Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование химического состава и разработкаметодик анализа растительного сырья некоторыхвидов берез

РГБ ОД 2 В ФЕО 2002

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

БЕРЕЗОВСКАЯ ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

Исследование химического состава и разработка методик анализа растительного сырья некоторых видов берез

15.00.02 -фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

ПЯТИГОРСК 2002

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ПЯТИГОРСКОЙ

ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ Доктор Фармацевтических наук.

заслуженный деятель науки РФ. профессор. БЕЛИКОВ В.Г. ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ Доктор Фармацевтических наук.

профессор. МУРАВЬЕВА Д.А. Доктор Фармацевтических наук, профессор,МОЛЧАНОВ Г.И. ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Курский государственный

(ПРЕДПРИЯТИЕ) медицинский университет

ЗАЩИТА СОСТОИТСЯ .сигрТЯ- 2002 Г. В ЧАСОВ

НА ЗАСЕДАНИИ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 208.069.01 ПО ЗАЩИТАМ ДИССЕРТАЦИЙ ПРИ ПЯТИГОРСКОЙ

ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ (357533, ПЯТИГОРСК, ПР. КАЛИНИНА, 11)

С ДИССЕРТАЦИЕЙ МОЖНО ОЗНАКОМИТСЯ В БИБЛИОТЕКЕ ПЯТИГОРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ (ПР. КАЛИНИНА, 11) АВТОРЕФЕРАТ РАЗОСЛАН « С'Л » фе/Аа^- 2002 Г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА ПРОФЕССОР

суп ./// , 9

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возрастающий интерес к лекарственным средствам, созданным на основе растительного сырья объясняется их комплексным воздействием на организм. Из 15 тысяч наименований, используемых в Российской Федерации, лекарственные средства растительного происхождения составляют более трети. Сочетание огромного разнообразия биологически активных веществ (БАВ) расширяет фармакологические перспективы применения растительных лекарственных средств.

Семейство Betulaceae является перспективным источником флавоноидов и терпенов. В настоящее время известно более 40 видов биологической активности флавоноидов, таких как: кардиотоническое, сосудоукрепляющее, антимикробное, противовоспалительное, противоязвенное, диуретическое, гипоазотемическое и др. Терпены обладают фунгицидной активностью.

Объектами нашего исследования были: лекарственное растительное сырье - почки березы повислой (березы бородавчатой) -Betula pendula Roth. (=В. verrucosa Ehrh.) и береты пушистой - Betula pubescens Ehrh. (=B. alba L.), докритические С02-экстракты почек березы пушистой, производства АО «Абицея» ^Екатеринбурга. Широкое использование почек березы в народной медицине и вместе с тем ограниченное применение п научной медицине, из-за недостаточной изученности химического состава БАВ, делает актуальным исследование этого растительного сырья. ФС на почки березы регламентирует качество сырья по количественному содержанию эфирного масла, однако, исследований компонентного состава эфирного масла, используемых в медицине берез, ранее не проводилось. В лекарственных средствах, содержащих в своем составе почки березы (эликсир «Кедровит» и бальзам «Демидовский»), согласно действующей НД идентифицируют

бетулен методом ГЖХ, в то же время само сырье по данному показателю не стандартизируют.

Важным направлением в создании новых лекарственных средств растительного происхождения является разработка технологий, позволяющих максимально извлечь БАВ из исходного сырья. Экстракция биологически активных веществ с помощью оксида углерода (IV) - это сравнительно новый вид технологии извлечения БАВ из сырья растительного или животного происхождения. Мы исследовали только образцы, полученные докритичесхой СОг - экстракцией. Эти исследования представляют как практический, так и теоретический интерес, вследствие малой изученности компонентного состава подобных извлечений. Вместе с появлением новых технологий, в том числе СОг -экстракции из сырья, повышаются требования, предъявляемые к качеству, как растительного сырья, так и к лекарственным средствам, созданным на основе полученных экстрактов. В связи с этим актуальным направлением современного фармацевтического анализа является разработка методов контроля качества БАВ, содержащихся в почках березы и СОг-экстракте почек березы.

Цель и задачи работы. Цель нашего исследования состоит в изучении химического состава и разработке методов анализа сырья почек березы и экстрактов из них по содержанию терпенов и флавоноидов.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

исследовать состав и идентифицировать биологически активные соединения, содержащиеся в почках березы; разработать методики очистки и разделения флавоноидных соединений и терпенов;

идентифицировать флавоноидные и терпеновые соединения почек березы;

разработать методики качественного и количественного анализа БАВ в почках березы;

изучить качественный и количественный состав компонентов докритического углекислотного экстракта из почек березы.

Связь задач исследования с проблемным планом НИР. Работа выполнена в соответствии с планом НИР академии, номер государственной регистрации 01.9.80 008688.

Научная новизна работы. Предложена теоретически и экспериментально обоснованная схема выделения и очистки суммы флавоноидов из почек березы. Показана возможность использования дифференциальной спектрофотометрии по продуктам комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом для количественного определения флавоноидов почек березы в пересчете на кверцетин.

Изучен с использованием ГЖХ метода анализа компонентный состав эфирного масла почек березы. Впервые в эфирном масле идентифицированы: а- и Р- кариофиллены, гуммулен, Р - бисаболен, кариофилленоксид, р-кариофилленовый спирт.

Впервые изучен состав докритического углекислотного экстракта почек березы. В С02 - экстракте почек березы пушистой, с использованием ГЖХ идентифицированы терпены: а- кариофиллен, гуммулен, Р - бисаболен, кариофилленоксид, а-бетуленол, бетулен, а-бетуленилацегат. С использованием тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии доказано наличие в докритическом углекислотном экстракте метоксилированных флавоноидов: бетулетола, 3-метил-бетулетола. Теоретически обоснована возможность коррекции «фона» сопутствующих веществ экстракта при спектрофотометрическом определении бетулетола в СОг -экстракте почек березы пушистой.

Проведены сравнительные исследования компонентного состава эфирного масла и докритического углекислотного извлечения из почек березы. Показано, что докритический углекислотный экстракт почек березы содержит меньше кислородсодержащих

производных сесквигерпеновых углеводородов, а содержание терпенов в нем больше, чем в эфирном масле.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования и разработанные методики позволяют стандартизировать почки березы по основным фармакологическим активным веществам: флавоноидам и терпенам. Разработана методика определения флавоноидов с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии, по реакции комплекеообразования с алюминия хлоридом. Методика дает возможность проводить оценку качества сырья по флавоноидам в пересчете на кверцетин.

Экспериментально разработана методика количественного определения бетулстола в докритическом СОг - экстракте почек березы методом производной спектрофотометрии с использованием комбинированного полинома, составленного из полиномов первой и второй степени.

Проведенный выбор условий ГЖХ анализа и разработанные методики идентификации и количественного определения позволяют выполнять оценку качества эфирного масла и докритического СОг -экстракта почек березы по содержанию терпенов.

Внедрение результатов работы. Методика спектрофотометрии еского анализа бетулетола в докритических углекислотных экстрактах почек березы внедрена в работу НИЦ экологических ресурсов ГОРО г.Росгова-на-Дону.

Методические рекомендации по идентификации и количественному определению содержания основных биологически активных соединений С02-экстракта внедрены в работу Уральского НИИ технологии медпрепаратов МЗ РФ ^Екатеринбурга и НИЦ экологических ресурсов ГОРО г.Ростова-на-Дону. Методики идентификации и количественного определения компонентов СО2-экстракта апробированы в АО «Абицея» г.Екатеринбурга. Получено 2 акта апробации и 5 актов внедрения разработанных методик

качественного и количественного анализа докритических углекислотных экстрактов.

Апробация полученных результатов. Основные результаты исследований доложены на научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии в 1997,1998, 1999, 2000 и 2001 годах.

Основные положения, выносимые на защиту: результаты изучения флавоноидных соединений и терпенов эфирного масла почек березы повислой (березы бородавчатой) -Betula pendula Roth. (=В. verrucosa Ehrh.), березы пушистой -Betula pubescens Ehrh. (=B. alba L.);

методы выделения, идентификации и количественного определения флавоноидов сырья и терпенов эфирного масла и докритического углекислотного экстракта почек березы; результаты анализа компонентов докритического СОг-экстракта почек березы пушистой, методы их выделения, идентификации и количественного определения;

сравнительная оценка компонентного состава эфирного масла и докритических СОг-экстрактов почек березы пушистой;

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 стр., состоит из введения, обзора литературы и 4 глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 21 рисунком и 27 таблицами. Библиография имеет 173 наименований, из которых 42 на иностранных языках.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Изучение компонентного состава флавоноидов

Почки березы содержат флавоноиды и эфирное масло, основными компонентами которого являются сесквитерпены и их кислородсодержащие производные. Для изучения состава

флавоноидных соединений использовались методы ТСХ и спектрофотометрии. Для получения фракций флавоноидов проводились предварительные исследования с целью получения фракций флавоноидов без липофильных и балластных веществ. В результате разработана методика выделения, схема которой представлена на рис.1.

Схема выделения БАВ из почек березы

Рис. 1

Для ТСХ анализа на пластинках с закрепленным слоем силикагеля «Сорбфил» ПТСХ-И-В-УФ, производства АО «Сорбполимер» г.Краснодара и чешских пластинках 8Ни<Ы использовали следующие системы растворителей: этилацетагг -

муравьиная кислота - вода (10:2:3); н-бутанол - уксусная кислота -вода (4:1:5); бензол - этилацетат - уксусная кислота (5:5:1); бензол -метиловый спирт (95:5); уксусная кислота - вода (6:4). Детектирование зон флавоноидов проводили как по собственной флуоресценции веществ в УФ свете (при X = 254 и 366 нм), так и с помощью следующих проявителей: пары аммиака, 5% водный раствор карбоната натрия, 2% спиртовый раствор хлорида алюминия (III), реактивы Вильсона и Бенедикта. Лучшей разделяющей способностью для веществ, извлекаемых из сырья этиловым спиртом, обладает система этилацетат -муравьиная кислота - вода, а для анализа фракции агликонов флавоноидов и спиртового раствора докритического углекислотного экстракта почек березы - система, включающая бензол и метиловый спирт.

Дальнейший анализ проводился методом ТСХ с использованием образцов свидетелей методом ТСХ. Образцы кверцетина, кемферола, апигенина, рутина и гиперозида были предоставлены НПО В ИЛ АР г.Москва. Вещества, для идентификации которых отсутствовали образцы свидетелей, анализировали спектрофотометрическим методом. Для идентификации использовали ионизирующие и комплексообразующие добавки: натрия ацетат, натрия ацетат с кислотой борной, хлорид алюминия (III), хлорид алюминия (Ш) с кислотой хлористоводородной, этилат натрия. Вещества идентифицировали по характерным сдвигам максимумов поглощения при использовании соответствующих диагностических добавок и по форме УФ спектров поглощения. Данные ТСХ анализа (значение Иг при соответствующих условиях хроматографирования) и спектрофотометрических исследований сопоставляли друг с другом. На основании полученных результатов в объектах исследования идентифицированы флавоны и флавонолы, указанные в табл. 1.

Таблица 1

Результаты идентификации флавоноидов

Идентифицированное Объект исследования

вещество Betula Betula C02-

Значение pendula pubescens экстракт

Rf Roth.(=B. Ehrh. (=B. почек

Verrucosa Alba L.) березы

Ehrh.)

Агликоны флавоноидов

Кверцетин 0,89±0,02 +

Бетулетол 0,72±0,02 + -t-

3-метил-кверцетик 0,61±0,02 +

Рамназин 0,56±0,02 +

Акацетин 0,48±0,02 + +

Пендулетин 0,6&±0,02 -+ + +

Апигенин 0,46±0,02 +

Кемферол 0,86±0,02 +

Рамноцитрин 0,54±0,02 +

Эрманин 0,51±О,02 +

7,4'-диметилапигенин 0,33±0,02 +

Кемферид 0,17±0,02 +

Гликозиды флавоноидов

Рутин 035±0,01 +

Гиперозид 0,38±0,02 +

Астрагалин 0,45±0,02 +

Примечание: 1. «+» - означает что объект исследования содержит данное вещество, отсутствие знака свидетельствует об отсутствии флавоноида в объекте.

2. Значение Rf приведено для системы этилацетат-муравьиная кислсгга-вода (10:2:3).

Из данных таблицы следует, что флавоноиды почек березы представлены в основном агликонами. Флавоноидный состав почек Betula pubescens Ehih. (=В. Alba L.) более разнообразен, чем в почках Betula pendula Roth.(=B. Verrucosa Ehrh.). Докритаческий углекислотами экстракт почек березы содержит метоксилированные флавоноиды бетулетол и пендулетин.

Количественное определение флавоноидов в почках березы

Для разработки методики количественного определения флавоноидов были изучены спектры этанольных извлечений и продуктов кислотного гидролиза извлечений из сырья, а так же спектральные характеристики продуктов взаимодействия флавоноидов извлечений с хлоридом алюминия (III). Дифференциальные спектры извлечения из почек березы и ГСО кверцетина приведены на рис.2.

Дифференциальные спектры продуктов кислотного гидролиза этанольного излечения из почек березы и кверцетина

длина волны,нм

|.....Извлечение из почек-Кверцетин |

Рис.2

Дифференциальный спектр этанольного извлечения из сырья после кислотного гидролиза и действия хлоридом алюминия (1П) имеет максимум светопоглощения, совпадающий с максимумом дифференциального спектра комплекса кверцетина с тем же реактивом при А,=430±2 нм. Исследуемая область спектра достаточно удалена от спектров поглощения сопутствующих веществ, кроме того,

для устранения их влияния определение проводили на фоне исходного раствора. Это позволяет выделить полосу поглощения комплекса флавоноидов с хлоридом алюминия (Ш) (ДЕ-вариант дифференциальной спектрофотометрии).

Проведены исследования по изучению влияния на процесс экстракции из сырья различных факторов, а так же по воздействию на результаты количественного определения объема, концентрации хлорида алюминия (III) и продолжительности

комплексообразования. Оптимальные условия экстрагирования флавоноидов и условий количественного определения приведены в табл.2.

Таблица 2

Оптимальные условия для количественного определения флавоноидов в почках березы

Экстрагент 70% этанол

Измельченность сырья 5 мм

Температурный режим Водяная баня 60°С

Время экстрагирования 60 мин

Соотношение сырье - экстрагент 1:40

Количество кислоты хлористоводородной для гидролиза 2 мл в 100 мл 70% этилового спирта

Количество хлорида алюминия (III) 3 мл 2% раствора

Время комплексообразования 40 минут

В результате проведенных исследований, в указанных (табл. 2) условиях была разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в почках березы с использованием дифференциальной спектрофотометрии.

Образцы лекарственного растительного сырья из различных географических зон РФ анализировали по предложенной методике. Количественное содержание флавоноидов в почках березы в пересчете на кверцетин составляло от 2,5 до 4,36%. Относительная

погрешность определения для разработанной методики не превышает ± 5,21%.

Количественное определение бетулетола в докритическнх углскислотпых экстрактах почек березы пушистой

Докритические углекислотные экстракты почек березы предоставлены АО «Абицея» г. Екатеринбург. Внешний вид: экстракты представляют собой мазеподобные однородные вязкие извлечения, бесцветные или слабо желтого цвета, с характерным запахом.

Флавоноиды впервые обнаружены в углекислотных извлечениях из сырья, поэтому представляло интерес определить их количественное содержание. В качестве рабочего стандартного образца использовался бслгулетол, полученный из листьев ВеШ1а папа Ь. методом хроматографической очистки. Спектр бетулетола в 96% этиловом спирте имеет максимумы при длинах волн 292 и 335 нм. Спектр докритического С02 -экстракта почек березы в 96% спирте этиловом имеет максимумы при длинах волн 285 и 320 нм. Определение бетулетола прямой спектрофотометрией невозможно, т.к. его максимумы перекрываются спектрами сопутствующих веществ. Для выделения индивидуальной полосы светопоглощения бетулетола был осуществлен выбор интервала аналитических длин волн, в котором его спектр поглощения максимально отличается от спектра поглощения «фона» экстракта. Интервал устанавливали по величине оптической плотности в каждой точке спектра, отнесенной к величине оптической плотности раствора того же вещества в средней точке выбранного аналитического участка длин волн. Таким участком является участок длин волн от 280 до 300 нм. По пяти точкам с шагом 5 нм были рассчитаны уравнения кривых светопоглощения бетулетола, СОг -экстракта и «фонового поглощения» веществ экстракта.

Сравнение найденных величин производных показало, что использование табулированных значений ортогональных полиномов Чебышева не позволяет полностью устранить светопоглощение сопутствующих веществ, т.к. светопоглощение «фона» описывается полиномами того же порядка, что и поглощение определяемого вещества. Поэтому, и учитывая нелинейный характер поглощения «фона», для определения бутулетола в присутствии сопутствующих веществ целесообразно использовать метод комбинированного полинома. При спектрофотометрическом анализе бетулетола в СОг -экстракте был составлен пятнчленный комбинированный полином с применением коэффициентов первой и второй производной, устраняющий светопоглощение «фона» в области длин волн 280-300 нм. Расчет комбинированного полинома, устраняющего светопоглощение веществ «фона» СО2 - экстракта, приведен в табл.3.

Таблица 3

Расчет комбинированного полинома, устраняющего светопоглощение веществ «фона» СОг - экстракта почек березы

им А Р1 Р,А Р2 Р2 А ЬР, ЬР, +Р2 Ра

280 0,428 -2 -0.856 2 0,856 3,075 5,075 9,44

285 0,459 -1 -0,459 -1 -0,459 1,5375 0,5375 1

290 0,468 0 0 -2 -0,936 0 -2 -3,72

295 0,431 1 0,431 -1 -0,431 -1,5375 -2,5375 -4,72

300 0,362 2 0,724 2 0,724 -3,075 -1,075 -2

I -0,16 -0,246 0 0

ЕР2А Ь= - =-1,5375 1Р.А

Для рассчитанного полинома сохраняются условия ортогональности. Найденные значения комбинированного полинома позволили разработать методику количественного определения бетулетола в присутствии других веществ содержащихся в СО2 -

экстракте. Результаты количественного определения бетулетола в двух экстрактах приведены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты количественного определения бетулетола в СОг-экстрактах почек березы

Содержание бетулетола, в %

Экстракт 1 Экстракт 2

1 0,1200 0,1541

2 0,1150 0,1520

3 0,1182 0,1584

4 0,1227 0,1490

5 0,1198 0,1662

6 0,1278 0,1525

Метрологические характеристики

х = = 0,120583 х = 0,155367

в х = 0,001774 в х= 0,002505

Д х. = 0,004558 А х= 0,006438

Е = 3,780054 = 3,78% е = 4,143678 = 4,14%

Разработанная методика позволяет проводить определение бетулетола в СОг-экстракте почек березы. Относительная погрешность определения для разработанной методики не превышает ±4,14%.

Исследование компонентного состава эфирного масла и докритического С02-экстракта из почек березы методом ГЖХ

Анализ проводили на хроматографе «Хром-5» с пламенно-ионизационным детектором. В качестве газа носителя использовали азот. Хроматографирование выполняли на стеклянной колонке длиной 2400 мм, заполненной хроматоном - N - супер с 5% неподвижной жидкой фазы БЕ-ЗО. При выборе условий хроматографирования учитывали физико-химические свойства анализируемых

компонентов. В ходе проведенных предварительных исследований

установлено, что наиболее полное разделение хроматографических пиков достигается в следующих условиях: режим программирования термостата 100-250 0 С со скоростью 2°С в минуту, температура испарителя и детекгора-250 °С. Для идентификации изомерных соединений использовали такие физико-химические свойства определяемых веществ, как газо-хроматографические индексы удерживания (ИУ). В исследовании мы пользовались базами данных значений ИУ моно- и сесквитерпеновых углеводородов и их кислородсодержащих соединений разработаными профессором Зенкевичем И.Г.

Линейная зависимость, лежащая в основе значений ИУ, позволяет применять в качестве стандартных соединений при расчетах различные вещества, ИУ которых в данных условиях известны. Расчет ИУ по отношению к гомологическому раду реперлых соединений мы заменили построением градуировочного графика Хроматографированию в качестве стандартных веществ были подвергнуты следующие вещества, сравнительно близкие по параметрам удерживания к исследуемым компонентам эфирного масла и докритического углекислотного экстракта из почек березы: ментол, тимол, эвгенол, камфора, анестезин, фенацетин, фенилсалицилат, кофеин-моногидрат, дибутилфталат (ДБФ). Для данных веществ были рассчитаны абсолютные значения времени удерживания и найдены их десятичные логарифмы. ИУ перечисленных веществ, для выбранных условий хроматографирования, были взяты из литературных данных. По результатам был построен график зависимости ИУ от ^ Туд., представленный на рис.3, используемый нами для определения ИУ исследуемых веществ.

Расчет линии тренда производили используя программу М ¡егозой Ехе! с помощью регрессионного анализа. Линия скользящего среднего, которая сглаживает случайные флуктуации,

яснее демонстрирует модель и прослеживает тенденцию изменения данных.

График зависимости ИУ от 1£ Туя

3

3

а а-

1 5 X 3

2 о

2000 1900 1800 1700 1600 1500 -1400 1300 1200 1100 1000

2,5 Э

десятичный логарифм времени удерживания

3,5

Рис.3

— График зависимости с маркерами данных

— Линия тренда

Проведенные исследования позволили нам использовать данную зависимость (см. рис.3) для идентификации ряда компонентов эфирного масла и СОг-эксгракта из почек березы. С этой целью в выбранных условиях хроматографирования проводился анализ эфирного масла и докритических СОг-экстрактов почек березы. На полученных хроматограммах фиксировали время удерживания каждого из пиков отклика. Полученную величину логарифмировали и по графику линии тренда, представленному на рис.3 находили величину ИУ. Полученные данные сравнивали с базами данным моно- и сесквитерпеновых углеводородов и их кислородсодержащих соединений. Таким образом, в эфирном масле почек березы идентифицированы 10, а в докритических углекислотных экстрактах из почек березы 7 веществ. Хроматографические параметры идентифицированных веществ приведены в табл.5.

Таблица5

Результаты идентификации компонентов эфирного масла и СОг -экстракта из почек березы белой

Идентифицированное вещество Т(сек) ИУ Объекты исследования

Эфирное масло со2- экстракт

а-кариофиллен 491 1409 + +

0- кариофиллен 493 1421 +

гуммулен 504 1450 + +

Р - бисаболен 522 1502 + +

кариофилленоксид 533 1530 + +

Р-кариофилленовый спирт 546 1573 +

а-бетуленол 579 1642 + +

Р-бетуленол 583 1680 +

бегулен 618 1759 + +

а- б егуленил ацетат 631 1783 + +

Следует отметить, что в таблицу вошли только данные по мажорным компонентам эфирного масла и докритического углекислотного экстракта почек березы, на полученных хроматограммах зафиксировано еще ряд пиков, которые в сумме не столь значительны и аналитического интереса не представляют. Данные табл. 5 свидетельствуют, что при экстракции сырья жидким диоксидом углерода в докритических условиях экстракции происходит потеря кислородсодержащих производных терпенов по сравнению с эфирным маслом, полученным традиционной перегонкой с водяным паром.

Количественное определение бехулена в эфирном масле и докритическом углекислотном экстракте почек березы

Основным компонентом эфирного масла и углекислотных экстрактов почек березы является бегулен. Нами разработана методика количественного определения бетулена методом ГЖХ, что

позволяет осуществлять объективную оценку качества по основным действующим компонентам.

Основной задачей оптимизации условий

хроматографирования для целей количественного определения являлся подбор режима температуры термостата и давления газа-носителя, обеспечивающих полное разделение бетулена с максимально возможной симметрией пика и минимальным влиянием сопутствующих веществ. Хроматографическое разделение проводили в следующих оптимизированных условиях: температура термостата 200°С, давление газа-носителя на входе в колонку 131,7 кПа, температура испарителя и детектора 250°С. В предлагаемых условиях анализа пик отклика бетулена как в эфирном масле, так и в СОг-экстракте достаточно симметричен и хорошо отделен от других веществ.

Для разработки методики образец бетулена получали путем хроматографического разделения эфирного масла почек березы на колонке с силикагелем, элюируя смесью этанол-хлороформ (3:1). Анализ хроматографически чистого образца бетулена методом ТСХ подтвердил достоверность его очистки от низкомолекулярных примесей фенольного характера.

В используемых нами условиях хроматографирования в качестве наиболее приемлемого внутреннего стандарта может быть использован дибутилфталат (ДБФ). Выбор стандарта производился из образцов веществ, используемых для идентификации, которые хроматографировали в оптимизированных для количественного определения условиях ГЖХ анализа. ДБФ выходит после бетулена, пик отклика симметричен и не перекрывается пиками других веществ, что обеспечивает более воспроизводимые результаты анализа.

Для проверки практической пригодности выбранных условий хроматографирования и возможности использования ДБФ в качестве внутреннего стандарта проводили исследования на модельных смесях. Исследования показали, что наилучшее

соотношение количества бегулена к ДБФ составляет 1:1. Установленный калибровочный коэффициент составил 0,533. Проведенные исследования позволили разработать методику определения бегулена в эфирном масле и С02-эксгракте почек березы.

С помощью разработанной методики установлено, что эфирное масло почек Betula pubescens Ehrh. (B.alba L.) содержит от 6,24 до 7,12% бетулена, эфирное масло почек Betula pendula Roth. (В. Verrucosa Ehrh.) - не более 5,49% бегулена. Содержание бегулена в анализируемых образцах докритических С02-эксграктов почек березы составляло от 17,41 до 25,76%. Относительная ошибка определения не превышала ±6,36%.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика выделения флавоноидов из почек берез: Betula pendula Roth. (В. verrucosa Ehrh.) и Betula pubescens Ehrh. (B.alba L.).

2. Подобраны оптимальные условия для ТСХ разделения флавоноидных соединений, содержащихся в почках некоторых видов берез.

3. Идентифицированы в почках Betula pendula Roth. (=В. verrucosa Ehrh.) флавоноиды: акацетин (4' -метиловый эфир апигенина), пендулетин, рамназин, бетулетол, 3-метилкверцеггин, кверцетин, рутин.

4. Изучен флавоноидный состав почек Betula pubescens Ehrfi. (=В. alba L.), в сырье идентифицированы: бетулетол, 7,4'-диметилапигенин, апигенин, кемпферол, акацетин, рамноцитрин (7-метнловый эфир кемферола), эрманин (3,4'-диметиловый эфир кемпферола), кемферид (4'-метиловый эфир кемпферола) и гликозиды: астрагалин и гиперозид.

5.Впервые в докритическом СОг-экстракте почек березы установлено наличие флавоноидов (бетулетола, 3-мегил-бетулетола), терпенов

(а- кариофиллена, гуммулена, Р - бисаболена, кариофилленоксида, а-бетуленола, бетулена, а- бетуленилацетата).

6. Исследованы УФ спектры поглощения спирто-водных извлечений из почек березы. Разработаны методики количественного определения в них флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии. Методики апробированы на образцах почек березы, полученных из различных регионов РФ.

7. Разработана методика количественного спектрофотометрического определения бетулетола в СОг-экстракге почек березы с использованием метода комбинированного полинома, составленного из полиномов первой и второй степени. Содержание бетулетола не превышает 158,4 мг/100 г.

8. Разработана методика идентификации компонентов эфирного масла и докритического СОг-эксгракта из почек березы методом ГЖХ с помощью индексов удерживания. В эфирном масле почек березы идентифицированы: а- и Р- кариофиллен, гуммулен, Р - бисаболен, кариофилленоксид, Р-кариофилленовый спирт, бетулен, а-бетуленол, р-бетуленол, а- бетуленилацетат.

9.Теоретически обоснованы и оптимизированы условия ГЖХ анализа для количественного определения бетулена. Разработана методика количественного газо-хроматографического определения бетулена методом внутреннего стандарта с использованием ДБФ в эфирном масле почек березы и докритическом СОг-экстракте почек березы.

Список опубликованных соискателем работ по теме диссертации:

1. Исследование химического состава и антибактериальной активности листьев березы карликовой // Материалы конференции студенч. науч. общества, посвященного юбилею академии, 1995. -С.40-41 (без со авт.).

2. Полифенольные и тритерпеноидные соединения растений рода Betula (Монофафия) // Хим.-фарм. производство, 1997. -Вьш.5. -23с. (соавт. Бандюкова В.А., Беликов В.Г.).

3. Изучение состава терпенов почек березы хроматографическими методами // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (52; 1997; Пятигорск). - Пятигорск: ПятГФА, 1997. - С.70. (соавт. Беликов В.Г., Клочков СВ.).

4. Анализ извлечений из растительного сырья, содержащего полифенольные соединения // Фармацевтическая наука в решении вопросов лекарственного обеспечения,- 1998.-Науч.труды-Т.37.-С.100-104 (соавт. Айрапетова А.Ю., Беликов В.Г., Клочков C.B., Компанцева Е.В., Маркова О.М., Стоянова Е.В., Фурсова E.H.).

5. Идентификация биологически активных компонентов извлечений из почек березы белой // Человек и лекарство: Тез.докл.Рос.нац.конгресса (5; 21-25 апр. 1998; Москва)-М.:РЦ Фармединфо, 1998. - С.348 (без соавт.).

6. Разработка технологии и изучение фармакологической активности жидкого экстракта из листьев березы карликовой // Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений. Материалы международного совещания, посвященного памяти В.Г.Минаевой, 15-18 апреля 1998 года. - Новосибирск, 1998. - С.103 (Беликов В.Г.).

7. Изучение состава извлечений из сырья тысячелистника, донника, лавра, березы // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (53; 1998; Пятигорск). - Пятигорск: ПятГФА, 1997. - С.64. (соавт. Андреева И.Н., Арчинова Т.Ю., Клочков C.B., Селезнева TJT., Дерлугов АЛ.).

8. Идентификация компонентов эфирного масла почек березы белой // Там же. - Пятигорск, 1998. - С.65-66 (Беликов В.Г., Клочков C.B.).

9. Спектрофотометрическое определение гилерозида в жидком экстракте березы карликовой // Материалы Всероссийской науч.конф. «От Materia medica к современным медицинским

технологиям», 13-15 мая 1998 года. -Санкг- Петербург, 1998. - С.17 (соавт. Бавдюкова В.А., Беликов В.Г.).

10. Спектрофотометрическое определение флавоноидов листьев и почек березы белой // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (54; 1999; Пятигорск). - Пятигорск: ПятГФА, 1999. - С.66-67. (соавт. Беликов В.Г.).

11. Использование индексов удерживания; при идентификации токсических веществ H Там же. - Пятигорск, 1999.-СЛЗ-74. (соавт. Вергейчик Т.Х., Родовниченко М.С., Цыбулина M.F., Клочков C.B., Волокитин C.B.)

12. Газо-хроматографическая оценка качества СОг-экстракта почек березы // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (55; 2000; Пятигорск). - Пятигорск: ПятГФА, 2000. - С.93. (соавт. Беликов В.Г., Клочков C.B.).

13. Спектрофотометрическое определение бетулетола в СОг-экстракте почек березы // Материалы 56-й региональной конференции по фармации, фармакологии и подготовке кадров. -Пятигорск, 2001 - С,87. (соавт. Беликов В.Г., Клочков C.B.).

14. Исследование и разработка методик анализа растительного сырья и фитокомплексных препаратов из некоторых видов берез (Заключительный отчет о НИР кафедры фармацевтической химии за 1997-2001 гг).