Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Сравнительное исследование препаратов и биологически активных добавок с ноотропным действием современными физико-химическими методами

На правах рукописи

Халахин Виталий Владимирович

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ

И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК С НООТРОПНЫМ ДЕЙСТВИЕМ СОВРЕМЕННЫМИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Самара-2012

005017826

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Кузнецов Петр Васильевич

Официальные оппоненты:

Егорова Светлана Николаевна - доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующая кафедрой фармации факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов

Пупыкина Кира Александровна - доктор фармацевтических наук, доцент, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, профессор кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального , образования «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится _2012 г. в 10°° часов на заседании

диссертационного совета Д 208.085.06 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

165Б.

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук, доцент

И. К. Петрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ноотропные препараты (НП) в настоящее время занимают значительный сегмент отечественного фармацевтического рынка. Востребованность препаратов данной группы в современной клинической практике объясняется несколькими причинами. Одна из них -значительное увеличение частоты неврологической и психиатрической патологии, особенно в пожилом и старческом возрасте.

Другой причиной является увеличение доли пожилых и старых людей в популяции и, соответственно, рост значимости возрастных изменений высшей нервной деятельности и памяти. НП занимают одно из ведущих мест практически во всех схемах и методах медикаментозного воздействия при данных заболеваниях.

Среди других причин расширения применения НП - их стресс-протекторные свойства. Значительное повышение роли хронического психоэмоционального и экологического стресса в жизни и деятельности населения определяет актуальность поиска путей профилактики и коррекции негативного воздействия стресса на деятельность нервной системы. Одним из путей профилактики является применение НП.

Несмотря на наличие большого разнообразия НП и различие механизмов их действия, эффективность существующих НП считается недостаточной (Д. А. Сычев и соавт., 2011). Именно поэтому активно ведется поиск не только новых синтетических НП, таких как гаммоксин, глипрофен, мефебут и др., но и растительных НП. Исследуется возможность применения комбинации нескольких веществ, приводящих к ноотропному эффекту.

Сегодня на фармацевтическом рынке России присутствуют синтетические НП, комбинированные НП, растительные препараты с ноотропным действием, а также биологически активные добавки (БАД) с ноотропным эффектом.

Исследование и стандартизация комбинированных препаратов, а также препаратов, содержащих растительные извлечения, относятся к достаточно сложной задаче, требующей значительных материальных и временных затрат. Это обусловлено тем, что в их состав могут входить вещества широкого спектра лиофильности и гидрофильное™, в том числе и их ассоциаты.

Наиболее оптимальным для исследования и стандартизации таких объектов является применение комплекса хроматографических методов. Наряду с классическими методами хроматографии: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), аффинная хроматография (АФХ), газожидкостная хроматография (ГЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ) хорошо себя зарекомендовал метод неклассической аффинной хроматографии (НАФХ), используемый для разделения биологически активных веществ растительных (П. В. Кузнецов, 2002) и синтетических

лекарственных препаратов, позволяющий осуществлять препаративное накопление.

Таким образом, для разделения и изучения компонентного состава лекарственных препаратов и биологически активных добавок на основе гинкго билоба целесообразно применение метода НАФХ.

Подчеркнем также, что исследования, связанные с оценкой качества НП, отражены в единичных публикациях. Данный факт определяет прикладной аспект актуальности настоящей работы.

Цель и задачи исследования. Разделение и анализ модельных смесей синтетических ноотропных препаратов, растительных препаратов и биологически активных добавок, содержащих экстракт гинкго билоба, в режиме неклассической аффинной хроматографии при варьировании хроматографических условий и строения адсорбента.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести синтез азоадсорбентов аффинного типа с применением различных вариантов эпоксиактивации и лигандов-модификаторов.

2. Определить хроматографические свойства синтезированных азоадсорбентов, в сравнении с немодифицированными матрицами, при разделении модельных смесей, состоящих из синтетических ноотропных препаратов и растительного препарата, содержащего экстракт гинкго билоба.

3. Оптимизировать хроматографические условия разделения и выделения на азоадсорбентах биологически активных веществ растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

4. Исследовать комплексом современных физико-химических методов компонентный состав выделенных на азоадсорбенте фракций растительного препарата, содержащего экстракт гинкго билоба.

5. Провести сравнительное исследование основных групп биологически активных веществ растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго биолба, комплексом современных физико-химических методов.

Научная новизна. Для оценки хроматографических особенностей ноотропных препаратов и их БАД методом жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) впервые сконструирован ряд оригинальных азоадсорбентов аффинного типа (азо-ААфТ). Впервые проведен скрининг модельных смесей ноотропных препаратов на азо-ААфТ с использованием в качестве сорбентов контроля немодифицированных матриц. Впервые показаны хроматографические особенности, влияние длины вставки для ряда оригинальных азо-ААфТ при скрининге модельных смесей НП. Впервые для изучения растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, применялся метод НАФХ, а в качестве элюента использован насыщенный раствор натрия тетрабората.

Впервые обоснована возможность применения спектральных методов анализа для сравнительного изучения растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, а также впервые проведено сравнительное исследование данных объектов методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС).

Практическая значимость. По результатам исследования синтезированы азоадсорбенты аффинного типа, обладающие специфичностью и эффективностью при разделении комбинированных ноотропных препаратов в режиме жидкостной колоночной хроматографии.

Предложенные подходы с применением азоадсорбентов аффинного типа снижают объем проводимой работы при выделении индивидуальных веществ из комбинированных лекарственных препаратов и многокомпонентных растительных экстрактов.

Разработанные азоадсорбенты аффинного типа позволяют осуществлять препаративное выделение, в том числе минорных компонентов растительных извлечений, а накопление их в необходимых количествах направлено на фармакологический анализ.

Экспериментальные данные позволяют рекомендовать введение в структуру ФС на растительные препараты, содержащие экстракт гинкго билоба, методы, УФ-, ИК-спектроскопии для экспресс-анализа подлинности.

Определены отличия компонентного состава в растительных препаратах и БАД, содержащих экстракты гинкго билоба, при этом полученные данные позволяют контролировать их качество по основным группам биологически активных веществ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Особенности синтеза азоадсорбентов аффинного типа.

2. Результаты скрининга модельных смесей НП растительного и синтетического происхождения на полисахаридных сорбентах и их эпоксимодифицированных аналогах.

3. Результаты применения азоадсорбентов аффинного типа в исследовании препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

4. Результаты сравнительного исследования физико-химическими методами препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

Связь задач исследования с планами научной работы. Диссертационная работа была выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Кемеровской государственной медицинской академии (№ Государственной регистрации 0120.0 506552 фр. № 2).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на научных конференциях: межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2006; 2008); «Разработка, исследование и маркетинг новой

фармацевтической продукции» (Пятигорск 2007; 2008); международных конференциях: «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006); «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); XIII Международной научно-практической конференции «Природные ресурсы и интеллектуальные ресурсы Сибири» (Кемерово, 2010); на Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011).

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 14 печатных работах, в том числе 3 статьи опубликованы, в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объектам и методикам исследований, четырех глав собственных исследований, выводов, а также списка литературы, включающего 142 наименования, из них - 38 источников иностранных авторов. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 80 рисунков.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований НП, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологической активности и применению в медицинской практике данных препаратов, а также методы анализа и стандартизации НП.

В главе 2 представлена характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики химического и физико-химического исследования НП.

В главах 3, 4, 5 экспериментальной части приведены способы получения азо-ААфТ для метода ЖКХ, а также результаты применения азо-ААфТ в скрининге модельных смесей НП и исследовании растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

В главе 6 экспериментальной части приводятся результаты исследований компонентного состава выделенных на азоадсорбенте фракций растительного препарата, содержащего экстракт гинкго билоба, и сравнительного исследования растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, с использованием комплекса современных физико-химических методов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования были выбраны растворы модельных смесей НП: гаммоксина (гидрохлорид-З-окси-З-фенил-4-амино-бутановая кислота), глипрофена (амид н-пропилфенилгликолевой кислоты)^ мефебута (метилового эфира 4-амино-З-гидрокси-З-фенил-бутановой кислоты гидрохлорид), которые получали из готовых субстанций, любезно предоставленных д-ром фарм. наук, проф. Т. И. Яры-гиной (ГБОУ ВПО ПГМА им. академика Е. А. Вагнера).

Растворы Фенибута, Фенотропила, Пикамилона готовили из таблеток: Фенибут 250 мг № 20 АО «Олайнфарм» (серия 70105), Фенотропил 100 мг № 10 «Щелковский витаминный завод» (серия 60205)! Пикамилон 50 мг № 30 ЗАО НПК «Эхо» (серия 70305). Экстракт гинкго бил оба (Egb 761) готовили из препарата Танакан 40 мг № 30 «Бофур Ипсен Индастри» (серия Р544) (табл. 1).

Таблица 1

Состав модельных смесей ноотропных препаратов

Смесь № Состав исследуемой модельной смеси

1 1 мл Гаммоксин +1 мл Глипрофен

2 1 мл Фенебут + 1 мл Фенотропил

3 1мл Гаммоксин + 1 мл Фенотропил

4 1 мл Гаммоксин + 1 мл Фенебут

5 1 мл Мефебут + 1 мл Фенибут

6 1 мл Фенебут +1 мл Пикамилон

7 1 мл Пикамилон + 1 мл Фенотропил

8 1мл Пикамилон + 1 мл Глипрофен

9 1мл Глипрофен + 1 мл Фенотропил

10 1 мл Гаммоксин + 1 мл Мефебут + 1 мл Пикамилон

11 1 мл Гаммоксин + 1 мл Мефебут

12 1 мл ЕдЬ 761 + 1 мл Гаммоксин

Также в качестве объектов исследования препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, использовали лекарственные препараты: Танакан таблетки 40 мг № 30 «Бофур Ипсен Индастри» (серия Р544), Гинос таблетки 40 мг № 30 ЗАО «Верофарм» (серия 30906), Билобил капсулы 40 мг № 20 «КИСА» (серия В44244).

Биологически активные добавки: Гинкго билоба С таблетки 0,45 г № 40 ЗАО «Свободный 20» (серия 0407), Гинкго билоба Эвалар таблетки 0,2 г № 40 ЗАО «Эвалар» (серия 58).

Химические и физико-химические методы исследования При скрининге азо-ААфТ в исследовании модельных смесей НП использовался метод ЖКХ. Колоночную хроматографию проводили на колонках (Pharmacia 125><5 мм) с объемом адсорбента 5 мл. Элюирование осуществляли водой дистиллированной с заменой элюента на раствор 0,1 н NaCl. В модельной смеси № 12 проводили дополнительное элюирование 50 %-ным С2Н5ОН. Элюент собирали с помощью коллектора фракций DOMBIFRAC D-002 (Россия) объемом по 3 мл. Скорость элюи-рования - 0,2 мл/мин. Детектирование проводили методом УФ-спектро-скопии при длине волны 230 нм и 260 нм; в модельной смеси № 12 — при 230, 250,270 нм.

Для изучения накопленных флавоноидных пиков в методе ЖКХ проводилась тонкослойная хроматография известными методами (М. Шар-шунова и соавт., 1980) на пластинах «Silufol» с последующим проявлением: по собственной окраске и в ультрафиолетовом свете. В качестве свидетелей использовали стандартные вещества изорамнетин, кемпферол и кверцетин. В качестве подвижной фазы использовались этилацетат, муравьиная кислота, вода в соотношении 8:1:1.

Высокоэффективная жидкостная хроматография проводилась на приборе ВЭЖХ-хроматограф «Цвет Яуза-04» (с УФ-детектором). Программное обеспечение - «МультиХром», версия 3.1.1550 (ЗАО «Ампер-сенд», Россия). Ацетонитрил - сорт 0 осч, УФ-поглощение на 200 нм (ВЭЖХ против воды) 0,012 о.е./см (НПК «Криохром», Россия). Исследуемые объекты, пропустив через фильтр «Атргер» для удаления механических примесей, в объеме 0,1 мл вводили в ВЭЖХ-хроматограф. Объем петли — 100 мкл. Скорость потока — 0,55 мл/мин, давление 61+1 bar. Подвижная фаза приготовлена согласно рекомендациям ФСП 420521591804. Она состоит из следующих компонентов: вода бидистиллированная, ацетонитрил, изопропиловый спирт (20:10:1) с добавлением лимонной кислоты. Использовалась колонка Gemini 5 мкм С18 110А. Размер-250x4,6 мм (Phenomenex).

ГЖХ-МС проводилась на приборе Finnigan Trace DSQ (США), колонка TR-ms, газ-носитель гелий, скорость потока 5м/мин. Термические параметры хроматографирования: начальная температура 50 °С (выдержка 5 мин), конечная - 340 °С (выдержка 10 мин), скорость нагрева 10 °С в минуту. Объем пробы — 10 мкл.

Спектральные характеристики в ультрафиолетовой области получены с использованием спектрофотометра марки СФ-26 (Россия), СФ-2000 (Россия). Детектирование проводили при длине волны 230 и 260 нм (модельной смеси № 12 при 230, 250, 270 нм). УФ-спектр пиковых фракций был получен в диапазоне 225-335 нм. При выраженном максимуме значений оптической плотности применяли метод разведения

с использованием в качестве растворителя соответствующий хроматографическому режиму элюент.

ИК-спектры изучаемых образцов в таблетках КВг регистрировались на однолучевом интерференционном (с обратным преобразованием Фурье) ИК-спектрометре ФСМ-1202 («Инфраспек», Россия). Параметры записи спектров: диапазон длин волн 4000-400 см"1, разрешение 4 см"1, циклическая запись с количеством сканов 25. Фоновый спектр (воздух) получали непосредственно перед записью каждого спектра испытуемой субстанции. Управление прибором и обработку спектров осуществляли с использованием программы Fspec (версия 4.0.0.2 для Windows®, ООО «Мониторинг», Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Особенности синтеза азоадсорбентов аффинного типа

Синтез азо-ААфТ состоит из следующих стадий:

Стадия № 1. Эпоксиактивация полимерного носителя

На этой стадии немодифицированые сорбенты сефадекс LH-20, сефадекс G-10 или сефароза CL-6B подвергались эпоксиактивации (П. В. Кузнецов, 2002) в среде диметилсульфоксида и NaOH при добавлении тетрабутиламмония бромида, диглицидлового эфира 1,2-этан-диола (ДГЭЭД - реактив Хуберта), либо эпихоргидрина (ЭХГ) (рис. 1).

Rj =Н2С-сн-о-сн-снго— R4 = — сн-сн—о-сн-сн—о-сн2—

ОН

R, = CI—CH—

Ra = -СИ-

ОН

Рис. 1. Эпоксиактивация полимерного носителя

Стадия № 2. Иммобилизация вставки и лиганда на поверхность эпоксиактивированных адсорбентов

Синтез производили как по аминофенильному, так и по реверсному типу (рис. 2).

Рис. 2. Общая схема синтеза азо-ААфТ

2. Результаты скрининга модельных смесей НП растительного и синтетического происхождения на полисахаридных сорбентах и их эпоксимодифнцированных аналогах

Для разделения модельных смесей методом НАФХ (П. В. Кузнецов, 2002) проведен хроматографический скрининг нескольких типов эпоксиактивированных азо-ААфТ с различными лигандами и вставками. Для вставки «гидразид салициловой кислоты» (ГСК) применялись лиганды новокаин и 4-амино-антипирин, для вставки «и-нитробензгидразид» (п-НБГ) - лиганды рутин, троксерутин, дигидрокверцетин, морин, 8-оксихинолин, кокарбоксилаза и АТФ. В качестве полимерных матриц использовались сефадекс в-10, ЬН-20 и сефароза СЬ-6В. На примере сефадекса ЬН-20 также было показано влияние способа активации полисахаридиой матрицы (активация ЭХГ, либо активация ДГЭЭД -реактив Хуберта). Данные по хроматографической особенности сорбентов представлены в таблице 2. Примеры типичного полного хроматогра-

фического разделения и тенденции к хроматографическому разделению показаны на рисунках 3 и 4.

Таблица 2

Результаты скрининга модельных смесей ноотропных препаратов

Тип Смесь N

сорбента 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

СЬ-6В - I - Г - + - | - - - - + - 1

СЬбВ- ДГЭЭД- иГСК -Новокаин * - - - + - - - - - + -

СЬбВ - ДГЭЭД- иНБГ -В-Оксихшюлнн + + + - - + + - - + -

С1--6В - ДГЭЭД-пНБГ -Морин + + + =1= - + + - - + -

СЬ-бВ - ДГЭЭД - пНБГ-Днгилроквернетнн + + + * - - + + - - + -

С1.-6В - ДГЭЭД -пНБГ-Рутин + + + - - - + + - * + -

С1.-6В- ДГЭЭД-пНБГ- Кокарбоксилаза + + + - - - + + - * + -

СЬбВ - ДГЭЭД -пНБГ-АТФ + + + - - - + + - - + -

ЬН-20 - - - - і - - - + -

Ш-20 - ДГЭЭД - ГСК -Новокаин - - - + - - - + -

ЬН-20 - ДГЭЭД-ГСК -4-амино-а1гшннрин * - * * + - - * - * + *

Ш-20-ДГЭЭД -ГСК-п-1штроаи|1Л1ш - - - * + - - - - - + -

Ш-20 - ДГЭЭД - пНБГ -Гинкго билоба + + + - - - + + + * - +

Ш-20-ДГЭЭД - пНБГ -Троксерутин + + + - - - + + + * - +

ЬН-20 - ЭХГ - пНБГ -Гинкго билоба - - - - + - - - - - + -

Ш-20- ЭХГ- пНБГ-Троксерутан - - - - + - - - - - + -

0-10 - - - - + - - - - - + -

й-10- ДГЭЭД-ГСК-Новокаин * * * * - * * * * * + -

С-10-ДГЭЭД-пНБГ-Троксерутии + * * * - + + + * * + +

в-Ю-ДГЭЭД - пНБГ -Рутин + + + + - - + + - * + +

С-10-ДГЭЭД-пНБГ-Дигидрокверцетин + + + + - - + + - * + +

«-» разделения нет, «+» полное разделение смеси, «*» тенденция к разделению.

9 10 11 12 13 14 15 16 17 № фракции

а)

10 11 12 13 14 15 16 17 № фракции

б)

Рис. 3. Пример хроматографического разделения смеси № 6 а) ^модифицированный сорбент сефадекс 1Л1-20

- 230 нм,---260 нм, 1 - Фепибут, 2 - Пикамилои

б) азоадсорбент аффинного типа ЬН-20- ДГЭЭД - пНБГ-Троксерутин -230 нм,---260 нм, 1 - Фепибут, 2 - Пикамилон

D

Рис. 4. Пример хроматографического разделения смеси № 12

-230 нм,---250 нм,.....270 нм, 1 - ггшколидная фракция,

2 — галшоксин, 3 — флавопоидная фракция

Анализируя полученные результаты, можно отметить, что на немодифицированном сорбенте сефароза CL-6B отсутствует полное разделение большинства исследуемых смесей, кроме смесей № 5 и 11. Это объясняется тем, что в состав этих смесей входит мефебут. На всех модифицированных сорбентах этой матрицы отмечается полное разделение модельных смесей под номерами 1, 2, 3, 7, 8. Для смесей № 4 и 10 отмечена лишь тенденция к разделению.

Для немодифицированного сорбента сефадекс LH-20 отмечена аналогичная картина, как и ранее для сорбента сефароза CL-6B:

отсутствует разделение большинства смесей, кроме смесей № 5 и 11 Модифицированные сорбенты на основе сефадекса ЬН-20 показывают лишь тенденции к разделению некоторых смесей, но только на азо-ААфТ с флавоноидными лигандами отмечается полное разделение модельных смесей № 1,2,3, 7, 8, 9, 12.

Влияние метода активации, а соответственно и длины вставки отчетливо прослеживается на примере адсобрентов сефадекс ЬН-20-ДГЭЭД - пНБГ - Троксерутин и сефадекс ЬН-20 - ЭХГ - пНБГ -Троксерутин. Так, если первый из вышеуказанных сорбентов имеет один из лучших показателей по разделению, то второй не отличается по сорбционнои способности от ^модифицированного сорбента.

^модифицированный сорбент сефадекс С-10 разделяет исследуемые смеси № 1-12, как и предыдущие контрольные сорбенты.

Однако на азо-ААфТ с новокаиновым лигандом тенденция к разделению повышается по сравнению с аналогичными сорбентами этого типа на матрицах сефадекс ЬН-20 и сефароза СЬ-6В. Для азо-ААфТ с флавоноидными лигандами рутин и дигидрокверцетин отмечено полное разделение наибольшей части модельных смесей № 7 8 11 12 Интересно, что на сорбенте с лигандом троксерутин только половина изученных модельных смесей разделяется полностью.

Сравнение структурных особенностей исследуемых объектов со структурой изученных азо-ААфТ позволяет сделать следующие выводы:

1. Образцы фенибут, гаммоксин и пикамилон, являющиеся кислотами, проявляют в изученных условиях сорбционные свойства Образцы с амидной структурой (глипрофен, фенотропил) не сорбируется и элюируются в первых фракциях при хроматографировании. Мефебут - НП со сложноэфирной группой сорбируется на любых типах сорбента что и обусловливает эффект разделения смеси № 5 на ^модифицированных гелях. В то же время на азо-ААфТ мефебут элюируется вместе со вторым компонентом смеси, и данная смесь, как правило, не разделяется, кроме азо-ААфТ на основе сефадекса ЬН-20.

2. Структура синтезированных азо-ААфТ реверсного типа по нашим данным, практически не приводит к феномену сорбции'для исследованных объектов, но этот феномен наблюдается на азо-ААфТ, полученных по аминофенилыюму пути.

3. Сорбент сефадекс ЬН-20 - ДГЭЭД - пНБГ - Гинкго билоба содержащий в качестве лиганда флавоноиды экстракта гинкго билоба, имеет хроматографический профиль, подобный азо-ААфТ с флавоноидными лигандами.

4. Смесь № 12, имеющая в составе Е§Ь 761, разделяется только на азо-ААфТ: с лигандами флавоноидоного типа (рутин, дигидрокверцетин и троксерутин). При хроматографировании на других типах сорбентов (даже если и происходит разделение ЕёЬ 761 на гинколидную и флавоноидную

фракции; типовая хроматограмма разделения показана на рисунке 5), пик 2-го компонента модельной смеси перекрывается гинколидной или флавоноидной фракцией Egb 761.

5. Таким образом, азо-ААфТ, эпоксиактивированные дигилицидиловым эфиром 1, 2-этандиола с иммобилизованными флавоноидными лигандами, следует считать наиболее перспективными в дальнейших исследованиях комбинированных НП препаратов.

3. Результаты применения азоадсорбентов аффинного типа в исследовании препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба

Для изучения состава препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, применялись различные сорбенты и разные системы элюентов.

В первичном варианте использовали систему элюентов: воду дистиллированную, 25 %-ный этиловый спирт и 50 %-ный этиловый спирт. В качестве азо-ААфТ применялся сефадекс ЬН-20 - ДГЭЭД - ГСК -Новокаин.

Хроматографические профили на азо-ААфТ показаны на рисунке 5.

Таким образом, между собой хроматограммы лекарственных препаратов Танакан и Билобил почти не различаются, а в препарате Гинос более выражены микрокомпоненты на фракциях 5 и 8. Пик № 1 отличается по форме и экстинции. Вышеизложенные различия фиксируются только при хроматографировании на сефадексе ЬН-20 - ДГЭЭД - ГСК -Новокаин. Хроматографические профили изученных лекарственных препаратов на немодифицированном сефадексе ЬН-20 практически

идентичны. □

D

2 1,8 +

1,6 -

1,4 -

1,2 -

1 -

0,8 -

0,6 -

0,4

0,2

0

С2Н5ОН 25%

С2Н5ОН 50%

2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1213141516171819 № фракции

а)

1 23456780 101112131

1516171819 № фракции

б)

Рис. 5. а) Хроматограммы препаратов экстракта гинкго билоба для сорбента сефадекс LH-20 - ДГЭЭД - пНБГ - Новокаин

— Танакан, — Биолбил,.....-Гинос, X = 250 нм

б) Хроматограммы БАД на основе экстракта гинкго билоба для сорбента сефадекс LH-20 - ДГЭЭД - пНБГ - Новокаин —Гинкго Билоба Эвалар, .......Гинкго Билоба С, X = 250 нм

На хроматограммах БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, четко видны различия с растительными препаратами, содержащими экстракт гинкго билоба. Так, в Гинкго Билоба С производства ЗАО «Свободный 20» увеличены экстинции 1-го и 2-го пиков. Связано это с наличием в данном БАД, помимо самого экстракта гинкго билоба, аскорбиновой кислоты и рутина. В хроматограмме Гинкго Билоба Эвалар экстинции пиков 1 и 2, в отличие от растительных препаратов, уменьшены.

УФ-спектр выделенных фракций соответствует терпеновым лактонам и флавоновым гликозидам.

Для более подробного изучения состава препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, был применен азо-ААфТ сефадекс ЬН-20 - ДГЭЭД - ГСК - Антипирин (контрольным сорбентом являлся немодифицированный сефадекс ЬН-20). В качестве системы элюентов флавоноидной фракции «Экстракт гинкго билоба» впервые использовали насыщенный раствор натрия тетрабората, 0,05н раствор натрия гидрооксида.

Предложенная элюентная система позволила разделить флавоноидную фракцию на 2 пика как в препаратах, так и в БАД, содержащих экстракт гинкго билоба (рис. 6а, б).

а) б)

Рис. 6. а) Хроматограмма препарата Танакан

б) Хроматограмма БАД Гинкго Билоба С

— 230 нм,--- 250 нм,......270 нм

Таким образом, применение азоадсорбентов аффинного типа в исследовании препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, позволяет не только идентифицировать основные биологически активные вещества, но и показывает различия растительных препаратов от БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

4. Результаты сравнительного исследования физико-химическими методами препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба

По данным нормативно-технической документации, в большей части фитопрепаратов, как правило, используются только хроматографические методы анализа. Такая же ситуация наблюдается и для препаратов, содержащих экстракт гинкго билоба. С другой стороны, можно предположить, что ключевые компоненты трилактоны и флавоноиды должны иметь УФ-активность в области 260-400 нм, давая характерные полосы поглощения.

На рисунке 7 приведены УФ-спектры исследуемых объектов.

В полученных УФ-спектрах отчетливо видно наличие нескольких пиков поглощения. Так, в препарате Танакан можно выделить следующие зоны поглощения Хгаах: при 257, 266, 347, 362 нм, что говорит о сложном, многокомпонентном составе изучаемого объекта.

Рис. 7. а) УФ-сиектр препаратов, содержащих экстракт гинкго билоба

- Танакан,---Биолбил, .......Гинос

б) УФ-сиектр БАД на основе Гинкго Билоба

- Гинкго Билоба Эвалар,---Гинкго Билоба С

Полученные УФ-спектры препаратов экстракта гинкго билоба в целом повторяют профиль оригинального препарата Танакан. В БАД наблюдаются отличия не только по экстинции, но и по Я.тах. Так, в БАД Гинкго Билоба производства «Эвалар» наблюдается дополнительный пик с ^-шах 370 нм. Гораздо сложнее анализировать состав в БАД Гинкго Билоба С производства «ЗАО Свободный 20», так как характерные полосы поглощения в области 230-305 нм перекрываются пиком поглощения аскорбиновой кислоты, входящей в состав данного БАД, а в зоне 330400 нм имеются отличия профиля спектра от УФ-спектра препарата Танакан. Это свидетельствует о другом соотношении ключевых флавоноидов, так как в данный БАД входит флавоноид рутин.

Полученные нами данные УФ-спектроскопии могут служить средством не только конкретной идентификации препаратов экстракта гинкго билоба, но и способом их количественного определения.

В ИК-спектрах препаратов, содержащих экстракт гинкго билоба (рис. 8), можно выделить основные полосы поглощения: сильную, широкую полосу поглощения О-Н группы, валентные колебания спиртов' фенолов, углеводов (3423 см"1) (А. А. Васильев и сооавт., 2008), алканы,' валентные колебания (2920 см"1), ароматических углерод-углеродных связей (1652 см"1), и С-О колебаний гликозидов (1074 см"1) (А А Лпенин 2008).

ИК-спектры БАД на основе экстракта гинкго билоба имеют ряд отличительных полос поглощения, так, в Гинкго Билоба производства «Эвалар» (рис. 9) отмечается: 3182 смесильное), 2607 см"1 (среднее), 2142 (слабое ) см", 1602 смесильное), 1519 смесильное), в Гинкго Билоба С производства ЗАО «Свободный 20» имеется дополнительная полоса поглощения в зоне 1361 см"1.

&

_ п Волновое «ело, 1/см

Рис. 8. ИК-спектр препарата Танакан

В области «отпечатков пальцев» (1500-500 см"1) ИК-спектр препаратов экстракта гинкго билоба схожи, в то время как у БАД эта область различна.

Волновое число, 1/сы

Рис. 9. ИК-спектр БАД Гинкго Билоба Эвалар

Полученные данные позволяют сделать вывод о применимости спектральных методов анализа для сравнительного исследования ключевых компонентов в препаратах и БАД на основе экстракта гинкго билоба.

По литературным данным (Б. М. Зузук и сооавт., 2001), к числу известных компонентов БАВ гинкго билоба, помимо основных, отнесены и другие группы природных соединений. Например, органические кислоты (шикимовая, хинная, линоленовая), катехины, таниды, воск и др. Однако данных о летучих БАВ, данных о растительных препаратах, определяемых методом ГЖХ-МС, в доступной литературе не найдено. Тем не менее, известно, что некоторые замещенные фенолы с трет-бутильными заместителями биологически активны. Например, лекарственное средство Дибунол обладает противоопухолевым эффектом. Обнаружение его в 1-й фракции препарата Танакан (рис. 10) проведено впервые (табл. 3).

Применение метода ГЖХ-МС позволило впервые обнаружить в 1-й и 3-й фракциях вещества, производные дифенилбутена и его аналогов, в том числе и оригинальные циклопропильные производные. Можно предположить, что производные дифенилбутена будут обладать свойствами антиэстрогенов (тамоксифен, кломифен и др.).

ИТ. О О« - А» 02

9

$

I

2« 11

21 га

1& 60 ' I -

! 20 01 , ( га 57

Рис. 10. ГЖХ-МС хроматограмма 1-й фракции

Таблица З

Состав летучих компонентов фракции 1

№ п/п ИТ Мг Брутто-формула Относительное распределение Определяемое вещество в соответствии с данными библиотеки прибора Достоверность, %

1 12.00 164 СпН;» 4.5% 3-октсн-5-ен-2,2,7,7-тетраметил 11.44

2 15.62 220 С',5Н240 2.0% 2,6-бис[ 1,1 -димстилзтнл]-4-мстилфснол Нэ9 ОН СН3 Н3С-?1ч1ч1-СНз НзС СНз сн3 25.51

3 19.58 196 с,,11,» 11.0% 1,3-дифенил пропан 86.03

4 21.11 208 35.0% 1,1 -дибензил-бутнлен-1 16.85

5 21.79 208 с,„И,6 32.0% Транс-1,2-дифснилциклобутан 72.93

6 22.70 238 С1411!20з 9.0% 2,2,6-триметил-7-оксо-бицикло-[4,1,0]-ге11тил-1-протшиловын эфир уксусной кислоты 30.85

7 24.56 258 СЦНМБ 3.0% 1,1 -диметилтетрадецил гндросульфид 11.50

8 26.13 278 с1(,н24о4 56.0% Дибутилфталат 12.28

9 26.61 240 с„и№ 10.0% 2,6,10-тр иметнлтеградекан 7.93

10 28.57 296 С2,Н44 6.0% п-Гепэйкозан 9.98

11 30.42 258 СиНчЯ 3.0% 1,1 -димсгилтеградецнл гидросульфид 19.08

12 35.16 332 СиИмСВ 46.0% 2-фснил-З- [(фенилсул ьфнннл )мстил ]цикло пропилбензол 40.70

13 36.38 278 с24нмо4 46.0% Диизооктнлфталат 39.39

14 36.71 316 57.0% [(1-мстил-2,2- дифснилциклопропил)сульфнн нл]бензол 52.11

14' 36.71 311 С19Н2|КО 57.0% М,М-диыетил,3-1,3-дифеинл-2-бутеновын эфир тиокарбаминовой кислоты ч-сн, Н3С 12.68

15 36.97 316 100.0% [(1-метил-2,2- дифенилциклопропил)сульф инил]бешол 25.70

15' 36.97 316 СнНзоЯ 100.0% 3-(2-циклопентенил)-2-метил-1,1 -дифенлпроттсн-1 24.70

16 37.27 316 С22Н2„5 45.0% [(1-метил-2,2- дифсншщиклопропил)сулъф инил!бензол (изомер) 34.94

17 38.79 311 С„Н21МО 15.0% Ы,Ы-димстил,8-1,3-дифснил-2-бутеновый эфир тиокарбаминовой кислоты (изомер) 37.45

18 39.15 311 7.0 % К,Ы-диметил,5-1.3-днфеннл-2-бутеновый эфир тиокарбаминовой кислоты (изомер) 23.87

Однако в настоящее время нет никакого предположения о возможном влиянии витамина группы Б (фракция № 3) на общий эффект данного препарата. В то же время дибензо[с,{]-циклогептадиен-7-оксо-циклобутан (фракция № 3) можно рассматривать как некоторый аналог иммуностимулятора циклоферона.

Вышеуказанные вещества обнаружены только в полученных ключевых хроматографических фракциях растительного НП Танакан, методом ЖКХ на азо-ААфТ сефадекс ЬН-20 - ДГЭЭД - ГСК - Антипирин. Данный эффект можно объяснить феноменом их накопления в изученных фракциях, в то время как в исходном препарате эти вещества находятся лишь в следовых количествах (табл. 4).

Таблица 4

Летучие компоненты препарата Танакан

№ п/п ЯТ Мг Круп о- формула Относительное распределение Определяемое вещество в соответствии с данными библиотеки прибора Достоверность, %

1 14.51 228 с,4н,»о, 17.00% Тетрадекановая кислота 61.58

2 16.95 256 С„,Нг>0, 63.00% н-Гексадекановая кислота 72.83

3 17.10 256 с|(,н„о, 58.00% н-Гексадскановая кислота 79.48

4 18.77 282 с,вн,4о. 39.0% Олеиновая кислота 26.67

5 19.03 372 с!2н„о. 49.00% Октодекановой кислоты 2-(2-гидроксиэтокси) этиловый эфир 70.15

6 22.12 390 с24н,8о4 17.00% 1,2-бстинилкарбоновой кислоты диоктиловый эфир 27.49

7 24.18 410 50 100.00% Сквален 50.92

8 25.09 384 С\7Н440 7.00% 4,6-холиестадиен-З-Р - ол 17.28

9 25.27 430 С29Н50О2 15.00% Холссто-5-ен,ЗР" (метоксиметокси) 43.50

Таким образом, совместное применение метода НАФХ и ГЖХ-МС позволяет прогнозировать и уточнять новые аспекты действия препаратов экстракта гинкго билоба. Помимо доказанного антиоксидантного действия можно говорить о наличии противоопухолевого и увеличивающего кровоточивость действия.

Выводы

1. Разработаны условия и впервые осуществлен синтез азоадсор-бентов аффинного типа с лигандами-модификаторами из класса флавоноидов (морин, дигидрокверцетин, рутин) на полисахаридных матрицах. В частности, получены производные декстрана (сефадекс С-10, ЬН-20), производные агарозы (сефароза СЬ-6В). Получены аналоги с использованием эпоксиактивации эпихлоргидрином и диглицидловым эфиром 1, 2-этандиола.

2. Показано, что характер удерживания компонентов модельных смесей ноотропных препаратов позволяет сопоставить хроматографические свойства синтезированных сорбентов, а применение диглицидлового эфира 1, 2-этандиола в качестве эпоксиреагента и троксерутина в качестве лиганда-модификатора наиболее эффективно.

3. Экспериментально подобраны условия хроматографирования основных биологически активных веществ гетерозидов гинкго и гинкголидов-билобалидов растительных препаратов и БАД, содержащих экстракты гинкго билоба.

4. Используя азоадсорбенты аффинного типа, впервые выделены и накоплены минорные компоненты с потенциальной биологической активностью, содержащиеся в растительном препарате экстракта гинкго билоба и обнаруженные по данным ГЖХ-МС анализа.

5. Впервые комплексом современных физико-химических методов анализа определено отличие препаратов, содержащих экстракт гинкго билоба, от БАД на основе экстракта гинкго билоба. Показана возможность применения азоадсорбентов аффинного типа для определения качественного и количественного содержания основных биологически активных веществ в препаратах и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Халахин, В. В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ XXV. Новые азоэпоксиадсорбенты на основе ванилингидразонов о-(окси, амино) замещенных бензойных кислот в неклассической аффинной хроматографии / В. В. Халахин, А. А. Дудин, П. В. Кузнецов // Ползунов-ский вестник. - 2008. - Вып. 3. - С. 190-193.

2. Халахин, В. В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ XXVI. Изучение лекарственного препарата, содержащего экстракт Гинкго билоба, методом неклассической аффинной хроматографии / В. В. Халахин, П. В. Кузнецов // Ползуновский вестник. - 2009. - № 3. - С. 312-315.

3. Халахин, В. В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ XXIV. Особенности разделения ноотропных препаратов различной природы методом неклассической аффинной хроматографии / В. В. Халахин, П. В. Кузнецов // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. -2010,-№8.-С. 25-29.

4. Кузнецов, П. В. Эпоксиактивированные адсорбенты нового поколения на основе перешитых полимерных матриц / П. В. Кузнецов, А. А. Сухих, В. В. Халахин и др. // Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий: материалы Международной научной конференции. - Томск, 2006. - Т. 1. - С. 255.

5. Кузнецов, П. В. Эпоксимодифицированные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ / П. В. Кузнецов, А. С. Сухих, В. В. Халахин и др. // Тезисы докладов XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. - Волгоград, 2011. - Т. 2. - С. 385.

6. Халахин, В. В. Первичный хроматографический скрининг модельных смесей ноотропных препаратов на эпоксимодифицированных гелях сефадекса в-Ю / В. В. Халахин, П. В. Кузнецов // Вестник Кузбасского научного центра «Инновационные технологии медицинской науки и здравоохранения». - Кемерово, 2006. - Вып. 2. - С. 161-162.

7. Дудин, А. А. Сравнительная характеристика препаратов левотироксина натрия / А. А. Дудин, В. В. Халахин // Медицина в Кузбассе. - 2006. - Спецвып. 3. - С. 48.

8. Халахин, В. В. К проблеме изучения препаратов, содержащих экстракт Гинкго билоба, методом неклассической аффинной хроматографии / В. В. Халахин, П. В. Кузнецов // Химия в XXI веке: новые технологии, новые продукты: сб. тез. докл. - Кемерово, 2007. - С. 160-161.

9. Халахин, В. В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ. XXIII. Скрининг модельных смесей ноотропных препаратов на азоэпоксиадсорбентах нового поколения / В. В. Халахин, П. В. Кузнецов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2007. - Вып. 62. - С. 405-407.

10. Халахин, В. В. Гидразид антраниловой кислоты - новый реагент аффинного синтеза / В. В. Халахин, П. В. Кузнецов, А. Г. Михайловский и др. // Актуальные вопросы фармации в XXI веке: материалы конференции. - СПб., 2008. - С. 164.

11. Халахин, В. В. О феномене увеличения межфазного катализатора в аффинном синтезе / В. В. Халахин II Медицина в Кузбассе. - 2008. -Спецвып. 2.-С. 185.

12. Халахин, В. В. Эпоксиазоантипирин - перспективный адсорбент для хроматографического изучения флавоноидной фракции препаратов экстракта Гинкго билоба / В. В. Халахин, П. В. Кузнецов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. Пятигорской фармацевтической академии. - Пятигорск, 2008. - Т. 63. -С. 353-355.

13. Халахин, В.В. Сравнительная оценка качества препаратов экстракта Гинкго билоба жидкостной колоночной хроматографией / В. В. Халахин, П. В. Кузнецов // Фармация из века в век: труды научно-практической конференции. - СПб., 2008. - Ч. 3. - С. 173-175.

14. Халахин, В. В. К проблеме исследования препаратов экстракта Гинкго билоба газожидкостной хроматографией с масс-спектрометрической детекцией / В. В. Халахин, П. В. Кузнецов // Природные ресурсы и интеллектуальные ресурсы Сибири: труды Х1П Международной научно-практической конференции. - Кемерово, 2010. -С. 161-164.

Подписано в печать 2.04.2012. Формат 60х84'/к!. Бумага офсетная № 1. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 106

Адрес издательства и типографии: ООО «Издательство «Кузбассвузиздат». 650043, г. Кемерово, ул. Ермака, 7. Тел. 8 (3842) 58-29-34, т/факс 36-83-77. E-mail: 58293469@mail.ru

Актуальность темы. Ноотропные препараты (НП) в настоящее время занимают значительный сегмент отечественного фармацевтического рынка. Востребованность препаратов данной группы в современной клинической практике объясняется несколькими причинами. Одна из них - значительное увеличение частоты неврологической и психиатрической патологии, особенно в I пожилом и старческом возрасте [16].

Другой причиной является увеличение доли пожилых и старых людей в популяции и, соответственно, рост значимости возрастных изменений высшей нервной деятельности и памяти. НП занимают одно из ведущих мест практически во всех схемах и методах медикаментозного воздействия при данных заболеваниях [68].

Среди других причин расширения применения НП - их стресспротекторные свойства [20, 4, 125]. Значительное повышение роли хронического психоэмоционального и экологического стресса в жизни и деятельности населения определяет актуальность поиска путей профилактики и коррекции негативного воздействия стресса на деятельность нервной системы [51, 17]. Одним из путей профилактики является применение НП [3].

Несмотря на наличие большого разнообразия НП и различие механизмов их действия, эффективность существующих НП считается недостаточной [85,123]. Именно поэтому активно ведется поиск не только новых синтетических НП [105], таких как гаммоксин [104], глипрофен, мефебут и др., но и растительных НП. Исследуется возможность применения комбинации нескольких веществ, приводящих к ноотропному эффекту[96, 9, 95].

Сегодня на фармацевтическом рынке России присутствуют синтетические НП, комбинированные НП, растительные препараты с ноотропным действием, а также биологически активные добавки (БАД) с ноотропным эффектом.

Исследование и стандартизация комбинированных препаратов, а также препаратов, содержащих растительные извлечения, относятся к достаточно сложной задаче, требующей значительных материальных и временных затрат. Это обусловлено тем, что в их состав могут входить вещества широкого спектра лиофильности и гидрофильности, в том числе и их ассоциаты.

Наиболее оптимальным для исследования и стандартизации таких объектов является применение комплекса хроматографических методов. Наряду с классическими методами хроматографии: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), аффинная хроматография (АФХ), газожидкостная хроматография (ГЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ) [91,133,134] хорошо себя зарекомендовал метод неклассической аффинной хроматографии (НАФХ), используемый для разделения биологически активных веществ растительных [87,88] и синтетических лекарственных препаратов [53,86], позволяющий осуществлять препаративное накопление.

Таким образом, для разделения и изучения компонентного состава лекарственных препаратов и биологически активных добавок на основе гинкго билоба целесообразно применение метода НАФХ.

Подчеркнем также, что исследования, связанные с оценкой качества НП, отражены в единичных публикациях. Данный факт определяет прикладной аспект актуальности настоящей работы.

Цель и задачи исследования. Разделение и анализ модельных смесей синтетических ноотропных препаратов, растительных препаратов и биологически активных добавок, содержащих экстракт гинкго билоба, в режиме неклассической аффинной хроматографии при варьировании хроматографических условий и строения адсорбента.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести синтез азоадсорбентов аффинного типа с применением различных вариантов эпоксиактивации и лигандов-модификаторов.

2. Определить хроматографические свойства синтезированных азоадсорбентов, в сравнении с ^модифицированными матрицами, при разделении модельных смесей, состоящих из синтетических ноотропных препаратов и растительного препарата, содержащего экстракт гинкго билоба.

3. Оптимизировать хроматографические условия разделения и выделения на азоадсорбентах, биологически активных веществ растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

4. Исследовать комплексом современных физико-химических методов компонентный состав выделенных на азоадсорбенте фракций растительного препарата, содержащего экстракт гинкго билоба.

5. Провести сравнительное исследование основных групп биологически активных веществ растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго биолба, комплексом современных физико-химических методов.

Научная новизна. Для оценки хроматографических особенностей ноотропных препаратов и их БАД методом жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) впервые сконструирован ряд оригинальных азоадсорбентов аффинного типа (азо-ААфТ). Впервые проведен скрининг модельных смесей ноотропных препаратов на азо-ААфТ с использованием в качестве сорбентов контроля немодифицированных матриц. Впервые показаны хроматографические особенности, влияние длины вставки для ряда оригинальных азо-ААфТ при скрининге модельных смесей НП. Впервые для изучения растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, применялся метод НАФХ, а в качестве элюента использован насыщенный раствор натрия тетрабората. Впервые обоснована возможность применения спектральных методов анализа для сравнительного изучения растительных препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба, а также впервые проведено сравнительное исследование данных объектов методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрией (ГЖХ-МС).

Практическая значимость. По результатам исследования синтезированы азоадсорбенты аффинного типа, обладающие специфичностью и эффективностью при разделении комбинированных ноотропных препаратов в режиме жидкостной колоночной хроматографии.

Предложенные подходы с применением азоадсорбентов аффинного типа снижают объем проводимой работы при выделении индивидуальных веществ из комбинированных лекарственных препаратов и многокомпонентных растительных экстрактов.

Разработанные азоадсорбенты аффинного типа позволяют осуществлять препаративное выделение, в том числе минорных компонентов растительных извлечений, а накопление их в необходимых количествах направлено на фармакологический анализ. Экспериментальные данные позволяют рекомендовать введение в структуру ФС на растительные препараты, содержащие экстракт гинкго билоба, методы, УФ-, ИК-спектроскопии для экспресс-анализа подлинности.

Определены отличия компонентного состава в растительных препаратах и БАД, содержащих экстракты гинкго билоба, при этом полученные данные позволяют контролировать их качество по основным группам биологически активных веществ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Особенности синтеза азоадсорбентов аффинного типа.

2. Результаты скрининга модельных смесей НП растительного и синтетического происхождения на полисахаридных сорбентах и их эпоксимодифицированных аналогах.

3. Результаты применения азоадсорбентов аффинного типа в исследовании препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

4. Результаты сравнительного исследования физико-химическими методами препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

Связь задач исследования с планами научной работ.

Диссертационная работа была выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Кемеровской государственной медицинской академии (№ Государственной регистрации 0120.0 506552 фр. № 2).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на научных конференциях: межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2006; 2008); «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2007; 2008); Международных конференциях: «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006); «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); XIII Международной научно-практической конференции «Природные ресурсы и интеллектуальные ресурсы Сибири» (Кемерово, 2010); на Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011).

Личный вклад автора состоит в планировании, организации и проведении исследований по всем разделам диссертации, включая разработку направлений исследований, сбор и анализ информации, выбор методов, интерпретации результатов, написании диссертации.

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 14 печатных работах, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объектам и методикам исследований, четырех глав собственных исследований, выводов, а также списка литературы, включающего 142 наименования, из них - 38 источников иностранных авторов. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 80 рисунков.

выводы

1. Разработаны условия и впервые осуществлен синтез азоадсорбентов аффинного типа с лигандами-модификаторами из класса флавоноидов (морин, дигидрокверцетин, рутин) на полисахаридных матрицах. В частности, получены производные декстрана (сефадекс в-10, ЬН-20), производные агарозы (сефароза СЬ-6В). Получены аналоги с использованием эпоксиактивации эпихлоргидрином и диглицидловым эфиром 1,2-этандиола.

2. Показано, что характер удерживания компонентов модельных смесей ноотропных препаратов позволяет сопоставить хроматографические свойства синтезированных сорбентов, а применение диглицидилового эфира 1,2-этандиола в качестве эпоксиреагента, и троксерутина в качестве лиганда-модификатора, наиболее эффективно.

3. Экспериментально подобраны условия хроматографирования основных биологически активных веществ гетерозидов гинкго и гинкголидов-билобалидов растительных препаратов и БАД, содержащих экстракты гинкго билоба.

4. Используя азоадсорбенты аффинного типа, впервые выделены и накоплены минорные компоненты с потенциальной биологической активностью, содержащиеся в растительном препарате экстракта гинкго билоба и обнаруженные по данным ГЖХ-МС анализа.

5. Впервые комплексом современных физико-химических методов анализа определено отличие препаратов, содержащих экстракт гинкго билоба, от БАД на основе экстракта гинкго билоба. Показана возможность применения азоадсорбентов аффинного типа для определения качественного и количественного содержания основных биологически активных веществ в препаратах и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

1.8 Заключение

Поиск новых биологически активных веществ с ноотропным действием ведется в ходе изучения различных химических соединений (нейропептиды, аналоги и конъюгаты медиаторных аминокислот, производных пролина, 3-оксипиримидина и др.) [19]. Наряду с ними препараты растительного происхождения также перспективны для фармакологической' коррекции нарушений, возникающих при недостаточности кровоснабжения мозга. Их широкое применение обусловлено достаточно высокой эффективностью и низкой токсичностью, а также характерным для растений богатством химического состава, который определяет многообразие фармакологических свойств фитопрепаратов и оказывает комплексное воздействие.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе использовали химические реагенты и вещества; эпихлоргидрин (ЭХГ, рекатив Аксена "Sigma", США), п-нитро-бензгидразид (п-НБГ, "Sigma", США), натрия нитрит, натрия дитионит (Япония), диглицидиловый эфир 1,2 - этандиола (ДГЭЭД, реактив Хуберта. г. Новосибирск); следующие сорбенты: сефадекс LH-20 ("Pharmacia", Швеция) (СФ-20), сефадекс G-10 ("Pharmacia", Швеция), сефароза CL-6B (Pharmacia, Швеция), другие препараты: диметилсульфоксид (Димексид, КПХФО "Татхим-фармпрепараты", Казань, (ДМСО), органические растворители: ацетонитрил -марки чда. этанол спектрально чистый в УФ-области, соответствующий требованиям ГФ X. Растворы веществ и элюентов готовили из солей марки хч, ч.д.а. и фиксаналов отечественного производства на бидистиллированной воде.

Для тонкослойной хроматографии (ТСХ) применяли хроматографические пластины "Silufol" производства фирмы "Kavalier" (Чехия). Природные стандартные вещества, флавоноиды: кверцетин, изорамнетин, кемпферол, получены из коллекции аналитических образцов кафедры фармакогнозии и ботаники Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии (заведующий кафедрой профессор Яковлев Г.П.).

2.1 Объекты исследования

2.1.1 Приготовление растворов модельных смесей ноотропных препаратов

Растворы модельных смесей НП: гаммоксина (гидрохлорид-З-окси-З-фенил-4-амино-бутановая кислота), глипрофена (амид н-пропилфенилгликолевой кислоты), мефебута (метилового эфира 4-амино-З-гидрокси-3-фенил-бутановой кислоты гидрохлорид), готовили из готовых субстанций, любезно предоставленных д. фарм. наук, проф. Т. И. Ярыгиной (ГБОУ ВПО ПГМА им. академика Е. А. Вагнера).

Растворы Фенибута, Фенотропила, Пикамилона готовили из таблеток: Фенибут 250 мг № 20 АО «Олайнфарм» (серия 70105), Фенотропил 100 мг № 10 «Щелковский витаминный завод» (серия 60205), Пикамилон 50 мг № 30 ЗАО НПК «Эхо» (серия 70305).

Растворы готовили следующим образом: таблетки измельчали, а готовые субстанции высыпали в ступку и экстрагировали в ней 50 мл воды, в течение 30 минут, с последующим фильтрованием через бумажный обеззоленный фильтр (синяя лента ТУ 6-09-1678-77). Затем дополнительно центрифугировали на центрифуге (310b/317b, Польша.) при 8 тыс. оборотов 10 минут. Экстракт гинкго билоба (Egb 761) готовили из препарата Танакан 40 мг № 30 «Бофур Ипсен Индастри» (серия Р544), аналогично растворам препаратов и БАД, содержащих экстракт гинкго билоба.

Оптическая плотность модельных смесей НП по данным УФ-спектроскопии (СФ-26, Россия) на 260 нм была равной 1 D, что составило для гаммоксина 0,05 г/л, глипрофена 0,2 г/л, мефебута 0,2 г/л, фенотропила 0,2 г/л, фенибута 0,25 г/л, пикамилона 0,05 г/л.

Состав модельных смесей ноотропных препаратов представлен в таблице (см. табл.2.1).