы диагностические признаки, позволяющие отличить близкие виды сырья. (Таблица 1,2; Рис. 1 - 4).

Таблица 1.

Диагностические признаки коры дуба в цельном (поперечный срез), измельченном (давленный препарат) сырье и порошке._

Диагностический признак Цельное сырье (поперечный срез) Измельченное сырье и порошок (давленный препарат)

Покровная ткань Пробка бурого цвета, состоящая из 5 - 8 рядов клеток (длина 28 - 50 мкм, ширина 4-8 мкм). Чечевички встречаются редко. Фрагменты бурой пробки

Колленхима Клетки округлой или овальной формы (длина 10 - 57 мкм, ширина 4 - 22 мкм) содержат друзы оксалата кальция. Округлые клетки (встречаются редко).

Паренхима коры Клетки неправильной формы (длина 12-70 мкм, ширина 10-30 мкм), встречаются многочисленные клетки с красно-коричневым содержимым (флобафены), клетки с друзами оксалата кальция. Клетки многоугольной неправильной формы (диаметр 10 - 45 мкм) содержат друзы оксалата кальция.

Вторичная кора Механический пояс, многочисленные группы лубяных волокон с кристаллоносной обкладкой и каменистых клеток. Идентифицируются отдельные ткани: паренхима, механические элементы.

Сердцевинные пучи Однорядные, состоят из клеток паренхимы, возле камбия содержат группы каменистых клеток. Идентифицируется как клетки паренхимы коры.

Механические элементы Механический пояс, состоящий из чередующихся групп лубяных волокон (диаметр 5-20 мкм) и групп каменистых клеток (диаметр до 55 мкм), группы (до 30) лубяных волокон с кристаллоносной обкладкой. Группы лубяных волокон (длина 60 - 110 мкм, ширина 5 - 20 мкм) с кристаллоносной обкладкой, группы каменистых клеток, образующие конгломераты.

Кристаллические включения Друзы оксалата кальция диаметром до 35 мкм.

Результаты исследования по изучению вариабельности были положены в основу микроскопических характеристик подлинности 9 видов измельченного ЛРС, подтвержденых фотоматериалами.

Рис. 1. Кора дуба. Поперечный срез. Ув. х 100. 1 - пробка, 2 - колленхима,

3 - механический пояс каменистых клеток,

4 - лубяные волокна с кристаллоносной обкладкой, 5 - сердцевинный луч.

Рис. 2. Кора дуба. Давленный препарат. Ув. х 100. 1 - каменистые клетки, 2 - лубяные волокна с кристаллоносной обкладкой.

_?

_3

.4

.5

Рис. 3. Кора калины. Поперечный срез. Ув. х 100. 1 - чечевичка, 2 - пробка, 3 - колленхима, 4 - друза оксалата кальция, 5 - лубяные волокна, 6 - сердцевинный луч.

Рис. 4. Кора калины. Давленный препарат. Ув. х 400. 1 - лубяные волокна, 2 - паренхимные клетки, 3 - каменистые клетки, 4 - друза.

Таблица 2

Сравнительное микроскопическое изучение коры дуба и калины.

Распределение диагностических признаков по тканям._

Кора дуба Кора калины

Покровная ткань Пробка бурого цвета, состоящая го 5 - 8 рядов клеток (длина 28 -50 мкм, ширина 4-8 мкм). Чечевички встречаются редко. Пробка бурого цвета, состоящая из 5 - 8 рядов вытянутых клеток (длина 20 - 50 мкм, ширина 4-10 мкм), многочисленные чечевички.

Паренхима коры Клетки неправильной формы (длина 12-70 мкм, ширина 1030 мкм), встречаются многочисленные клетки с красно-коричневым содержимым (флобафены), клетки с друзами оксалата кальция. Клетки округлые (диаметр 15-60 мкм), редко встречаются клетки с красно-коричневым содержимым (флобафены), многочисленные клетки с друзами оксалата кальция.

Механические элементы Механический пояс, состоящий из чередующихся груш лубяных волокон (диаметр 5-20 мкм) и групп каменистых клеток (диаметр до 25 мкм), группы (до 30) лубяных волокон с кристаллоносной обкладкой. Одиночные шш расположенные группами по 2 - 4 лубяные волокна (диаметр 10-25 мкм) с толстыми, неодревесневшими, пористыми стенками. Каменистые клетки крупные (диаметр 14 - 20 мкм), расположены тангентально вытянутыми группами по 2 - 6, реже одиночные, одревесневшие, желтого цвета, с пористыми стенками.

Кристаллические включения Друзы оксалата кальция диаметром до 35 мкм. Друзы оксалата кальция диаметром 5-35 мкм.

Разработка характеристик подлинности сырья, основанных на физико-химических свойствах БАВ.

Качественная реакция осаждения дубильных веществ.

Для идентификации дубильных веществ в JIPC в ГФ XI используется реакция с солями железа (III). Соли железа образуют окрашенный комплекс с дубильными веществами, простыми фенолами и их производными. Европейская фармакопея 7 изд. наряду с солями железа использует гольевой порошок, который осаждает только дубильные вещества.

Нами была изучена возможность использования для осаждения дубильных веществ нового реактива - раствора коллагена различной концентрации и показано, что оптимальным является использование 1% раствора коллагена. При сравнительном изучении использования гольевого порошка и коллагена с водными извлечении из 13 видов JICP, содержащего 12

дубильные вещества, было установлено, что 1% раствор коллагена может использоваться в качестве реактива осаждения дубильных веществ, наравне с гольевым порошком.

ТСХ-характеристика ЛРС.

Идентификация ЛРС хроматографическими методами анализа широко используется в отечественной и зарубежной НД. В ГФ XI хроматографические методы не нашли своего применения для анализа ЛРС, содержащего дубильные вещества. Нами было проведено исследование по разработке методик идентификации ЛРС методом ТСХ.

Исследования проводили в нейтральных и подкисленных подвижных системах: №1: эфир - уксусная кислота ледяная - гексан - этилацетат (20:20:20:40), №2: муравьиная кислота безводная - этилацетат - толуол (10:30:60), №3: бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2), №4: этилацетат -муравьиная кислота безводная - вода (80:10:10), №5: хлороформ - вода -спирт (60:30:20).

Обнаружение зон адсорбции БАВ проводили в УФ-свете при длине волны 254 и 365 нм, с последующей обработкой раствором железа (III) аммония сульфата 1% (квасцов железоаммониевых раствор 1% (ЖАК)), ванилина раствором в хлористоводородной кислоте 2%, алюминия хлорида спиртовым раствором 2%.

В результате хроматографического исследования было установлено, что использование системы № 2 позволяет охарактеризовать комплекс полифенольных соединений в 8 видах ЛРС разных морфологических групп (корневища змеевика, бадана, лапчатки, корневища и корни кровохлебки, кора дуба, кора калины, плоды черники, соплодия ольхи) (Рис. 5).

Наилучшее разделение полифенольных соединений плодов черемухи, и листьев скумпии происходит в системе № 3, листьев сумаха - в системе № 4, корневищ бадана и лапчатки - в системе №1.

Результаты хроматографического изучения были использованы при составлении ТСХ-характеристик подлинности изучаемого ЛРС.

Finish

Рис. 5. ТСХ. Подвижная фаза 2. Муравьиная кислота безводная - этилацетат - толуол (10:30:60). Детектор УФ 365 нм.

1 - галловая кислота, 2 - танин, 3 - кверцетин, 4 - кора дуба, 5 - соплодия ольхи, 6 - корневища и корни кровохлебки, 7 - корневища змеевика, 8 - корневища бадана, 9 - корневища лапчатки, 10 - плоды черники, 11 - плоды черемухи, 12 - кора калины, 13 - листья сумаха, 14 - листья скумпии - извлечения спиртовые 60% (1:10).

Спектральные (ИК, КР) характеристики ЛРС.

В анализе ЛРС находят применение только УФ-спектральные характеристики. Для изучения ИК- и КР-спектров сырья нами была разработана пробоподготовка, которая предусматривала удаление пробки, механических элементови и измельчение сырья до однородного порошка с частицами, проходящими сквозь сито с диаметром отверстий 0,1 мм.

Для получения КР-спектра использовали спрессованный в таблетку порошок сырья. ИК-спектр снимали с помощью приставки неполного внутреннего отражения (НПВО), позволяющей проводить анализ с сухим порошком. Полученные таким образом спектры ЛРС (Рис. 10 - 11) сравнивали со спектрами стандартов: танин, галловая кислота, глюкоза, крахмал, фруктоза, пирогаллол, эллаговая кислота, рутин (Рис. 6 - 9). Для каждого исследуемого объекта описаны волновые числа (см1) наиболее интенсивных характерных максимумов полос (ИК НПВО) и линий (КР). Для корневищ змеевика ИК-и КР-спектры имеют следующие максимумы: КР-спектр: 2957 о(СН), 1622 ^(СОО), 1530 ш(СОО) + т> (кольца). ИК-спектр: 3308 ^(ОН), 2926 и(СН), 1607 шв(СОО), 1538 5(СОН), 1443 те(СОО), 1324

и(кольца), 1225 те^кольца), которые свидетельствуют о наличии галловой кислоты, танина, глюкозы и крахмала (Рис. 10).

Результаты исследования КР- и ИК-спектров порошков ЛРС дают возможность рекомендовать спектральные характеристики для идентификации изучаемого ЛРС.

Разработка методики определения содержания суммы дубильных веществ в пересчете на танин с использованием спектрофотометрии.

Фармакопейный метод количественного определения дубильных веществ в JIPC (перманганатометрия) имеет ряд недостатков. Трудности представляет субъективное установление точки эквивалентности в окрашенных растворах.

Нами была разработана методика спектрофотометрического определения содержания суммы дубильных веществ в ЛРС в пересчете на танин, в основе которой лежит измерение оптической плотности водных извлечений ЛРС при 277 нм (максимум поглощения водных растворов танина и кислоты галловой) (Рис. 12). Результаты определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин фармакопейным методом и СФМ для 13 видов ЛРС представлены в Таблице 3.

=3 1-

25 О 277 ЗОО Wavalength (um)

Рис. 12. УФ-спектры поглощения водных растворов танина (1) и кислоты галловой (2)

Таблица 3

Содержание дубильных веществ в ЛРС в пересчете на танин, определенное

ЛРС X сумма дубильных веществ в пересчете на танин, % (спектрофотометрия) X сумма дубильных веществ в пересчете на танин> % (перманганатометрия) Норма по нд,% (не менее)

Корневище змеевика 19,72 ±0,22 25,38 ± 1,34 15

Корневище бадана 27,69 ±0,31 30,90 ± 1,54 20

Корневище лапчатки 17,27 ± 0,37 24,30 ±1,18 20

Корневище и корни кровохлебки 25,19 ±0,70 32,50 ±1,50 14

Плоды черники 3,12± 0,10 5,97 ± 0,48 не регламентируют

Плоды черемухи 2,73 ± 0,08 4,56 ± 0,28 1,7

Соплодия ольхи 18,99 ±0,54 19,01 ± 0,32 20

Кора дуба 5,96 ±0,23 12,49 ±0,91 8

Кора калины 3,94 ±0,14 6,16 ±0,27 4

Лист сумаха 35,26 ±0,45 не определяют перманганато-метрически 15

Лист скумпии 27,60 ±0,91 15

Лист чая 11,76 ±0,38 8,30 ±0,27 не регламентируют

Трава зверобоя 20,08 ± 0,76 14,39 ±0,52

Разработка методики определения полифенольных соединений в ЛРС с использованием реактивов осаждения пересчете на галловую

кислоту.

Европейская фармакопея в качестве показателя содержания действующих веществ в ЛРС приводит показатель - содержание дубильных веществ, осаждаемых гольевым порошком, в пересчете на пирогаллол. Этот показатель по сравнению с показателем содержания дубильных веществ в пересчете на танин (по ГФ XI) значительно ниже. Так как по ГФ XI под названием «дубильные вещества» определяется сумма всех полифенольных соединений, извлекаемых водой и титруемых перманганатом калия 0,02М в присутствии индигосульфокислоты. Нами разработана методика определения содержания полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту после осаждения дубильных веществ 1% раствором коллагена.

Методика проведения анализа.

Около 2,0 г (точная навеска) измельченного сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, помещают в колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл нагретой до кипения воды и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через вату, отбрасывая первые 50 мл фильтрата. Аликвоту переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, и доводят водой до метки (раствор А). Параллельно к 30 мл водного извлечения добавляют раствор коллагена 1%. Смесь взбалтывают 60 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Определенное количество, соответствующее конкретному виду ЛРС переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят водой до метки (раствор В). Измеряют оптическую плотность обоих растворов на спектофотометре при длине волны 277 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Содержание дубильных веществ, осаждаемых раствором коллагена 1% в пересчете на галловую кислоту и абсолютно сухое сырье в процентах (X) в

ЛРС определяют как разницу между содержанием дубильных веществ в растворах А и В. Результаты количественного определения представлены в Таблице 4. Метрологичесие характеристики разработанных методик представлены в Таблице 5.

УФ-спектры поглощения водных извлечений ЛРС представлены на рисунках 13, 14 (1 - водное извлечение ЛРС (сумма полифенольных соединений), 2 - водное извлечение после адсорбции дубильных веществ реактивом осаждения (1% раствором коллагена)).

S 1.5-<

1.00.5-

-277.00,1.833 Ш, 0.482

260 280 300 Wavelength (nm)

276.00,1.191 277.00.0.551

Рис. 13. Корневища змеевика

260 280 300 Wavelength (rim)

Рис. 14. Кора дуба

Таблица 4

Содержание осаждаемых дубильных веществ, суммы полифенольных соединений, не осаждаемых фенольных соединений в пересчете на галловую

ЛРС X осаждаемых вубильиые вещества» % X не осаждаемых полифенольные соединения» % X сумма полифенольных соединений» %

Корневища змеевика 8,75 ± 0,62 3,15 ±0,12 12,00 ±0,08

Корневища бадана 12,47 ±0,29 6,02 ± 0,44 18,48 ±0,66

Корневища лапчатки 7,28 ± 0,02 3,92 ± 0,07 11,20 ±0,08

Корневища и корни кровохлебки 8,43 ± 0,73 7,06 ±0,11 15,49 ±0,62

Плоды черники 0,59 ± 0,04 1,56 ±0,03 2,16 ±0,04

Плоды черемухи 0,61 ±0,01 1,17 ±0,01 1,79 ±0,02

Соплодия ольхи 6,16 ± 0,08 6,11 ±0,16 12,27 ± 0,20

Кора дуба 2,12 ±0,03 1,82 ±0,08 3,93 ± 0,06

Кора калины 0,95 ± 0,03 1,73 ±0,05 2,68 ± 0,04

Лист сумаха 12,71 ±0,14 10,14 ±0,21 22,85 ± 0,32

Лист скумпии 10,93 ±0,04 6,71 ± 0,29 17,64 ±0,30

Лист чая 4,15 ±0,22 4,05 ±0,15 8,21 ±0,37

Трава зверобоя 5,03 ± 0,27 8,36 ± 0,26 13,39 ±0,40

Таблица 5

Метрологические характеристики методики количественного

определения дубильных веществ, осаждаемых 1% раствором коллагена в пересчете на галловую кислоту методом спектрофотометрии.

№ ЛРС Т X в2 8 Р, % № Г) АХ ДХ" Е, % Е , %

1 Корневища змеевика 4 8,75 0,0496 0,2227 95 2,78 0,62 0,28 7,08 3,17

2 Корневища бадана 4 12,47 0,0109 0,1045 95 2,78 0,29 0,13 2,33 1,04

3 Корневища лапчатки 4 7,28 0,0001 0,0075 95 2,78 0,02 0,01 0,28 0,13

4 Корневища и корни кровохлебки 4 8,43 0,0681 0,2610 95 2,78 0,73 0,32 8,61 3,85

5 Плоды черники 4 0,59 0,0002 0,0143 95 2,78 0,04 0,02 6,73 3,01

6 Плоды черемухи 4 0,61 0,0001 0,0038 95 2,78 0,01 0,01 1,71 0,76

7 Соплодия ольхи 4 6,16 0,0008 0,0291 95 2,78 0,08 0,04 1,31 0,59

8 Кора дуба 4 2,11 0,0001 0,0120 95 2,78 0,03 0,01 1,58 0,71

9 Кора калины 4 0,95 0,0001 0,0093 95 2,78 0,03 0,01 2,72 1,22

10 Лист сумаха 4 12,71 0,0025 0,0498J 95 2,78 0,14 0,06 1,09 0,49

11 Лист скумпии 4 10,93 0,0002 0,0141 95 2,78 0,04 0,02 0,36 0,16

12 Лист чая 4 4,15 0,0062 0,0785 95 2,78 0,22 0,10 5,26 2,35

13 Трава зверобоя 4 5,03 0,0092 0,0936 95 2,78 0,27 0,12 5,31 2,37

Оптимизация фармакопейной методики определения содержания дубильных веществ в ЛРС

При определении содержания дубильных веществ в ЛРС методом перманганатометрии установление точки эквивалентности в присутствии индигосульфокислоты в окрашенных извлечениях из-за размытого перехода окраски раствора вызывает затруднения. При сравнительном изучении определения содержания дубильных веществ в корневищах бадана перманганатометрическим титрованием с использованием индикатора индигосульфокислоты и приборного установления точки эквивалентности с использованием рН-метра рН-410 (Россия) нами были получены результаты, приведенные в Таблице 6.

Таблица 6

Результаты сравнительного определения дубильных веществ в __корневищах бадана.__

Метод определения Потенциометрия Перманганатометрия Норма по ГФ

Содержание дубильных веществ, 19,58% ± 0,92% 30,90 ± 1,54 не менее 20%

Статистическую обработку данных проводили по ГФ XI, используя

программу Microsoft Excel. Метрологические характеристики воспроизводимости методики представлены в Таблице 7. Методика воспроизводима и не имеет систематической ошибки.

Относительная ошибка единичного определения методики количественного определения суммы дубильных веществ с 95% вероятностью составляет ±4,71%.

Таблица 7

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы дубильных веществ методом потенциометрического титрования в

пересчете на танин (Р=95, п=6).

F X S2 S Р,% t(F,P) АХ Е, %

5 19,58 0,1285 0,3584 95 2,57 0,92 4,71

Разработка ВЭЖХ-методики определения отдельных компонентов дубильных веществ в коре дуба.

Для определения содержания свободной и связанной галловой кислоты, эллаговой кислоты в водных извлечениях коры дуба, а также для изучения осаждения полифенольных соединений 1% раствором коллагена был выбран метод ВЭЖХ.

Методика проведения анализа:

Извлечение готовили как указано в методике на стр. 17 (раствор А). Определение содержания свободной и связанной галловой кислоты проводили до и после кислотного гидролиза: к 10 мл раствора А прибавляют 2 мл хлористоводородной кислоты разведенной 1:1, кипятят с обратным холодильником 30 мин, фильтруют (раствор А').

Параллельно готовят 0,05% растворы сравнения в спирте 60% галловой, эллаговой кислот. Полученные результаты представлены в Таблице 8.

Для определения возможности использования нового реактива осаждения - 1% раствора коллагена - проводили ВЭЖХ водных извлечений до и после осаждения дубильных веществ 1% раствором коллагена. На

примере эллаговой кислоты показано, что 1% раствор коллагена, осаждает 97 ± 2% эллаговой кислоты из водного извлечения коры дуба.

Таблица 8

Содержание свободной галловой кислоты, % Содержание связанной галловой кислоты, % Суммарное содержание свободной и связанной галловой кислоты, %

0,46 ±0,04 0,56 ±0,05 1,02 ±0,25

Полученные результаты подтверждают правильность выбора 1% раствора коллагена в качестве реактива осаждения для количественного определения осаждаемых дубильных веществ в ЛРС методом спектрофотометрии.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Проведен анализ нормативной и научной литературы по стандартизации ЛРС и препаратов, содержащих дубильных вещества, выявлены тенденции в использовании современных физико-химических методов для идентификации и определения содержания дубильных веществ.

2. Изучена вариабельность диагностических признаков подземных органов змеевика, бадана, лапчатки и кровохлебки, коры дуба и калины, плодов черники и черемухи, соплодий ольхи при измельчении. Выявлены наиболее вариабельные элементы: проводящие пучки и их части, механические волокна, цепочки друз оксалата кальция в подземных органах; конгломераты каменистых клеток и лубяные волокна в корах; фрагменты проводящих пучков и эндокарпия в плодах.

3. При сравнительном изучении порошков ЛРС выявлены и описаны диагностические признаки, позволяющие идентифицировать порошки близких видов сырья различных морфологических групп, подтвержденные фотоматериалами.

4. Разработаны методики пробоподготовки для идентификации изучаемых видов сырья методом микроскопии и получения спектральных характеристик порошков ЛРС различых морфологических групп.

5. Получены ИК- и KP-спектры для 11 видов JIPC и 8 стандартных образцов: глюкозы, крахмала, фруктозы, танина, пирогаллола, галловой и эллаговой кислот, рутина; описаны их характеристики. Полученные спектры рекомендованы для идентификации сырья.

6. Подобраны оптимальные условия для идентификации JIPC методом ТСХ для 11 видов сырья; разработаны хроматографические характеристики, которые рекомендованы для включения в НД.

7. Разработаны методики определения содержания суммы дубильных веществ в JIPC методом спектрофотометрии в пересчете на танин и галловую кислоту. Ошибка методов составила в среднем соответственно 2,79% и 1,53%.

8. Разработана ВЭЖХ-методика идентификации и определения содержания свободной и связанной галловой кислоты в коре дуба.

9. Предложен новый реактив осаждения дубильных веществ в водных извлечениях из 13 видов JIPC. Приоритетность научных исследований по возможности использования реактивов осаждения подтверждена заявкой на изобретение «Способ определения содержания дубильных веществ в растительном сырье» №2010 141622.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гринько E.H. Изучение вариабельности диагностических признаков корневищ бадана (Rhizomata Bergeniae) при измельчении. // Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни. XI международный конгресс "Здоровье и образование в XXI веке. М. - 2010 г. -С. 73 - 75.

2. Гринько E.H. Обоснование выбора метода количественного определения дубильных веществ в лекарственном растительном сырье. // Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни. XI международный конгресс "Здоровье и образование в XXI веке. М. - 2010 г. -С. 76.

3. Гринько E.H. Требования российской и европейской фармакопеи к методикам определения содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье. // Фармация. 2010. - № 5. - С. 49 - 53.

4. Гринько E.H., Самылина И.А. Изучение вариабельности диагностических признаков лекарственного растительного сырья кровохлебки при измельчении. // Гомеопатический ежегодник. Материалы

XXI Московской международной гомеопатической конференции "Развитие гомеопатического метода в современной медицине. М. - 2011 г. - С.204-209.

5. Гринько E.H., Самылина И.А. Изучение диагностических признаков лекарственного растительного сырья соплодий ольхи (Fructus Alni). // Гомеопатический ежегодник. Материалы XXI Московской международной гомеопатической конференции "Развитие гомеопатического метода в современной медицине. М. - 2011 г. - С. 207 - 214.

6. Гринько E.H. Сравнительное исследование требований фармакопей к качеству лекарственного растительного сырья кора дуба (Cortex Quercus). // Научно-методическая конференция "Гаммермановские чтения - 2011". -СПб.: Издательство СПХФА. - 2011 г. - С.24-26.

7. Гринько E.H., Самылина И.А. Исследование проявляемости диагностических признаков в корневищах бадана (Rhizomata Bergeniae) при измельчении. // Научно-методическая конференция "Гаммермановские чтения - 2011". - СПб.: Издательство СПХФА. - 2011 г. - С. 26 - 27.

8. Гринько E.H., Самылина И.А. Диагностические признаки плодов черники (Fructus Myrtilli) в цельном, измельченном сырье и порошке. // Всероссийская научно-практическая конференция «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты. -Самара. - 201L-С. 111-112.

9. Гринько E.H., Самылина И.А. Исследование диагностических признаков в микропрепаратах корневищ змеевика при измельчении. // Всероссийская научно-практическая конференция «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты». -Самара.-2011.-С. 109-110.

10. Гринько E.H., Самылина И.А. Изучение вариабельности диагностических признаков лекарственного растительного сырья бадана при измельчении. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск: Пятигорская ГФА. - 2011. - Вып. 66. - С. 45-48.

П.Гринько E.H., Самылина И.А. Сравнительное изучение диагностических признаков цельного, измельченного сырья и порошка плодов черемухи (Padus Avium Mill.). // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск. - 2011. - Вып. 66. -С.48-50,

12. Гринько E.H., Самылина И.А. Определение содержания дубильных веществ в коре дуба методом ВЭЖХ. // Традиционная медицина. 2011. - № 5 (28).-С. 180- 183.

13. Гринько E.H., Самылина И.А., Харитонов Ю.Я. Исследование ИК-и KP-спектров корневищ змеевика. Сообщение 1. // Фармация. 2011. - № 6. -С. 24-27.

Подписано в печать 27.12.2011 р. Формат 60x90 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л-ст. 0,9 Печать: ризограф. Тираж 100 экз. Зак. № 2712/01.

Предприятие УВ01 "Допомога" УСГ' Свидетельство о государственной регистрации №531018 03056, г. Киев, пер. Политехнический 6, корп. 5 (КПИ) Тел.: 277-41-46.