Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование меркаитопурина

*. .. * ■ ■■ :-> 1

■г 1 в/О "Сойзфармацяя" пр'Л

_• мшстзрствз здравоохранения ссср

всесоюзный каучко-исслбдовастьскйй институт ■ ' • фармации /

. На правах рукописи • ' САЯНОВА ГАЛИЯ ЫЫРЗАГАЛШНА

яшшо-тозкинмогкческое ::сслЕдовАказ

йеркаптопурина • (Спацйальассагь 15.СП.02 - фарцацввгичаская хииая и фариакох*нозйя)

' АВЮРБ.Ф БРА* диссертации на соискание ученой стеки ка.чдадага фармацевтических наук

Ноокза - 1591 год

• /<

Рабата заполнена ка кафедре аналитической и токсикологичеб коя ххияя Алиа-Атакского Ордена Трудового Красного Знамени государственного медицинского института им.С.Д.Ас^аядиарова

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор К.У.Ушбаев

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

ст.науч.сотр. Н.Н.Деиентьева

кандидат фармацевтических наук, бт.кауч.сотр. Е.Ц.Салоцатин

Зздузая организация: Ташкентский государственный

фармацевтический институт

Защита состоится _" ^-/¿¿Ы.^ г. в ¿У , часов

ка гаседакия с п е Ц'/ а." и з и р о в айог оСо ва т а Д 07^.23.01 при ■Зсессазна; .—учно-исследовагальскоц институте фармации (по адресу: 1X74X3, Москва, ул. Красикова, 34) * ' ' . '

С диссертацией исако ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научкз-исследоЕательского института фармации

Автореферат разослан " А » /Л¿'/л^. 1991 г.

Учоны?. секретарь . •

сг.ецнаяязирогаккого Совета Д 07^.23.01,

какдкда: фариацезтлческих каук,

.ст.науч.сотр. Л.Ц.Боброва

МШнам - 3 -

« л

. " ,<!М I ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

;?рт^аций I Актуальность темы. В современной медицине широко используются препараты для лечения злокачественных новообразований, к числу которых относится меркаптопурин. Он обладает не только ценными фармакологическими свойствами, но в определенных условиях может быть токсичнкм. Об этом свидетельствует принадлежность его к'препаратам списка А и наличие случаев отравлений этим соединением. Несмотря на вирокое применение меркаптопу-рина в медицине и его токсичность в химико-токсикологическом от, нопении он не изучен.

До настоящего времени методы выделения меркаптопурнна из органов трупов и биологических жидкостей на разработаны. Отсутствуют чувствительные методы идентификации и количественного определения меркаптопурнна, пригодные для целей химико-токсикэлоги- . ческого анализа. Не изучены условия экстракции меркаптопурина из водных растворов и вытяжек из биологического материала. Отсутствуют данные о связывании меркаптопурина с биологическим материалом. Не изучено влияние различных факторов на разложение соединений белковых веществ, с меркаптопурином, не имеется данных о распределении этого препарата в органах отравленных животных и сроках .сохраняемости в биологическом материале при его гниении. Не изучено влияние рН среды на изолирование меркаптопурина из органов трупов.

Учитывая токсичность меркаптопурина и отсутствие надежных методов анализа этого препарата в органах трупов, разработка способов обнаружения и количественного определения меркаптопурина, выделенного из биологического материала, является одной из актуальных проблем современного химико-токсикологического анализа. .Цель и задачи исследования. Целью на-

еих исследований является разработка оптимальных методов идентификация, количественного определения и выделения меркаптопурина из органов трупов, крови и мочи.

Для достижения указанной цели предстояло решить следующие ' задачи:

- разработать чувствительные реакции и.методы идентификации • меркаптопурина, выделенного из объектов биологического происхождения ;

- изучить возможность применения физических и физико-химических методов анализа для идентификации и количественного определения меркаптопурина, выделенного из объектов биологического проис-хоядення;

- изучить УФ- и ПК-спектры поглощения меркаптопурина, а затем использовать их для анализа этого препарата;

- разработать услозия применения метода диск-электрофореза для идентификации меркаптопурина в вытяжках из биологического материала;

- разработать методы спектрофотометрии (в видимой области) ^ фотоколориметрии для количественного определения меркаптопурина, пригодные для целей химико-токсикологического анализа;

- изучить зависимость степени экстракции меркаптопурина от природы органических растворителей, рН среды и присутствия электролитов в водкой фазе;

- разработать методы выделения меркаптопурина из органов трупов и из биологических нидкостей (крови и мочи);

- изучить распределение меркаптопурина в органах животных, отравленных этим препаратом;

- изучить влияние процессов гниения на сохраняемость меркаптопурина в биологическом материале.

Научная новизна работы. Для идентифи -кации меркалтопурина, выделенного из объектов биологического происхождения предложены чувствительные цветные реакции, метод хро -ыатографии в тонком слое сорбента, УФ ИК -спектроскопии, диск-электрофорез в полкакриламидном геле.

С помочью физико-химических методов ( фотоколориметрический и спехтрофотометрический в УФ - и видимой областях ) подобраны условия для количественного определения меркаптопурина в поровкв -и таблетках, основанных на реакции препарата с реактивом Фолина-Чиокальто, при этой относительная ошибка методов составляют : + 1,Б656, + 0,41% и + 1,253.

Подобраны оптимальные условия для максимального извлечения иеркаптопурина из водных растворов органическнии растворителями, с учетом влияния различных факторов С рН среды, природы раствори- • телей, присутствия электролитов ).

Для решения вопроса об отравлении меркаптопуринои разработаны способы очистки (методы: гель-хроматография или хроматография в тонком слое силикагеля КСК) иеркаптопурина из вытяжек биологи -ческого материала от примесей белковых веществ и продуктов их гнилостного разложения.

С иелыз выделения максимального количества меркаптопурина из органов трупов, крови и мочи предложен метод, основанный на изоли- ' ровании этого препарата водой, подкисленной серной кислотой, и на последующей очистке вытяжек от примесей. С помощью этого метода определены органу и ткани с н&ибольгвш содержанием иеркаптопурина, а также сроки гнилостного разложения обьвктов биологического происхождения.

Практическое значение работь*.

IIa основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

-чувствительные методики качественного обнаружения, количественного определения и выделение меркаптопурина из обьектов биологического происхождения о использованием УФ ИК -спектроскопии, хроматографии б тонком слое сорбента п фотоколоркмет-рического метода (методические указания "Об определении меркал-топурина в трупьом материале", которые находятся на отзобагэга в Главной судебно-медицинской экспертизе Минздрава СССР, письмо № 188/х от 28.02.91 г)*;

- методики способов идентификации, количественного определения и выделения меркаптопурина из биологического материала

(использовали в практике химического отделения Республиканского . бюро судебно-химическэй экспертизы Казахской ССР, акт внедрения от 16.04.90 г, 15.05.90 г, 25.05.90 г; Чимкентского областного бюро судебно-медицинской экспертизы, акт внедрения от I6.06.90r, ' • а. также в учебный процесс Львовского Ордена Дружбы народов государственного медицинского института, акты внедрения от 15.06. 90 г и Каунасской медицинской академии, акты внедрения от 10.09. 90 г).

По материалам диссертации опубликованы 4 научные работы и 3 работы приняты к печати.

Апробация работы. Основные результата диссертационной работы доложены:

- на конференции молодых ученых и специалистов Алма-Атинского Ордена Трудового Красного Зналени государственного медицинского института

- на Республиканской научно-практической конференции, посвященной проблемам фармации СЧимкент, II—12 мая, I9Ö9 г.);

- на Первом съезде судебных медиков Казахстана (Чимкент, 2022 сентября, 1969 г.);

- на семинаре-совещании судебно-медицинских экспертов-этши-ков Казахстана (Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Казахской ССР, 16-17 февраля, 1969 г.);

- на совместном заседании кафедр общей, аналитической, токсикологической и фармацевтической химий (Алма-Атинский Ордена Трудового Красного Знамени государственный медицинский институт, 1990г.).

Обьем и структура диссертации. Диссертация" изложена на 158 страницах машинописного' текста. Она содержит 39 таблиц, 20 рисунков. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, пояснения к эксперименту, списка литературы, включающего 151 источник, из них 23 на иностранных языках и приложения.

Связь задач исследования с проблемным план ом фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с основным планом научно-исследовательских работ Алма-Атинского Ордена Трудового Красного Знамени государственного медицинского института им. А.С.Асфендиа-рова (№ государственной регистрации 01.Ь7.00250-14) и саязана с решением общесоюзной проблемы "Фармация" АМН СССР (сифр проблемы 10.06), которая включена в план Министерства здравоохранения Казахской ССР.

На защиту диссертации выносятся следующие результаты экспериментальных исследований и их теоретическое обоснование:

- способн идентификации меркаптопурина в химико-токсикологическом анализе;

-'методы количественного определения меркаптопурпна, выделенного из биологического материала;

- влияние различных факторов на екстракцп» 1.:еркаптопурина орга нпче сгаши ра с твори т елями;

-методы выделениямеркаптопурпна из_ органов трупов, крови и мочи;

- распределение меркаптопурпна в органах я биологических кипкостях собак, отравленных эш препаратом;

- сохраняемость меркаптопурпна в биологическом материале при его гниении.

С0ДЕР1Л1СЕ РАБОТЫ Керкаптопурин представляет собой желтый кристаллический порошок, гадающий следующее строение:

Б-Н

N

■Н20

С5НА Й-Н20

Мол.масса 170,19

Меркаптопурин

В медицине мсркаптопурин применяется в качестве препарата антилейкемического действия. Он применяется для лечения леЛког подострого миелолейкоза, псориаза, ревматоидного артрита, обладает иммунодепрессишыми свойствами а т.д.

Идентификация меркаптопурина

В литературе описан ряд реакций для обнаружения меркаптопурина, которые неспецифичны и малочувствительны. Поэтому эти реакции неприменимы в химико-токсикологическом аначлэе.

Для обнаружения меркаптопурина на,'.™ предложены цветные реакции с ванадатом аммония, с фосфорновольфрамовой кислотой и реактивом Фолина-Чиокальто, которые могут быть использованы в химико-токсикологическом анализе для обнаружения меркаптопурина только после очистки вытяжек из биологического материала методами хроматографии в тонком слое сорбента или гель-хроматографии.

Нами разработаны условия применения некоторых физических и физико-химических методов (хроматография в тонком слое силикаге-ля ИСК, УФ-, ИК-спектроскопил и диск-электрофорез) для обнаружения меркаптопурина. Причем методы УФ- и ИК-спектрсскопни могут быть использованы для обнаружения меркаптопурина в Еытя.^ах из биологического материпла, дополнительно очищенных метода}.™ хроматографии в тонком слое силикагелп КСК или гель-хроматографии.

Для обнаружения меркаптопурина методом хроматографии в тонком слое сорбента были использованы пластинки "силуфол" и пластинки, покрытые суспензией, состоящей из 3,5 г силикагеля КСК, 0,2 г медицинского гипса и 9 мл воды. Для развития хроматограмл нами использованы смесь н-бутилового спирта, муравьиной кислоты и воды (25:3:2). Пятна меркаптопурина на пластинках проявляли реактивом Драгендорфа, модифицированным по Мунье.

Предел обнаружения: 3 мкг меркаптопурина в одной капле (О,'05 мл).

Нами сняты спектры поглощения меркаптопурина в У$-области с помощью спектрофотометра СФ-26. В качестве растворителей меркаптопурина использованы: 0,01 М раствор гидроксида натрия,

0,01 М раствор серной кислоты, этиловый и метиловый спирты. Устг новлено, что меркаптопурин в 0,01 М растворе гидроксида натрия ' имеет полосы поглощения с максимумами при 230 и 310 нм; в 0,01 к растворе серной кислоты полосы поглощения ыеркалтопурина имеют максимум при 225 и 324 нм. В этиловом спирте максимум полос поглощения меркаптопурина соответствует 230 и 329 да; в метиловом ' спирте полоса поглощения меркаптопурина имеет максимум при 327 ь

Для обнаружения меркаптопурина использованы метод ИК-спект-роскопии. С этой целью сняты КК-спектри этого препарата в виде волновых чисел от 4000 см-* до 700 см-*. Снятый спектр поглощени характеризуется основными полосами поглощения при 1020, 1230, 1590, 1620 см-*. ИК-спектр меркаптопурина имеет и другие менее интенсивные полосы поглощения.

При использовании методов УФ- и ИК-спектроскоини для вденти фикации меркаптопурина в вытяжках из биологического материала ус тановлено, что на спектрах поглощения вытяжек в УФ- и ИН-областя спектров появляются дополнительные полосы ноглоданга, что свидетельствует о наличии в вытяжках примесей. Поэтому полученные вытяжки из биологического материала мы подвергали дополнительной очистке с помощью метода хроматографии в тонком слое силикагеля ИСК или гель-хроматографии. После такой очистки полосы поглощения в УФ- и ИК-областях меркаптопурина в вытяжках и в заведомо чистом препарате совпадают.

Обнаружение меркаптопурина методом диск-электрофореза мы проводили в полиакриламидном геле, пользуясь прибором типа 0Е-П Установлено, что незначительное количество примесей, содерясащих в вытяжках из биологического материала, не мешает обнаружена меркаптопурина методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле.. Предел обнаружения: 5 мхг меркаптопурина в 0,1 мл пробы.

Количественное определение меркаптопурина Для количественного определения меркаптопурина нами разработаны методики УФ-спектрофотометрии, спектрофотометрии в видимой области и фотоколориметрический метод.

• Для спектрофотометрического определения меркаптопурина в УФ-области вытяжки из биологического материала подвергали дополнительной очистке методом хроматографии в тонком слое силикагеля КСК или гель-хроматографии. В элюатах, полученных с помощью 0,01 Ы раствора серной кислоты, определяли количественное содержание меркаптопурина методом Уё-спектрофотометрии при 324 нм. Измерение оптической плотности проводили с помощью спектрофотометра СФ-26 (кювета I см). Удельный коэффициент светопоглощения меркаптопурина в 0,01 М растворе серной кислоты равен 1297, а молярный - 22073. Расчет содержания меркаптопурина в исследуемых растворах проводили по удельному коэффициенту светопоглощения. Граница концентраций, в пределах которых светспоглощение растворов меркаптопурина подчиняется закону Бугера-Лаиберта-Бера, равны" 2-14 мкг отого вещества в I мл. Относительная ошибка метода составляет - 0,415?.

Нами разработан метод количественного определения керкапто-. пурина по светопоглощенда в видимой области спектра. Для переведения меркаптопурина з охраненное соединение мы использовали реактив Фолина-Чисхальто. Зтот реактив с меркаптопурином дает синее окрашивание. Оптическую плотность окрасенного соединения; определяли с помощью спектрофотометра СФ-26 при длине волны 750 км. Относительная ошибка этого метода составляет - 1,25$.

Указанная выше реакция меркаптопурина с реактивом Фолина-Чиокальто использована нами для количественного определения этого препарата фотоколориметрическим методом. В качестве прибора

ш хслользоаадк фотозлектроколорпмегр КФК—2—УХЛ 42 / светофильтр красный // эфф.=750 нм/, кювета 20 гл'й/«

Предел определения меркаптопурина этим методом составляет 10 лкг б 10 мл конечного объема. Границы определения от 10 до IC0 мкг в указанном конечном объеме. Относительная ошибка метода 1,86 %.

Разработанную на:.з: методику количественного определения мер-каятопурика применили к анализу таблеток меркаптопурина. Наши исследования доказали, что мохко определять до 100 % меркаптопурина з таблетках. Статистическая обработка результатов подтверждает достоверность метода.

Найденные количества меркаптопурина и их различие с рассчитанном количеством укладква:-зтся в допустимые нормы отклонения.

Экстракция меркаптопурина органическими _рас твооит елями_

При изучении экстракции меркаптопурина к? водных растворов мы исследовали Елиякие природы органически растворителей, рН среды и наличие в водной фазе электролитов на экстракцию этого препарата.

3 качестве органических растворителей мы использовали све:ке-пьрегнйннь'о: дпэтилоеын эфир /теил.кил.34°С/, хлороформ /темп.кип. 51,2^/,. гексан /темп.кип.€3,8°С/, бензол /темп.кип.80°С/,. 1,2-ди-хлорэтан /темп.кип.34°С/, толуол /темп.кип.II0°C/f. н-бутиловый /те:.-1.кил.117,5°С/ и изсамхловыи /темя.кип.ISO,5°С/ спирты.

Для создания необходимого рН среды мы применяли универсальную буферн^-л смесь Бриттона-Робиксона с различным рК. Б качестве электролитов использовали хлорид натрия и сульфат аммония. Количество' экстрагированного меркаптопурина определяли фотоколорикетричеокзш методом, основанным на реакции с реактивом Фолина-Чиокальто»

Зависимость степени экстракции меркаптопурина от рН среды-и природы органических растворителей

К,/. 1 . 1«0

I !

« ]

Рис. I ' ,

1 - нзоамиловым спиртом

2 - н-бутиловку. спиртом

3 - 1,2-дихлорэтаном

4 - хлороформом

5 - бензолом

6 - толуолом

7 - гексаном

Ь - диэтиловкм эфиром

Результаты наших исследований показали, что меркаптопуркн начинает экстрагироваться почти всеми испытанными нами органическими растворителями при рН 2,0. Лучшими органическими растворителями по количеству извлекаемого Ее^естза для экстракции меркаптопурина являются кзоамиловый -л н-бутиловый спирты, область максимума экстракции которыми находится при рН 7,0 - 10,4.

Нами установлено, что кзоамиловый спирт при рК 7,0 до 10,4 экстрагирует 65% меркаптопурина. При тех ?ле рН н-бутиловш спир-

том экстрагируется Ы% этого препарата. Учитывая, что изоамиловый сг.ирт имеет более высокую температуру кипения и является более ядовитым, чем н-бутилоБЫй спирт, при дальнейших исследованиях для экстракции меркаптопурпна из вытяжек, полученных настаиванием биологического материала с извлекающими жидкостями, мы использовали н-бутиловый спирт. Другие растворители 1,2-дихлорэтан (3Ъ%), хлороформ (25^), бензол (1Ь%), толуол (IЪ%), гексан (IЬ%) и диэтиловый эфир экстрагируют значительно меньшие количества меркаптопу-

рпна, чем н-бутиловый спирт. Поэтому, перечисленные органические растворители практически непригодны для экстракции меркаптопурина з химико-токсикологическом анализе.

Изучение влияния электролитов на степень экстракции меркаптопурина н-бутиловым спиртом при рН 2,0 и 7,0 (в области рН минимума и максимума) показало, что хлорзд натрия и сульфат аммония практи-, чески нз влияют на экстракцию этого препарата.

Выделение меркаптопурина из биологического

_материала_

Учитывая, что до настоящего времени методы выделения меркаптопурина из обьектов биологического происхождения не изучены, мы разработали методы выделения'этого препарата из органов трупов, крови и мечи.

Вначале, для выделения меркаптопурина из биологического материала мы попытались использовать описанные в литературе методы, рекомендованные для выделения других токсических веществ. С этой целью мы проверили возможность использования методов, основанных на изолировании токсических веществ этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой (модифицированный метод Стаса-Отто), водой, подкисленной щавелевой кислотой (модифицированный метод А.А.Василье-

вой), к водой, подкисленной серной кислотой, для выделения меркаптопурина.

Наши исследования показали, что с помощью трех перечисленных методов из биологического материала ввделяются небольшие количес- • тва-меркаптопурина. Поэтому мы попытались разработать метод, поз- , воляющий выделить больпие количества меркаптопурина из биологического материала.

Вначале мы изучили влияние рН среды на связывание меркаптопурина с белковыми веществами трупного материала и на разложение образующихся при этом соединений. Для этой цели мы применили метод равновесного диализа. С помощью этого метода установлено, что мер- • каптолурин связывается с биологическим материалом при рН 5,5 и выше. Образовавшиеся при этом соединения разлагаются при рН ниже. 5,0.

Кз результатов этих исследований следует, что для извлечения . максимальных количеств меркаптопурина из биологического материала необходимо извлекающую жидкость подкислить до рН 2,0. Также установлено, что для полноты изолирования меркаптопурина из биологического материала необходимо производить трехкратное настаивание его с водой, подкисленной серной кислотой (рН 2,0).

Изучив влияние рН извлекающих жидкостей к кратность настаивания биологического■материала с указанными жидкостями на полноту изолирования меркаптопурина из исследуемых обьектов, а также изучив условия связывания биологического материала с меркаптопурином

< I

и разложения образующихся при этом соединений, мы разработал'^ме-тод выделения меркаптопурина из органов трупов и биологических жидкостей (крови и мочи)..

В основу разработанного нами метода положен метод, предложенный В.Ф.Крамаренко (1562).' В отличии от указанного метода для очи- ' стки вытяжек от примесей мы не применяли сульфат аммония, а исполь-

зовали метод хроматографии в тонком слое силикагеля КСК или мет< гель-хроматографии."

Выделение меркаптопурина из органов трупов. Согласно предл( ному нами методу органы трупов измельчали, вносили в широкогорл; колбу и заливали 0,01 М раствором серной кислоты (рН 2,0) до по] тш биологического материала этой жидкостью и оставляли на 2 ча< при частом перемешивании. После этого Сливали кислые вытягкки, а тавшиеся твердые частицы биологического материала еще 2 раза на! таивали по одному часу с новыми порциями 0,01 М раствора серной лоты (рН 2,0). Кислые вытяжки сливали с биологического материал! соединяли и центрифугировали в течении 30 минут (5 000 об/мин), затем сливали центрифугат. Осадок в центрифужной пробирке заливг 25 мл 0,01 М раствором серной кислоты, перемешивали и настаивал1 течении одного часа, а затем центрифугирован!. Надосодочную жид1 сливали и присоединяли к ранее полученной яидкости. К объединен] надосадочной жидкости прибавляли 0,01 М раствор серной кислоты ) 250 мл.

50 мл указанной жидкости вносили в колонку (высотой 40 см, внутренним диаметром 3,5 см) для гель-хроматографии, залолнепну1 гелем сефадекса 0-25. Из колонки меркаптопурин элпировали 0,01 1 раствором серной кислоты. Элюаты собирали фракциями по 10 мл. Э. аты с I по 27 фракции, объемом 270 мл, содержание примеси, отбр; сывали, а на исследование брали элюаты с 28 по 44 фракции (160 ] К объединенным элюатам прибавляли 20д—ный раствор гидроксида на1 . рия до рН 7,0. Из полученного раствора меркаптопурин экстрагиро: . ли 2 раза н-бутиловым спиртом (по 50 мл) в течении 10 мин. Е&тя: полученные с помощью н-бутилового спирта, соединяли под вакуумо) создаваемым водоструйным насосом, отгоняли н-бутиловкй спирт пр

мерно до 5 мл. Оставшийся н-бутилояый спирт переносили в фарфоровую чашку и выпаривали при комнатной температуре. К сухому остатку прибавляли 5 мл 0,2 М раствора гидроксцца натрии. Н полученному раствору прибавляли 5 мл воды. 0,5 ад указанного раствора вносили в градуированную пробирку, прибавляли 3 мл 0,2 М раствора гвдрок-^Сида натрия, 0,2 мл реактива Фолина-Чиокальто и обьем жидкости доводили водой до 10 мл'. Оптическую плотность окраценного в синий .. цвет раствора через 10 мин. измеряли с помощь» фотоэлектроколори-метра КФК-2-УХЛ 42 (светофильтр - красный,Д эфф.= 750 им, кювета 20 мм).

Наши исследования! показали, что с помощью предложенного нами метода вьщелпются большие количества (39,0 - 43,0£) меркаптопури- 1 • на, чем с помощью других, применяемых в химико-токсикологическом анализе методов.

Предел определения меркаптопурина составляет 0,1 мг в 100 г биологического материала.

Предложенный метод выделения меркаптопурина из органов трупов является более эффективным, чем другие методы. Этот вывод подтвер-. лщзется результатами сравнительного пнаппза, приведенными в таблицей.

Выделение меркаптопурина из крови.

5 мл крови вносили в мерный цилиндр вместимостью 50 мл, прибавляли 10 мл 0,01 М раствора серной кислоты, кислотность смеси доводили 20£-ннм раствором серной кислоты до рН 2,0 (по универсальному индикатору). Смесь оставляли на 2 часа при частом перемешивании. По истечении указанного времени исследуемую пробу центрифугировали в точении 30 мин (5 000 об/мин). Нпдосадочную жидкость сливали с осадка, который в центрифужном стакана еще раз обрабатывали 10 мл 0,01 М раствором серной кислота и вновь центрифугировали.

Таблица I

Сравнительная оценка результатов выделения меркаптопурпна из биологического материала с помощью различных методов &

Жидкости, применяемые для изолирования ! меркаптопурина из биологического ,j

материала I'

Выделено меркаптопурина

мг

сТ

rJ

Этиловый спирт, подкисленный щавелевой 2,02-2,06 10,10-10,30 кислотой

Вода, подкисленная щавелевой кислотой Вода, подкисленная серной кислотой (по методу В.Ф.Крамаренко) Еода, подкисленная серной кислотой (по разработанному нами методу)

2,50-2,60 3,27-3,43

12,50-15,00 16,35-17,15

7,Ь0-6,60 39,00-43,00

Цеятрифугаты объединяли и пропускали через колонку, заполненную гелем сефадекса G- - 25- Далее поступали так, как указано выше при описании способа выделения меркаптопурина из трупного материала. '

Нами установлено, что с помощью этого метода из крови можно выделить 34,ь-35,С# меркаптопурина. Предел определения составляет 10 мкг исследуемого препарата в Ь мл крови.

Выделение меркаптопурина из мочи.

50 мл мочи вносили в стакан вместимостью 100 мл. Исследуемую мочу доводили ¡годным раствором серной кислоты до рН 2,0 (по универсальному индикатору) и оставляли на 2 ч при периодическом пере, мешивании. Затем смесь подщелачивали 20%-ным раствором гидроксида натрия до рН 7,0 и 2 раза взбалтывали с н-бутиловкм спиртом (по 50 мл). Вытяжки, полученные с помощью н-бутилового спирта, соедик и определяли в них меркаптопурин так, как. указано при описании сп

соба вьщеления меркаптопурина из трупного материала.

Установлено, что с помощью разработанного нами метода из мочи можно выделить 45,0-47,4^> меркаптопурина. Предел определения составляет 40 мкг исследуемого препарата в 50 мл мочи.

Распределение меркаптопурина в органах и биологических гад-костях животных, отравленных этим препаратом. В качестве подопытных животных мы брали беспородных собак, которым зондом вводили меркаптопурин в виде суспензии (препарат в воде) или внутршлсаеч-но в растворе соды. После гибели собак производили вскрытие их, при котором на исследование брали мочу, кровь, кишечник с содержимым, желудок с содержимым, печень, легкие, почки, селезенку, мозг и сердце. В указанных обьектах определяли количественное содержание меркаптопурина". Наши исследования показали, что меркаптопурин в органах собак, отравленных этим препаратом, распределяется неравномерно. Больше всего мерклптопурлна можно обнаружить п моче (ШГ*-), затем в кишечнике с содержимым (9^), печени (ьГО, желудке с содержимым (б!?), почках (Ь%), селезенке (7$), легких (7^), только незначительное количество меркаптопурина можно обнаружить в мозге и серлне.

Сохраняемость меркаптопурина п органах к биологических жидкостях трупов. Меркаптопурин, находящийся в органах трупов и в биологических жидкостях (крови и мочи), подвергается разложения. Установлено, что через I месяц из гнилостно разложившегося биологического материала можно вццслить-21-2255, через 3 месяца - Ь-9^ и через 6 месяцев - 2-4% меркаптопурина.

Для решения вопроса об отравлении меркаптопурином на исследование необходимо направлять мочу, кишечник с содэржимым, хрозь, пе-*чень и желудок с содержимым.

обще штоды

. I. Для идентификации меркаптопурина предложены цветные реакции, метод хроматографии в тонком слое сорбента, диск-электрофореза в полиакриламидном геле. Эти .методы пригодны для обнаружения меркаптопурина, выделенного из объектов биологического происховде-г"Иия• Методы УФ- и ИК-спектроскопии можно использовать после дополнительной очистки вытяжек методами хроматографии в тонком слое си-ликагеля ИСК или гель-хроматографии. С помощью-разработанных нами реакций и методов можно обнаружить 0,05-0,1 мг меркаптопурина в 100 граммах биологического материала.-

2. Разработана методика количественного определения меркаптопурина с помощью фотоколориметрического метода, основанного на взаимодействии отого препарата с- реактивом Фолина-Чнокальто. Свето-поглощение окрашенных растворов подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в границах концентраций от 10 до 100 мкг меркаптопурина в пробе. Прздел определения составляет 10 мкг меркаптопурина в 10 мл конечного обьема. Относительная ошибка метода составляет ± 1,66$.

3. Разработана методика количественного определения меркапто-пурина спектрофотометрическим (в видимой области) методом, основанным на реакции взаимодействия вышеуказанного препарата с реактивом Фолина-Чиокальто. Предел определения составляет 0,01 мг препарата

в 100 г биологического материала. Относительная ошибка метода составляет - 1,25$.

4. Для количественного определения меркаптопурина предложен УФ-спектрофотометрический метод.- Определен уделысый коэффициент светологлощения меркаптопурина в 0,01 М растворе серной кислоты. Границы концентраций, в пределах которых светопоглощение растворов меркаптопурина в 0,01 М растворе серной кислоты подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера, состайллют 2-14 мкг этого вещества в I кл.

Относительная огибка метода составляет + 0,41%.

5. Разработана методика количественного определения меркаптопурина в таблетках. Относительная ошибка метода составляй?^

± 1,29$.

6. Установлено, что на эхстракции меркаптопурина из водных растворов существенное влияние оказывал? природа органичесхих растворителей и рН среды и мало влияет присутствие электролитов ' ,

в водной фазе. Максимальные количества ыеркаптопурина экстрагируются из щелочной среды при рН 7,0-10,4 н-бутиловым спиртом (.57%). * С помощь» 1,2-дихлорэтана (385?), хлороформа (25$), бензола (18$), толуола (18$), гексана (16$) и диотилового эфира (12$) при'той же , рК среды экстрагируются меньшие количества этого вещества.

7. Для выделения меркаптопурина из органов животных и биологических жидкостей предложен метод, основанный на изолировании

'этого препарата водой, подкисленной серной кислотой, и на последующей очистке вытяжек при помощи метода гель-хроматографии или хроматографии з тонком слое сорбента. При этом из биологического материала выделяется 39-43$ меркаптопурина. Предел определения "составляет 0,1 мг меркаптопурина з 100 г биологического материала. По той же методике из крови выделяется 34,8-36,0$ меркаптопурина (предел определения составляем 10 мхг меркаптопурина в 5 мл крови), а из мочи -45,0-47,4$ меркаптопурина. Предел определения составляет 40 мкг меркаптопурина в 50 мл мочи.

8. Мерхаптопурин, поступивший в организм, связывается с бел-хозыми веществами при рН 5,5 и въке. Продукты взаимодействия меркаптопурина с белковыми веществами разлагаются при рН 5,0 и ниже.

9. Мерхаптопурин в органах трупов распределяется неравномерно. В относительно больших количествах он может быть обнаружен в моче, кизечнике с содержимым, крови, печени и желудке с содержи-

шм. При химико-токсикологическом исследовании трупного материала на наличие в нем меркалтопурина следует брать указанные органы.

10. Изучение влияния сроков гкиедая биологического материала на устойчивость содержащегося в нем меркалтопурина показало, уто этот препарат разлагается в органах при их гниении. Через б месяцев из гнилостно-измельченной печени трупа можно выделить 2-4% этого препарата.

11. Результата выполненных нами опытов могут быть использованы не только в химико-токсикологическом анализе. Они могут быть использованы биохимиками и фармакологами, изучающими действие, токсичность, распределение в органах к тканях, динашку накопления и выделения лекарств из организма.

Основные положения диссертационной работы изложены в. следующих публикациях: _ I; Применение метода электрофореза для идентификации меркап-топурина./ Саякова Г.М., Ушбаев К.У. и соавт.// Некоторые вопросы химико-токсикологического анализа.'Сборник научных трудов. Барнаул, Щ>9. - С. 34-39.

. 2. Саякова Г.М./ Идентификация меркагттопурика с помощь» метода спектроскопии.// Современные проблемы фармации. Алма-Ата, 1989.-C.II4-II5.

,3. Саякова Г.М./ Распределение меркаптопуртаа в органах и биологических жидкостях животных.// Актуальные проблемы фармации. Алма-Ата, 19ъ9. - С.45-47.

4. Саякова Г.М./ Сохраняемость меркаптопурина в биологическом материал©.// Актуальные проблемы ф„ г;.;ации. Алма-Ата, 1989. -С.В-8.