Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Химико-токсикологический анализ некоторых производных фенилалкиламина

На правах рукописи

005005891

КАЗАРЦЕВ ИЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНИЛАЛКИЛАМИНА (МИДОКАЛМА, КЕТ АМИНА, ФЛУОКСЕТИНА И СИДНОКАРБА)

Специальность 14.04.02.- фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 2 ДЕК 2011

Пермь-2012

005005891

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г.Барнаул)

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России Доктор фармацевтических наук, профессор

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития Росии

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «17» января 2012 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.068.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д.2. Тел/факс: (342) 233-55-01

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» (г. Пермь, ул. Крупской, д.46).

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации

http://www.mon.gov.ru «_»_2011 г. и на сайте ПГФА http://www.pfa.ru

«_» _2011 г.

Автореферат разослан « С?/"» декабря 2011 г.

Федосеева Людмила Михайловна

Ярыгина Татьяна Ивановна Куклин Владимир Николаевич,

Ученый секретарь диссертационного

совета Д 208. 068. 01, кандидат /

фармацевтических наук, доцент / ^ И.А. Липатникова

\

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди большого арсенала лекарственных веществ, действующих преимущественно на центральную нервную систему, широко используются производные фенилалкиламина. Интерес вызывают мидокалм, кетамин, флуоксетин и сиднокарб.

Мидокалм - спазмолитическое средство центрального действия. Отмечены случаи использования мидокалма больными наркоманией для снятия спазмов гладкой мускулатуры при абстинентном синдроме. Передозировка мидокалма вызывает состояние легкого опьянения, описаны смертельные отравления. (Кобзарь Я.В., 1989 г.).

Кетамин относится к группе неингаляционных средств для наркоза. Применение в малых дозировках вызывает диссоциативное действие на психику человека подобно некоторым наркотическим средствам (фенциклидин) (Бушуев Е.С., 2002 г.).

Флуоксетин - антидепрессант третьего поколения, используется для лечения депрессивных расстройств и шизофрении, чаще всего в сочетании с коаксилом, амитриптилином, грандаксином. Зафиксированы отравления флуоксетином (Wong D.T., 2005 г.).

Сиднокарб - стимулятор центральной нервной системы, широко применяется в психиатрической практике. Относится к допинговым препаратам, не рекомендован для применения в спорте (Веселовская Н.В., 2000 г.).

Резкое увеличение незаконного оборота наркотических веществ в последние годы вызвало активное использование мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба больными наркоманией для усиления состояния наркотического опьянения и облегчения проявлений абстинентного синдрома.

По данным Алтайского краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы за последние пять лет на территории края был зарегистрирован ряд случаев смертельного отравления кетамином, в том числе и в сочетании с производными барбитуровой кислоты. Отмечены случаи обнаружения

мвдокалма, свднокарба и флуоксетина в ходе токсикологического мониторинга (Воронкова Л.Г., 2007 г.).

Применение мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба в медицинской практике, использование в качестве наркогенов и случаи передозировок определяют их важное токсикологическое значение. Однако, в доступной литературе не обнаружено методик химико-токсикологического анализа данных препаратов. Использование общепринятых методов изолирования (Васильевой A.A., Стаса-Отго, ацетонового) приводит к низким выходам определяемых веществ (Карташов В.А., 2002 г.).

Разработанные методики идентификации и количественного анализа исследуемых производных фенилалкилмина различными физико-химическими методами не адаптированы к условиям практического химико-токсикологического анализа.

Не разработаны методики обнаружения мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба при совместном присутствии с другими лекарственными препаратами (дифенилгидрамином, производными фенотиазина и т.п.), нет данных о сохраняемости изучаемых веществ при гнилостном разложении биологического материала.

Анализ литературных данных и результатов практических экспертиз выявил необходимость разработки методик химико-токсикологического анализа мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба.

Цель исследования Разработка методик химико-токсикологического анализа мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба в биологических жидкостях и тканях внутренних органов.

Задачи исследования:

1. Определить влияние основных факторов на процесс экстрагирования мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба из водных растворов.

2. Разработать методики изолирования мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба из биологических жидкостей (кровь, моча) и тканей внутренних органов.

-53. Подобрать оптимальные условия очистки методом ТСХ.

4. Изучить спектральные характеристики исследуемых веществ методами прямой и дифференциальной спектрофотометрии в УФ области.

5. Разработать скршшговые и индивидуальные методики идентификации мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба методом ТСХ.

6. Определить условия разделения кетамина, сиднокарба, флуоксетина и мидокалма методом ГЖХ с использованием насадочных и капиллярной колонок для идентификации и количественного анализа. Определить основные показатели валидации разработанной методики.

7. Модифицировать методики идентификации и количественного анализа мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба методом изократической и градиентной ВЭЖХ. Определить основные показатели валидации разработанной методики.

8. Разработать схему анализа трупного материала в случаях комбинированных отравлений изучаемыми веществами в сочетании с дифенилгидрамином, прометазином, амитриптилином, тиопенталом.

9. Изучить сохраняемость кетамина, сиднокарба, флуоксетина и мидокалма в трупном материале и установить оптимальные условия и сроки хранения биологических образцов.

Научная новизна работы. Изучено влияние основных факторов на экстрагирование мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба из водной среды.

Разработаны методики изолирования исследуемых веществ из крови, мочи и тканей внутренних органов (печень). Установлен более высокий выход исследуемых веществ при использовании разработанных методик изолирования по сравнению с общепринятыми методами (Васильевой А.А., ацетоновым).

Определены оптимальные условия для идентификации и количественного определения мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба в извлечениях из биологического материала различными физико-химическими методами

анализа: тонкослойная, газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография, спектрофотометр™ в УФ области.

Показана возможность использования разработанной методики химико-токсикологического анализа для исследования случаев комбинированных отравлений изучаемыми веществами в сочетании с дифенилгидрамином, прометазином, амитриптилином, тиопенталом.

Изучена сохраняемость мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба при гнилостном разложении трупного материала и установлены оптимальные условия и сроки хранения биологических образцов.

Практическая значимость работы. Разработаны методики идентификации и количественного определения мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба в извлечениях из крови, мочи и тканей внутренних органов с применением различных физико-химических методов анализа (ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ, СФМ-УФ), которые могут применяться в судебно-химических лабораториях с целью лабораторной диагностики отравлений и в учебном процессе студентов, обучающихся по специальности «Фармация» при освоении дисциплины «Токсикологическая химия».

Степень внедрения. На основании проведенных исследований разработаны методические рекомендации, основные положения которых апробированы в судебно-химических лабораториях Алтайского краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 28.05.2007 г.), Новосибирского областного Бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 13.07.2007 г.), Санкт-Петербургского городского Бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 29.08.2007 г.).

Разработан проект информационного письма «Об определении мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба в трупном материале».

Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедры фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии ГЪОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет»

Минздравсоцразвития России и кафедры токсикологической химии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»

Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы обсуждены на научно-практических конференциях «Молодежь Барнаулу» (Барнаул, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.), «Актуальные проблемы судебной медицины и экспертной практики» (Барнаул, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.), «Наука о человеке» (Томск, 2005 г.), «Аналитические методы и приборы для химического анализа» (Санкт-Петербург, 2007 г.), на региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Состояние, перспективы судебно-токсикологической службы и научных исследований» (Харьков, 2005 г.), российской научно-практической конференции (с международным участием) «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 177 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, собственных исследований (3 главы), выводов, списка литературы, включающего 152 источника, из них 51- на иностранных языках, приложений. Работа иллюстрирована 54 таблицами и 37 рисунками.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследований, показана новизна и практическая значимость проведенных исследований, основные положения, выносимые на защиту.

Первая глава содержит обзор отечественной и зарубежной литературы, отражает современное состояние исследований в области фармакологии, токсикологии, химико-токсикологического анализа некоторых производных фенилалкиламина (мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба).

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.

В третьей главе приведены результаты изучения влияния основных факторов на экстрагирование исследуемых веществ и разработки методик

изолирования мвдокалма, кетамина, флуоксетина, сиднокарба из биологических жидкостей (крови, мочи) и тканей внутренних органов (печень), определены условия очистки полученных извлечений методом ТСХ, позволяющие свести к минимуму потери выделяемых веществ.

В четвертой главе изложены результаты исследования спектральных характеристик мидокалма, кетамина, флуоксетина, сиднокарба. Установлены хроматографические характеристики и выбраны оптимальные условия разделения, идентификации и количественного анализа методами ГЖХ и ВЭЖХ. Представлены модифицированные методики скрининговой и индивидуальной идентификации методом ТСХ. Определены основные показатели валидации разработанной методики химико-токсикологического анализа.

В пятой главе показаны возможности применения разработанной методики химико-токсикологического анализа мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба для решения различных научных и практических задач. Доказана эффективность использования разработанной методики исследования внутренних органов лабораторных животных (крыс) после однократного и многократного введения изучаемых веществ. Результаты апробированы для исследования практических экспертных случаев. Представлены схема и алгоритм исследования случаев комбинированных отравлений изучаемыми веществами в сочетании с дифенилгидрамином, прометазином, амитрштгилином и тиопенгалом. Изучены степени разложения (сохраняемость) мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба при гнилостном разложении трупного материала, выявлены оптимальные условия и сроки хранения биологических образцов.

В приложениях представлены данные спектральных и хроматографических характеристик мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба, результаты квантово-химических исследований молекул, проект информационного письма, документы, подтверждающие внедрение результатов диссертационной работы. .

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации, заключается в том, что автор является инициатором, основным исполнителем исследований и написания публикаций по теме диссертации. При выполнении работы автор освоил и самостоятельно выполнил все используемые методики исследования, квантово-химические расчеты и статистическую обработку данных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, три из которых в журналах, рекомендуемых ВАК.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом основных научных исследований ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России (номер государственной регистрации 01200600351).

Экспериментальное исследование по теме диссертации выполнялось на базе Алтайского государственного медицинского университета на кафедре фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии и Алтайского краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы.

Основные положения, выносимые на защиту:

-результаты разработки методик химико-токсикологического анализа кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в биологических жидкостях и тканях внутренних органов;

-схема исследования случаев комбинированных отравлений изучаемыми веществами в сочетании с дифенилгидрамином, прометазином, амитриптилином, тиопенталом.

-результаты изучения сохраняемости мидокалма, флуоксетина, сиднокарба и кетамина при гнилостном разложении трупного материала

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали растворы кетамина гидрохлорида, мидокалма, флуоксетина гидрохлорида и сиднокарба, «модельные смеси», внутренние органы лабораторных животных (крыс) и экспертный материал.

Определение оптимальных условий изолирования проводили с использованием «модельных смесей»: измельченные ткани печени, цельная кровь или моча трупов с определенным количеством добавленного исследуемого вещества (Карташов В.А., 1989).

Контрольные опыты применяли для каждой серии экспериментов с применением «модельных смесей» без добавления исследуемых веществ.

Идентификацию и количественное определение кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в извлечениях из биологического материала осуществляли физико-химическими методами исследования: ТСХ, ВЭЖХ («Милихром А-02»), ГЖХ («Кристалл-2000» с ДИП), СФМ-УФ («Бресогс!-40М»),

Апробацию разработанной методики химико-токсикологического анализа кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба проводили с использованием экспертного материала и крыс обоего пола массой 150-200 г, при однократном и многократном введении исследуемых веществ.

Схему химико-токсикологического исследования случаев комбинированных отравлений изучаемыми веществами в сочетании с дифенилгидрамином, прометазином, амитрипгилином и тиопенталом разработали с использованием «модельных смесей» и экспертного материала.

Изучение сохраняемости кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в трупном материале проводили с использованием «модельных смесей».

Для квантово-химических расчетов показателей энергии низшей свободной молекулярной орбитали (НСМО), коэффициента распределения в системе октанол-вода (1с^Р), моделирования геометрии и ЗБ структуры

изучаемых препаратов применили компьютерную программу HyperChem Pro 6.0 (метод АМ-1), для определения показателя константы кислотности (рКа) программу ACD/pKa v4.03.

Разработка методик изолирования и очистки кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба

Для разработки методик изолирования кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба изучили влияние основных факторов на экстрагирование токсического вещества в системе органический растворитель - вода: природа растворителя, значение рН среды, введение электролита. Количественное определение проводили с использованием методов ВЭЖХ (кетамин, мидокалм и флуоксетин) и дифференциальной спектрофотометрии в УФ области (сиднокарб).

Приближенный теоретический расчет значений указанных факторов для изучаемых препаратов произвели с использованием показателей: энергия НСМО, коэффициент распределения в системе октанол - вода, показатель константы кислотности (табл. 1).

Таблица 1

Влияние основных факторов на экстрагирование исследуемых производных

фенил алкил амина

Вещество Факторы экстрагирования

Экетрагент (степень экстракции, %) Значение рН

Расчетный Эксперимент Расчетный Эксп.

Флуоксетин Экстрагенты с НСМОО и низким значением LogP (эфир диэтиловый) Углерод четыреххлористый (64%) 8,5-10,5 8,0-10,0

Сиднокарб Эфир диэтиловый (33%) Углерод четыреххлористый (36%) Не опр. 3,0-3,5; 8,0-8,5

Мидокалм Экстрагенты с НСМОсО и низким значением LogP (хлороформ, бензол, углерод четыреххлористый) Хлороформ (95%) Углерод четыреххлористый (87%) 9,0-11,0 9,0-10,0

Кетамин Хлороформ (97%) Бензол (93%) 6,5-8,5 8,5-9,5

Оптимальные условия экстракции мидокалма из водной среды: рН=9,0 -10,0; экстрагенты - хлороформ, углерод четыреххлор истый (степень экстракции составила 95% и 87% соответственно), кетамина: рН= 8,5 - 9,5, экстрагенты - хлороформ, бензол (97% и 93% соответственно), флуоксетина: рН=8,0 -10,0, экстрагенг - углерод четырех-хлористый (64%).

Сиднокарб имеет два интервала значений рН экстрагирования: 3,0 - 4,0 и 8,0 - 10,0, что можно объяснить наличием двух таутомерных форм сиднониминового цикла, устойчивого в кислой среде и раскрывающегося при увеличении значения рН. Максимально сиднокарб экстрагируется из водной среды при рН=3,0; экстрагент - эфир диэтиловый (степень экстракции 33%), при рН=8,0; углерод четыреххлористый - 36%.

Добавление электролита (натрия хлорида) приводит к увеличению выхода кетамина, мидокалма и флуоксетина на 15-20%, выход сиднокарба уменьшается на 10%.

Разработали методику изолирования исследуемых веществ из мочи при совместном присутствии (рис. 1).

Биологическая жидкость (моча, кровь)

I

Разрушение комплексов белок- исследуемое вещество пои добавлении ацетонипзила

I

>■ Для крови

Экстракция гексаном (очистка от липидов и порфиринов)

рН=2,0 (НС1, 10%)

Экстракция эфиром диэтиловым (очистка от примесей кислотного характера)

рН= 8,5 (натрия карбонат)

Двухкратная экстракция углеродом четыреххлористым

рН=10,0 (N№011, 25%) натрия хлорид_

>. Объединяли и исследовали

Последовательная экстракция хлороформом и эфиром диэтиловым

Рис.1 Схема изолирования исследуемых веществ из биологических жидкостей

Таблица 2

Выход исследуемых веществ из крови и мочи при использовании разработанной методики

Вещество Выход, % (п=5; Р=95%; 1р=2,78)

Кровь Моча

Хер ±АХ $Хср Е, % Хср+ДХ ^Хср Е, %

Мвдокалм 79,82±3,27 1,6664 2,11 93,75+3,51 1,6153 1,67

Кетамин 71,68+3,09 1,3826 1,93 95,24±2,31 1,0312 1,08

Флуоксетин 38,12±3,55 1,5889 4,17 55,00+2,78 1,2433 2,26

Сиднокарб 19,50+1,26 1,3619 2,68 23,77+1,90 0,8478 3,57

Разработанная методика изолирования из мочи обеспечивает высокие значения выхода мидокалма (94%), кетамина (95%) и флуоксетина (55%).

Сиднокарб при использовании данной методики извлекается менее 30%, поэтому осуществили разработку частной методики изолирования, которая включает последовательную экстракцию эфиром диэтиловым при рН=3,0 и 10,0, углеродом четыреххлористым при рН=8,0. Очистку от примесей кислотного характера не проводили, точные значения рН установили по глициновому буферу. Выход сиднокарба составил 44,36%±2,51% (8Хср =1,0412; Е=2,51%).

При исследовании крови разработанной методикой дополнительно проводили разрушение комплексов «белок - определяемое вещество» добавлением ацетонитрила с последующей очисткой гексаном (табл 2).

Для изолирования исследуемых производных фенил ал кил амина из тканей внутренних органов (печени) в качестве экстрагенгов по общепринятым методикам изучали растворители различной природы: раствор кислоты щавелевой 0,1%, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л.; гексан, хлороформ, эфир диэтиловый; спирт этиловый 96%, ацетон, ацетонитрил и смесь ацетон - спирт этиловый 96% (1:1). Кроме того, исследовали влияние на выход кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба значение рН среды экстрагента и кратности экстракции.

Установили, что максимальный выход из биологического материала достигается при использовании трехкратной экстракции ацетонитрилом (рН=7,0) мидокалма - 71%, кетамин - 50%, флуоксетин - 41%, сиднокарб- 25%.

Рис.2. Схема изолирования исследуемых веществ го тканей внутренних органов

На основании полученных данных разработали методику изолирования кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба из тканей внутренних органов при совместном присутствии (рис. 2).

Выход кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба из тканей внутренних органов определили с использованием «модельных смесей», в качестве сравнения использовали общепринятые методы изолирования Васильевой А.А., ацетоновый (по Карташову В.А.). Кислые и щелочные извлечения очищали методом ТСХ на пластинках «БогЬШ» (элюент - спирт этиловый 96%) и исследовали отдельно. Количественное определение проводили методом ВЭЖХ (табл. 3).

Установшш, что разработанная методика изолирования из тканей внутренних органов обеспечивает более высокий суммарный выход мидокалма (85%), кетамина (60%), флуоксетина (35%), сиднокарба (38%), чем по методу Васильевой А.А.: мидокалм - 29%, кетамин - 12%, сиднокарб - 12%, флуоксетин - менее 5%; по ацетоновому методу: мидокалм - 41%, кетамин -26%, флуоксетин - 21%, сиднокарб - 37%.

Таблица 3

Выход исследуемых веществ из печени при использовании разработанной

методики

Вещество Выход, % (п=5; Р=95%; гр=2,78)

Кислое извлечение Щелочное извлечение Суммарный

Хср±ДХ 5хср Е, % Хср+ДХ $Хср Е, %

Мидокалм 15,9011,69 0,7563 4,76 69,44±3,42 1,5293 2,20 84,60±3,69

Кетамин Менее 5% - - 59,20±3,12 1,3955 2,36 62,32±3,12

Флуоксетин 10,56±2,31 1,0312 6,77 24,9612,90 1,2968 5,02 35,42+2,64

Сиднокарб 18,06+2,10 0,9405 5,21 22,63±2,25 1,0065 3,45 37,33±2,98

Таким образом, в ходе проведенных исследований разработали методики изолирования и очистки мидокалма. кетамина, флуоксетина и сиднокарба из биологических жидкостей и тканей внутренних органов.

Оптимизация условий идентификации и количественного определения исследуемых веществ в извлечениях из биологических

объектов

Для идентификации производных фенилалкиламина в извлечениях из биологических объектов применили: ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ, спектрофотометрию в УФ - области.

Определили условия оптимального разделения мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба методом ТСХ, использовали системы растворителей: спирт н-бутиловый, хлороформ - ацетон (7:3) и спирт н-бутиловый - эфир диэтиловый (8:2). Хроматограммы обрабатывали реактивами Драгендорфа (по Мунье), Бушарда, раствором нингидрина в спирте

н-бутиловом 1%, раствором калия йодплатината 5%, раствором натрия нитропруссида 5%.

Для идентификации методом СФМ-УФ рассчитали и экспериментально изучили спектральные характеристики кетамина, сиднокарба, флуоксетина и мидокалма в УФ-области.

Расчет спектральных характеристик (длина волны максимума поглощения, интенсивность, дипольные моменты основного и возбужденного состояния молекулы) произвели с использованием метода ZINDO/S.

Максимумы поглощения оптической плотности в растворе кислоты хлороводородной 0,1 моль/л (рН=2,0) составили: мидокалм - 264 нм, флуоксетин - 228, 266 и 277 нм, кетамин - 272 и 279 нм, сиднокарб - 235 и 294 нм, что в целом совпадает с данными полученных расчетов.

Выявили зависимость спектральной характеристики сиднокарба от значения рН среды: при изменении рН от 2,0 до 10,0 максимумы поглощения оптической плотности смещаются от 235 и 295 нм до 253 и 334 нм соответственно. Поэтому для исследования сиднокарба применили метод дифференциальной спектрофотометрии.

Установили сольватохромные эффекты мидокалма и флуоксетина, которые являются их дополнительным идентифицирующим признаком. Для мидокалма максимум поглощения при изменении полярности среды от раствора кислоты хлористоводородной 0,1 моль/л до спирта этилового или ацетонитрила смещается от 264 до 257-258 нм, оптическая плотность при этом уменьшается в 0,6-0,8 раз; для флуоксетина - увеличивается в 1,2-1,5 раза, длина волны максимума поглощения при этом не изменяется.

Для качественного анализа методом ГЖХ использовали хроматограф «Кристалл-2000», капиллярную кварцевую колонку (25 м, 0,25 мм) с привитой фазой SE-30 и насадочные стальные колонки (2 м *4 мм) с пятью сорбентами различной полярности, изготовленные по общепринятым методикам. Идентификацию проводили по абсолютному и относительному времени удерживания исследуемых веществ (внутренний стандарт- фенацетин).

Установили, что оптимальное разделение пиков исследуемых веществ и внутреннего стандарта достигается при условиях хроматографирования: насадочные колонки НЖФ 5% Apieson-L и 5% ХЕ-60, режим программирования: температура колонки от 150 до 220°С, газ-носитель (азот) -30 мл/мин.; капиллярная колонка - режим программирования температуры колонки от 170 до 210°С, газ-носитель (азот) - 1,0мл/мин., деление потока 1:100.

Для ВЭЖХ использовали обращенофазную хроматографию на хроматографе «Милихром-А02» в изократическом и градиентном режимах с использованием колонки "Prontosil-120-5-C18" (75 мм/2мм). Идентификацию проводили по показателям объема удерживания (абсолютный и относительный), спектральным отношениям и спектральным углам (внутренний стандарт - новокаин). Для дополнительной идентификации использовали базу данных «БД-2003-350».

Выявили, что оптимальное разделение мидокалма, кетамина, флуоксетина, сиднокарба и внутреннего стандарта (новокаина) происходит при применении следующих условий хроматографирования: изократический режим - раствор лития перхлората 0,2 моль/л в водном растворе кислоты хлорной 0,05моль/л -ацетонитрил - спирт метиловый (10:7:3). Градиентный режим - элюент А: раствор кислоты трифторуксусной водный 0,1%., элюент Б: ацетонитрил -спирт метиловый (1: 1).

Далее провели определение основных показателей валидации для разработанной методики химико-токсикологического анализа (предел обнаружения, предел количественного определения, специфичность, прецизионность). Количественное определение исследуемых веществ в извлечениях из мочи и печени осуществляли методом ГЖХ, ВЭЖХ и спектрофотометрии в УФ области спектра, для идентификации кроме того использовали ТСХ.

Установили, что предел обнаружения для идентификации мидокалма и кетамина при использовании наиболее чувствительных методов (ВЭЖХ и ТСХ)

составляет: в моче - 30 мкг, а в печени - 50 мкг, для флуоксетина и сиднокарба 50 и 100 мкг соответственно (на 100 г исследуемого биологического объекта).

Предел количественного определения мидокалма и кетамина в моче составляет - 50 мкг, в печени - 100 мкг; флуоксетина и сиднокарба 50 и 150 мкг соответственно (на 100 г исследуемого биологического объекта) (табл. 4).

Таблица 4

Предел количественного определения исследуемых веществ

(мкг препарата на 100 г объекта).

Вещество СФМ ГЖХ ВЭЖХ

Хер ±ДХ | Е, % Хер ±ДХ | Е, % Хер +ДХ | Е, %

Биологические жидкости (моча)

Мидокалм 50,13±5,76 11,48 97,56±5,16 5,28 48,46±4,55 9,39

Кетамин - - 99,12+7,51 7,58 51,43±3,90 7,59

Сиднокарб 150,82+9,64 6,39 - - 52,5415,64 9,76

Флуоксетин 156,66+31,66 20,21 - - 54,36+5,88 10,22

Внутренние органы (печень)

Мидокалм 100,91+8,18 8,10 152,53+9,32 6,31 99,93+5,09 5,08

Кетамин - - 147,64114,62 9,90 101,56+5,19 5,11

Сиднокарб 217,16+17,52 8,06 - - 145,75+10,58 7,26

Флуоксетин 192,64+45,96 23,86 - - 160,08116,58 10,36

При использовании метода ВЭЖХ при определения минимально открываемых концентраций исследуемых веществ погрешность составила от 5 до 9%, СФМ - от 5 до 8%, ГЖХ - от 6 до 9%. В среднем прецизионность методики при использовании указанных методов составляет от 2 до 6%.

Использование метода СФМ для количественного определения флуоксетина нецелесообразно в связи с высокой погрешностью определения (более 20%).

При сравнении полученных результатов с результатами исследования контрольных опытов без добавления исследуемых веществ методами ГЖХ и ВЭЖХ доказана высокая специфичность разработанной методики химико-токсикологического анализа мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба.

Разработка схемы исследования случаев комбинированных отравлений

При применении разработанной методики для исследований практических экспертных случаев выявили отравления кетамином, мидокалмом, флуоксетином и сиднокарбом в сочетании с другими широко распространенными лекарственными препаратами: дифенилгидрамин (метаболит - бензгидрол), прометазин (метаболит - сульфоксид прометазина), тиопентал, амитриптилин.

С помощью «модельных смесей» установили, что разработанные методики позволяют изолировать перечисленные лекарственные вещества из тканей внутренних органов (печень). Выход тиопентала составил 65%, прометазина 70%, сульфоксида прометазина 60%, дифенилгидрамина 50%, бензгидрола 30%, амитрипгилина 80%.

Предлагаемая схема исследования комбинированных отравлений с использованием методом ТСХ-скринига и ВЭЖХ с базой данных «БД-2003-350» представлена на рис. 3.

Рис. 3 Схема исследования случаев комбинированных отравлений

ТСХ-скрининг проводили по модифицированной методике Карташова В.А. на пластинках «БогЬШ» (метчики: хинин, аминазин, амидопирин, дибазол). После определения хроматографической группы (подгруппы) идентифицируемых веществ изучали результаты подтверждающих качественных реакций.

Дальнейшую идентификацию и количественный анализ осуществляли методом ВЭЖХ с использованием базы данных «БД-2003-350».

Исследование сохраняемости кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в биологическом материале.

Важное значение для проведения химико-токсикологического анализа имеет сохраняемость токсических веществ в биологическом материале.

Сохраняемость мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба в тканях печени определяли при хранении образцов в различных условиях: одна серия сохранялась при комнатной температуре (от +20 до +24°С) без консервации, другая - при комнатной температуре с добавление спирта этилового 96% в соотношении 1:1, третья - при пониженной температуре (от -2,0 до +2,0°С) без консервации, четвертая - при пониженной температуре и добавлении спирта этилового 96% в соотношении 1:1.

100 -|-

90--

кетэмин мидокалм сиднокарб фпуоксетмн

Ш При хранении 30 суток и При хранении 90 суток

Рис. 4 Сохраняемость исследуемых веществ при использовании

оптимальных условий хранения

Установлено, что оптимальные условия хранения биологических образцов, содержапщх кетамин, флуоксетин и сиднокарб является пониже!шая температура (от -2,0 до +2,0°С), мидокалм - пониженная температура и консервация спиртом этиловым 96% (рис. 4).

Предельные сроки хранения образцов составляют: в случае содержания кетамина и мидокалма - 90 суток (сохраняемость 55% и 52% соответственно), флуоксетина - 30 суток (сохраняемость 80%). Полное разложение исследуемых веществ в биологических объектах наблюдается при хранении 180 суток.

Сиднокарб в биологическом материале подвергается разрушению при хранении образцов 30 суток (сохраняемость 22%), поэтому для повышения результативности химико-токсикологического исследования секционный материал необходимо направлять сразу после забора.

Общие ВЫВОДЫ:

1. Определено влияние основных факторов на экстрагирование исследуемых веществ из водных растворов: мидокалм и кетамин - рН= 9,0-10,0, экстрагент - хлороформ; флуоксетин - рН=6,0-8,0, экстрагент - углерод четыреххлористый; сиднокарб - рН=3,0-4,0, экстрагент - эфир диэтиловый и рН=8,0-10,0, экстрагенты углерод четыреххлористый и эфир диэтиловый соответственно.

2. Разработаны методики изолирования мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба из биологических жидкостей и тканей внутренних органов (печень), обеспечивающие суммарный выход кетамина - кровь - 72%, моча - 95%, печень - 59%; мидокалма: кровь - 80%, моча - 94%, печень - 86%; флуоксетина: кровь - 38%, моча - 55%, печень - 43%; сиднокарба: кровь - 20%, моча - 44%, печень -41%).

3. Подобраны оптимальные условия очистки методом ТСХ: на пластинах «Sorbfil», элюент - спирт этиловый 96%, обеспечивающие минимальные потери: кетамина - 22%, флуоксетина - 30%, сиднокарба - 27%, мидокалма - 20%.

-224. Изучены спектральные характеристики сиднокарба, кетамина, мидокалма, флуоксетина в УФ-области. Выявлена возможность использования дифференциального спектра для идентификации сиднокарба и сольватохромных эффектов для флуоксетина и мидокалма.

5. Разработаны методики идентификации исследуемых производных фенилалкилминов методом ТСХ при использовании в качестве подвижных фаз: спирт н-бутиловый, хлороформ - ацетон (7:3) и спирт н-бутиловый - эфир диэтиловый (8:2) с использованием реактивов Драгендорфа, Бушарда, раствора нингидрина в спирте н-бутиловом 1%, раствора калия йодплатината 5%, раствора натрия нитропруссида 5%.

6. Определены оптимальные условия разделения кетамина и мидокалма методом ГЖХ, позволяющие проводить их идентификацию и количественное определение в биологических объектах: программирование температуры, капиллярная колонка с привитой НЖФ 8Е-30. Пределы обнаружения 100 мкг в 100 мл биологической жидкости и 150 мкг в 100 г внутренних органов соотвественно, доказана высокая прецензионность и специфичность разработанной методики.

7. Подобраны оптимальные условия для проведения идентификации и количественного определения кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в извлечениях из биологических объектов методом ВЭЖХ: градиентный режим, обращенно - фазная колонка. Установлены пределы обнаружения: мидокалм и кетамин 30 мкг в 100 мл биологической жидкости и 50 мкг в 100 г внутренних органов; флуоксетин и сиднокарб- 50 и 100 ми-соответственно, доказана высокая прецизионность и специфичность разработанной методики.

8. Предложена схема анализа трупного материала в случаях комбинированных отравлений мидокалмом, кетамином, флуоксетином и сиднокарбом с амитриптилином, дифенилгидрамином, прометазином и тиопенталом, включающий в себя изолирование, ТСХ и ВЭЖХ скрининг.

Установлены значения выходов веществ из тканей печени при использовании разработанной методики.

9. Изучена сохраняемость кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в трупном материале. Установлены оптимальные условия хранения экспертного материала: температура холодильной камеры от -2,0 до +2,0°С и спирт этиловым 96% в качестве консерванта.

Установлены максимальные сроки хранения образцов биологического материала: для определения кетамина и мидокалма - 90 суток, флуоксетина - 30 суток. Исследование сиднокарба необходимо проводить непосредственно после забора образцов.

В заключение благодарим заведующую химическим отделением Алтайского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы Воронкову Л.Г. и ведущего эксперта Царева В.И. за помощь и сотрудничество при проведении экспериментальных исследований.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Исследование сиднокарба в химико-токсикологическом отношении// Актуальные вопросы судебной и клинической медицины- Барнаул,

2003.-С.34-35 (соавт. Воронкова Л.Г.)

2. Разработка оптимальной методики химико-токсикологического анализа сиднокарба // Молодежь - Барнаулу 2003. Материалы научно-практической конференции. -Барнаул, 2003,- С 47 (соавт. Федосеева Л.М.)

3. О возможности применения классических методик изолирования в химико-токсикологическом анализе сиднокарба // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. -Пятигорск, 2004. - Вып. 59. - С. 170-172 (соавт. Федосеева Л.М.)

4. Поиск оптимальных условий изолирования сиднокарба // Молодежь - Барнаулу 2004. Материалы научно-практической конференции. -Барнаул,

2004,- С. 195-196 (соавт. Федосеева Л.М.)

-245. Модификация метода ТСХ-скрининга ядовитых и сильнодействующих азотсодержащих органических оснований // VI конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» - Томск, 2005. - С. 94 (соавт. Федосеева JI.M.)

6. Разработка комплексного химико-токсикологического анализа мидокалма // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики-Барнаул, 2005,- С.211-215

7. Изучение спектральных характеристик препаратов-производных фенилалкиламина (сиднокарба, кетамина, мидокалма) // Молодежь - Барнаулу 2005. Материалы научно-практической конференции. -Барнаул, 2005,- С 23. (соавт. Федосеева JI.M.)

8. Анализ препаратов группы фенилалкиламинов методом тонкослойной хроматографии // «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов». - Пятигорск, 2005. -Вып. 60. - С.226-228 (соавт. Федосеева JI.M.)

9. Разработка методики идентификации некоторых препаратов-производных фенилалкиламина в условиях химико-токсикологического анализа // Приоритеты фармацевтической науки и практики: Материалы заочной международной конференции- Москва, 2006,- С-261-263 (соавт. Федосеева JI.M.)

10. Выбор оптимально экстрагента мидокалма из биологического материала // Материалы национальной научно-практической конференции с международным участием: «Состояние, перспективы судебно-токсикологической службы и научных исследований» -Харков, 2006,- С 48 (соавт. Федосеева JI.M.)

11. Опыт использования базы данных «БД-2003-250» на жидкостных хроматографах «Милихром-А02» при судебно-химических исследованиях // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики-Новосибирск-Красноярск, 2007,- С 46-51 (соавт. Заздравных H.A.)

-2512. Химико-токсикологический анализ кетамина // Фармация. - 2007. -№ 8. - С. 6-9. (соавт. Федосеева Л.М.)*

13. Анализ использования метода ВЭЖХ на хроматографах «Милихром А-02» в химико-токсикологическом анализе.// Аналитические методы и приборы для химического анализа- Санкт-Петербург, 2007.- С 17-23 (соавт. Воронкова Л.Г.)

14. Химико-токсикологический анализ препарата флуоксетин // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008,- № 4- С. 31 - 35 (соавт. Воронкова Л.Г.)*

15. Разработка методики изолирования кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба // Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа -Пермь, 2009.-С. 57-59 (соавт. Федосеева Л.М.)

16. Определение кетамина и флуоксетина в сочетании с лекарственными препаратами //Фармация. - 2011. - № 7. - С. 8 - 10. (соавт. Федосеева Л.М.)*

Казарцев Илья Александрович (Россия)

Химико-токсикологический анализ некоторых производных фенилалкиламина (мидокалма, кетамина, флуоксетина и сиднокарба).

В результате проведенных исследований определены условия изолирования кетамина, сиднокарба. флуоксетина и мидокалма из биологических жидкостей и тканей внутренних органов. Установлены оптимальные условия разделения, способы детектирования и количественного определения кетамина, мидокалма, флуоксетина и сиднокарба в извлечениях из биологического материала различными физико-химическими методами анализа. Проведена валидация разработанной методики, определены показатели: пределы обнаружения и количественного определения в 100 г биологического объекта, сходимость результатов (прецизионность), правильность. Показана возможность использования разработанной методики химико-токсикологического анализа для решения различных научных и практических задач, в частности для изучения сохраняемости мидокалма. флуоксетина, сиднокарба и кетамина при гнилостном разложении трупного материала.

Kazarcev Ilia (Россия).

Analytical toxicology of some derivatives phenylalkylamines (mydocalm, ketamine, fluoxetine and sydnocarb).

In the result of the research defined the conditions of isolation mydocalm, ketamine, fluoxetine and sydnocarb of biological fluids and tissues of internal organs. Optimum conditions of separation, methods of quantative and quantitative determination of mydocalm, ketamine, fluoxetine and sydnocarb in extracts from biological material of different physical-chemical methods of analysis. Carried out the validation of the developed method, defined indicators: the limits of detection and quantification in 100 g of a biological object, the convergence of the results, the accuracy. The possibility of use of the developed methods of analytical toxicology for the solution of various scientific and practical tasks, in particular for the study of the preservation of mydocalm, ketamine, fluoxetine and sydnocarb at putrid the decomposition of the corpse of the material.

Подписано в печать 28.11.2011. Формат 60x84 1/16. Печать - цифровая. Усл.п.л. 1,63. Тираж 100 экз. Заказ 2011 - 762

Отпечатано в типографии АлтГТУ, 656038, г. Барнаул, пр-т Ленина, 46 тел.: (8-3852) 29-09-48

Лицензия на полиграфическую деятельность ПЛД №28-35 от 15.07.97 г.