Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка биологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола
- Ученая степень
- кандидата фармацевтических наук
- ВАК РФ
- 15.00.02
Автореферат диссертации по фармакологии на тему Разработка биологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола
На правах рукописи
МИШЕНИНА ИРИНА ИВАНОВНА
РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКОГО СПОСОБА УТИЛИЗАЦИИ НЕПРИГОДНЫХ К МЕДИЦИНСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОЛА
15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Пермь-2008
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
Научные доктор фармацевтических наук, профессор
руководители: Чекрышкина Людмила Александровна
доктор биологических наук, профессор, чл -корр РАН Ившина Ирина Борисовна
Официальные доктор фармацевтических наук, профессор оппоненты Ярыгина Татьяна Ивановна
кандидат фармацевтических наук Захарова Людмила Андреевна
Ведущая ГОУ ВПО «Пятигорская государственная
организация: фармацевтическая академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
Защита диссертационной работы состоится 22 апреля 2008 г в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068 01 при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» по адресу 614990, ГСП-277, г Пермь, ул Ленина, 48 Тел. (342) 212-90-06.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу 614070, г Пермь, ул Крупской, 46
Автореферат разослан « <%0 » марта 2008 г
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент
Метелева Е.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы В настоящее время в Российской Федерации остро обозначилась проблема утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств - фальсифицированных, забракованных, с истекшим сроком годности или потерявших свои потребительские свойства по тем или иным причинам.
Все некачественные лекарства признаются фармацевтическими отходами и подлежат обязательному уничтожению. Анализ случаев уничтожения таких лекарственных средств на территории Российской Федерации в период с 1997 по 2005 показал отсутствие единой системы проведения этой процедуры и централизованных мест их хранения
Научно обоснованные методики утилизации лекарственных средств, за исключением наркотических и психотропных, пока не разработаны Используемыми на практике способами уничтожения являются слив в промышленную канализацию, сжигание на открытом воздухе или захоронение на свалках, при этом часто не учитываются физико-химические, токсические свойства лекарственных веществ и протекающие в процессе уничтожения химические процессы Поэтому исследования по совершенствованию существующих и поиску новых путей утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств является актуальным.
Анализ исследований в области промышленной технологии показывает, что большое внимание, особенно за рубежом, уделяется биологическим методам, за которыми признается несомненный приоритет по показателям эффективности и безопасности Природные микроорганизмы используют для обезвреживания химических отходов, в первую очередь, нефтепродуктов, тяжелых металлов, полихлорированных фенолов, фосфорорганических и других химических соединений Ведутся активные поиски новых микроорганизмов, адаптированных к развитию в присутствии чужеродных веществ и вызывающих их биотрансформацию
В качестве эффективных биодеструкторов ксенобиотиков могут быть использованы актинобактерии рода Шюйососст, которые являются обычными компонентами техногенно-загрязненных сред обитания Родококки способны усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические вещества, в том числе предельные и ароматические углеводороды, фенолы, гетероциклические соединения, что делает использование этой группы микроорганизмов перспективными при разработке биологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, Помимо поиска микроорганизмов-деструкторов токсических веществ, необходимо также изучение влияния на человека и окружающую среду промежуточных и конечных продуктов их трансформации
Цель и задачи исследования. Оценка возможности использования актинобактерий для биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола
Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач
1 Провести скрининг активных штаммов актинобактерий рода Л/г<5й?ососсш'-биодеструкторов веществ, производных фенола, и выбрать среди исследуемых лекарственных средств модельное соединение
2 Разработать способы идентификации и количественного определения продуктов его биодеструкции
3 Установить оптимальные условия процесса биотрансформации
4 На примере модельного соединения изучить динамику процесса биодеструкции.
5 Изучить свойства конечных продуктов биодеструкции (шлама)
6 На основе полученных результатов разработать технологические схемы и лабораторный регламент процесса утилизации непригодных к медицинскому применению лекарственных средств.
Научная новизна. На примере парацетамола показана возможность биологического способа биодеструкции непригодных к медицинскому применению лекарственных веществ (ЛВ) и их препаратов
Путем скрининга 82 бактериальных штаммов в качестве деструкторов выбраны 2 штамма актинобактерий рода ЯЪо^соссиз Установлены оптимальные условия процесса состав среды культивирования, влияние вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток парацетамола, на скорость его деструкции, адаптация родококков к фенолу, что расширяет перспективу их использования для биодеструкции других ЛВ, производных фенола Получены биокатализаторы на основе иммобилизованных в полимерном криогеле поливинилового спирта клеток микроорганизмов, с участием которых идет значительное ускорение процесса биотрансформации парацетамола
Разработаны методики анализа в культуральных средах парацетамола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и его основного метаболита я-аминофенола спектрофотометрическим методом, позволяющие контролировать динамику процесса
Предложена схема трансформации парацетамола в процессе биодеструкции Методом тонкослойной хроматографии доказано наличие в культуральных средах и-аминофенола, пирокатехина, гидрохинона, бензохинона и трех неидентифицированных веществ
Изучены физико-химические свойства, токсичность и фитотоксичность конечных продуктов биодеструкции парацетамола (шлама)
Работа поддержана грантом РФФИ № 04-04-96057 Практическая значимость По результатам выполненных исследований разработан лабораторный регламент и представлены технологические схемы утилизации парацетамола Процесс утилизации парацетамола с положительным результатом апробирован в ОАО «Пермфармация» с использованием ферментационной установки «Фермус — 3» с загрузкой, в 30 раз превышающей загрузку при выполнении эксперимента (акт от 20 11 07 г )
Результаты работы используются в учебном процессе Пермской государственной фармацевтической академии в лекционном курсе и на лабораторных занятиях слушателей ФДПО, интернов и студентов на кафедрах фармацевтической технологии и фармацевтической химии ФДПО и ФЗО (акты от 05 04 05 г и 01 11 07 г ), включены в лабораторный практикум студентов очного отделения биологического факультета Пермского государственного университета (акт от 20 12 07 г )
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Номер государственной регистрации 01 9 50 007417
Апробация работы Результаты и основные положения диссертационной работы доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004, 69-й научно-практической конференции «Медико-биологические проблемы Центрального Черноземья», Курск, 2004, V Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2004, IX Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий Экологический катализ», Новосибирск, 2004, XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2005, II Международной конференции «Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биопотенциал», Пермь-Казань, 2005, II Всероссийской научно-практической конференции «Техническая химия Достижения и перспективы», Пермь, 2006, XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2006, XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2007, Научно-практической конференции, посвященной 70-летик> Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, 2007
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 6 статей (3 - в изданиях, рекомендованных ВАК)
Основные положения, выносимые на защиту.
1 Обоснование условий биологического способа деструкции ЛВ, производных фенола, на примере парацетамола как модельного соединения
2 Способы оптимизации процесса деструкции парацетамола
3 Методики анализа парацетамола и продуктов его биодеструкции в культуральных средах
4 Результаты изучения свойств конечных продуктов деструкции парацетамола
5 Технологические схемы и лабораторный регламент процесса биодеструкции парацетамола
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 44 таблицы, 24 рисунка, 4 схемы, 4 фотографии, включает введение, обзор литературы (глава 1), экспериментальную часть (главы 2-5), список литературы, содержащий 181 библиографический источник, из которых 46 на иностранных языках, и Приложение
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, определены научная и практическая значимость работы
В первой главе представлен обзор литературы, в котором рассмотрены способы утилизации непригодных к медицинскому применению лекарственных средств, перспективы использования для этой цели различных штаммов микроорганизмов, способы анализа парацетамола и я-аминофенола
Во второй главе описаны объекты, материалы и методы исследования
Третья глава посвящена разработке методик количественного определения парацетамола и и-аминофенола в культуральных средах, использованию метода ТСХ для исследования динамики процесса биодеструкции парацетамола
В четвертой главе изложены исследования по оптимизации условий биодеструкции парацетамола, разработке технологической документации и ее апробации
Пятая глава посвящена изучению свойств шлама, образующегося в процессе биодеструкции парацетамола
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве модельных ЛВ использовали парацетамол (ацетаминофенол), ацетилсалициловую и салициловую кислоты как наиболее распространенные лекарственные средства, относящихся к производным фенола В качестве биодеструкторов выбраны 82 штамма родококков, относящихся к 6 видам рода Якос1ососсш К. егу/Ьгорокх
(14 штаммов), R fascians (14 штаммов), R. ,,longus"(\4- штаммов), R opacus (12 штаммов), R rhodochrous (14 штаммов), R ruber (14 штаммов), представленные Институтом экологии и генетики микроорганизмов (ИЭГМ) УрО РАН
Условия биодеструкции. Для выбора объекта исследования и активного штамма актинобактерий использовали микролуночный метод Культивирование клеток осуществляли в водной минеральной среде «К», в которую вносили исследуемые J1B в виде водных растворов Биотрансформацию парацетамола изучали в условиях периодического перемешивания родококков в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на шейкере (160 об/мин) при 28°С В качестве посевного материала служила 48-часовая бактериальная культура родококков, предварительно выращенная на мясо-пептонном агаре, которую добавляли в концентрации 3,2 х 107клеток/мл
Биодеструкцию парацетамола осуществляли в двух минеральных средах «Киевская» («К») и «RS», базовый состав которых включал следующие компоненты (г/л) KN03~ 1 0, КН2Р04- 1 0, К2НР04— 1 0, NaCl— 10, MgS04 7Н20- 0 2, СаС12 6Н20- 0.02, FeCh 6Н20-0 001, среда «RS» дополнительно содержала (NH4)2 S04— 2 0
Парацетамол использовали в виде субстанции и лекарственной формы - таблеток, содержащих 0,2 г парацетамола, которые вносили в водные минеральные среды
Изучено влияние каждого из вспомогательных веществ таблеток на скорость, полноту биотрансформации, рост и жизнеспособность микроорганизмов
Для активизации бактериальных оксигеназ и адаптации клеток штаммы родококков выращивали в жидкой минеральной среде «RS», содержащей 0,1% фенола и дрожжевой экстракт Иммобилизацию осуществляли путем внесения бактериальной взвеси клеток родококков в раствор поливинилового спирта в соотношении 1 2 Условия утилизации парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus, установленные в ходе эксперимента, воспроизведены на укрупненной ферментационной установке «Фермус-3»
Исследование парацетамола и продуктов его биотрансформации. Результаты хроматографического исследования показали, что первый метаболит — я-АФ появляется в течение первых суток эксперимента при использовании чистых и адаптированных клеток родококков, а в случае применения иммобилизованных клеток появление п-АФ наблюдается уже через 4-6 часов На штаммах R erythropolis ИЭГМ 767 и R ruber ИЭГМ 77 в процессе биодеструкции парацетамола через 3-е суток эксперимента появляется пирокатехин, через 5 суток — гидрохинон и через 7-8 суток обнаруживается бензохинон На основе литературных и экспериментальных данных биодеструкцию парацетамола можно представить схемой, которая
применима к аэробным микроорганизмам, какими являются актинобактерии рода Rhodococcus
ОН
ОН
ОН
О
ОН [О]
k^-COOH
Пирокатехин о-Бензохинон Муконовая
кислота
ОН О
1QJ
Nif— С— СНз
О
NI-Ь
ОН
Парацетамол и-Аминофенол «-Гидрохинон и-Бензохинон
ОН
О
ОН ОН
1,2,4-Триоксибензол
PI | I
"11 '011 О
о-Окси-я-хинон
Предполагаемая схема биотрансформации парацетамола
Качественное определение продуктов биотрансформации парацетамола проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол и Сорбфил Из десяти апробированных вариантов составов подвижных фаз эффективное разделение исследуемых веществ наблюдается в системах спирт этиловый 95%-аммиак 25%-вода (80 4 16) и хлороформ-спирт этиловый 95% (8 2) на пластинках «Силуфол» Исследуемые вещества на хроматограмме обнаруживали путем облучения пластинок УФ-светом или обработкой цветореагентами железа (III) хлорида 1% спиртовым раствором, п-диметиламинобензальдегида 5% спиртовым раствором, парами йода На рис 1 представлена хроматограмма, полученная при разделении модельной смеси продуктов биодеструкции парацетамола в системе хлороформ-спирт этиловый 95% (8 2)
I I
I .
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 1. Хроматограмма исследуемых веществ в системе хлороформ-спирт этиловый 95% (8:2) на пластинках «Силуфол»
1- Парацетамол;
2- и-Аминофенол;
3 - Гидрохинон;
4 - Пирокатехин;
5- Бензохин он;
6- Фенол;
7- Муконовая кислота
8- Модельная смесь продуктов биодеструкции парацетамола
Свойства конечных продуктов биотрансформации парацетамола (шлама) оценивали по физико-химическим свойствам, токсичности и фитотоксичности.
Количественное содержание парацетамола в культуральных жидкостях определяли методом ВЭЖХ на базе лаборатории РИЦ «Фарматест» ПГФА на хроматографе модели HP-1090 (Hewlett Packard, США) и колонке ZORBAX SB- С18 (4,6 х 250 мм, 5 |дм), заполненной октадецильной привитой фазой, на приборном комплексе «Милихром А-02» с УФ-детектором. Подвижная фаза - ацетонитрил:вода:натрия дигидрофосфат:натрия октилсульфонат (25 мл : 75 мл : 100 мг: 30 мг); постоянная времени детекции - 0,34 сек; скорость потока элюента - 100 мкл/мин; объем вводимой пробы 5 мкл; режим элюирования — изократический; температура колонки 35°С; длина волны ^,=230 нм; время удерживания парацетамола около 3 мин ± 0,30 мин. Запись и обработку хроматограмм осуществляли с помощью программы «ChemStation». Хроматограммы 0,2% водного раствора парацетамола-стандарта и парацетамола, содержащегося в культуральной жидкости, полученные в этих условиях, идентичны (рис. 2 и 3).
Содержание и-аминофенола определяли спектрофотометрическим методом на основе реакции конденсации его с и-диметиламино-бензальдегидом при Х=450 нм на приборе Lambda EZ201 корпорации «Perkin-Elmer». Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), Statistica, версия 6,0 (StatSoft Inc., 2001).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Предварительными исследованиями установлено, что парацетамол, соли ацетилсалициловой и салициловой кислот не являются токсичными для родококков. Я. ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767 сохраняют свою жизнеспособность в присутствии исследуемых ЛС в концентрациях от 0,75 до 500 мкг/мл. Другие штаммы по окончании эксперимента были нежизнеспособны или их минимальная подавляющая концентрация (МПК) составляла менее 100 мкг/мл. Из-за низкой растворимости в воде салициловой и ацетилсалициловой кислот необходимо введение в среду 5% водного раствора натрия гидрокарбоната для получения их водорастворимых солей, что требует дополнительной операции и может привести к изменению состава среды культивирования. В связи с этим, в дальнейших исследованиях в качестве модельного соединения для изучения процесса био деструкции нами избран парацетамол, а в качестве микроорганизмов-деструкторов — R. ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767.
Влияние условий культивирования на процесс трансформации парацетамола и активность родококков. Продолжительность эксперимента составляла до 25 суток. Установлено, что уменьшение содержания парацетамола в среде «RS» происходит значительно быстрее как в таблетках, так и в виде субстанции, что возможно, объясняется присутствием в ней аммония сульфата, который является легкоусвояемым для алканотрофных
родококков и может служить дополнительным источником аммонийного азота. Скорость биотрапсформации парацетамола зависит также от вводимой формы. В таблетированной форме биодеструкция парацетамола в обеих средах происходит значительно быстрее, чем в виде субстанции, вероятно, из-за наличия вспомогательных веществ, которые могли служить дополнительными источниками питания для акгинобактерий. Остаточное содержание парацетамола в виде субстанции составляет 1,6% через 20 суток эксперимента в среде «RS» под влиянием R. erythropolis ИЭГМ 767. В то же время полная биодеструкция парацетамола в таблетируемой форме в этих же условиях наблюдается уже на 5-6 сутки (рис. 4). Скорость биодеструкции парацетамола при использовании R. ruber ИЭГМ 77 значительно ниже (рис. 5).
I I -------т-
I 3 5 10 15
Время инкубации, сутки
1 - субстанция
2 - таблетки
Рис. 4. Изменение содержания парацетамола, введенного в виде субстанции и таблеток, содержащих 0,2 г парацетамола, К. егуМгороН.ч ИЭ1 М 767 в среде «1^».
о
17 20
0
в среде «RS».
содержащих 0,2 г парацетамола,
субстанции и таблеток,
с од с ржа 1111 я пара цета м oj i а,
Рис. 5. Изменение
введенного в виде
R. ruber ИЭГМ 77
о
3 5 10 15 17 20 Время инкубации, сутки
Появление первого метаболита («-АФ) обнаруживается на первые сутки эксперимента в обеих средах. Его количественное определение в культуральной жидкости в процессе эксперимента показало, что в
первые 5 суток наблюдается увеличение его содержания. По окончании опыта через 25 суток остаточное содержание и-АФ составило около 2 % в среде «RS» и 8 % в среде «К», причем скорость его преобразования актинобактериями R. eiylhropolis ИЭГМ 767 выше, чем при использовании штамма R. ruber ИЭГМ 77.
Для исследования влияния каждого из вспомогательных веществ таблеток (крахмала, талька, ПВП или стеариновой кислоты) на скорость и полноту биотрансформации парацетамола в культуральную среду вносили каждое из них в количестве 10% от содержания парацетамола в таблетке. Пробы для количественного определения парацетамола отбирали через I, 3, 5, 10 и 15 суток.
Как следует из рис. 6 и 7, добавление кислоты стеариновой и ПВП увеличивает скорость биодеструкции парацетамола.
Уменьшение содержания парацетамола в присутствии ПВП происходит значительно быстрее, чем в присутствии стеариновой кислоты. Можно предположить, что ПВП является не только дополнительным источником питания для микроорганизмов, но и катализатором процесса биодеструкции парацетамола.
Рис. 6. Динамика изменения содержания парацетамола в присутствии 10 % количества
вспомогательных веществ при использовании R. ruber ИЭГМ 77.
1 - крахмал; 2 - тальк;
3 - стеариновая кислота;
4 - ПВГ1
Рис. 7. Динамика изменения содержания парацетамола в присутствии 10 % количества
вспомогательных веществ при использовании R. erythropolis ИЭГМ 767.
1 - крахмал; 2 - тальк;
3 - стеариновая кислота;
4 - ПВП
Влияние вспомогательных веществ таблеток изучено также на рост и жизнеспособность актинобактерий без введения парацетамола. Контроль увеличения биомассы родококков спектрофотомегрическим методом (Х=600 нм) показал, что наиболее благоприятным для роста актинобактерий также являются стеариновая кислота и ПВП, что подтверждает результаты приведенного эксперимента.
Для активизации бактериальных оксигеназ изучен процесс адаптации родококков на феноле, поскольку парацетамол является производным фенола. Пробы отбирали ежедневно в течение 14 суток.
Время адаптации, сугки
Рис. 8. Динамика роста R. erythropolis ИЭГМ 767
1 - контроль — клетки, выращенные на плотной среде;
2 - клетки, адаптированные в парах фенола;
3 - клетки, адаптированные в среде с содержанием 0,1% фенола;
4 - контроль — клетки, выращенные в жидкой среде
Установлено, что увеличение биомассы клеток родококков и устойчивая адаптация клеток происходит в жидкой минеральной среде в присутствии 0,1% фенола, находящегося в растворенном виде. На рис. 8 приведена динамика роста биомассы на примере R. erythropolis ИЭГМ 767. Увеличение концентрации фенола более 0,1% замедляет рост биомассы клеток. Предварительная адаптация клеток родококков позволяет повысить устойчивость к окислительному стрессу в процессе биотрансформации парацетамола в сравнении со свободными культурами. Применение адаптированных клеток R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 сокращает время полной деструкции парацетамола в виде субстанции до 5 суток, а в таблетируемой форме до — 3 суток, что оптимизирует процесс по временному параметру и позволяет проводить его без дополнительного внесения инокулята. При использовании R. ruber ИЭГМ 77 или смеси родококков процесс идет с меньшей скоростью (табл. I и 2).
Таблица 1
Результаты количественного определения парацетамола (субстанция) при его биодеструкции адаптированными клетками
Время инкубации, сутки Содержание парацетамола, %
Я егуШгороЬь ИЭГМ 767 Я гиЬег ИЭГМ 77 Я е>у1Ьгоро!1ь ИЭГМ 767 и Я гиЬег ИЭГМ 77
0 100,00* 100,00* 100,00*
1 67,89±3,39 92,41 ±1,26 77,32±4,23
2 35,41 ±4,06 63,60±2,14 43,87±2,51
3 5,63±2,09 44,91 ±3,51 19,40±2,49
4 1,82±0,011 36,52±2,45 9,34±1,08
5 0,00 27,84±1,29 6,53±0,67
6 0,00 20,16±3,23 4,03±0,99
7 0,00 17,80±2,11 0,90±0,007
8 0,00 15,43±1,05 0,00
Примечание Каждый резулы ат - среднее из 3-х значений
* За 100% принято введенное количество парацетамола - 0,2 г
Таблица 2
Результаты количественного определения парацетамола (таблетки) при его биодеструкции адаптированными клетками
Время инкубации, сутки Содержание парацетамола, %
И егугНгорокь ИЭГМ 767 Я гиЬег ИЭГМ 77 Я егуМгороЫз ИЭГМ 767 и Я гиЬе> ИЭГМ 77
0 100,00* 100,00* 100,00*
1 8,97±1,43 58,30±4,85 33,01 ±3,23
2 1,82±1,09 32,64±3,48 15,47±1,05
3 0,07±0,005 18,42±3,11 8,05±!,73
4 0,03±0,001 9,10±2,02 2,12±0,17
5 0,00 5,19±1,35 0,00
6 0,00 2,72±1,06 0,00
7 0,00 0,00 0,00
8 0,00 0,00 0,00
Примечание Каждый результат - среднее и»3-х значений
* За 100% принято введенное количество парацетамола - 0 2 г
Из литературных данных известно, что увеличение скорости процесса биодеструкции органических соединений возможно с
помощью биокатализаторов на основе иммобилизованных живых клеток микроорганизмов в «мягких» условиях, при которых сохраняется жизнеспособность и функциональная способность клеток. Нами в качестве носителя использован криогель поливинилового спирта, что обеспечивает иммобилизацию бактериальных клеток при физиологических значениях рН, оптимальной температуре и без применения Химических веществ. Каталитическую активность клеток родококков определяли и экспериментах по динамике биотрансформации парацетамола в субстанции и таблетках, отбирая пробы каждые 2 часа в течение эксперимента.
Использование клеток R. eiythropolis ИЭГМ 767, предварительно выращенных на феноле и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта, позволяет значительно ускорить (до 12 часов) процесс биодеструкции парацетамола, внесенного в виде субстанции (рис. 9 и 10). В то же время, продолжительность процесса с участием иммобилизовамных клеток R. ruber ИЭГМ 77, также адаптированных к фенолу, составляет более 24 ч. Изменение содержания парацетамола, внесенного в виде таблеток, с использованием адаптированных или чистых клеток R. eiythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 в этих же условиях значительно меньше. Возможно, влияние вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток, ингибирует процесс биотрансформации парацетамола иммобилизованными клетками.
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 ~ »2468 10 ,2 14 16 «К 20 22 24 Время инкубации, часы ВРемя ""кубации. часы
1 - субстанция, иммобилизованные адаптированные клетки;
2 - субстанция, иммобилизованные чистые клетки;
3 - таблетки, иммобилизованные адаптированные клетки;
4 - таблетки, иммобилизованные чистые клетки
Рис. 9. Изменение содержания парацетамола в культуральной среде при использовании иммобилизованных адаптированных и чистых клеток R. eiythropolis ИЭГМ 767
Рис. 10. Изменение содержании парацетамола в культуральной среде при использовании иммобилизованных адаптированных и чистых клеток Я.гиЬег ИЭГМ 77
Для реализации установленных в ходе эксперимента условий утилизации парацетамола актинобактериями рода КЬойососси.у в укрупненном масштабе разработана документация, регламентирующая процесс. Подготовлены технологические схемы процесса биодеструкции ЛС адаптированными иммобилизованными и адаптированными свободными клетками актинобактерий рода КИос/ососси.ч и лабораторный регламент утилизации парацетамола применительно к ферментационной установке «Фермус - 3» с загрузкой, в 30 раз превышающей загрузку при выполнении лабораторного эксперимента. На основе разработанной документации проведена утилизация субстанции парацетамола со сроком хранения более 5 лет и таблеток со сроком хранения более 3-х лет. Полученные результаты (табл. 3) свидетельствуют о возможности масштабирования объема ферментера и последующей промышленной реализации проекта.
Таблица 3.
Результаты количественного определения парацетамола (субстанции и таблетки) в культуральных средах в процессе биодеструкции на установке «Фермус - 3» при использовании адаптированных К. егуЛгороПи ИЭГ1У1 767
Время инкубации, Содержание парацетамола, %
сутки Таблетки Субстанция
0 93,50 98,67
1 50,42±2,87 83,15±3,05
2 27,65±2,31 65,19±3,17
3 11,90±2,14 57,97±3,12
4 1,18±3,04 24,45±2,45
5 0,00 1 1,60±2,21
6 0,00 2,30+2,17
Примечание. Каждый результат - среднее из 3-х значений
Параллельно в кульгуральной среде проводили количественное определение и-АФ, остаточное содержание которого в субстанции составляет 3,15% на 15 сутки. Скорость образования и содержание метаболита в культуральной среде в процессе биодеструкции парацетамола в таблетках значительно выше и его содержание на 11 сутки составляет 1,03%.
Свойства продуктов трансформации парацетамола. В течение эксперимента появляется, накапливается и укрупняется черный с серо-фиолетовым оттенком аморфный осадок. Температура плавления полученного осадка (шлама) находится в интервале 150-205нС (с разложением). Он практически нерастворим в воде, эфире и хлороформе, мало растворим в гексане и ацетонитриле, хорошо растворим в этилацетате, ацетоне, метиловом и этиловом спиртах, легко растворим в растворе аммиака и очень легко - в диметилсульфоксиде и
1 М растворе натрия гидроксида Растворы полученного осадка в спиртах окрашены в красно-коричневый цвет, в ацетоне, эфире и этилацетате имеют желто-оранжевую окраску, а в растворе аммиака -сине-фиолетовую
Конечный продукт трансформации парацетамола представлен сложной смесью веществ, ряд компонентов которых на данном этапе исследования не представляется возможным идентифицировать Их значения не совпадают со значениями Яг веществ, полученных при исследовании биотрансформации парацетамола в этих системах
Установлено, что осадок (шлам) не является токсичным для окружающей среды Значение ЬО50 составляет 3 ООО (2 400 - 3 800) мг/кг при внутрибрюшинном введении мышам Для сравнения 1Л>5о парацетамола в этих же условиях составляет 2 728 мг/кг При пероральном введении значение ЬО50 более 4 ООО мг/кг
Исследование на фитотоксичность при использовании в качестве тест-объектов семян и проростков травяных культур в результате обработки почвы осадком (шламом) показало, что биомасса исследуемых фитокультур и растений, выращенных на чистой сельскохозяйственной почве, значительно различается (табл 4 и 5)
Таблица 4
Влияние конечных продуктов биодеструкции парацетамола на вегетативное развитие овса
Показатель фитотоксичности Контроль Содержание конечных продуктов в почве*
0,25 г 0,5 г
Длина стебля, мм Длина корня, мм Биомасса сухая, г 64,1±1,58 49,4± 1,44 0,6838±0,27 116,7±5,45 125,4±8,13 62,4±4,74 58,1 ±6,23 0,6883±0,32 0,7205±0,38
Примечание Каждое значение - среднее определение при трехкратном повторении * Содержание исследуемых продуктов в 100 I почвы
Таблица 5
Влияние конечных продуктов биодеструкции парацетамола на вегетативное развитие гороха
Показатель фитотоксичности Контроль Содержание конечных продуктов в почве*
0,25 г 0,5 г
Длина стебля,мм Длина корня, мм Биомасса сухая,г 77,3±3,11 52,4±2,48 0,4865±0,26 95, 5±4,23 67,2±3,96 0,7759±0,15 110,9±5,73 76,4±4,15 0,9112±0,21
Примечание Каждое значение - среднее определение при трехкратном повторении * Содержание исследуемых продуктов в 100 г почвы
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что полученный после окончания процесса биодеструкции парацетамола шлам нетоксичен для животных и оказывает благоприятное воздействие на растения Возможно, что исследуемый продукт является дополнительным источником азота и углерода и может использоваться в качестве биодобавок к почве
ВЫВОДЫ
1 Установлено, что в качестве модельного соединения для изучения биодеструции JIC, производных фенола, может служить парацетамол, а актинобактериями деструкторами - штаммы Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и R erythropohs ИЭГМ 767, которые его эффективно метаболизируют
2 Установлено, что деструкция парацетамола протекает более эффективно при использовании адаптированных к фенолу и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков
3 Изучена динамика процесса биодеструкции парацетамола с использованием актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и R erythropohs ИЭГМ 767 Установлено, что штамм Rhodococcus erythropohs ИЭГМ 767 обладает более высокой биотрансформирующей активностью в отношении парацетамола При использовании свободных клеток родококков R erythropohs ИЭГМ 767 процесс деструкции парацетамола заканчивается через 10 суток, на адаптированных свободных клетках - через 5 суток, а при использовании иммобилизованных адаптированных- клеток в течение 14 часов эксперимента В тех же условиях скорость трансформация парацетамола клетками R ruber ИЭГМ 77 значительно ниже
4 Найдены оптимальные условия разделения парацетамола и возможных продуктов его деструкции методом ТСХ на пластинках Силуфол с использованием систем растворителей хлороформ-спирт этиловый 95% (8:2) и спирт этиловый 95%-аммиак 25%-вода (80.4 16) при детектировании УФ-светом и в парах йода
5. Разработаны методики количественного определения парацетамола и и-аминофенола в культуральных средах, позволяющие контролировать процесс биотрансформации для и-аминофенола - это спектрофотометрическое определение на основе реакции с и-ДМ АБА (относительная ошибка не превышает ± 2,09%), для парацетамола -методика с использованием ВЭЖХ (относительная ошибка не превышает ± 4,15%)
6 Изучены физико-химические свойства конечных продуктов процесса биодеструкции парацетамола (шлама) растворимость, температура плавления, значение рН среды. Исследование токсичности и фитотоксичности, показало, что эти продукты нетоксичны для
животных и оказывают благоприятное воздействие на растения, что может быть использовано в сельском хозяйстве
7 На основе проведенных биологических, химических и физико-химических исследований процесса биодеструкции парацетамола предложены технологические схемы утилизации его адаптированными и иммобилизованными клетками родококков и лабораторный регламент, которые реализованы при проведении процесса на ферментационной установке «Фермус - 3»
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1 Изучение возможности окислительной биодеструкции лекарственных средств, не пригодных к медицинскому использованию (на примере парацетамола) /ЕВ Вихарева, И Б Ившина, Л А Чекрышкина, ИИ Мишенина [и др] // Медико-биологические проблемы Центрального Черноземья Матер 69-ой конф - Курск -2004 - С 292-293
2 Биодеструкция парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus sensu stricto / ЕВ Вихарева, И Б Ившина, И И Мишенина, J1A Чекрышкина [и др ] //Человек и лекарство Тез докл XI Рос нац конгресса - Москва -2004 - С 16-17
3 Использование родококков для биодеструкции лекарственных средств /ЕВ Вихарева, И И Мишенина, Л А Чекрышкина [и др ] // Матер IX Международ экологической студенческой конф Экология России и сопредельных территорий Экологический катализ Новосибирск -2004 - С 204
4. Биоконверсия парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus sensu stricto ! И Б Ившина, Е В. Вихарева, Л А Чекрышкина, И И Мишенина [и др ] И Матер V Международ науч -практич конф Здоровье и образование в XXI веке - Москва Росс ун-т дружбы народов - 2004 - С 148
5 Изучение биодеструкции парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus /ЕВ Вихарева, Л А Чекрышкина, И И Мишенина [и др ] //Фармация -2004 -№5 -С 12-13
6 Биодеструкция непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств актинобактериями рода Rhodococcus sensu stricto / И Б Ившина, М И Рычкова, И И Мишенина [и др ] // Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико-фармацевтической промышленности Тез докл II конф - Новосибирск, 2004-С 119-122
7 Изучение динамики и скорости бактериальной деструкции парацетамола /ЕВ Вихарева, И И Мишенина, Ю В Данилов [и др ] // Матер XII Росс нац конгресса Человек и лекарство - Москва - 2005 -С 743
8 Кинетические параметры процесса биодеструкции парацетамола, непригодного к медицинскому использованию / И Б Ившина, М И Рычкова, И И Мишенина [и др ] // Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биопотенциал Тез докл. II Международ конф - Пермь-Казань - 2005 -С 86-87
9 Деградация парацетамола с истекшим сроком годности свободными клетками актинобактерий / И Б Ившина, JI А Чекрышкина, И И Мишенина [и др ] // Катализ в промышленности - 2006 - № 2 - С 44-49
10 Алканотрофные родококки как катализаторы процесса ) биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств / И Б Ившина, И И. Мишенина, М.И Рычкова [и др.] // Журнал прикладной микробиологии и биохимии - 2006 - Т 42 -№ 4. - С 392-395
11 Интенсификация процесса биодеструкции непригодного к медицинскому использованию парацетамола / И Б Ившина, JT А Чекрышкина, И И Мишенина [и др ] // Техническая химия Достижения и перспективы // Докл II Всероссийс. конф - Пермь - 2006. - С 54 -56
12. Кинетические параметры процесса биотрансформации парацетамола /ЕВ Вихарева, И.И Мишенина, Ю В Данилов [и др ] // Мат-лы XIII Росс нац конгресса- Человек и лекарство - Москва - 2006 -С 10
13 Оптимизация процесса биодеструкции парацетамола свободными клетками актинобактерий /ЕВ Вихарева, И И Мишенина, JI.A. Чекрышкина [и др.] // Сб. материалов XIV Рос. нац Конгресса «Человек и лекарство» - Москва - 2007 - С. 10-11
14 Оптимизация процесса биодеструкции парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus / ИИ Мишенина, J1А Чекрышкина, ЮН Карпенко [и др] // Вестник Пермской, государственной фармацевтической академии - 2007 - №2 — С 168171.
Подписано в печать 14 03 2008 Формат 60*90/16 Набор компьютерный Бумага ВХИ Тираж 100 экз Уел печ 1,25 л Заказ № 44/2008
Отпечатано на ризографе в типографии ГОУ ВПО ПГФА 614070, г Пермь, ул Крупской, 46, тел/факс 8-901-266-59-37
Оглавление диссертации Мишенина, Ирина Ивановна :: 2008 :: Саратов
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. СПОСОБЫ УТИЛИЗАЦИИ НЕПРИГОДНЫХ К МЕДИЦИНСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ПАРАЦЕТАМОЛА И я-АМИНОФЕНОЛА (Обзор литературы)
1.1. Характеристика непригодных к использованию лекарственных средств.
1.1.1. Бракованные лекарственные средства.
1.1.2. Лекарственные средства с истекшим сроком годности.
1.1.3. Фальсифицированные лекарственные средства.
1.2. Способы утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств.
1.2.1. Сжигание.
1.2.2. Слив в канализацию.
1.2.3. Захоронение на свалках и оборудованных местах. 1.2.4. Биологические способы уничтожения ксенобиотиков.
1.2.4.1. Использование микроорганизмов для биодеструкции
1.2.4.2. Характеристика актинобактерий рода Ккос1ососсш.
1.2.4.3. Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов.
1.2.4.4. Механизмы микробного окисления.
1.3. Методы анализа парацетамола и и-аминофенола.
1.3.1. Идентификация парацетамола.
1.3.2. Количественное определение парацетамола.
1.3.3. Методы анализа гс-аминофенола.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Характеристика объектов, вспомогательных материалов, оборудования и реактивов.
2.2. Методы исследования.
ГЛАВА 3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ БИОДЕСТРУКЦИИ
ПАРАЦЕТАМОЛА. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАЦЕТАМОЛА И и-АМИНОФЕНОЛА 3.1. Разделение парацетамола и возможных его метаболитов методом тонкослойной хроматографии.
3.1.1. Выбор оптимальной системы растворителей для разделения парацетамола и возможных продуктов его биодеструкции.
3.1.2. Способы детектирования.
3.1.3. Чувствительность способов детектирования.
3.1.4. Хроматографическое исследование возможных продуктов биодеструкции парацетамола.
3.2. Разработка методик количественного анализа парацетамола и и-аминофенола.
3.2.1. Изучение условий проведения реакции и-аминофенола с и-диметиламинобензальдегидом.
3.2.2. Определение и-аминофенола в культуральных средах спектрофотометрическим методом.
3.2.3. Количественное определение парацетамола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Выводы по главе 3.
ГЛАВА 4. БИОДЕСТРУКЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОЛА (на примере парацетамола) АКТИНОБАКТЕРИЯМИ РОДА ЯНОООСОССШ
4.1. Скрининг активного штамма и выбор объекта биодеструкции из группы ЛС производных фенола.
4.2. Изучение условий'биотрансформации парацетамола.
4.3. Влияние вспомогательных веществ на скорость биодеструкции парацетамола и жизнеспособность бактерий Ююс1ососсш.
4.4. Адаптация родококков к окислительному стрессу.
4.5. Использование адаптированных родококков для биодеструкции парацетамола в таблетках и субстанции.
4.6. Биодеструкция парацетамола иммобилизованными в полимерном криогеле родококками.
4.7. Разработка технологической документации и ее апробация при утилизации парацетамола на ферментационной установке «Фермус -3».
Выводы по главе 4.
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ШЛАМА, ОБРАЗУЮЩЕГОСЯ В ПРОЦЕССЕ БИОДЕСТРУКЦИИ ПАРАЦЕТАМОЛА
5.1. Физико-химические свойства шлама.
5.2. Исследование токсичности и фитотоксичности шлама.
Выводы по главе 5.
Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Мишенина, Ирина Ивановна, автореферат
Актуальность темы. В настоящее время в Российской Федерации остро обозначилась проблема утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств — фальсифицированных, забракованных, с истекшим сроком годности или потерявших свои потребительские свойства по тем или иным причинам.
Все некачественные лекарства признаются фармацевтическими отходами и подлежат обязательному уничтожению [28, 123, 180]. Анализ случаев уничтожения таких лекарственных средств на территории Российской Федерации в период с 1997 по 2005 показал отсутствие единой системы проведения этой процедуры и централизованных мест их хранения.
Научно обоснованные методики утилизации лекарственных средств, за исключением наркотических и психотропных, пока не разработаны. Используемыми на практике способами уничтожения являются слив в промышленную канализацию, сжигание на открытом воздухе или захоронение на свалках [91], при этом часто не учитывают физико-химические, токсические свойства лекарственных веществ и протекающие в процессе уничтожения химические процессы. Поэтому исследования по совершенствованию существующих и поиску новых путей утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств является актуальным.
Анализ исследований в области промышленной технологии показывает, что наряду с совершенствованием имеющихся методов большое внимание, особенно за рубежом, уделяется биологическим методам, за которыми признается несомненный приоритет по показателям эффективности и безопасности [92, 141].
Природные микроорганизмы используют для обезвреживания химических отходов, в первую очередь, нефтепродуктов [47], тяжелых металлов [51, 150], полихлорированных фенолов, фосфорорганических [162] и других химических соединений [97, 101, 166, 170].
Ведутся активные поиски новых микроорганизмов, адаптированных к развитию в присутствии чужеродных веществ и вызывающих их биотрансформацию [152, 153, 168].
В качестве эффективных биодеструкторов ксенобиотиков могут быть использованы актинобактерии рода Rhodococcus, которые являются обычными компонентами техногенно-загрязненных сред обитания. Родококки способны усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические вещества, в том числе предельные и ароматические углеводороды, фенолы, гетероциклические соединения, что делает использование этой группы микроорганизмов перспективными при разработке биологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств. Помимо поиска микроорганизмов-деструкторов токсических веществ, необходимо также изучение влияния на человека и окружающую среду промежуточных и конечных продуктов их трансформации.
Цель и задачи исследования. Оценка возможности использования актинобактерий для биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола.
Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:
1. Провести скрининг активных штаммов актинобактерий рода Rhodococciis-биодеструшоров веществ, производных фенола, и выбрать среди исследуемых лекарственных средств модельное соединение.
2. Разработать способы идентификации и количественного определения продуктов его биодеструкции.
3. Установить оптимальные условия процесса биотрансформации.
4. На примере модельного соединения изучить динамику процесса биодеструкции.
5. Изучить свойства конечных продуктов биодеструкции (шлама).
6. На основе полученных результатов разработать технологические схемы и лабораторный регламент процесса утилизации непригодных к медицинскому применению лекарственных средств.
Научная новизна. На примере парацетамола показана возможность биологического способа биодеструкции непригодных к медицинскому применению лекарственных веществ (JIB) и их препаратов.
Путем скрининга 82 бактериальных штаммов в качестве деструкторов выбраны 2 штамма актинобактерий рода Rhodococcus. Установлены оптимальные условия процесса: состав среды культивирования; влияние вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток парацетамола, на скорость его деструкции; адаптация родококков к фенолу, что расширяет перспективу их использования для биодеструкции других ЛВ, производных фенола. Получены биокатализаторы на основе иммобилизованных в полимерном криогеле поливинилового спирта клеток микроорганизмов, с участием которых идет значительное ускорение процесса биотрансформации парацетамола.
Разработаны методики анализа в культуральных средах: парацетамола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и его основного метаболита и-амиыофенола спектрофотометрическим методом, позволяющие контролировать динамику процесса.
Предложена схема трансформации парацетамола в процессе биодеструкции. Методом тонкослойной хроматографии доказано наличие в культуральных средах и-аминофенола, пирокатехина, гидрохинона, бензохинона и трех неидентифицированных веществ.
Изучены физико-химические свойства, токсичность и фитотоксичность конечных продуктов биодеструкции парацетамола (шлама). Работа поддержана грантом РФФИ № 04-04-96057.
Практическая значимость. По результатам выполненных исследований разработан лабораторный регламент и представлены технологические схемы утилизации парацетамола. Процесс утилизации парацетамола с положительным результатом апробирован в ОАО «Пермфармация» с использованием ферментационной установки «Фермус — 3» с загрузкой, в 30 раз превышающей загрузку при выполнении эксперимента (акт от 20.11.07 г.).
Результаты работы используются в учебном процессе Пермской государственной фармацевтической академии: в лекционном курсе и на лабораторных занятиях слушателей ФДПО, интернов и студентов на кафедрах фармацевтической технологии и фармацевтической химии ФДПО и ФЗО (акты от 05.04.05 г. и 01.11.07 г.), включены в лабораторный практикум студентов очного отделения биологического факультета Пермского государственного университета (акт от 20.12.07 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. Номер государственной регистрации 01.9.50 007417.
Апробация работы. Результаты и основные положения диссертационной работы доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; 69-й научно-практической конференции «Медико-биологические проблемы Центрального Черноземья», Курск, 2004; V Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2004; IX Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ», Новосибирск, 2004; XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2005; II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биопотенциал», Пермь-Казань, 2005; II Всероссийской научно-практической конференции «Техническая химия. Достижения и перспективы», Пермь, 2006; XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2006; XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2007; Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, 2007.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 6 статей (3 - в изданиях, рекомендованных ВАК).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Обоснование условий биологического способа деструкции JIB, производных фенола, на примере парацетамола как модельного соединения.
2. Способы оптимизации процесса деструкции парацетамола.
3. Методики анализа парацетамола и продуктов его биодеструкции в культуральных средах.
4. Результаты изучения свойств конечных продуктов деструкции парацетамола.
5. Технологические схемы и лабораторный регламент процесса биодеструкции парацетамола. 1
Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка биологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола"
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
1. Установлено, что в качестве модельного соединения для изучения биодеструции JIC, производных фенола, может служить парацетамол, а актинобактериями деструкторами - штаммы Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767, которые его эффективно метаболизируют.
2. Установлено, что деструкция парацетамола протекает более эффективно при использовании адаптированных к фенолу и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков.
3. Изучена динамика процесса биодеструкции парацетамола с использованием актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767. Установлено, что штамм Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 767 обладает более высокой биотрансформирующей активностью в отношении парацетамола. При использовании свободных клеток родококков R. erythropolis ИЭГМ 767 процесс деструкции парацетамола заканчивается через 10 суток, на адаптированных свободных клетках — через 5 суток, а при использовании иммобилизованных адаптированных клеток в течение 14 часов эксперимента. В тех же условиях скорость трансформация парацетамола клетками R. ruber ИЭГМ 77 значительно ниже.
4. Найдены оптимальные условия разделения парацетамола и возможных продуктов его деструкции методом ТСХ на пластинках Силуфол с использованием систем растворителей: хлороформ-спирт этиловый 95% (8:2) и спирт этиловый 95%-аммиак 25%-вода (80:4:16) при детектировании УФ-светом и в парах йода.
5. Разработаны методики количественного определения парацетамола и и-аминофенола в культуральных средах, позволяющие контролировать процесс биотрансформации: для и-аминофенола - это спектрофотометрическое определение на основе реакции с и-ДМАБА (относительная ошибка не превышает ± 2,09%); для парацетамола - методика с использованием ВЭЖХ (относительная ошибка не превышает ± 4,15%).
6. Изучены физико-химические свойства конечных продуктов процесса биодеструкции парацетамола (шлама): растворимость, температура плавления, значение рН среды. Исследование токсичности и фитотоксичности, показало, что эти продукты нетоксичны для животных и оказывают благоприятное воздействие на растения, что может быть использовано в сельском хозяйстве
7. На основе проведенных биологических, химических и физико-химических исследований процесса биодеструкции парацетамола предложены технологические схемы утилизации его адаптированными и иммобилизованными клетками родококков и лабораторный регламент, которые реализованы при проведении процесса на ферментационной установке «Фермус - 3».
Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2008 года, Мишенина, Ирина Ивановна
1. A.c. № 911091. Способ уничтожения органических отходов / Е.В. Пантелеев, А.Н. Кетов, Ю.С. Чекрышкин и др.; Перм. гос. техн. ун-т (СССР) 1982.-№9.-С. 161.
2. Адасова, E.JI. Государственная система контроля и учета токсичных химических отходов / E.JL Адасова, A.C. Беляновский // Хим.пром. 1993. -№ 3/4. - С. 8.
3. Акашкина, Л.В. Сертификация лекарственных средств / Л.В. Акашкина // Новая аптека. 2000.- № 9. - С. 157.
4. Активность штаммов-деструкторов ароматических соединений, иммобилизированных в гранулах агарового геля / В.И. Корженевич, О.В. Игнатов, А.Д. Миронов и др. // Прикл. биохимия и микробиология 1991.Т. 27, вып. 3.- С. 365 - 369.
5. Аладышева, Ж.И. Статистические данные по лабораторной экспертизе лекарственных средств за 2003-2005 годы / Ж.И. Аладышева, А.И. Лутцева, Н.В. Триус // Ведомости НЦ ЭСМП. 2006. - № 2. - С. 91-95.
6. Анализ ситуации по фальсифицированным, бракованным и лекарственным средствам с истекшим сроком годности в Пермской области / Е.В. Вихарева и др. // Рос. аптеки. 2002. - № 7. - С. 46 - 51.
7. Арзамасцев, А.П. Стандартные образцы лекарственных веществ / А.П. Арзамасцев, П.Л. Сенов. М.: Медицина, 1988. - 248 с.
8. Артамонов, А.Г. Переработка различных органических отходов в плазмохимическом реакторе / А.Г. Артамонов // Аппараты высокотемпературной техники: межвуз. сб. науч. тр. МИХМ. М., 1988. - С. 56-75.
9. Ахрем, A.A. Тонкослойная хроматография / A.A. Ахрем, А.И. Кузнецова. М.: Наука, 1965. - С. 175.
10. Бабошин, М.А. Кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas fluorescens / М.А. Бабошин, З.И. Финкелынтейн, Л.А. Головлева // Микробиология. 2003. - Т.72, № 2. - С. 194-198.
11. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях / В.Г. Грищенков, Р.Р. Гаязов, В.Г. Токарев и др. // Прикл. биохимия и микробиология. 1997,- Т.ЗЗ, вып. 2. -№4. - С. 423-427.
12. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок / Е.Г. Плотникова, О.В. Алтынцева, И.А. Кошелева и др. // Микробиология. 2001. - Т. 70, вып.З. - С. 61-69.
13. Беккер, С. Безопасное уничтожение высокотоксичных веществ / С. Беккер, Р. Дерре, Е. Штельт // Рос. хим. журн. 1993. - Т. 37, № 3. - С. 29-33.
14. Беликов, В.Г. Анализ лекарственных веществ фотометрическими методами. Опыт работы отечественных специалистов // Рос. хим. журн. (журн. Рос. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева). 2002 - Т. XLVI, №4. - С. 52-56.
15. Беликов, В.Г.' Спектрофотометрическое определение парацетамола /
16. B.Г. Беликов, A.A. Сами, Н.В. Соловей // Фармация. 1995. - Т. 44, № 3.1. C. 41-42.
17. Беличенко, Ю.П. Замкнутые системы водоснабжения химических производств / Ю.П. Беличенко. М.: Химия, 1990. - 208 с.
18. Бернадинер, М.Н. Огневая переработка и обезвреживание промышленных отходов / М.Н. Бернадинер, А.П. Шурыгин. М.: Химия, 1990. - 304 с.
19. Биологическая дегазация отравляющих веществ: материалы конф. Науч.-исслед. ин-тов НАТО (май 1991 г.). М., 1991. - С. 213-215.
20. Биологическая деструкция фенола, формальдегида, нефтепродуктов в промышленных сточных водах / В.У. Никоненко, Т.П.Чеховская, С.М. Федорик, П.И. Гвоздяк // Химия. 1987.- Т. 15, № 5. - С. 389 - 393.
21. Бирюков, В.В. Основные направления разработки аппаратуры для биосинтеза микробных метаболитов иммобилизованными клетками аэробных микроорганизмов / В.В. Бирюков, B.C. Барбот // Сборник научных трудов. Пущино, 1987. - С. 163-173.
22. Брусничкин, A.B. Определение п-аминофенола в препаратах Парацетамола при помощи термолинзовой спектрометрии / A.B. Брусничкин, М.А. Проскурин, Н.В. Орлова // Аналитика и контроль. 2004. - Т. 8, № 3. -С. 257-262.
23. Брысаев, A.C. Применение 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана для анализа и-аминофенола в парацетамоле / A.C. Брысаев, Л.Ш. Шакирова, С.Ю. Гармонов // Тез. науч. конф. Пущино, 2006. - С. 135-136.
24. Булатов, М.И. Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа / М.И. Булатов, И.П. Калинкин. -3-е изд., испр. и доп. Л.: Химия, 1972. - 407 с.
25. Варпаховская, И. Фальсификация лекарств — тень кризиса / И. Варпаховская //Ремедиум. 1999. - № 2. - С. 38-39.
26. Веслопалова, Е.М. Микрометод определения численности колониеобразующих микроорганизмов / Е.М. Веслопалова // Микробиология. 1995. - Т.64, № 2. - С. 279-284.
27. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон / Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, В.В. Ильинский и др. //Микробиология. 1994. - Т. 63, вып. 3. - С. 917- 922.
28. Вихарева, Е.В. Проблемы загрязнения окружающей среды / Е.В. Вихарева, В.Ф. Олонцев // Современные проблемы экологии. V Междунар. конф.: Волгоград-Пермь, 2001.
29. Вихарева, Е. Анализ ситуации по фальсифицированным, бракованным препаратам и лекарственным средствам с истекшим сроком годности (напримере Пермской области) / Е. Вихарева, А. Солонинина, JL Чекрышкина // Российские аптеки. 2002. - № 7. - С. 46-51.
30. Влияние иммобилизации на метаболизм ксенобиотиков / В.И. Корженевич и др. // Прикл. биохимия и микробиология. 1991. - Т. 34, № 3. -С. 251-255.
31. Влияние фенола и 5-метилрезорцина на канцерогенное воздействие бенз(а)пирена // Изв. АН СССР. Сер. Химия и геология.- 1973. Т. 22, № 3. -С. 224 - 229.
32. Внукова, В.А. Фальсифицированные и контрафактные лекарственные средства: определяемся с терминами // Новая аптека. Эффектив. управ. Норматив, док. 2005. - № 9. - С. 40-45.
33. Возможные биотехнологии: перспектива на ближайшие несколько лет // Экологическая биотехнология: пер. с англ. /под ред. К.Ф. Форстера, Д.А.Дж. Вейва. Л.: Химия.- 1990.- С.340.
34. Волченко, Е.В. Экологические аспекты микробной деструкции ароматических ксенобиотиков / Е.В. Волченко, В.И. Корженевич, И.Н. Сингирцев // Хим.-фармац. пр-во: обзор, информ. Вып. 2. - М.: НИИСЭНТИ, 1995. - 22 с.
35. ВФС 42-2253-99. Сироп парацетамола 2,4% / Гос. инспекция за качеством лекарственных средств и изделий мед. Техники, Фармакопейный комитет. М., 1999. - 7 с.
36. Гаврин, А.Ю. Изучение особенностей процесса иммобилизации алканотрофных родококков в полимерном криогеле / А.Ю. Гаврин, И.Б.
37. Ившина, М.С. Куюкина // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: сб. тр. молодых ученых. Пермь, 2004. - С. 85-93.
38. Галицкая, И.В. Экологические проблемы обращения и утилизации бытовых и промышленных отходов / И.В. Галицкая // Геоэкология. 2005. -№2.-С. 144-147.
39. Гвоздев, В.Д. Очистка производственных сточных вод и утилизация осадков / В.Д. Гвоздев, Б.С. Ксенофонтов. М.: Химия, 1988. - 112 с.
40. Гвоздяк, П.И. Иммобилизованные микроорганизмы в очистке сточных вод от ксенобиотиков / П.И. Гвоздяк // Сборник научных трудов. Пущино, 1987.-С. 57-61.
41. Государственная фармакопея СССР / М-во здравоохранения СССР. -10-е изд. М.: Медицина, 1987. - 1080 с.
42. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа. / М-во здравоохранения СССР. - 11-е изд. - М.: Медицина, 1987.- 334 с.
43. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. / М-во здравоохранения СССР. 11-е изд. - М.: Медицина, 1987. - 398 с.
44. Губергриц, М.Я. Превращение канцерогенных веществ в биосфере / М.Я. Губергриц, У.Э. Кирсо, Л.П. Пальме. М.: Знание, 1975. - 64 с.
45. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Шюйососст егугкгороИх НЬ РМ-1 / А.Е. Китова, Т.Н. Кувичкина, А.Ю. Аринбасарова, А.Н. Решетилов // Прикл. биохимия и микробиология. -2004. Т. 40, № 3. - С. 307-311.
46. Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями / И.С. Звягинцева и др. // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 3. - С. 321-328.
47. Доронин, С.Ю. Проблемы аналитической химии / С.Ю Доронин, Р.К. Чернова, А.Н.Панкратов // Мустафинские чтения: сб. науч. тр. / под общ. ред. Р.К. Черновой, А.Н. Панкратова. Саратов: Изд-во Саратовск. ун-та. - 1999. -С. 37-39.
48. Доронин, С.Ю. Фотометрический анализ парацетамола на содержание примеси и-аминофенола / С.Ю. Доронин, H.H. Гусакова, Р.К. Чернова // Фармация. 2001. - № 3. - С. 35-37.
49. Ившина, И.Б. Бактерии рода Rhodococcus: биоразнообразие, иммунодиагностика, детекция : дис. . д-ра биол. наук / И.Б. Ившина. Пермь, 1997. - 197 с.
50. Илялетдинов, А.Н. Микробиологическая очистка промышленных сточных вод иммобилизованными клетками микроорганизмов-деструкторов / А.П. Илялетдинов, P.M. Алиева // Сборник научных трудов. Пущино, 1987. -С. 62-71.
51. Илялетдинов, А.П. Микробиология и биотехнология очистки промышленных сточных вод / А.П. Илялетдинов, P.M. Алиева. Алма-Ата: Гылым, 1990. - 224 с.
52. Иммобилизация уксуснокислых бактерий на углеродных волокнах и использование их для трансформации тиодигликоля / Н.Г. Медведев, Ю.А. Гриднева, A.A. Лысенко, В.И. Сухаревич // Биотехнология. 2001. - №5. -С. 51-57.
53. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. М.: Изд-во МГУ, - 1994. - С. 288294.
54. Инструктивные указания по проведению газобиохимических поисковых работ на нефть и газ / под ред. Г.А. Могилевского, Е.В. Стадника. М.: ОНТИ ВНИИЯГГ, 1974.- 116 с.
55. Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов для получения этанола / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, Г.П. Бачурина и др. //
56. Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: сб. науч. тр. Пущино, 1987. - С. 87-95.
57. Кабиров, P.P. Разработка и использование многокомпонентной тест-системы для оценки токсичности почвенного покрова городской территории / P.P. Кабиров, А.Р. Сагитова, Н.В. Суханова // Экология. 1997. - № 6. - С. 408-411.
58. Казакова, E.H. Биодеградация углеводородов в нефтезагрязненной почве северной тайги / E.H. Казакова, И.Г. Калачникова, Т.А. Масливиц // Влияние промышленных предприятий на окружающую среду. Пущино, 1984.-С. 84-85.
59. Каталог штаммов региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / под ред. И.Б. Ившиной.- М.: Наука, 1994.163 с.
60. Киреева, H.A. Комплексное биотестирование для оценки загрязнения почв нефтью / H.A. Киреева, М.Д. Бакаева, Е.М. Тарасенко // Экология и пром-сть России. 2004. - февраль. - С. 26-29.
61. Кирхер, Ю. Тонкослойная хроматография / Ю. Кирхер. Т.1. - М.: Мир, 1981.-616 с.
62. Кирхер, Ю. Тонкослойная хроматография / Ю. Кирхер. Т.2. - М.: Мир, 1981.-528 с.
63. Кислицин, А.Н. О химизме жидкофазного окисления а-пинена кислородом воздуха / А.Н. Кислицин, И.Н. Клабукова, А.Н. Трофимов // Химия раст. сырья. 2004. № 4. - С. 109-116.
64. Классы опасности не пригодных к использованию лекарственных средств для окружающей природной среды / Е.В. Вихарева, A.B.
65. Солонинина, Ю.Л. Данилов и др. // Материалы XII нац. Конгресса: Человек и лекарство. М., 2005. - с. 743.
66. Кобрин, В.С. Опасные органические отходы (технология управления) = Hazardous Organic Wastes (Management Technology): аналит. обзор / B.C. Кобрин, Л.И. Кузубова; СО РАН, ГПНТБ, НИОХ. Новосибирск, 1995.- 122 с. - (Сер. Экология. Вып. 35).
67. Количественный учет априорноизвестной информации методом наименьших квадратов / М.Г. Левин, А.И. Гризодуб, В.П. Георгиевский // Журн. аналит. химии. 1993. - Т.48, № 4.- С. 599-609.
68. Коренман, И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений / И.М. Коренман. М.: Химия, 1970. - 334 с.
69. Коронелли, Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде // Микробиология. 1996. -Т. 32, № 6. - С. 579-585.
70. Крыловецкая, С.В. Контроль качества, эффективности и безопасности лекарственных средств // Новая аптека. Аптека и рынок. 2000. - № 1. - С. 25-28.
71. Мазеин, В.Т. Проблемы фальсификации на фармрынке России // Фармац. вест. 2006. - № 11. - С. 26-27.
72. Мазеин, В.Т. Фальсифицированные ЛС: итоги 2006 г. // Рос. аптеки. -2007. № 9. - С. 8-9.
73. Мамина, Д.Х. Пути утилизации твердых бытовых отходов // Промышленные и бытовые отходы: проблемы хранения, захоронения, утилизации, контроля: 8 междунар. науч.-практ. конф., 25-26 февраля 2004 г.: сб. материалов. Пенза: Пенз. Дом знаний, 2004. - 121 с.
74. Методы общей бактериологии / под ред. Ф.Герхардт. М.: Мир, 1983. -224 с.
75. Мешковский, А.П. Осторожно: поддельное лекарство // Мед. курьер. -1998. -№ 1.-С.48.
76. Мешковский, А.П. Фальсифицированные лекарства: состояние проблемы // Фарматека. 1998. - № 1. - С. 9-13.
77. Наумова, Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений / Р.П. Наумова. — Казань: Изд-во Казан, ун-та, 1985.- 240 с.
78. Некрасова, С.В. Проблемы организации контроля качества и сертификации лекарств на российском фармацевтическом рынке // Эконом, вестн. фармации.- 2000.- № 11.- С. 30 40.
79. Нестеренко, О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. Киев: Наук, думка, 1985. -336 с.
80. Неугодова, О.П. Токсикологическая оценка парацетамола / О.П. Неугодова, Г.В. Цариченко, Г.П. Сахарова // Фармакология и токсикология. -1984.-№6.-С. 118.
81. Образование водорода термофильными анаэробными бактериями Clostridium thermosaccharolyticum, иммобилизованными в криогель поливинилового спирта / О.А. Никитина, С.С. Зацепин, С.В. Калюжный и др. //Микробиология. 1993. - Т. 62, № 3. - С. 477-489.
82. Окислительный катализ в высокотемпературных ионных расплавах / Ю.С. Чекрышкин, Т.А. Роздяловская, А.А. Федоров, Г.В. Лисичкин // Успехи химии. 2007. - Т. 76, № 2. - С. 169-182.
83. Определение и-аминофенола в парацетамоле по реакции с резорцином при помощи термолинзовой спектрометрии / М.А. Проскурин, В.В. Кузнецова, Н.В. Орлова, А.В. Пихтарь // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. -2001.-Т. 42, № 1.-С. 30-32.
84. Перспективы использования геологической среды в проблеме уничтожения химического оружия / И.Б. Евстафьев, А.И. Рыбальченко, Ю.К. Шипулин, И.Н. Торгун // Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. -1991. Т. 36, № 2. - С. 174-178.
85. Пимкин, В.Г. Термическое обезвреживание токсичных технологических выбросов. Промышленная экология / В.Г. Пимкин, Д.Г. Артамонов, А.П. Кулешов // Хим. пром-сть. 2003. - Т. 80, №4. - С. 24-32.
86. Плазмохимическая переработка отходов хлорорганических производств / A.M. Тухватуллин, Ю.В. Изингер, И.В. Берегнева и др. // Хим. пром-сть. 1988. - № 9. - С. 61.
87. Превращение флуорена бактериями рода Rhodococcus. / З.И. Финкелынтейн, Б.П. Баскунов, Е.Л. Головлев и др. // Микробиология. -2003. Т. 72, № 6. - С. 746-751.
88. Об утверждении Инструкции о порядке уничтожения лекарственных средств: приказ М-ва здравоохранения Рос. Федерации от 15.12.02., № 382 // Сборник основных нормативных актов по фармацевтической деятельности (Доп. 7). СПб., 2003. С. 450-452.
89. Применение микроорганизмов для деструкции опасных веществ, загрязняющих окружающую среду / А.Т. Харечко, В.И. Мягких, Ю.И. Остроумов и др. //Рос. хим. журн. 1995. - Т. 37, № 3. - С. 37-40.
90. Прозоровский, B.B. Экспресс метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки / В.В. Прозоровский, М.П. Прозоровская, М.В. Демченко // Фармакология и токсикология. 1978. - № 4. - С. 497-502.
91. Пропаноокисляющие родококки / И.Б. Ившина, P.A. Пшеничнов, A.A. Оборин. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. - 125 с.
92. Решетников, С.Н. Проблемы борьбы с фальсификацией лекарственных средств в России / С.Н. Решетников: материалы II между нар. форума. М., 2003. - С. 131-132.
93. Романенко, В.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов: ла-боратор. рук. / В.И. Романенко, С.П. Кузнецов. JL: Наука, 1974. - 194 с.
94. Ротмистров, М.Н. Микробная деструкция синтетических органических веществ / М.Н. Ротмистров, П.И. Гвоздяк, С.С. Ставская. -Киев: Наукова думка, 1975. 224 с.
95. Рубашко, Г.Е. Оптимизация процесса деградации флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 / Г.Е. Рубашко, М.П. Коломыцева, JI.A. Гоголева // Прикл. биохимия и микробиология. 2006. - Т. 42, № 4. - С. 448451.
96. Руководство по безопасному уничтожению ненужных фармацевтических препаратов во время и после экстренных ситуаций / ВОЗ. -М., 1999.-27 с.
97. Рыбкина, Д О. Деструкция хлорбензоатов почвенными бактериями / Д.О. Рыбкина, Е.Г. Плотникова, В.А. Демаков // Объедин. науч. журн. 2003.- № 1. С. 73-82.
98. Рыбкина, Д.О. Характеристика штамма Р25 деструктора полихлорированных бифенилов / Д.О. Рыбкина, Е.Г. Плотникова // Биология- наука XXI века: материалы 6-й Пущинской школы конф. молодых ученых.- Пущино, 2002. С. 56.
99. Савельева, О.В. Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов: сб. тр. науч. конф. / О.В. Савельева, И.Б. Котова Моск. гос. ун-т.- М.: Диалог, 2000. - 82 с.
100. Саноцкий, И.В. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений / И.В. Саноцкий, И.П. Уланова. -М., 1985.-328 с.
101. Спектрофотометрическое и хроматографическое определение п-аминофенола в парацетамоле / М.И. Евгеньев, С.Ю. Гармонов, Л.Ш. Шакирова, А.С. Брысаев // Хим.-фармац. журн. 2000. Т. 34, № 5. - С. 52-54.
102. Тян, А.Т. Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов: сб. тр. науч. конф / А.Т. Тян, A.JI. Брюханов.- Моск. гос. ун-т. М.: Диалог, 2000. -82 с.
103. Удальцова, Г.И. Пути решения проблемы обеспечения безопасности уничтожения опасных веществ за рубежом / Г.И. Удальцова, В.И. Холстов, С.Г. Григорьев //Рос. хим. журн. 1993. - Т. 27, № 3. - С.43-50.
104. Филиппова, И.С. Фальсификаты: масштаб распространения в условиях глобализации // Ремедиум. 2005. - № 9. - С. 68-71.
105. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И.Б. Ившина, М.В. Бердичевская, JI.B. Зверева и др. // Микробиол. 1995. - Т.64, № 4. - С. 507-513.
106. Федеральный Закон Рос. Федерации «О лекарственных средствах» (в ред. Федерального закона от 22.08.04 № 122-ФЗ). Взамен Федерального закона Рос. Федерации «О лекарственных средствах» (№86-ФЗ от 22.06.98) //
107. Сборник основных нормативных актов по фармацевтической деятельности (Доп. 7). СПб., 2003. С. 481-483.
108. ФС 42-14031-06. Кислота ацетилсалициловая субстанция. / Гос. инспекция за качеством лекарственных средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. М., 2006. - 5 с.
109. ФС 42-3292-96. Парацетамол субстанция / Гос. инспекция за качеством лекарственных средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. Взамен ГФ X, ст.505. М., 1996. - 5 с.
110. ФС 42-3363-97. Таблетки парацетамола 0,5 г / Гос. инспекция за качеством лекарственных средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. Взамен ВФС 42-2131-92. М., 1997. - 7 с.
111. ФС 42-3659-98. Таблетки парацетамола 0,2 г и 0,5 г. / Гос. инспекция за качеством лекарств, средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. М., - 1998. - 7 с.
112. ФС 42-4421-00. Кислота салициловая субстанция / Гос. инспекция за качеством лекарств, средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. М., 2000. - 5 с.
113. ФСП 42-0008-1692-01. Парацетамол субстанция. ОАО «Фармакон» / Гос. инспекция за качеством лекарственных средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. М., 2001. - 5 с.
114. ФСП 42-0306-2366-02. Таблетки парацетамола 0,2 г и 0,5 г ЗАО «Медисорб» / Гос. инспекция за качеством лекарственных средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. М., 2002. - 7 с.
115. ФСП 42-13247-04. Парацетамол субстанция. Производитель Китай / Гос. инспекция за качеством лекарственных средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. М., 2004. - 5 с.
116. ФСП 42-1502-96. Парацетамол 250 Берлин-Хеми, свечи / Гос. инспекция за качеством лекарственных средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. М., 1996. - 7 с.
117. ФСП 42- 4491-95. Детский эликсир парацетамола / Гос. инспекция за качеством лекарственных средств и изделий мед. техники, Фармакопейный комитет. М., 1995. - 5 с.
118. Хабриев, Р.У. Качество лекарственных средств, поступающих на российский фармацевтический рынок / Р.У. Хабриев, Р.И. Ягудина // Фармация. 2003. - № 5. - С. 39- 40.
119. Хабриев, Р.У. Проблемы фальсификации лекарственных средств / Р.У. Хабриев, Р.И. Ягудина, Ж.Н. Аладышева // Фармация. 2000. - № 1. - С. 1822.
120. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья / Е.Г. Плотникова, Д.О. Рыбкина, JI.H. Ананьина и др. // Экология. 2006. - № 4. - С. 261-268.
121. Хацкин, С. Фалыпивотаблетчики // Ремедиум. 2000. - № 3. - С. 4-10.
122. Хроматография. Практическое приложение метода. 4.1: пер. с англ. / Э. Хефтман, Т. Кастер, А. Недервизер и др.; под ред. Э. Хефтмана. М.: Мир, 1986.-336 с.
123. Хроматография. Практическое приложение метода. 4.2: пер. с англ. / Хефтман, Т. Кастер, А. Недервизер и др.; под ред. Э. Хефтмана. М.: Мир, 1986. - 422 с.
124. Чекалева, И.И. Рынок фальсифицированных JIC в России: сегодня и завтра // Новая аптека. Аптека и рынок.- 2002. № 1.- С. 29-33.
125. Чекалева, И.И. Фальсификация JIC проблема решаемая // Новая аптека. Норматив, док. - 2001. - № 6. - С. 48-51.
126. Чекрышкина, Л.А. Хроматографический метод в фармацевтическом анализе: метод, пособие / Л.А. Чекрышкина, Н.И. Эвич. Пермь, 2005. - 71 с.
127. Шеховцова, Н.В. Кинетика роста Arthrobacter globiformis и Pseudomonasßuorescens на средах со стекловолокном / Н.В. Щеховцова, Д.Г. Звягинцев, Н.С. Паников // Микробиология. 1992. - Т.61, вып.6. - С. 9951004.
128. Эдельштайн, Е.А. Побочные действия лекарственных средств / Эделыдтайн, Е.А., А. Амудсен; ред. М.Н. Дюкса М.: Медицина, 1993. - С. 118-120.
129. Экологические аспекты использования алканотрофных родококков. Экологическая безопасность зон градопромышленных агломераций Западного Урала/И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, М.И. Рычкова. Пермь, 1993. -С. 29-32.
130. Экологические технологии: глубокое окисление органических азотсодержащих отходов на расплавленных катализаторах / Ю.С. Чекрышкин, Т.А. Роздяловская, А.А. Федоров, JI. А. Чекрышкина // Инженерная экология. 2005. - № 3. - С. 36-43.
131. Aldsworth, T.G. Bacterial suicide through stress / T.G. Aldsworth, R.L. Sharman, E.R. Dodd // Cell. Mol. Life Sci. 1996. - V.56. - P. 378-383.
132. Ausstellungsschwerpunkte im Themenpavillion Pharmaverpackung auf der Technopharm 2004 // Pharma + Food. 2004. - № 7. - C. 16.
133. Bozic, A. Problemática sezigalnih naprav = Термическая переработка токсичных отходов // Kov., Zlit., Tehnol. 1992. - Bd 26, №1-2. - P. 114-117.
134. Christie. J. etc. // Anal. Chim. Acta. 1993. - Vol. 53, №1. - P. 145- 150.
135. Dechets dangereux: programme de traitement par biodegradation. In.: Bio la letter des biotechnologies. 1998. - V. 196. - P. 67.
136. Dehalococcoides ethenogenes strain 195 reductively dechlorinates diverse chlorinated aromatic pollutants / D.E. Fennell, I. Nijenhuis, S.F. Wilson et. al. // Environ. Sci. and Technol. 2004. - 38, №7. - C. 2075-2081.
137. Degradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized on Biolite in packedbed reactor / M.B. Prieto, A. Hidalgo A. et al. // Journal of Biotechnology. 2002. - V.97. - P. 1-11.
138. Elder, D.J.E. The bacterial degradation of benzoic and benzene compounds under anaerobic conditions: Unifying trends and new perspectives / D.J.E. Elder, DJ. Kelly //Microbiology Reviews. 1994, Vol.13. - P. 441-468.
139. Fischer, H.F. Bundesforschungsanstalt fuer Landwirtschaft, Brunswick: Institut fuer Bodenbiologie / H.F. Fischer, D.M. Munnecke // BMFT-FB-T- 70046.
140. Gallizia I. Bacterial biodegradation of phenol and 2,4-dichlorophenol / I. Gallizia, S. McClean, I.M. Banat // J. Chem. Technol. and Biotechnol. 2003. -V.78. - № 9. - P. 956-963.
141. GAC biofilm reactor for the continuous degradation of 4-chlorophenol: treatment efficiency and microbial analysis / M.F. Carvalho, I. Vasconcelos, A.T. Bull et al. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2001. - V. 57. - P. 419426.
142. Hackl, R.P. Organometall / R.P. Hackl, F.R. Wright F.R. Chem., 1990. V. 4. - № 4. - P. 245-250.
143. Hazardous waste landfill construction: the state of the art / Th. Wrignt, D.E. Ross et al. // Standard Handbook of Hazardous Waste Treatment and Disposal. Ed. H.M. Freeman. N.Y.: McGrow-Hill Book Company, 1988. - P. 101-103.
144. Haggblom, Max M. // Microbiol. Ecol. 1989. № 2. - P. 147-159.
145. Heider, J. Microbial anaerobic aromatic metabolism. Anaerobe. 1997. -Vol. 3. - P. 1-22.
146. Hoyle, R. Biol. Technol., 1991, V. 9. № 11. - P. 1034.
147. Hundgers, E.E. //Clin. Chim. Acta. 1990. - V.187, №2. - P. 95-104.
148. Ilker, Uz. Characterization of naphthalene-degrading bacterium, Rhodococcus opacus M213 / Uz. Ilker, Y.P. Duan, A. Ogram // FEMS Microbiology Letters. 2000. - V. 185. - P. 231-238.
149. Ingerslev, F. Pharmaceuticals and personal care products: A source of endocrine disruption in the environment? / F. Ingerslev, E. Vaclavik et al. // Pure Appl. Chem.- 2003. Vol. 75. - Nos. 11-12. P. 1881-1893.
150. Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Philp J.C., Christofi N. // World J. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 14. - №1. - P. 307-312.
151. Janke, D. Nature and significance of microbial cometabolism of xenobiotics / D. Janke, W. Fritsche // J Basic Microbiology. 1985. - № 29. -P. 291-297.
152. Jorgensen S.E., Halling-Sorensen. B. Occurrence, Fate and Effects of Pharmaceutical Substances // Chemosphere. 2000. № 40. - P. 691-699.
153. Les substances pharmaceutiques dans les ecosystems aquatiques: presence, comportement et impact /Garric J., Ferrari B. // Techn., sci., meth. 2004. - № 11. - P. 47-58.
154. Lindstrom, E.B., Gunneriusson L. J. Ind. Microbiol. 1990. - V. 5. - № 6. - P. 375-382.
155. Lozinsky, V.I. Cryogels on the basis of natural and synthetic polymers: preparation, properties and applications // Russian Chemical Reviews. 2002. -№6.-P. 489-511.
156. Methanogenic biodégradation of selected aminobenzoates / S.V. Kalyuzhnyi, V.I. Sclyar V.I. et al. // INTAS 1999.
157. Michael Warhurst A. and Charles A. Fewson. Biotransformations Catalyted by the Genus Rhodococcus II Critical Reviews in Biotechnology. -1994. V. 14. -№ 1. - P. 29-73.
158. Mueller JG, Chapman PJ, Blattmann BO, Pritchard PH. Isolation and characterization of a fluoranthene-utilizing strain of Pseudomonas paucimobilis // Appl. Environ Microbiol. 1990. - V. 56. - № 4. - P. 1079-1086.
159. Mueller J.G. Action of a Fluoranthene-Utilizing Bacterial Community on Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Components of Creosote. / J.G. Mueller, P.J. Chapman, P.H. Pritchard // Appl Environ Microbiol. 1989. - V. 55. - №12. - P. 3085-3090.
160. Munnecke, D.M. Appl. And Environ. Microbiol. 1977. - V. 33. - № 3. -P. 503-507.
161. Munnecke, D.M. Process Biochem. 1978. - V. 13. - № 1. - p. 16-19.
162. Occurrence Fate and Effects of Pharmaceutical Substances in the Environment / B. Halling-Sorensen, S.P. Nielsen et al. // Chemosphere. 2001. -№36.-P. 357-393.
163. Paskard, T. The measurement of respiratory electron-transport activity in marine phytoplankton // J. Mar. Res. 1971. - V.29. - P. 235-244.
164. Simultaneous LC determination of paracetamol and related compounds in pharmaceutical formulations using a carbon-based column / Monser Lotfi, Darghouth Frida // J. Pharm, and Biomed. Anal. 2002. - V. 27. - №6. - P. 851-860.
165. Strigfellow W., Aitren M.D. Competitive metabolism of naphthalene, methylnaphthalenes and fluorine by phenanthrene-degrading Pseudomonas / W. Strigfellow, M.D. Aitren // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. - №1. - P. 357-362.
166. Thayer A.M. Chem. and Eng. News. 1991. - V. 69. - № 34. - P. 27-43.
167. The Metabolic Pathway of 4-Aminophenol in Burkholderia sp. Strain AK-5 Differs From That of Aniline and Aniline with C-4 Substituents / Shinji Takenaka, Susumu Okugawa et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 38. - №4. - P. 254-261.
168. Zhang Wei, Yang Xiang-hua, Hong Xin, Liu Yu-rong, Wang Zhan-yong // Liaoning shiyou huagong daxue xuebao/ J. Liaoning Univ/ Petrol. And Chem. Technol. 2004. - №1. - P. 4-7.