Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологический анализ парацетамола и его основного метаболита n-аминофенола

На правах рукописи

КОЗЛОВА ВИКТОРИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПАРАЦЕТАМОЛА И ЕГО ОСНОВНОГО МЕТАБОЛИТА

П-АМИНОФЕНОЛА

15.00.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск-2004

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ПЯТИГОРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор фармацевтических наук, профессор Компанцева Евгения Владимировна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, профессор Маршалкин Михаил Федорович доктор фармацевтических наук, доцент Лазарян Джоник Седракович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Курский государственный медицинский университет

Защита состоится "_"_2004 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 при Пятигорской государственной фармацевтической академии (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорской государственной фармацевтической академии

Автореферат разослан.

3004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор фармацевтических наук, профессор

Э.Ф. Степанова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Среди большого арсенала лекарственных препаратов, обладающих анальгезирующим и жаропонижающим действием, важное место занимает парацетамол. Наиболее часто он используется в детской практике. Особый интерес для проведения судебно-химической экспертизы представляют вопросы превращения лекарственных веществ. Парацетамол в организме претерпевает изменения с образованием ряда метаболитов, одним из которых является очень токсичное вещество п-аминофенол.

Наряду с терапевтическим эффектом при передозировках парацетамол оказывает побочное и токсическое действие на организм. В судебно-химической практике известны случаи острых отравлений парацетамолом. Широкое применение в медицинской практике, токсическое действие при передозировках и смертельные случаи придают этому лекарственному веществу определенное токсикологическое значение. Несомненно, что возможность определения одного из метаболитов лекарственного вещества в трупном материале расширит границы судебно-медицинской экспертизы и позволит судебно-следственным органам иметь более веские доказательства при решении вопроса об отравлении. Разработанные методики определения парацетамола в биологических жидкостях не применимы при общем ходе химико-токсикологического анализа биологического объекта на лекарственные препараты. Не изучены оптимальные условия извлечения из водных растворов ^аминофенола, что не позволяет сделать выбор наиболее подходящих растворителей для экстракции изучаемого лекарственного вещества и его основного метаболита ^аминофенола из вытяжек и для очистки парацетамола после выделения из биологического материала. Не предложены частные методики изолирования, обнаружения и определения парацетамола в трупном материале. В доступной литературе не описаны методики обнаружения парацетамола и ^аминофенола при совместном присутствии, а также не определена чувствительность цветных реакций при обнаружении обоих веществ.

Отсутствуют данные о сохраняемости парацетамола при гнилостном разложении биологического материала, что очень важно при проведении судебно-химического анализа на наличие указанных веществ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методологического подхода к выделению, обнаружению, и определению парацетамола и ^аминофенола для проведения судебно-химических исследований с использованием современных физико-химических методов анализа.

Решение поставленной цели возможно с помощью следующих задач:

- найти оптимальные условия разделения и обнаружения парацетамола и п-аминофенола методами ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ;

- изучить оптимальные условия экстракции парацетамола и п-аминофенола из водных растворов органическими растворителями в зависимости от различных факторов;

- изучить возможность использования при анализе извлечений из печени на исследуемые вещества методов ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ;

- провести сравнительное изучение по выделению парацетамола и п-аминофенола из печени общепринятыми судебно-химическими методами изолирования;

- предложить схему и методологический подход к анализу трупного материала на парацетамол и п-аминофенол;

- изучить сохраняемость парацетамола и его основного метаболита при гнилостном разложении печени трупов.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена по плану научно исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации № 01960009199) и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 38.

Научная новизна работы На основе сравнительной оценки результатов исследований

- найдены оптимальные условия разделения и способы детектирования парацетамола и ^аминофенола с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ);

- разработаны условия разделения и обнаружения и количественного определения парацетамола и ^аминофенола с помощью методов газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Предел обнаружения ГЖХ методом 0,1 мг парацетамола и 0,05 мг п-аминофенола, ВЭЖХ методом 2,3 мкг/мл парацетамола, 30 мкг/мл п-аминофенола;

- изучены условия экстракции парацетамола и ^аминофенола из водных растворов органическими растворителями, показано, что максимум экстракции парацетамола наблюдается при рН 1-7 эфиром без электролитов, п-аминофенол экстрагируется при рН 5-7 этилацетатом в присутствии электролитов;

- научно обоснована и разработана схема обнаружения, изолирования и определения парацетамола из трупного материала (печени), по нативному соединению и по продукту гидролиза парацетамола п - аминофенолу;

- впервые изучена сохраняемость парацетамола при гнилостном разложении трупного материала. Парацетамол и его метаболит п-аминофенол можно обнаружить в консервированной этанолом печени в концентрации 5 % и 24 % соответственно в течение двух лет.

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования.

Предложены методики идентификации и количественного определения парацетамола и ^аминофенола в вытяжках из биологического материала методами газожидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, полуколичественного определения методом тонкослойной хроматографии. Разработанные методики анализа парацетамола и п-аминофенола рекомендованы для использования в химико-токсикологических лабораториях с целью определения их подлинности и диагностики отравления. Методики

имеют ряд преимуществ: позволяют в одной пробе одновременно определять парацетамол и п-аминофенол.

Материалы внедрения. Предложенные методики апробированы и внедрены в практику судебно- химических лабораторий Краевого клинического Бюро судебно - медицинской экспертизы Ставропольского края и Бюро судебно -медицинской экспертизы Астраханской области. Составлено информационное письмо «Определение парацетамола в биологическом материале при проведении судебно-химического исследования», проект которого принят к рассмотрению в Российском центре судебно-медицинской экспертизы г. Москва (вх-№ 290 от 10.02.03).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 53 и 55 региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск, 1997,2000 гг.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Основные положения выносимые на защиту.

- результаты разработки методик обнаружения и количественного определения парацетамола и ^аминофенола при совместном присутствии;

- результаты разработки методик пробоподготовки, изолирования и очистки извлечений, содержащих парацетамол и ^аминофенол, из объектов биологического происхождения (печени трупа);

- способы обнаружения и количественного определения парацетамола и п-аминофенола в извлечениях из биологического материала (печени трупа);

- критерии сохраняемости парацетамола и ^аминофенола в трупном материале в зависимости от времени и условий хранения;

- схема и результаты выбора общего методологического подхода к анализу трупного материала, содержащего парацетамол.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах печатного текста, и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы. В диссертации приводится 14 рисунков и 41 таблица.

Библиографический указатель включает 137 источников, из них 78 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ 1. Разработка способов обнаружения парацетамола и п-аминофенола 1.1. Идентификация парацетамола и п-аминофенола методом ТСХ В работе использовали пластины "БогЬйЫ1У-254" отечественного производства, размерами 150 х150 мм. Хроматографическую подвижность исследуемых веществ изучали в 16 индивидуальных растворителях, двух-, трех-, и четырехкомпонентных системах кислого, нейтрального и основного характера, для каждой из которых рассчитывали значения ^ парацетамола и п-аминофенола, и коэффициент, характеризующий эффективность разделения. Выбор подвижных фаз основан на данных литературы и собственных экспериментальных исследованиях.

Для проявления пятен на хроматограммах применяли: реагенты, используемые в фармацевтическом и токсикологическом анализе. Наиболее чувствительными (1 мкг) оказались реактив Драгендорфа, 3% раствор железа (III) хлорида, 5% раствор калия перманганата в кислоте серной; Реакция образования азокрасителя с ^аминофенолом имеет высокий предел обнаружения (3-5 мкг). Парацетамол менее чувствителен к этой реакции (10 мкг) с р- нафтолом, а с N-a-нафтилэтилендиаминдихлоридом наблюдали самый низкий предел обнаружения из всех используемых реагентов (50 мкг).

Изучена хроматографическая подвижность п-аминофенола и 10 лекарственных веществ назначаемых совместно с парацетамолом. Хроматографирование проводили в тех подвижных фазах, в которых получено хорошее разделение веществ, а именно: хлороформ - бутанол- 25% р-р аммиака (70:40:5); бутанол - уксусная кислота - бензол - вода (2:2:10:1); хлороформ -диоксан - ацетон - 25%раствор аммиака (22,5:24:2,5:1,25); этилацетат-10%раствор гидроксида натрия- вода- 25% раствор аммиака (9:2,7:0,1:0,2). Пятна на хроматограммах проявляли последовательно 3% раствором железа (III) хлоридом и реактивом Драгендорфа. Отмечено, что в предлагаемых нами

системах растворителей можно надежно идентифицировать как парацетамол так и п-аминофенола, назначаемый в исследуемых веществах.

В выбранных условиях разделения разработана методика полуколичественного определения парацетамола и п-аминофенола. Для

определения веществ, идентифицированных методом тонкослойной хроматографии, предварительно строили калибровочные графики зависимости площади пятна от концентрации веществ в пробе. Прямая пропорциональная зависимость между площадью пятна от концентрации наблюдается в пределах 1 - б мкг для парацетамола и п-аминофенола. Ошибка определения составила ±14%.

1.2.Идентификация парацетамола и п-аминофеиола методом ГЖХ

Ввиду того, что парацетамол и п-аминофенол относятся к сильно полярным соединениям, использовали полярные жидкие фазы ОУ-1,ОУ-17. В качестве твердого носителя был выбран СЬгоша1:оп N-AW зернением 0,16 - 0,2мм (ЧСФР) с НЖФ-5% ОУ-17. В. качестве растворителя для приготовления модельных смесей использовали этилацетат из-за низкой чувствительности к нему пламенно-ионизационного детектора.

Целью наших исследований явилась унификация ранее разработанных методик 1"ЖХ-определения парацетамола и п-аминофенола. Исследования проводили на хроматографе Цвет-550 М и детекторе по ионизации пламени, на стеклянной колонке 1м х 0,2 см, заполненной СЬгоша1:оп зернением

0,16 х 0,2 мм с нанесенной жидкой фазой 5% ОУ-17. Нами подбирались условия, при которых наблюдается полное разделение пиков, без размытия хроматографических зон. В ходе эксперимента установлено, что оптимальными являются давление газа-носителя азота 1,5 кПа, скорость воздуха 250 мл/мин, водорода 25мл/мин, температура колонки 230°С. Разделение веществ осуществляли в изотермическом режиме. Полноту разделения пиков определяли по критерию разделения пиков компонентов модельной смеси В разработанных условиях определяли предел

обнаружения и линейный диапазон концентраций для парацетамола и п-аминофенола. Минимальный сигнал детекции с высотой пика 8 мм для парацетамола и п-аминофенола - соответствовал концентрации 0,1 мг/мл и 0,05 мг/мл соответственно. В ходе определения наблюдали линейность в диапазоне концентраций 0,2-1,5 мг/мл для парацетамола и 0,05-1,5 мг/мл для п-аминофенола.

Методику количественного определения разрабатывали, используя в качестве внутреннего стандарта анестезин. Модельные смеси растворов с различной концентрацией веществ хроматографировали в условиях, описанных выше в различных соотношениях. На рис. 1 представлена хроматограмма разделения модельной смеси. Результаты количественного определения отражены в табл. 2.

1.3. Идентификация парацетамола и п-аминофенола с помощью ВЭЖХ

В результате предварительно проведенных опытов для идентификации парацетамола и п-аминофенола выбраны следующие условия хроматографирования: колонка КАХ-6, заполненная сорбентом О^аэогЬ-Счб, детектор УФ-спектрофотометрический. Автоматический режим работы прибора, при длинах волн Л 240 (а), 270 (б) нм, в программе Echrom в

2 2

I

Т, мин

Рисунок I. - ГЖХ разделение модельной смеси: 1-п-аминофенол; 2-анестезин; 3-парацетамол

изократическом режиме элюирования, границы спектра 190-360 нм; скорость потока элюента 100 мкл/мин. Идентификацию парацетамола и п-аминофенола проводили по времени удерживания пиков на хроматограмме исследуемого раствора и смешанного стандарта (StS).

Рисунок 2. Разделение парацетамола и ^аминофенола при двухволновой детекции методом ВЭЖХ: ^-аминофенол; 2-парацетамол

Полученное значение критерия эффективности разделения для подвижной фазы ацетонитрил - фосфатный буфер рН 3 (30:70) больше единицы, что говорит о хорошем взаимодействии сорбат-сорбент (рис.2). Между пиками парацетамола и ^аминофенола наблюдается достаточная селективность разделения равная 1,5. Эффективность хроматографической колонки для парацетамола составляет 1600, для п-аминофенола 1800 теоретических тарелок. За минимальную высоту пика был принят сигнал (4мм), превышающий в 2 раза уровень флуктуации. Минимальная высота пика парацетамола ^=0.0030) соответствовала концентрации 29,55 мкг/мл. Минимальный детектируемый сигнал ^аминофенола ^-0.0032) соответствует 0.9136 мкг/мл. В результате проведенных исследований установлено, что в диапазоне рабочих концентраций от 1 до 200 мкг/мл при указанных длинах

воли для парацетамола наблюдается линейная зависимость величины площади пика от содержания вещества в пробе. Диапазон линейности для п-аминофенола варьирует в зависимости от длины волны, и соответствует концентрации от 1 до 1600 мкг/мл при Л 240 нм, от 1 до 1200 мкг/мл при Л 270 нм.

Найденные условия были использованы для количественного определения обоих веществ в модельных смесях. Содержание парацетамола и п-аминофенола в модельных смесях рассчитывали, используя рабочий стандартный образец (РСО). Полученные результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2. - Результаты количественного определения парацетамола и п-аминофенола при совместном присутствии методами ГЖХ и ВЭЖХ

Метрологические характеристики Парацетамол, г п -аминофенол, г

ГЖХ ВЭЖХ ГЖХ ВЭЖХ

X 0,02426 0,02466 0,02452 0,02490

а 0,00033 0,00028 0,00547 0,00037

Бх 0,00013 0,00012 0,00022 0,00015

АХ 0,00035 0,00030 0,00057 0,00039

1,4 1,2 2,3 1,6

Результаты определения парацетамола и п-аминофенола в модельной смеси методом ВЭЖХ не отягощены систематической ошибкой. Относительная ошибка результата определения по разработанной методике находится в пределах для парацетамола для п-аминофенола

2. Изучение условий экстракции парацетамола и п-аминофенола из водных растворов

При изучении оптимальных условий экстракции парацетамола применен экспериментальный метод. В качестве экстрагентов применяли: эфир, этилацетат, гексан, дихлорэтан, дихлорметан. Электролитами служили

натрия хлорид и аммония сульфат, добавленные к растворам в концентрации 5; 20% и до насыщения. Для создания необходимого значения рН (от 2 до 12) в работе использовалась универсальная буферная смесь Бриттона и Робинсона. Для создания среды, имеющей значение рН=1, применяли 0,1 М раствор

кислоты хлористоводородной. Количество выделенного парацетамола определяли спектрофотометрическим методом при X 240 нм, по калибровочному графику. Результаты исследований по экстракции парацетамола органическими растворителями представлены на рис.3.

О 5 10 15 Рн

Рисунок 3.- Зависимость экстракции парацетамола от природы органических растворителей и рН среды: 1-эфир; 2 -этилацетат; 3 -дихлорметан; 4 -хлороформ; 5 -дихлорэтан; 6 -гексан

Парацетамол экстрагируется всеми используемыми нами органическими растворителями из кислой, нейтральной и щелочной среды, в интервале рН 1,0-12,0. При однократной экстракции, наибольший выход парацетамола эфиром находится при рН 1,0-7,0 (66%); этилацетатом при рН 1,0-10,0 (60%). Наименьшие количества вещества экстрагируются гексаном при рН 12,0 (менее 3%), дихлорэтаном (4%). В ходе дальнейших экспериментов значение рН-среды, при которой извлекается парацетамол, подвергали коррекции с учетом условий экстракции ^аминофенола. Для выяснения оптимальной продолжительности экстракции эфиром и этилацетатом, экстракцию проводили 10 мл растворителя по 3, 5, 10, 15 минут. Продолжительность экстракции в течение 3 минуты обеспечивает максимальный выход парацетамола в органический растворитель.

На основании результатов, полученных при изучении влияния растворителей эфира и этилацетата на экстракцию парацетамола, можно сделать вывод о том, что наилучшим экстрагентом для парацетамола является

эфир насыщенный водой. Добавление электролита аммония сульфата в небольших концентрациях, незначительно (20%) увеличивает степень экстракции парацетамола, а в больших концентрациях не изменяет ее. Используя значение константы распределения (7,12), нами рассчитано, что трехкратная экстракция обеспечивает извлечение парацетамола из

водного раствора в течение 3 минут объемами растворителя, равного 50 мл, при соотношении фаз вода- органический растворитель 1:3, в присутствии электролита 20 % аммония сульфата.

Принимая во внимание биотрансформацию парацетамола в организме человека, следующим этапом наших исследований был выбор оптимальных условий экстракции основного метаболита парацетамола п-аминофенола.

Для изучения оптимальных условий максимального извлечения п-аминофснола из водных растворов нами применен метод математического планирования эксперимента - метод латинского квадрата. Одновременно нами изучалось влияние на процесс экстракции четырех факторов: природа органического растворителя (фактор А), рН буферного раствора-среды (фактор В), фактор присутствия электролита (фактор С), и времени экстракции в минутах (фактор D). В качестве экстрагентов водной фазы, содержащей п-аминофенол, использовали этилацетат, эфир, хлороформ, гексан, дихлорэтан. Экстракцию проводили универсальной буферной смесью при рН 2, 4, 6, 8, 10 в отсутствии электролитов, или при добавлении до 20% и до насыщения аммония сульфатом и натрия хлоридом. Продолжительность экстракции составляла 1,3.5,10,15 мин. Количество выделенного ^аминофенола определяли спектрофотометрическим методом по калибровочному графику при длине волны нм.

В результате статистической обработки мы остановились на следующих условиях проведения экстракции ^аминофенола: экстрагент - этилацетат (эфир), рН в интервале 6,0-8,0 , время экстракции 3 минуты, без электролита.

Таблица 6.- Результаты экстракции парацетамола и ^аминофенола при совместном присутствии смесью эфир-этилацетат (1:1)

Внесено препаратов по 5 мг Найдено %

Парацетамола п-аминофенола *=96,8; £5=2,50960; 8,=1,02454; ДХ=2,6; £=2,7 Х=96,6; 5=3,24791; Б,-!,32596; ДХ=3,4; £=3,5

Установлено, что для извлечения 95% ^аминофенола из водной фазы необходима трехкратная экстракция препарата этилацетатом порциями по 50мл.

Ввиду того, что п-аминофенол экстрагируется этилацетатом, а парацетамол эфиром нами на модельной смеси исследуемых веществ проведена экстракция смесью растворителей эфир-этилацетат 1:1. Результаты экстракции парацетамола (97,4%) и п-аминофенола (97,3%) при совместном присутствии смесью эфир-этилацетат (1:1) не отличаются от данных, полученных по отдельному извлечению изучаемых веществ из водной фазы подобранными растворителями (до 97,6%).

З.Сравнительая оценка методов изолирования парацетамола и ^аминофенола из биологических объектов Для разработки более рационального способа изолирования парацетамола и ^аминофенола из трупного материала, отвечающего задачам химико-токсикологического анализа, сравнительному изучению подвергали методы Стаса-Отто (в описании М.Д. Швайковой, 1966), А.А. Васильевой (1949) и В.Ф. Крамаренко (1966).

Таблица 3.- Результаты выделения парацетамола и ^аминофенола из печени

трупов различными методами

Методы изолирования Выделено парацетамола, % Выделено п-аминофенола, "Л

кислое щелочное кислое щелочное

Метод Стаса-Отто 8,6 23,4 3,7 8.3

Метод Васильевой 9,6 30,4 3.6 14,4

Метод Крамаренко 7,7 17.3 9,3 18,7

Модельные смеси трупного материала (печени), не подвергшегося гнилостным изменениям, с парацетамолом и ^аминофенолом, изолировали

при помощи каждого из перечисленных методов. Парацетамол и п-аминофенол могут быть обнаружены всеми изучаемыми методами, но только в количествах не превышающих 40% для парацетамола, и 28 % для п-аминофенола.

4.Методики изолирования парацетамола и п-аминофенола в извлечениях

из трупного материала

Объектом исследования при изучении изолирования и сохраняемости парацетамола и п-аминофенола в трупном материале служила печень. Принимая во внимание хорошую растворимость парацетамола в ацетоне, а п-аминофенола в воде, мы использовали эти растворители в качестве изолирующих жидкостей, в различных соотношениях от 1: 1 до 1: 5 и наоборот. Для разрушения белковых комплексов изучаемые растворители подкисляли 10% раствором щавелевой кислоты до рН 2,0-3,0 по универсальному индикатору. Изолирование производили разными объемами растворителей, подбирая время настаивания с каждой порцией. Экстракцию веществ производили в условиях, подобранных ранее.

На основании полученных экспериментальных данных в области изучения влияния различных факторов на степень выделения парацетамола и п-аминофенола из биологического материала, нами предложена следующая методика изолирования: 100 г мелкоизмельченной печени заливали 100 мл смеси ацетон-вода (1:1), подкисляли 10% раствором щавелевой кислоты. Настаивание производили дважды (с 50 мл смеси), в течение часа, периодически помешивая и проверяя значение рН среды (2,0-3,0 по универсальному индикатору). Вытяжки объединяли, центрифугировали 20минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали в фарфоровую чашку, испаряли до исчезновения запаха ацетона. Водное извлечение насыщали сульфатом аммония до 20 % содержания, и экстрагировали смесью эфир - этилацетат (1:1 ) по 3 минуты 3 раза, порциями по 50 мл. В случае образования эмульсии разделение фаз достигалось центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Водное извлечение подщелачивали до рН 6,0-

8,0 по универсальному индикатору 25% раствором аммиака. Экстракцию производили при условиях, описанных для кислой среды. Извлечения

Схема химико-токсикологического анализа внутренних органов, содержащих парацетамол и ^аминофенол (модельные смеси)

объединяли, испаряли до 1/3 от общего объема, обезвоживали безводным сульфатом натрия, и помещали в мерную колбу на 50 мл. Объем экстракта доводили смесью растворителей до метки. Полученные извлечения подвергались исследованию следующим образом: 10 мл - для идентификации парацетамола и п-аминофенола; 20 мл для идентификации и количественного определения; 20 мл для возможных дополнительных исследований.

При исследовании извлечений методом ТСХ, при концентрациях п-аминофенола в пятне более 5 мкг его можно обнаружить по собственной коричневой окраске с М 0,50 и ИХ 0,25 соответственно системам: хлороформ -бутанол -25 % раствор аммиака (70:40:5), этилацетат-10% раствор натрия гидроксида - вода- 25% раствор аммиака (9:2,7:0,1:0,2). При обработке хроматографической пластинки ранее подобранными реактивами парацетамол и п-аминофенол, найденные в исследуемом извлечении, по значению ИХ и окраске пятен идентичны нанесенным свидетелям: парацетамолу КЮ,78; 0,67 ± 0,5, и п-аминофенолу ИХ 0,50; 0,25 ± 0,5.

Эндогенные соединения находятся вне зоны обнаружения изучаемых веществ и не мешают их определению при детекции перечисленными реактивами. Примеси белковых веществ и продукты их разложения проявляются неустойчивыми, исчезающими во времени пятнами, а пятна парацетамола и п-аминофенола имеют устойчивую окраску.

После проведения хроматографического исследования измеряли радиусы и определяли площади проявленных пятен. Количество парацетамола и п-аминофенола, изолированных из биологического материала, определяли по построенным ранее калибровочным графикам и производили пересчет найденной концентрации вещества в исследуемом объекте в мкг на общий объем извлечения.

Для определения присутствия исследуемых веществ методами ГЖХ и ВЭЖХ по 10 мл извлечений испаряли досуха в пенициллиновых флаконах. Один из сухих остатков растворяли в 100 мкл этилацетата для

газохроматографического определения парацетамола и и-аминофенола. Другой остаток - в 10 мл подобранной элюирующей системы, состоящей из ацетонитрила - фосфатного буфера рН 3 (30:70), для определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Идентификацию парацетамола и и-аминофенола проводили по времени удерживания пиков на хроматограмме исследуемого раствора и стандартов .

Количественное определение парацетамола и и-аминофенола указанными хроматографическими методами проводили методами внутреннего (ГЖХ) и внешнего (ВЭЖХ) стандарта.

В качестве стандартного вещества для газохроматографического определения использовали анестезин в концентрации 250 мкг/мл в этилацетате. Для высокоэффективной жидкостной хроматографии использовали рабочие стандартные образцы парацетамола и и-аминофенола в концентрациях 500 мкг/мл в элюенте ацетонитрил - фосфатный буфер рН 3 (30:70). Результаты определений отражены в таблице 4

Данные, приведенные в табл.4, показывают, что с помощью предлагаемого нами метода изолирования можно выделить до 63 % нативного парацетамола и до 68 % его метаболита п-аминофенола.

Пределы обнаружения по разработанной методике: методом ГЖХ для парацетамола 0,1 мг, для п-аминофенола 0,05 мг на 100 г органа; методом ВЭЖХ 9,55 мкг/мл для парацетамола, 0,91 мкг/мл для и-аминофенола на 100 г органа.

5. Определение парацетамола по п-аминофенолу Учитывая способность парацетамола к гидролизу, нами была разработана методика идентификации и количественного определения парацетамола по п-аминофенолу. Методика анализа сводится к следующему: по 100г мелкоизмельченного печени заливали 50 мл 10% раствора кислоты хлористоводородной и гидролизовали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. По окончании гидролиза холодильник промывали 10 мл 3% раствора кислоты хлористоводородной, промывные воды

присоединяли к гидролизату. Горячий гидролизат фильтровали через ватмановский фильтр. Остаток на фильтре 3 раза промывали 3% раствором кислоты хлористоводородной. К фильтрату добавляли сульфат аммония до 20% содержания. После подщелачивания гидролизата 25% раствором аммиака до рН 6,0-8,0 по универсальному индикатору производили экстракцию ранее описанным методом.

Результаты, полученные в ходе исследования извлечений методами ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ, свидетельствует об отсутствии в гидролизата парацетамола, что говорит о правильно подобранных условиях гидролиза.

Таблица 4.- Эффективность изолирования нативного и гидролизованного

парацетамола из печени трупа

Внесено препаратов по 10 мг Найдено %

Парацетамола п-аминофенола Х=63,1%; 8,-1,16180; ДА" =3,0; г =4,7% Х=67,0%; $,=1,47324; ДХ=3,$; г =5,7%

Гидролизованного парацетамола Л7 =75,2%, 8,= !,3211; ДЛ:=3,4; г =4,5%

Данные, приведенные в табл.4, показывают, что с помощью гидролиза парацетамола из печени трупов, не подвергшихся гнилостным изменениям, можно выделить от 71 % до 79 % n-аминофенола. Определение парацетамола по продукту его гидролиза, с последующим перерасчетом обоих веществ на п-аминофенол выше, чем по определению нативного вещества и его метаболита, т.к. в данной методике не применяются процессы настаивания.

4.6. Изучение сохраняемости парацетамола и ^аминофенола в трупном

материале

При изучении сохраняемости парацетамола и его основного метаболита л-аминофенола в трупном материале устанавливали влияние этанола 95 %, как консерванта на сохраняемость парацетамола и п-аминофенола.

Модельные смеси с затравленной печенью оставляли при комнатной температуре на 90, 180, 360, 720 суток. Периодически проводили изолирование, обнаружение и количественное определение выделенных парацетамола и п-

аминофенола. Парацетамол и п- аминофенол изолировали путем настаивания смесью ацетон-вода (1:1) по ранее разработанной нами методике.

Для очистки вытяжек из биологического материала от балластных веществ перед началом экстракции водную фазу экстрагировали гексаном при рН 11,012,0 по универсальному индикатору, гексановые извлечения отбрасывали. Водную вытяжку подкисляли 10% раствором кислоты хлористоводородной до рН 2,0-3,0 по универсальному индикатору. Далее изолирование нативного парацетамола производили по указанной выше методике.

Метод хроматографии в тонком слое сорбента использовали для обнаружения парацетамола и п-аминофенола, а также для очистки веществ перед проведением ГЖХ и ВЭЖХ исследований.

Проведенные эксперименты по изучению сохраняемости парацетамола и п-аминофенола в трупном материале показали, что более чистые вытяжки получаются при выделении парацетамола и п-аминофенола из печени, консервированной этанолом. При анализе гнилостно-разложившегося трупного материала, не консервированного этанолом, белковые вещества в предложенных системах растворителей и условиях хроматографического разделения при ГЖХ и ВЭЖХ исследований, находятся вне зоны определения парацетамола и п-аминофенола. Результаты экспериментов отражены в табл. 5. Оба вещества обнаруживаются в консервированном биологическом материале при хранении его в течение 2х лет. В неконсервированных объектах парацетамол можно обнаружить только в течение одного года (6,3%), п-аминофенол сохраняется спустя два года при указанных условиях в незначительных количествах (9,17%). Присутствие этанола как консерванта увеличивает выход веществ до 25 % парацетамола и 37 % п-аминофенола, а также позволяет их определить спустя два года в концентрациях 5 % и 24 % соответственно.

Полученные результаты имеют существенное значение для судебно-медицинской практики, связанной с производством первичных и повторных

судебно- химических экспертиз, а также при исследовании эксгумированного трупного материала и решении других вопросов.

Выводы:

1. Изучено хроматографическое поведение смеси парацетамола и п-аминофенола в тонком слое сорбента. Рекомендовано для разделения веществ использовать системы: хлороформ-н-бутанол-25%раствор аммиака (70:40:5) или этилацетат-10% раствор натрия гидроксида-25% раствор аммиака (9:2,7:0,1:0,2). Определена чувствительность 14 реагентов-проявителей по отношению к парацетамолу и ^аминофенолу. Предложена методика полуколичественного определения парацетамола и п-аминофенола. Данным методом можно определить от I до 6 мкг каждого вещества в пробе.

2. Предложено полуколичественное определение парацетамола и п-аминофенола в извлечениях из печени использовать с помощью разработанной ТСХ методики. Предел обнаружения в 100 г печени 0,24 мг для обоих веществ.

3. Разработаны условия разделения и обнаружения парацетамола и п-аминофенола с помощью ВЭЖХ. Предел обнаружения для парацетамола 29,55 мкг/мл, для п-аминофенола 0,91 мкг/мл. Разработана методика количественного определения, относительная погрешность определения находится в пределах

для парацетамола, и для п-аминофенола.

4. Разработаны условия разделения и обнаружения парацетамола и п-аминофенола с помощью ГЖХ. Предел обнаружения для парацетамола 0,8 мг, для п-аминофенола 0,05 мг. Разработана методика количественного определения, относительная ошибка определения находится в пределах ± 3% для п-аминофенола и ± 1,4 % для парацетамола.

5. Эмпирическим методом и методом математического планирования эксперимента определены оптимальные условия экстрагирования парацетамола и п-аминофенола из водных растворов. Для парацетамола они составляют рН 1,0-7,0, экстрагент-эфир объемами по 50 мл, время экстракции 3 минуты, без электролита; n-аминофенол выделяется при рН 6,0-8,0 этилацетатом порциями по 50 мл, время экстракции 3 минуты, электролит сульфат аммония до 10%

концентрации. Установлено, что экстракционным методом из водного раствора можно извлечь как парацетамола так и п-аминофенола до 97 %.

6. Показано, что парацетамол и п-аминофенол могут быть обнаружены в печени трупа общепринятыми методами изолирования (Стаса-Отто, Васильевой, Крамаренко), но только в количествах, не превышающих 40% для парацетамола, и 28% для п-аминофенола.

7. Предложена методика пробоподготовки, изолирования и очистки извлечений из печени при исследовании на парацетамол и п-аминофенол. Данным методом изолирования можно обнаружить до 63 % парацетамола и 67% п-аминофенола,

8. Разработана методика, основанная на изолировании и определении парацетамола, содержащегося в печени, по продукту его расщепления п-аминофенолу. Предложенный метод позволяет определять до 75% вещества.

9. Предложены способы обнаружения парацетамола и п-аминофенола в извлечениях из печени с помощью ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ методов. Ошибка определения не превышает

10. Установлено, что парацетамол, добавленный к 100 г печени трупа в количестве 10 мг, обнаруживается в течение года. Использование этанола в качестве консерванта позволяет обнаруживать и определять парацетамол в трупном материале до двух лет хранения. При добавлении 10 мг п-аминофенола к 100 г печени его можно обнаружить и определить в течение двух лет в консервированных и неконсервированных объектах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Козлова, В.В.Состояние вопроса по изучению парацетамола в химико-токсикологическом отношении / В.В.Козлова, Т.Х. Вергейчик, СВ. Шабалин.-Пятигорск, 1996.- 10 с. Деп. в ВИНИТИ 10.03.96г.-№ 5241-96.

2. Козлова, В.В. Изучение условий экстракции парацетамола из водных растворов в зависимости от рН-среды, природы органического растворителя, природы и концентрации электролитов. / В.В. Козлова, Е.В. Компанцева //

Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (55;2000; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск, 2000,- С.107.

3. Козлова, В.В. Выбор оптимальных условий разделения парацетамола и п-аминофенола методом ТСХ /В. В. Козлова, Е.В. Компанцева // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (55;2000; Пятигорск): Материалы... -Пятигорск.-2000.- С. 107.

4. Козлова, В.В. Газохроматографическое определение парацетамола и его основного метаболита п-аминофенола в трупном материале/В.В. Козлова, Е.В. Компанцева, СВ. Шабалин и др// Человек и лекарство: Тез.док. 8 Рос. нац. конгр. 2-в апр. 2001 г: - М.,2001.- 776 с.

5. Козлова, В.В.Обнаружение и определение парацетамола и п-аминофенола при остром отравлении./ В.В.Козлова // Пробл. экспертизы в медицине -2002.-№3- С.30-32.

6. Козлова, В.В. Вопросы отравления парацетамолом. / В.В.Козлова, К.И.Кильдишев // Пробл. экспертизы в медицине - 2002,- №3.- С.15-16.

7. Козлова, В.В. Изучение сохраняемости парацетамола и п-аминофенола в трупном материале/В.В.Козлова, Копылов А.В. // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (60;2004; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск, 2004.- (принято в печати)

V - 6 4 7 3

КОЗЛОВА ВИКТОРИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПАРАЦЕТАМОЛА И ЕГО ОСНОВНОГО МЕТАБОЛИТА

П-АМИНОФЕНОЛА

Автореферат

Подписано в печать,^лД^^^формат 60x84/16. бумага книжно-журнальная, печать - ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. тираж 80 экз. Заказ№ 2 Пятигорская государственная фармацевтическая академия 357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11. Ротапринт ПятГФА, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11.

Актуальность темы. Парацетамол находит широкое применение в медицинской практике как противовоспалительное средство при заболеваниях вызванных аденовирусами, риновирусами, вирусами герпеса, гриппа,при инфекциях мононуклеоза, а так же как тест для определения глюкуронидов у человека.

Наряду с терапевтическим эффектом парацетамол при передозировках оказывает токсическое действие на организм. Широкое применение парацетамола в медицинской практике, токсическое действие на организм при передозировках, случаи смертельных отравлений придают этому лекарственному веществу определенное токсикологическое значение. Несмотря на токсичность парацетамола, методы доказательства его в биологическом материале не разработаны. Разработанные методики определения парацетамола в биологических жидкостях не применимы при общем ходе химико-токсикологического анализа биологического обьекта на лекарственные препараты. Не изучены оптимальные условия извлечения парацетамола из водных растворов, что не позволяет сделать выбор наиболее подходящих растворителей для экстракции изучаемого препарата и его основного метаболита n-аминофенола из вытяжек и для очистки парацетамола после выделения из биологического материала. Не предложены частные методики изолирования, обнаружения и определения парацетамола в трупном материале. Отсутвуют данные о сохраняемости парацетамола при гнилостном разложении биологического материала, что очень важно при проведении судебно-химического анализа на наличие указанных веществ.

Особый интерес для проведения судебно-химической экспертизы представляют вопросы превращения лекарственных веществ. Парацетамол в организме претерпевает изменения с образованием ряда продуктов основным из которых является n-аминофенол. Однако, методики обнаружения парацетамола и n-аминофенола при совместном присутствии в доступной литературе не описаны, а также не определена чувствительность цветных реакций при обнаружении обоих веществ.

Несомненно, что возможность определения одного из метаболитов лекарственного препарата в трупном материале расширит границы судебно-медицинской экспертизы и позволит судебно-следственным органам иметь более веские доказательства при решении вопроса об отравлении.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явиляется разработка методологического подхода к выделению, обнаружению и определению парацетамола и его основного метаболита n-аминофенола для проведения судебно-химических исследований с использованием современных хроматографических методов анализа и включение разработанных методик в соответствующие методические разработки (информационное письмо). Решение поставленной целей возможно с помощью следующих задач:

- найти оптимальные условия разделения и обнаружения парацетамола и п-аминофенола методами ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ;

- изучить оптимальные условия экстракции парацетамола и n-аминофенола из водных растворов органическими растворителями в зависимости от различных факторов;

- изучить возможность использования при анализе извлечений из печени на исследуемые вещества методов ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ;

- провести сравнительное изучение по выделению парацетамола и п-аминофенола из печени общепринятыми судебно-химическими методами изолирования;

- предложить схему и методологический подход к анализу трупного материала на парацетамол и п-аминофенол;

- изучить сохраняемость парацетамола и его основного метаболита при гнилостном разложении печени трупов.

Поставленные задачи решались путем обобщения анализа и критического рассмотрения данных литературы и результатов собственных экспериментальных исследований.

Научная новизна работы. На основе сравнительных данных результатов исследований

- найдены оптимальные условия разделения и способы детектирования парацетамола и n-аминофенола с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ);

- разработаны условия разделения и обнаружения парацетамола и п-аминофенола с помощью методов газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Предел обнаружения ГЖХ методом 0,1 мг парацетамола и 0,05 мг n-аминофенола, ВЭЖХ методом 2,3 мкг/мл парацетамол, 30 мкг/мл п-аминофенол;

- изучены условия экстракции парацетамола и n-аминофенола из водных растворов органическими растворителями, показано, что максимум экстракции парацетамола наблюдается при рН 1-7 эфиром, в присутствии электролитов, п-аминофенол экстрагируется при рН 5-7 этилацетатом без электролитов;

- предложена методика полуколичественного определения парацетамола и п-аминофенола методом ТСХ в извлечениях из печени; научно обоснована и разработана схема обнаружения, изолирования и определения парацетамола из трупного материала (печени), по нативному соединению и по продукту гидролиза парацетамола п - аминофенолу;

- впервые изучена сохраняемость парацетамола при гнилостном разложении трупного материала. Парацетамол и его метаболит n-аминофенол можно обнаружить в консервированной этанолом печени в концентраци 5 % и 24 % соответственно в течение двух лет.

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования. Предложены методики идентификации и количественного определения парацетамола и n-аминофенола в вытяжках из биологического материала методами газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии, полуколичественного определения методом тонкослойной хроматографии. Разработанные методики анализа парацетамола и п-аминофенола рекомендованы для использования в химико- токсикологических лабораториях с целью определения их подлинности и диагностики отравления.Методики имеют ряд преимуществ: позволяют в одной пробе одновременно определять парацетамол и п-аминофенол,

Материалы внедрения. Предложенные методики апробированы и внедрены в практику судебно- химических лабораторий Краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы Ставропольского края и Бюро судебно- медицинской экспертизы Астраханской области. Составлено информационное письмо «Определение парацетамола в биологическом материале при проведении судебно-химического исследования», проект которого принят к рассмотрению в Российском центре судебно-медицинской экспертизы г. Москва (вх.№ 290 от 10.02.03).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно исследовательских работ "Совершенствование контроля качества лекарственных средств" Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации № 01960009199) и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 38 Ученого совета Минздрава России.

Структура и обьем работы. Диссертационная работа представляет собой машинописную рукопись, изложенную на 139 страницах, состоящую из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы. В диссертации приводится 14 рисунков и 41 таблица. Библиографический указатель включает 136 источников, из них 72 на иностранных языках.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 53, 55 региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск, 1997,2000 гг.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Основные положения выносимые на защиту.

- результаты разработки методик обнаружения и количественного определения парацетамола и п-аминофенола присовместном присутствии;

- результаты разработки методик пробоподготовки, изолирования и очистки извлечений содержащих парацетамол и n-аминофенол из объектов биологического происхождения (печени трупа);

- способы обнаружения и количественного определения парацетамола и п-аминофенола в извлечениях из биологического материала (печени трупа);

-критерии сохраняемости парацетамола и п-аминофенола в трупном материале в зависимости от времени и условий хранения;

-схема и результаты выбора общего методологического подхода к анализу трупного материала, содержащего парацетамол.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Общие выводы:

1. Изучено хроматографическое поведение смеси парацетамола и п-аминофенола в тонком слое сорбента. Рекомендовано для разделения веществ использовать системы: хлороформ-н-бутанол-25%раствор аммиака (70:40:5) или этилацетат- 10%раствор натрия гидроксида-25%раствор аммиака (9:2,7:0,1:0,2). Предложена схема детектирования и определена чувствительность каждого реагента по отношению к парацетамолу и n-аминофенолу. Определена чувствительность 14 реагентов-проявителей по отношению к парацетамолу и п-аминофенолу. Предложена методика полуколичественного определения парацетамола и n-аминофенола. Данным методом можно определить от 1 до 6 мкг каждого в пробе.

2. Предложено полуколичественное определение парацетамола и п-аминофенола в извлечениях из печени использовать с помощью разработанной ТСХ методики. Предел обнаружения в 100 г печени 0,24 мг для обоих веществ.

3. Разработаны условия разделения и обнаружения парацетамола и п-аминофенола с помощью ВЭЖХ. Предел обнаружения для парацетамола 29,55 мкг/мл, для п-аминофенола 0,91 мкг/мл. Разработана методика количественного определения, относительная погрешность определения находится в пределах ±1,2% для парацетамола, и ±1,6% для п-аминофенола.

4. Разработаны условия разделения и обнаружения парацетамола и п-аминофенола с помощью ГЖХ. Предел обнаружения для парацетамола 0,8 мг, для п-аминофенола 0,05 мг. Разработана методика количественного определения относительная ошибка определения находится в пределах ± 3% для п-аминофенола и ± 1,4% для парацетамола.

5. Эмпирическим методом и методом математического планирования эксперимента определены оптимальные условия экстрагирования парацетамола и n-аминофенола из водных растворов. Для парацетамола они составляют рН 1,0-7,0 экстрагент-эфир поциями по 50 мл, время экстракции 3 минуты, электролит сульфат аммония до 20% концентрации; n-аминофенол выделяется при рН 6,0-8,0 этилацетатом порциями по 50 мл, время экстракции 3 минуты, без электролита. Установлено, что экстракционным методом из водного раствора можно извлечь как парацетамола так и n-аминофенола до 97 %.

6. Показано, что парацетамол и n-аминофенол могут быть обнаружены общепринятыми методами изолирования (Стаса-Отто, Васильевой, Крамаренко), но только в количествах не превышающих 40 % для парацетамола, и 28 % для п-аминофенола.

7. Предложена методика пробоподготовки, изолирования и очистки извлечений из печени при исследовании на парацетамола и п-аминофенол. Данным методом изолирования можно обнаружить до 63 % парацетамола и

67 % п-аминофенола.

8. Разработана методика, основанная на изолировании и определении парацетамола по продукту его расщепления n-аминофенолу. Предложенный метод позволяет определять до 75% вещества.

9. Предложены способы обнаружения парацетамола и n-аминофенола в извлечениях из печени с помощью ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ методов. Ошибка определения не превышает ±5%.

10. Установлено, что парацетамол добавленный к 100 г печени трупа в количестве 10 мг, обнаруживается в течение года. Использование этанола в качестве консерванта позволяет обнаруживать и определять парацетамол в трупном материале до двух лет хранения. При добавлении 10 мг п-аминофенола к 100 г печени его можно обнаружить и определить в течение двух лет в консервированных и неконсервированных объектах.