Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование кислоты налидиксовой

#

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Г РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

КАЗАХСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. С. Д. АСФЕНДИЯРОВА

На правах рукописи УДК 615. 011: 547. 834. 2

РАЗЗАКОВ АЗИЗБЕК КОКОЕВИЧ

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КИСЛОТЫ НАЛИДИКСОВОИ

15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

АЛМАТЫ 1997

Работа выполнена на базе Алматыпской городской муниципальной су-",обтто-м"Д'1Ц11некой экспертизы МЗ Республики Казахстан и Республиканского бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ Кыргызской Республики.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат фармацевтических наук, доцент Байзолданов Т. Б.

— доктор фармацевтических наук, профессор КазГМУ им. С. Д. Асфендиярова Бисенбаев Э. М.

— кандидат химических наук, судебио-ме-дицннский эксперт-химик высшей категории Главного бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ РК Кондауров Г. Н.

Ташкентский фармацевтический институт

¡4>»

1997 г.

Защита диссертации состоится

в /У часов на заседании диссертационного Совета Д 09.01.07 и Казахском государственном медицинском университете имени С. Д. Асфендиярова по адресу: 480012, г. Алматы, ул. Толеби, 88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КазГМУ имени С. Д. Асфендиярова /480012, г. Алматы, ул. Толеби, 88/.

у-

Автореферат разослан <г » \Kyjj

¡997

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук

Радюк М. И.

ОВЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы» К числу фармацевтических препаратов, нашедщих широкое применение в медицине,,».относится, кислота, налидиксовая. . В химическом отношении препарат- является.производным I,8-нафтиридина и представляет собой 1-этид«1,4-дкгидро-7-метид-4-оксо-1,8-нафтири-дин-3-карбоновую кислоту. Препараты^кислоты налидиксовой /неграм, незиграмон и др./ применяются, главным образом при инфекциях" мочевых путей /циститах, пиелитах,.пиелонефритах/. Кислота налидинсовая эффективна при острых инфекциях.,.Может применяться п,:к энтероколитах, холециститах, воспалении среднего ,ух.а, и других заболеваниях, вызванных чувствительными к препарату,микроорганизмами, в'том числе устойчивыми к другим антибактериальным препаратам.'

Кислота налидиксовая представляет интерес не только как лечебное средство, но и как-вещество,, обладающее олределённ'ой токсичностью. Б литературе тлеются сообщения- о случаях смертельных отравлений препаратами кислот-г налидиксовой. К тому же кислота налидиксова. относится к сильнодействушрм веществам списка Б.

Несмотря на широкое применение препаратов кислоты налидиксовой в медицине и.её токсичность, кислота налидиксовая в химико-токсикологическом отношении изучена недостаточно. В литературе имеются отдельные работы, посвященные вцделению кислоты налидиксовой из трупного материала с помощью г-в£стных методов'изолирования алкалоидов и их синтетических аналогов. Не пригодятся сведения о. связывании препарата с тканями организма и разложении образующихся при этом соединений. Недостаточна изучены.методы обнаружения и определения кислоты налидиксовой в вытяжках из биологического материала. Неизучв-но распределение кис., эта. налидиксовой в органах и биологических жидкостях людей и/животных,- умерших в результате отравления кислотой налидиксовой, что не позволяет правильно выбрать объееты исследования на. наличие этого препарата. 3 доступной нам литературе отсутст-

вуют сведешь о срхр<аня~емрстй препарата в трупном материале при .его гниении.

В связи еуказанньшиыте разра^отха'шгодик-иссле^оваяия кислоты налидиксовой в объектах биологического происхождения «вдается одной из актуальных задач совре»®нного химико-токРикологичвскаго. анализа.

Цель и. задачи исследований. Целью наимх исследования является . разработка методик хикико-трксикологичесЕого-. анализа : кислоты нали-. диксовой, изучений влияйия-ргйад^ййг факторов на. результаты отдельных этапов химко-токсикологинеского исследования атого п^зпарата.

Для решения указанной цели : мы поставили следующие задачи :

- разработать методики идентификации' кислоты налидиксовой« выделенной из биологического материала, с помощь» микрокристамкческих и цветных реакций; .

- изучить возможность применения' методов хроматографии в тонком слое сорбента и ^-спектроскопии для идентификации 'кислоте налидиксовой в объектах хкмико-тохсикологи.меского анализа;

- разработать чувстБит^льнуй иетодику, пригодную для количест- . венного определения кислоты налидиксовой è объектах фармацевтического и химико-токсикологического анализов, с помощью метода экстракционной фотозлектроколарикетрии;•

. - изучить возможность применеда'я метода. УФ-шзентрофотометрии для количественного определения кислоты налидиксовой, "вцделенной из биологического материала; . .

- изучить вдшяние прчрода орга^чеС^ экстракции кислоты налидиксовой из водных растворов;

_ изучить' влияние различных' факторов ка экстракцию кислоты кали-дихсовой из водой внюшш

- взучктьусловия связывания кислоты, налидиксовой. с белковшя; , веществами - и разложения образующихся при этом со единений;

- изучить - пригодность опис'адв^ в^ли.тера^П^' изолирование алкалоидов-', и --друг«* азотисТкх- основан^ для -ееделения. кислоты

налидиксовой иэ объектов биологического происхождения; .

■ - разработать; оптимальную методику выделения кислоты налидиксо-вой из объектов биологического происхождения;

-•изучить-'распределение кислоты налидйксрвой. в органах животных, отравленных этим препаратом*

-изучить сохраняемость кислоты Налидиксовой в трупном материале ' при его гнилостном разложении.

.. Научная('.новизна' работы*. При. изучении, кислоты налидиксовой в хи-мико-токсикологичёскрн отношении - яамирекоыендованы методики выделения препарата из объектов биологического происхождения. Обоснован ■ механизм выделения препарата. • • Для идентификации, кислоты. налидиксовой предложены микрокристаллические к цветные реакции, метод хроматографии в тонком слое сорбента И УФ-СПЭКТрЮСКОПИИ;, '

Для количественного определения препарата,, выделенного из биологического материала, отработаны, впервые методики экстракцлонно-фотоэлектроколоринетрического и спектрофо'тоыетрического анализов.

Изучено влияние природа растворителей, рН среды, природы злек- -тролитов и т»д. на экстракция кислоты налидиксовой органическими растворителями. ••

Изучены условия связнвапия кислоты налидиксовой с биологическим материалами влияние рН. Среда- на разложение образующихся при этом •• соединений. . •

На основании данных, полученных при изучении распределения кислоты налидиксовой в-с/ганах,. тканях и биологических жидкостях отравлениях животных» даны- ракомк^ацнй для правильного выбора объектов биологического Происхождения, -подлежащих химико-токсикологичес-коыу анализу.

. Изучена сахуз^йгаисоть -¿насвта надздшгс.овоЯ в биологическом материала э • эазвисяйости &2: уегоЕЯЙ'и арэмэта гнизпия его. Определены . основные метабагпггыи-гоэкй'^аат^ испояьзозания последних для уста. немения'ссста яаетиманн* су.ь-вгя*

- 4 - ■

Практическое значение работы. Разработанные'-нами методики обна- . ружения и количественного.определения кислота налидиксовой пригодны для целей химико-токсикологического анализа..Методики легко выпол-. ■ нимы в условиях судебно-химических лабораторий бюро судебно-медицинской экспертизы, а наличие нескольких методик исследований для . одной и той не пробы практически во всех, случаях, позволяет эксперту исключить"судебно-химическую ошибку.

Выводы, рекомендуемые после изучения распределения кислоты налидиксовой в организме подопытных животных, позволяют правильно отобрать объекты при целенаправленных.исследованиях на наличие препарата в них. Кроме" этого, установленные сроки появления основных.метаболитов препарата позволяют химику сформулировать экспертное заключение , что иногда необходимо при' установлении, следственными ор- ' ■ ганами, давности.или времени наступления.смерти.

Разработанные нами методики исследований, кислоты налидиксовой внедрены в практику-судебно-химических отделений Республиканского бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ Кыргызской республики и Ал-матынской городской муниципальной судебно-медицинской экспертизы МЗ Республики-Казахстан, а также в учебный-процесс для студентов 1У курса фармацевтического факультета Кыргызского государственного' медицинского института.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены:

- на 3-й- Международной конференции - студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы современной медицины" /2 доклада/, г.Бишкек, 1996г.;

- на заседании членов научного общества судебно-медицинских экс-пертоз-хкмиков г.Алматы, 1996г.; "

- на заседании научного-общества судебно-медицинских экспертов РНЖ МЗ Кыргызской республики,;1996г.;

- на заседании Проблемной комиссии Ученого Совета фармацевтического факультета АГШи:«. С.Д. Асфендиярова, 1996г.;

- на научной конференции ЕВШ1 МВД Кыргызской' республики "Актуальнее проблемы совершенствования деятельности ОВД Кыргызской республики" /доклад/, г.Бишкек,'1596 т.

Объем и структура-диссертации. Диссертация состоит из введения,

5 глав, общих вуводов, списка литературы,'включающего 243 источника,

* •

из.них 50 работ на.иностранных языках. Работа изложена на 190 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц, 10 рисунков и приложения.

- На защиту диссертации, выносятся следующие результаты экспериментальных исследований и их.теоретическое обоснование:

- идентификация кислоты налидиксовой в химико-токсикологическом анализе;

- методики количественного определения кислоты налидиксовой. в объектах химико-токсикологического анализа;

- условия зкстраяции кислоты налидиксовой органическими растворителям; ■

- методики выделения кислоты налидиксовой из органов трупов, крови и мочи;

- распределение кислоты налидиксовой в органах, тканях и биологических жидкостях животных, отравленных этим препаратом;

- сохраняемость препарата в трупном материала в зависимости от условий и.времени хранения.

. С0Д2РЕАБЕ РАЕОШ

■ Кислота налидиксовая относится к числу фармацевтических препаратов антибактериального действия, нашедших шкрокое применение при лечении-инфекций мочевого канала. Препарат представляет собой Г-

этил-1,4-дигидро-7-ыетил-4-оксо-1,е-на?/гиркдин-2-карбйковую кислоту:

С2*% '

•■ ИДгЩ-ЙЩЦЙЯ -КИСЛОТЫ НАДу^ССБСЙ

Химические методы обнаружения кислоты налидиксовой -могут быть ■ направлены на проявление препаратом свойств; оснований, ,за снег третичных атомов азота; кислотннх свойств, эа счзт карбоксильной группы согласно структуры молекула.

В действительности, - раствора препарата'со шогиш - .общеадналоид-ныыи осадительными реактивами образуют муть .или осадки; среда них реактивы Драгендорфа, /раствор' йода^ца висы/та в йодиде калия/,. Бу-шарда /раствор йодавйодйде калий/ г , ЗоНненсгейна /раствор ^олибдата аммония в фосфорной кислоте/ обрадуют -интенсйдаые аморфные, осадки . ораняевого,. бурого и -белого■цвзта соответственно« Поскольку в. суде5-но-химической практике обцеаЛкалокдные ■ освдительще' реакция играют отрицательное судебна-химическое значение мы рзсраявчились только некоторыми из них. .

С целью разработки наиболее, 'чуветвителькес и селективных реакций обнаружения кислоты- налидиксовой на«к бьий изучены- многие другие .■■; реакции. Среди них следущие, считаёк, удовлетЕорийт требованиям -хишко-тсксикологического' анализа. .'

Реакция с раствором калия петэманганата* - Каплю'- 0,Одного спиртового раствора препарата наносили в углубление предметного- стекла и

- ? -

упаривали на водяной бане досуха. Остаток на стекле растворяли в 1-2 каплях разбавленной"соляной кислоты и добавляли-1 каплю 196-ного свежеприготовленного.раствора калия перманганата, и помещали во влажную камеру. Через'. 2'.часа-образуется бесцветные мечеобразные ' кристаллы. '• - .. • ' '• " ' ■ ':.''.'/'"

Ни--:ч'лй.'предел обнаруаения' 5..ыкг препарата' в. пробе. . Реакция выделения кислотной фор?ла. препарата,;.-На. предметное стекло наносили 1-2 капли О^ОГ^-ного- раствора- препарата -и добавляли I -кашли конц.ентрировайной'серной кислоты.;-.Через- 10- минут жидкость разбавляли двойным' количеством йоды.-. При стоянии- во влажной камере по истечению-7-10- минут, появляются- кристаллы' характерной, игольчатой формы,. '■-■-•' •

Кигшяй предел, обнаружения 19 ыкт препарата в-пробе-. ■ .-Реакция с-Пергидролем в присутствии концентрированной серной . кислоты.. Б фарфоровуто чглку вносили 1-2 капли, раствора препарата и выпаривали-на водяной бане досуха. К остатну- добавляли 2 капли пер-.гидроля,Ткаплю концентрированной серной Кислоты, и нагревали на водяной бане. Появляется лимонно-нзлтое окрашивание.. Нижний предел обнаружения 0,8-мг- препарата в пробе. ■ Далее .мы определили.пригодность изученных реакций для обнаружения кислоты налидиксовой в фармацевтических препаратах /при неоходимости изымаемых как "вещественное доказательство"/, и во внут-

органах-лицт.погш5щих -от трявы'/методом затоавки/. Результаты опытов доказали,:, что разработанные .'нами реакции-пригодны для идентификации кпслоть налидиксов&й•• в фармацевтических препаратах и вытязспах;из 'биологического материала..

Установлено,..что кислоту налидакоовуя мелено обнаружить методом хроматографии звонком слое сорбента. Для этих далей ислользовали-• съ пластинки "сылуфол"- /ЧССР/,, а такле пластинки, изготовленные наш из силннагеля КСК и'ые^цинсг'аго;гипса. Для-развития хромато-- грамм на плзетдажах-.приманила системы растворителей, которые при-

ведены в-табл. Г. Проявление пятзн : кислоты-налидиксовой на пластин-, ках осуществляли реактивом Драгендорфа, ыоджЬицировакнкм по Мунье, или 5?4-ным раствором хлорида железа /III/.

При проявлении пятен кислоты налидиксовой'на пластинках реакти-' воы Драгеш, рфа^. модифицированным.'по- Ыунье, на желтом-фоне проявляется оранжевое пятно» .При обработке¡пластинки "силуфол" реакти- ^ воы Драгендорфа к.нему необходимо добавлять аскорбиновую кислоту из расчета .1,0 г. на 100 ыл реактива* Предел обнаружения 0,25 мкг кислота налидиксовой'в пробе.'

При проявлении-пятен кислоты ■ налидиксовой на . пластинках 5%-шм . раствором хлорида железа /III/появляется пятно лимонно-яелтого .цвета. Предел.обнаружения 20 мкг препарата в пробег

Тайлипа I ^ Значения^ ^ пятен кислота налидиксовой в различных системах растворителей

' / ./• I. Значения ßj! пятен препарата'на

Система растворителей i "сйлуфоле"'¡на Пластинке с тонким '

!_ 1 слоем силикагеля КСК

0,50-0,52 " 0,42-0,45

0,48-0,51 0,44-0,46

0,46-0,50 0,40-0,42

Нами изучены УЗ-спектры поглощения кислоты налидиксовой в 0,1 н. растворах соляной кислоты и гидроксида натрия, этиловом спирте, хлороформе.. При этом установлено, что кислота налндиксовая во всех применяемых растворителях имеет две полосы поглощения, обусловленные хромофорной системой- карбонильная группа м двойные связи.-. В водно-кислой среде сг.зктр поглощения кислоты налидиксовой характеризуется максимумами при-длинах волн 257 и '315-нм; в.водно-щелоч-ной среде- 25S и 334- нм; хлороформе- 259 и 330'нм; этиловом спирте-

1. хлороформ:ацетон

9 • X,

2. хлорофош:эфир

'3. диоксан:25#-ный раствор, аммиака •

3:1

¿ab и 330 нм. Установлено, что природа растворителя-существенно влияет на количественную характеристику спектров поглощения препарата. Наиболее интенсивным является максимум СЕетопоглощения этого пр-зпарата в 0,1 н. растворе гидрокеида-натрия и этиловом спирте.

летод УФ-спектроскопиа для идентификации кислота налидиксовой, выделенной из биологического материала, пригоден только после предварительной счистки. Науи разработан способ очистки вытяжек методом хроматографии в тонком слое силикагеля КСК и на п. остинках "силу-аюл". -Для этой цели приготовляли пластинки, покрь:т::с тонким слоем сидккагеля КСК, закрепленным гипсом. На пластинку /на 2 см згпле нижнего ярая/ с лево."5 стороны наносили полосой /длиной 6 см/ хлороформную внтя-.-ку из биологического ааФеркалг. Правое через 2 см, в точку наносили раствор "свидетеля" /0,01%-нчй спиртовый раствор кислоты налидиксовой/. Нанесенные растворы Еысугнззли на воздухе. Пластинку после этого переносили в камеру для хроматог рг!к по j,чшп, насыщенную парами одной из систем растворителей указанных п таблице I. Длина пробега фронта растворителей 10 см. Затем пластинку вытаскивали из камеры и подсук'чалк на воздухе. Чистым стеклом закрывали ту часть пластинки /слева/, на которую'была нанесена вытяжка. Правую, незакрытую часть пластинки, опрыскивали реактивом Драгендорфа, модифицированным по Уунье или. 5&-нык раствором хлорида железа /III/,.и этим определяли местонахождение кислоты налидиксовой, нанесенной на пластинку в виде полосы с вытяжкой. В зоне, с левой части-пластинки длиной-б см и шириной.1,5 см, соответствующей местонахождению препарата, снимали слой сорбента /или вырезается та часть, если применяется пластинка "силуфол*/. Слой сорбента, снятый /или вырезанную часть/ с пластинки-, помещали в колбу /или б стакан/ и зализали'10 мл 0,1н. раствора глдронсида .натрия, для элвкрования кислоты нынувуюовоЯ. Операияю олюирэва-няя повторяли ещё 2 рая а раствором гагсия /10 и 5 мл/.

Объем эхлбтоз доводили тем же растэосктеглк до .:•"> мл. Измеряли оп-

тическую плотность полученного раствора с помощью спектрофотометра СФ-26 в диапазоне длин волн от 220 до 360 да. Спектр поглощения кислоты налидиксовой, выделенной из Трупного материала, имел максимумы поглощений при длинах волн 258 а 334 нм, По контуру совпали со спектром поглощений чистой кислоты налидиксовой в 0,1 н. растворе гидроксида натрия. Толщина поглощающего слоя /кюветы/ I см. ■

ШШгСТВлННОЙ ОШдаЬМу^ КИСДОШ Ш>'#1КС0В0И

Для количественного определения кислоты налидиксовой нами разработаны методики экстракционной фотоэлектроколориметрии и УФ-спек-трофотометрии.

Разработанная нами методика, экстракционной- фотоэлектроколориметрии основана на реакции кислоты налидиксовой с метиловым оранжевым. В результате реакции образуется ионный ассоциат возможно следующего состава:

сС^74^—Н

Методом кооколкрных'сериГ: установлено, что кислота-нал-даксовая ------„.„.-г взаимодействуют -в соэтногекки 1:1. Кояичест-

во кислоты налидиксовой, эквивалентное количеству метилового оранжевого, освободившегося из ионного ассоциата, определяли путем измерения оптической плотности кислого раствора красителя, имеющего розовую окраску. Для этого полученный ионный ассоциат экстрагировали хлороформом при рН 7,0. Далее его разрушали 0,2 н. раствором сорной кислоты. Раствором сравнения служил 0,2 н. раствор серной кислоты. Б качестве .прибора для измерения оптической плотности мы применили фотоэлектроколоримвтр К5К-2 /светофильтр Н? 5, Д.зфф.= 490>10 нм, кювета 5 мм/. Расчет'содержания кислоты налидиксовой производили по калибровочному графику.

Относительная ошибка предложенной нами методики составляет +0,05%. Предел обнаружения: 0,04 мг препарата в 10 мл конечного объема. Оптическая плотность окрашенных кислых растворов подчиняется закону Еугера-Ламберта-Бера в пределах от 0,04 до 1,00 мг в указанном конечном объеме.'

Науи тахче разработана-методика количественного определения кислоты налидиксовой по светопоглогцению в У5-области спектра. Нами установлено, что количественному определению кислоты налидиксовой, выделенной из объектов биологического происхождения методами У5-спектрофотомотрии и экстракционной фотоэлектроколориметрии, мешают примеси, переходнике в хлороформные вытяжки с исследуемым препаратом. Эти методы пригодны для целей химико-токсикологического анализа только после предварительной очистки вытяжек методом хроматографии в тонком слое сорбента, как описано выше. Полученный элюат /элюпрование проводите хлороформом, если количественная оценка будет производиться окстракционно-фотоэлектроколориметрическим методом/ использовали, для количественного определения кислоты налидиксовой по светопоглощеиия в У'5-области спектра. Величину оптической плотности препарата з 0,1 н. растворе гмдроксида натрия /элюата/ при ^^258+2 нм применяли для. расчета количественного содержания препарата по калибровочному графику или при помочу удельного коэф-

- 12 -

фициента светопоглогцения по формуле /Е|£и=Ш9,5'1+0,63/:

■ с = : т > гДе 1см 1

С - концентрация определяемого раствора,

Д - отеческая плотность определяемого раствора;

^1см~ УДельный коэффициент светопоглощения этого раствора;.

I - толщина поглощающего слоя раствора, см.

Предел определения: 0,5 мкг препарата в I мл раствора щелочи.

Границы концентрации кислоты налидиксово/,, для которых соблю-' дается закон Бугера-Ламберта-Бера в 0,1 н. растворе гидроксида натрия составляют-от 0,5 до 10 мкг/мл.

экстракция- кислота.на-щ-1ликсс -юй из водах растворов

На?.гл изучена зависимость степени экстракции, кислоты налидиксо-вой от рН сроды и от природы органических растворителей. Яы пркме-нили свегоперегн1нные органические растворители: хлороформ /темп, кип. 61,2°С/,'диоткловый эфир /темп. кип. 34,6°С/, бензол /темп, кип. 80,8°С/ и толуол /темп. кип. 110,6°С/. В делительные воронки вносили по 9,5 мл универсальной буферной смеси с соответствующим значением рН /от 1,81 до 11,40/, добавляли по 0,5 мл 0,1$-ного раствора препарата и по 10 мл одного из указанных выше органических растворителей. Содержимое делительных воронок взбалтывали в течение 10 минут и оставляли на некоторое время для разделения фаз. Затем из каждой длительной воронки отделяли фазу органического растворителя, которую выпаривала! досуха. Сухие остатки растворяли в 9,5 мл универсальной буферной смеси /рН 7,0/ и добавляли 0,5 мл 0,19*-лего водного раствора этилового оранжевого. Смесь взбалтывали с новыми порциями ;-:порс" 3 раза по 5 мл. Для полного .разрушения ионного асссц'.мтл и гп"..-:;:..дсннп метилового оржгевого--в 0,2 н. рас-тзор серкой г:--си ли двухкратное взбалтывание хлороформ-

ного слоя с ого", кислого;? /по о-мл/ и определяли .оптичёкясу» плот-

ность раствора как описано выпе. Результаты наших исследований при ведены на рисунке.

родных растворов от рН среды:

1 - хлороформом;

2 - диэтилое^м .-эг'/.рсм;

3 - бензолом;

4 - толуолом.

Результаты проведенных нами опытов показали, что кислота налн-днксовал экстрагируй оя всеми названными выгз оргаиичзсгшми растворителями как из кислой, та:-: и из т.елсчно;: сг-зяы. Оанако, бельке количества препарата экстсагируктся из кнелей среды. Стзпзнь экстракции зависит от псизог.и органического састьогптеля и пН срои-:. Максимальные к сличите а кислоты налидихсовой зкетоаг;*рувтея хлеоо-ф.->р.:см при рН 2,27. Мень-з:* количества препарата эхстгагкруктся

......... . - ,14 -

диэтиловым эфиром, толуолом и бензолом.

Мы также изучили влияние электролитов на степень экстракции кислоты налидиксовой из водных растворов. В качестве электролитов мы примени.:« хлорид натрия, котож?. используется в химико-токсикологическом "адаг эе для разрушения'эмульсий, и сульфат аммония, приме- . няемый-для - осаждения белковых веществ и других примесей из вытяжек. Влияние этих электролитов изучали при рН.2,21, соответствующей области максш/уда экстракции кислоты налидиксовой.

Установлено,- что наличие-электролитов незначительно увеличивает степень экстралц11и кисл0ты налидиксовой.

Произведен "расчет'"объема-органического растворителя и количества экстракций,, необходимых дляполноты экстракции исследуемого препарата органическим растворителем /хлироформом/. -

ЕЬЩЕЛНЬМБКИСл01Н;ШИД;ИС0ШЙ ИЗ. БШЛ0Г/1ЧЕСК0Г0 МАТЕРИАЛА

При проверке пригодности методов, применяемых в химико-токсикологическом анализе для выделения алкалоидов и их синтетических аналогов, установлено, что с помощью этих методов кислота налидиксовэя из биологического материала выделяется не полностью.

В сеязи с этим, мы поставили задачу изучить все условия для полноты выделения кислоты налидиксовой из биологического материала. Последовательно нами'изучено влияние рН среды на связывание кислоты налидиксовой с белковыми веществами и на разложение образовавшихся при этом спедидений. Для этой цели мы применили метод равновесного диализа. С помощью этого метода нами было установлено, что кислота налидиксовая связывается с белковыми веществами при рН 4,10-7,0. Образовавшиеся при этом соединения разлагаются при значениях рН 1,81-2,21.

Нами изучено такта влияние природа кислот,.применяемых для под-кислекия объектов исследования, из которых изолируют кислоту нали-диксоэ^ю, на стеяень выхода этого препарата. Для выбора'оптимально-

.го"реагента, служащего для подююлатя вода, при.выделении кислота налидиксовой из биологического материала, ш проверили влияние ща-велеЕой, уксусной, соляной и серной кислот) Результата наших-исследований показали, что наибольшее количество'препарата удается'вцде-лить при подкислении объектов ксслёдованйя-раствора!:,;« щавелевой и серной кислот. • - . - '"■■"" ■-.■•■->:■■" .,.-......

После обстоятельного изучения и анализа проведенных нами йссле- •' дований мы предложили методику выделения кислоты ы-лмдиксовой 'из ' объектов биологического происхождения. .

Выделение кислоты налидиксовой из органов трупов. 100 г. гоыоге-. ната биологического материала вносили в колбу, добавляли 10 мг по-роггка кислоте налидиксовой. Содержите1 колбы смешивала я оставляли на сутки, периодически перемешивая. Через сутки пробу биоматерпала заливали .56#-нум этиловым спиртом до покрытия им твердых частиц объекта. Смесь подкисляли насыщенным спиртовым раствором щавелевой кислоты до рН 2,0 /ло универсальному индикатору/ и оставляли на сутки при периодическом перемешивании. ■ Через сутки проверяли значение рН смеси и сплртовую вытяжку сливали, а бкоматериал вновь заливали спиртом /контроль рН среды/. Настаивание биологического материала с новыми порциями подкисленного спирта повторяли 3 раза.

Спиртовые вытяжки объединяли, а оставшийся биоматериал промывали подкисленным этиловым спиртом, который присоединяли к основным вытяжкам и весь объем центрифугировали 5 минут при 2500 об/мин. Цен-трифугат сливали,-а осадок смешивали с 20 мл подкисленного спирта и вновь центрифугировали. Полученный цзнтряфугат присоединяли к основному. -Затем объединенный центрифугат-упаривали' на водяной бане в фарфоровой ча^ке до густоты сиропа /при тег.лературе не выие 40°С/. В сиропообразном остатке осатдали белки добавлением по.каплям абсолютного спирта. Едкость центрифугировали при вгаеопиевкных условиях, вновь упаривали-на водяной бане до густоты сиропа, и осаждали белки'. Опе^ацта оса-денкл белков проводили до тех пор, пока спирт

■ перестал что-либо осаждать. В последний раз сиропообразный остаток обрабатывали 75 мл дистиллированной воды /при необходимости центрифугировали/. Полученную кислую водно-спиртовую смесь переносвди в делительную воронку и пятикратно взбалтывали с ■ ноижй' порциями хлороформа /по 30 ил/ по 5 минут /рН водной Фазы - 2,0 по универсальному индикатору/»

Объединенные хлорофорьздые вытякки выпаривали достаг, сухой остаток растворяли в 5 мл хлороформа. I мл последнего использовали для количественного определения кислоты налидиксоЕой экстракциокно-гго-тоэлектроколориметрическим методом, описанным вкше.

Сравнительная оценка результатов выделения кислоты налидиксовой из биологического материала различными методами изолирования алкалоидов и их синтетгческих аналогов приведена в табя; 2.

Таблица 2 - Сравнительная оценка, различных методов выделения кислоты налидиксовой из биологического материала

Метод кзолигювания ■ ! Вёделено кислоты ...

А ■ ' , . - -■ ' налидиксовои, %_■

-Спиртов, подкисленным щавелевой кислотой 71,75-73,09 /кисл.+щзлоч./ Водой, подкисленной щавелевой кислотой 51,76-53,40 /кисл.+щелоч./ Водой, подкисленной серной"кислотой ■' 50,83-52,93 /кисл.+щелоч./ Кодифицированной нами методикой 79,91-80,53

Результаты навях исследований-, приведенные в таблице 2, свиде- . тельствуют о том, что с помопцш модицированной и предложенной наш методики из биологического материала выделяется-большее количество кислоты налидяксовой, чем с помощь» других методов изолирования.

Выделение кис^?отк* калигоксовой из крови. В. колбы емкостью 50 мл вносили по 10 мл исследуемой крови, прибавляли по 10 мг препарата, содержимое колб перемешивали и оставляли на сутки. По истечению указанного времени в каждую колбу добавляли по 20 ¡¿л насыщенного .

- раствора,щавелевой 'кислоты,, при необходимое?;; доводили рН до 2,0 /по универсальному индикатору/ растворе:,-. едвзлог-ой, ккс^тн. Содзр-

жимое колб оставляли на.2 часа периодически перемешивая.. Затем содержимое колб центрифугировали 5 минут при 2500 об/мин.. Центрифуга? отделяли,.а. осадок еще 2 . раза обрабатывали насыщенным раствором щавелевой кислоты й подвергали центрифугированию. Центрифугаты объединяли, 5 раз взбалтывали с.новкми порциями-хлороформа по 30 мл в делительной воронке по. 5 минут /рН водной'фазы 2,0/. Хлороформные вытдакк объединяли и выпаривали досуха. Сухой остаток растворяли в о мл хлороформа-и-по 1,-мл полученных, растворов использовали для количественного определения препарата зкстракционно-фотоэлектроколо-риметрическим методом, описанным выше. .

Установлено, что с помощью'предложэнной■нами методики можно выделить из крови около .75?$ кислоты налидиксовой.

Выделение кислоты налиликсовой измочи. Б колбы емкостью 100 мл вносили по 25 мл мочи, содержащей по 10 мг препарата.- Мочу подкисляли насыщенным растворсм щавелевой кислоты до.рН 2,0 /по универ-■ сальному индикатору/ и оставляли на 2 часа при периодическом перо-меигивании. Затем проверяли рН содержимого колб /рН 2,0/, переносили ягидкости в делительные -воронки и взбалтывали с новыми порциям хлороформа /ка-«дая порция хлороформа .при этом равна 1/3 объема водной фазы/ 5 раз по 5 минут. Образовавшиеся при этом эмульсии разрушали центрифугированием. Хлороформные вытяжки объединяли и выпаривали досуха. Сухие остатки растворяли в 5 мл хлороформа и по I мл полученных растворов использовали для количественного определения кислоты налидиксовой, описанным выше методом.

Установлено, что п_эдложенной нами методикой можно выделить из мочи от 76,79% до 77,09?í кислота.|далидиксовой.

Распределение кислота налидиксовой в' -органах, тканях и биологических жидкостях изучено нами на экспериментальных животных. 2и-•воткым с помощью зонда- вводили раствор кислоты налидиксовой в Биде крахмальной взвеси из расчета С,1 г препарата на I кг зеса живот-

- 18 - ... ' '/■ '. _ ного /собаки/. Через-З часа после введения препарата гшвртных умер-, швляли и определяли количественное- .содержание, кислоты налидиксовой. В различных органах и биологических . жидкостях. .

Выпо^шенные нами исследования показали,, что у собак, отравленных данным I репаратом,. наибольшее количество, кислоты налидиксовой обнаружено в почках, крови/ моче, желудке.тонком кишечнике, пече- ■ ни.и в легких;. Меньшие-количества препарата .содержатся в сердце',., мозге и толстом кишечнике. .

. Сохраняемость кислоты- 'налидиксовой в биоматешале.. Наж изучена . сохраняемость кислоты налидиксовой,. а также--.возможность появления : •основных метаболитов ее в трупном-материале в-, процессе! его падений. Для этой цели в рад колб вносили по 100 г го'могената печени трупов лиц, пагибшх:от травму прибавляли по -20 мг порошка препарата». Со--деряю«ое.колб переиедавали'в-оставляли на.рааличное время, в раз-,' личных условиях, /холодильник и комнатная -температура/. По истече-. нии определенного' времени /для- каждой.-колбы^ отдельно/'производили выделение кислоты налидиксовой с помощью предложенной-наш методики. Полученные вытяжки.-выпаривали досуха, сухие, остатки растворяли в 5 мл хлороформа и по. I мл из них хроматограф'ировали в. системе растворителей хлорофори:ацетон /9:1/, как описано выше. Хромато-. грамму проявлял!-! 5;£->шй раствором хлореда железа-/III/.. Отмечали окраску проявившихся пятей и вычисляли значения их „ При этом установлены- два основных -метаболита. Это метаболиты. I и.II, пред-положителы '.> соответствующие ?~гид ро кс и налидикс о вой и 7-карбокси-налидиксовой кислотам. В процессе' гниения' биоматериала в-комнатных условиях метаболит I появляется череа 3 суток /¡^0,10-6,15, пятно красно-фиолетового ц^ета/, а метаболит II /1^0,60-0,65, пятно по-.является при стоянии- розовое/ через. 6 суток. Кислота налидаксовая и её метаболиты в этих-. условиях не обна'руживаятея чере'з 4- месяца ровно. .А в процессе хранения биоматериала в условиях холодильника

л. - 19 — .

метаболит I появляется через 6 суток, метаболит'II- через 22 суток. Кислота нал'идиксовая и её метаболиты в условиях.-холодильника-в. био-. ■ логическом материале сохраняются более года кислоты налидиксо-вой 0,50-0,52, пятно лимонно-желтрго цвета/.

' ' 4 -' - ■

завода .

- I;. Для идентификации.- кислоты. налидиксовой в.растворах и вытяжках Из биологического материала пригодны микрокристаллические реакции и реакции окрашивания.- В основном,; это реакцга: с калия перман-ганатом в кислой среде;:выделения кислотной формы препарата и.реакция с пергидролем вприсутствий. концентрированной серкой-кислоты. -, 2. Для идентификации кислоты налидиксовой в химико-токсикологическом анализе могут-быть' Применены физико-химические методы, такие,-, как хроматография в. тонком слое сорбента, УЗ-спектроскогшя. Метод" ^-спектроскопии мояет быть использован для идентификации кислоты налидиксовой,в вытяжка^ из . биологического материала только . после' предварительной очистки полученных вытяяе-к,: от сопутствутопщ примесей:, методом хроматограф™ ■ в гонком слое- сорбента. " 3. "Для количественного определения- кислоты налидиксовой, выделенной-из биологического'материала, пригодна-разработанная, нами методика экстракционной фо^оэявктройолордоотрии, основанная на- реакции образования ионногоассоциата препарата..с метиловым оранжевым. .-.-.• 4,. Количественное определение кислота'налидиксовой, выделенной из биологического материала,- можно проводить методом У^-спектрофо-тометрии только после -предварительной -оадсткв ,5затя?.ев методом хрома' ографии в' тсйксм с.тоо сорбента. • • : 5. Из органических растворителей', .-/хлороформ, .диэтиловый эфир,

• бензол,- толуол/ наиболее пригоден для экстракции кислоты налидиксовой из водных растворов хлороформ. С помощью этого растЕоритзля

• извлекается наибольшее количество препарата,- с' .помощью других

вышеперечисленных органических.растворителей, не смешивающихся с водой.

6. Нами установлено, что степень экстракции кислоты налидиксовой из водной фазы органическими растворителями, не смешивающимися с водой., зависит не только от природы этих растворителей,-но и от рН среды и в незначительной, степени от присутствия электролитов.

7. Кислота налидиксовая, поступивиая в организм, связывается с белками при рН 4,10-7,00, а образующиеся при. этом соединения разлагаются при рН 1,81-2,21.

8. Проверкой.пригодности описанных в литературе методов выделения алкалоидов и их синтетических аналогов из биологического мате-.. риала установлено, что наибольший еыход кислоты налидиксовой наблюдается при изолироврчии её из биологического материала методом Стае-Отто. Этот метод'нами рекомендуется для выделения кислоты налидиксовой из биологического материала, при исследовании по общему ходу химико-токсикологического анализа, • .

9. При направленных /целавкх/ исследованиях на кислоту налидиксо-вую предлагаем выделять этот препарат из биологических объектов модифицированным нами методом Стас-Отто. Это позволяет выделить большее количество исследуемого препарата, чем с помощью описанных ранее методов изолирования.

10. На судебно-химическое исследование для решения вопроса об отравлении препаратами кислоты налидиксовой, необходимо направлять почки, кровь, мочу, желудок-с родергшмым, тонкий кишечник с содержимым, печень и легкие.

11. Кислота налидиксоЕая является нестойким .веществом. Определены два его основных метаболита. Это метаболиты I и II* и различаются они друг от друга по сроку появления в зависимости от условий хранения биологического материала. Так в трупном материале во время его гниения при кошагной температуре препарат -подвергается метаболизм

. - 21 -

и через 4 месяца разлагается почти- полностью;.В условиях холодильника кислота налидщссовая и ее метаболиты .сохраняются в биомате-рйале более года.

12,- Основные результаты хймико-токсикологического исследования кислоты налидиксовой внедрены в' учебный процесс студентов фармацевтического Факультета Кыргызского государственного медицинского института, а также в-практику, судебно-химических отделений Республиканского бюро судебно-медицинской экспертизы. МЗ Кыргызской республики и Алматынской городской муниципальной судебно-медицинской экспертизы МЗ Республики Казахстан. •

' ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕЬЛЕНДАЩИ

I- При подозрении на отравление кислотой налидиксовой для су-дебно-химического'исследования следует отбирать почки, кровь, мочу, желудок с содержимым, тонкий кишэчнпк с содержимым, печень и легкие.

2.. Для изолирования кислоты налидиксовой из трупного материала рекомендуется модифицированный нами метод Стас-Отто.

3. Для идентификации и-количественного определения кислоты, нали-. диксовой, выделенной из биологического материала, Физико-химическими методами необходимо проводить предварительную Очистку вытяжек.., методом хроматографии в тонком слое сорбента.

4. При интерпретации результатов исследования препарата необходимо учитывать появление метаболитов I и II, а наличие последних можно использовать • для установления возможного срока наступления смерти.

НАУЧНЫЕ РАБОТУ, ОПУБЛШЮВАНКЫЕ-ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Раззаков А.К., Еайзолданов. Т.Б. Спектрофотометрнческое изучение кислоты налидиксовой в химико-токсикологических исследованиях //Здравоохранение Казахстана, ^ 8,- е.. 51.

2. Раззаков А.К., Еайзолдгноз' Г.Б. Методы обнаружения кислоты налидиксовой //Здравоохранение Казахстана, 1955, Р 12, с. 52-53.

■ - 22 - " .'■• • '.'/"■ V'

3. Байзолданов Т.Е., Раззаков А.К. -Фотометрическое исследование кислоты налидиксовой в биологическом материале•//Здравоохранение Казахстана. - 1956. -14. - 5.63-54..;

4. Р_ззаков А.К., Айтмырзаез. -Б.Н., Набиев В;Б. Распределение кислоты надищиксовой в органах подопытных животных //Материалы .В-й. Международной' конференции студентов и мододахученых "Актуальные ' вопросы современной медицины". Бишкек, ,-1996. -Ч. I.. С.87-89.

5. РаЗзаков А.К. Сравнительная оценка методов изолирования кис- • лоты налидиксовой из биологического материала //Материала 3-й Международной конференции студентов и молодых ученых; "Актуальные вопросы совреыенной медицины^. Эилж'ек. ^бЗб. -Ч.1. - С .£9-90.

6. А.К... Раззаков,. Т.Б.-' Байзолданов..Сохраняемость кислоты нали-.- ■ диксовой в- трулноц материале и возможность.'применения, этих факторов при установлении давшюти наступления смерти в экспертной практике. - В кн.: Пластичность и. реактивность, организма,"органов, тканей и . клеток. /Сб. научных трудов/. .-• Бишкек, 1997. - С.435-438. •

7. А.К. Раззако», Т.Б. Байзолданов, Б.Н. Айтмырзаев.'. Методики' количественного определения кислоты напндйксовой в объектах химико-токсикологического анализа».- В кн*.: Пластичность и.реактивность организма',, органов, тканей и клеток.. /Сб научных трудов/. - Бишкек, 1997. - 0.438*439«. •

; :-,;23- Д. ■ .

Раззаков взйбвк Кокойулы

НАЛИДИКС ЦЫШКЫЛЫНЫН ХИМИЯ-ТСЖСИКОЛОГИЯЛЫК ЗЕРТТЕЛУ1

/ тУралы :.

. . Фармация гылым кандидаты дэрежеЫн any уинн диссертация -. t5.00.02 фармацевте химия жене фармакогнозия ТУЖЫРЫМ

Налидикс кышкылы. ■ зэр , шыгару жолдарын емде; ушм кецшен цолданылатын антибактерйалдыК • препарат. Налидикс ^шкылы дертнс касиет!мен катар абайсыз крлданылганд'а улы касиет» бар зат ретжде де кецгл аударады. BipaK ол, химиялыкулылыгына катысты Tirm зерттелмеген. Осыган байланыст'ы б!'зд|'к зерттеу^лздщ максаты - биологиялык материализм налидикс к,ышкылын бвлт алу онин 6apv жоктыгы немесе идентификациясы жэне сандык мелшер'т амыктау QflicrepiM талдау едг.

Налидикс кышкыл'ыныч хммиялык-улылык жагдайЬш эерттсу кез1нде 6i3 теменделдей нэтижелерге алгаш рет кол жвтк(з(г» отырмыз: налидик»-кышкылыныц идентификациясы уш!н микрокристалдык; турльтусп реакция ивтижелер! усынылып, УФ-спектроОкопия,- жука - кдбатт'ы. сорбенгпк хроматография .эдктгефж налидикс кышкылын иден-тификациялау максат'ы и да- . пайдалану кврсетшдЬ УФ-спектрофотометрия жене экстракциялык фотоэлектроколориметриялык eyjtCTepi налидикс кышкылын . сандык . «¡иелшерш аныктауга пайдаланылды. Налйдикс кышкылыньщ ■ органикалык ер'тк1штермен epfrtultiK катынасы жене химиялык ортасыка . кзрай белоктармен байлаиысу- • жагдайы зерттелди биологиялык матёриалдаи налидикс кышкылын бв/нп алу eflicrrepi усынылды; налидикс кшшкылымен улан?аи лабораториялык- жануарлардыц ¡ш-мушелерше таралуы жвне МЭЙГ ¡иьмущелерМн квзгндел.свктйлуы, метаболиттер лайда болуы мерз«мдвр( зерттедш. •

Б1здИ жасаган вд1стер1Мй налидикс кышкылымеи уланган жагдайда срт-химиялык зерпеулерш жургйу уш!н кажё*. Бул вдастердИ 6ip беШп фармация саласында бакылау-талдау, халыкка- сатыдвтыи налидикс кышкылынын сапасын тексеруде пайдага асады.

Azizbek K Razzakov NALIDIXIC ACID CHEMICO-TOXICOLOGICAL INVESTIGATION Dissertation for a candidate degree of pharmaceutical sciences 15.00.02 ■> pharmaceutical chemistry "and pharmacognosition

SUMMARY

Nalidixic acid is an antibakterial agent which is widely used in treatment of urinary tract infections. Nalidixic acid is one of the great interest not only as remedy but as a substance of definite toxicity: Inspite of this it not yet been studied practically in chemico-toxicolagical respect. In this connection the aim of our research was' working out of nalidixic acid discharge method from the object of chemico-toxicological analysis and the methods of identification and quantitative definition of the preparation discharged from biological matenal.

For the first time Quiring nalidixic acid in chemico-toxicological aspect the following results have been received; microccrystallic and color reactions for nalidixic acid has been suggested; possibility of UV - spectroscopy methods use, chromatography in thin sorbent layer for nalidixic acid in identification, has been shown; UV - spectrophotometry and extractional priotocolorijnetry methods for nalidixic acid Quantitative definition have been worked out; conditions of nalidixic acid extraction by organic solvent and nalidixic acid fixation with protein substances dependiong on pH medium and destruction of formed compounds have been studied; method of nalidixic acid discharge from biological material has been suggested; nalidixic acid distribution in organs of animals corpses poisoned by this preparation and time of nalidixic acid preserving cadaveric material duiring the period of its putrifaction have been studied. ' *

The method worked out-by. us are useful for cherrecolegal investigation of poisoning by nalidixic acid. Part of these methods are suitable for their use in test-analytical laboratories of pharmacy management for quality control of nalidixic acid sold by the chemists.