Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-фармацевтический анализ метотрексата и изучение его токсичности при гемобластозах у детей

На правах рукописи

Иванов Алексей Владимирович

Химико-фармацевтический анализ метотрексата и изучение его токсичности при гемобластозах у детей

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена в ММА им. И.М. Сеченова и в НИИ Детской Онкологии и Гематологии Государственного Учреждения Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н. Блохина РАМН

Научные руководители:

Академик РАМН, доктор фармацевтических наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Арзамасцев Александр Павлович Байкова Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Казьмина Эма Максимовна

Доктор медицинских наук, профессор Горожанская Эрна Гаспаровна

Ведущая организация: ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Защита диссертации состоится « » 2005 г. в часов на •

заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова (119019 г. Москва, Никитский б-р, 13).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ММА им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский пр-т, 49).

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор фармацевтических наук

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования Прогресс в детской онкологии связан в первую очередь с развитием химиотерапии. )спехи которой определили новые возможности лечения гемобластозов у детей. Химиотерапия превратилась из вида вспомогательной помощи в метод лечения, в большинстве случаев определяющий исход заболевания. Путь к улучшению результатов лечения лежит в интенсификации химиотерапии, «по увеличивает риск, связанный с её проведением. Это потребовало создания комплекса мер, направленных на профилактику и лечение осложнений, возникающих в процессе проведения химиотерапии, что является не менее важной и не менее сложной задачей, чем лечение рака (Л.А. Дурное, 2002,2004). Следовательно, искусство проведения высокодозной химиотерапии (ВДХТ), в первую очередь, связано не с формальным соблюдением режима введения питоста гиков в организм больного, а нрофилак такой и лечением острых и отсроченных осложнений химиотерапии.

Метогрексат (Mtx) является одним из самых эффективных циюстатических препаратов, относящихся к антиметаболитам фолиевой кислоты. Как лекарственное средство он известен с 1948 года (А.Альберт,1989). В России для использования в онкологической практике зарегистрировано десять его торговых марок. Выбор наиболее качественного из них. безусловно, является актуальной и важной задачей, ранение которой позволит сделать более безопасным и эффективным проведение ВДХТ. Проведение химико-фзрмацевшческого анализа Mtx, а лакже разработка экспресс-метода для его количественного определения в лекарственной форме (ЛФ) непосредственно перед началом лечения позволит полностью исключить введение'больным недоброкачественного препарата.

Mtx конкурентно ингибирует дигидрофолатредуктиу, превращающую фолиевую кислоту в тетрагидрофолат, в результате чего косвенно тормозится синтез нуклеиновых кислот и клеточное деление в S-фазе клеточного цикла (J.Holland et aJ., 1997; FLBast et a!., 2000) В связи со способностью Mtx проникать через гистогематические барьеры использование высоких и сверхвысоких лоз (1,0-12,0 г-'м:) этого препарата является ключевым фактором, позволяющим добиться излечения детей» страдающих гемобластозами. Однако наряду с высокой противоопухолевой активностью Mtx проявляет серьезные побочные -эффекты, главными из которых являются нейро-. нефро-, гепатотоксичность, миелодепрессия, поражения ЖКТ (И.Копосов, 2002). Фармакокинетп-ка Mtx таклее является принципиальным аспектом в развитии системной Mix токсичности и «.вязанной с ней смертностью. Именно потгому ВДХТ Mtx представляет собой именно тот случай, когда необходим тщательный терапевтический лекарственный мониторинг (ГЛМ) препарата и биохимических показателей токсичности в крови. Нейрогоксичносгь может быть дозолимши-рующим фактором, ограничивающим возможности противоопухолевого лечения Mtx. Известно, что в основе механизма иейротоксичности лежат различные поражения структур нервной ткани.

вызывающие нейрональную и аксональную деструктуризацию и демислииизацшо. Разработка

3

методологических подходов к диагностике и мониторингу нейротоксичности М1х на основе комплекса биохимических методов исследования является одной из важных задач. Следует отме-' тить, что в литературе отсутствуют работы, посвященные изучению биохимических маркеров нейротоксичности - N -ацетилнейраминовой (МЛНК) и ванилминдальной кислот (ВМК) в крови больных гемобластозами детей. В этом аспекте очевидна актуальность проведенного комплексного исследования.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка современных методов количественного определения метотрексата в инъекционных лекарственных формах различных фирм-производителей и сыворотке крови больных детей, страдающих гемобластозами, а также изучение его токсичности при новых высокодозных режимах применения.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод количественного определения М1х и его основного метаболита (7-ОН-М1х) в сыворотке крови больных при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2. Установить возможность применения флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа (ФПИА) для проведения количественного определения М1х в инъекционных ЛФ и разработать новый экспресс-метод его количественного определения.

3. Провести сравнительную оценку качества лекарственных препаратов М1х, применяемых в детской онкологии.

4. Провести сравнительную оценку методов количественного определения М1х в сыворотке крови и выбрать наиболее оптимальный для проведения ТЛМ М1х.

5. Изучить взаимосвязь между нарушением элиминации М1х и его метаболизмом у детей, страдающих гемобластозами.

6. У детей, страдающих гемобластозами, изучить динамику изменения биохимических показателей: нейротоксичности - МАНК и ВМК; общей токсичности - молекулы средних масс (МСМ); продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ) - малоновый диальдегид (МДА); антиоксидантного статуса - ретинол, токоферол и каталаза.

7. С помощью корреляционного анализа у детей, страдающих гемобластозами, изучить взаимосвязь биохимических показателей с ЭЭГ исследованиями и данными мониторинга М1х.

Научная новизна исследования

Впервые разработан экспресс-метод количественного определения М1х в инъекционных ЛФ с помощью ФПИА.

Впервые разработан метод количественного определения М1х и его основного метаболита 7-ОН-М1х в сыворотке крови больных с помощью ВЭЖХ.

Впервые изучен вклад Mtx в развитие нейротоксичности и общей токсичности у детей с гемо-бластозами. Выявлены биохимические маркеры: N-AHK, ВМК, МДА, каталазы, МСМ, позволяющие проводить оценку побочных действий при химиотерапии до их клинического проявления.

Впервые с помощью корреляционного анализа обнаружены взаимосвязи между метаболическими изменениями (показателями нейротоксичности, общей токсичности и СПОЛ), значением Mtx в сыворотке крови и ЭЭГ-данными у детей, страдающих гемобластозами.

Научно-практическая значимость исследования

Разработанный экспресс-метод количественного определения Mtx в ЛФ с использованием флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа позволяет в короткие сроки (20 минут) провести количественное определение, что исключает применение недоброкачественного препарата.

ВЭЖХ метод количественного определения соотношения концентраций Mtx и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови рекомендован для оценки и коррекции токсических проявлений метотрексата.

Разработанные методики биохимической диагностики общей токсичности и нейротоксичности предлагаются для выявления и корректирования побочных действий при химиотерапии Mtx. ' ,

Внедрение в практику

• Экспресс-метод количественного определения Mtx в ЛФ методом ФПИА применяется в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

• Методика определения метотрексата и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке! крови с помощью ВЭЖХ используется в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

• По результатам выполненных работ составлены отчеты в РФФИ (грант РФФИ № 01-0449828; № 00-15-97909 и НШ-1110.2003.01), подготовлены к изданию методические рекомендации.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены: на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004 г.); Н-ом и Ш-ем Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва 2003,2004 гг.); на Ш Съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Беларусь, Минск, 2004 г.); на XXII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2004 г.).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего источников. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (№, 01.200.110545) и экспресс-лаборатории НИИ ДОГ ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН «Изучение общих биохимических механизмов синдрома токсичности у детей, страдающих злокачественными опухолями» (№ 00-15-97909). Положения, выносимые на защиту:

• Метод количественного определения Mtx и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови больных с помощью ВЭЖХ;

• Обоснование возможности использования соотношения концентраций Mtx и 7-OH-Mtx в' качестве нового диагностического маркера для выявления ранней, бессимптомной токсичности организма при применении высокодозной химиотерапии Mtx у детей, страдающих гемо-бластозами;

• Результаты сравнительного анализа методов количественного определения Mtx в инъекционных ЛФ;

• Результаты сравнительного анализа препаратов Mtx, применяемых в детской онкологии и выпускаемых различными фирмами-производителями.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

- В работе для проведения сравнительной оценки качества использовались лекарственные препараты Mtx, применяемые для проведения ВДХТ у детей, страдающих гемобластозами, в НИИ ДОГ ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН: 1) раствор для инъекций Mtx 1000 мг в 10 мл «Lachema» (Чешская Республика); 2) раствор для инъекций Mtx 1000 мг в 10 мл «Teva» (Израиль); 3) концентрат для приготовления инфузий Mtx 1000 мг в 10 мл «Ebewe» (Австрия); 4) «Метотрексат-ЛЭНС» 1000 мг порошок (лиофилизированный) для приготовления инъекционного раствора фирмы «ЛЭНС - Фарм» (РФ).

В ходе работы в динамике обследовано 48 детей, страдающих гемобластозами (острый лим-фобластный лейкоз (ОЛЛ) и неходжкинская лимфома (НХЛ)) и получающих лечение по протоколу BFM-90, который был разработан группой ученых из крупнейших клиник Берлина, Франкфурта и Мюнстера в 1990 году, что и отражено в его названии. Средний возраст детей составил 10,6±1,2л.

Изучение динамики изменения биохимических показателей токсичности проводилось у детей, страдающих гемобластозами, которым впервые в НИИ ДОГ проводилось лечение по поводу основного заболевания. В обследуемую группу вошло 12 детей, из которых у 4-ех пациентов (33,3 %) был диагностирован ОЛЛ, а у 8-ми (66,7 %) - НХЛ. Исследование включало одновременное определение биохимических показателей (нейротоксичности и общей

токсичности) и ЭЭГ-анализа на протяжении всего лечения (до начала лечения, после первого (индукции) и второго (ВДХТ Mtx) курса химиотерапии, а также после окончания терапии).

Изучение вклада Mtx в развитие нейротоксичности проводилось у 15 детей, получающих терапию по программе BFM-90. Исследование включало одновременное определение концентрации Mtx на 48 час, после проведения двух последних курсов ВДХТ Mtx, и N-AHK. Параллельно обследовалась контрольная группа практически здоровых детей (11 человек). Средний возраст, которых составил 9,76 ± 1,6 лет.

Изучение взаимосвязи между метаболизмом Mtx и его токсическими проявлениями проводилось в сыворотке крови 21 больного гемобластозом, получающего ВДХТ этим препаратом. Биологический материал отбирался для анализа на основе полученной в нём концентрации Mtx на 48-ой час с момента его введения методом ФПИА и был разделен на две группы. В первую группу вошли пациенты, у которых концентрация Mtx в сыворотке крови, определенная методом ФПИА была больше 1,0 мкмоль/л. Эта группа составила 5 человек - 23,8 %. Во вторую группу вошли больные, концентрация Mtx в сыворотке крови которых была менее 1,0 мкмоль/л (16 человек - 76,2 %).

В работе были использованы следующие реактивы: Mtx фирмы ICN Biomedicals (USA); ацето-j нитрил (Merk); кислота лимонная (х.ч.); калия гидрофосфат (х.ч.); кислота фолиевая марки (х.ч.); пакеты реагентов для определения Mtx методом ФПИА (Abbott кат. № 34-0001); стандартные растворы Mtx и калибраторы (Abbott кат. № 34-0003); натрия дигидрофосфат (Merk); трифторуксусная кислота (Sigma); тиобарбитуровая кислота (Sigma); о-фосфорная кислота (85%, ч.д.а.); н-бутанол (х.ч.); резорцин (х.ч.); кислота хлороводородная (37%, х.ч.); сульфат меди (II) (х.ч.); бутилацетат (х.ч.); кислота трихлоруксусная (х.ч.); N-AHK (Sigma); а-токоферола ацетат (Fluka); ретинол (Fluka); набор реагентов для спектрофотометрического определения ВМК (BioRad); молибдат аммония (х.ч).

Методы исследования. Для количественного определения Mtx в инъекционных лекарственных формах использовался метод ВЭЖХ на хроматографе Bischoff (Швейцария) и метод ФПИА на приборе фирмы «Abbott» TDx/FLx. Концентрация определялась методом внешнего стандарта.

Для количественного определения Mtx и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови использовался метод ВЭЖХ на хроматографе Hewlett-Packard 1050. Концентрация определялась методом абсолютной калибровки.

Во всех исследованных группах больных и контрольных лиц проведено изучение уровней концентрации: МДА (методом M.Mihara et al., 1980); N-AHK (Сорокина Е.Г., 1993) с некоторыми изменениями - метод был автоматизирован и выполнялся на приборе Stat Fax 1904; МСМ (методом Габриелян Н.И., 1983); совместное определение витаминов А и Е в одной пробе (метод Черняускене, 1984); ВМК в суточной моче (метод компании Bio-Rad, 1994); активность каталазы

определяли в эритроцитах (методом Beers R.S., Sizer J.W., 1994).

7

В работе использовали спектрофотометры «Beckman» Du-650 (США) и СФ-46, спектро-флуориметр Perkin-Elmer LS 50 (США), полуавтоматический биохимический анализатор Stat Fax 1904 (США) и автоматические анализаторы «Abbott» (США): флуоресцентно-поляризационный иммуноанализатор FLx, гематологический - Cell-Dyn 3700 и биохимический - Alcyon 300.

Статистическую обработку результатов исследования и корреляционного анализа проводили с помощью пакета прикладных программ для персонального компьютера Statistica 6 и программ пакета Microsoft Office XP - Excel. Сравнительную оценку методов количественного определения метотрексата в сыворотке крови проводили по ФС: «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний» (ГФ XI).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработка метода количественного определения метотрексата и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови больных.

Для определения концентрации Mtx методом ВЭЖХ в сыворотке крови проводили пробоподго-товку. В стеклянные пробирки отбирали 400 мкл сыворотки крови, затем для осаждения белков; добавляли 800 мкл ацетонитрила. Пробирки закрывали и интенсивно встряхивали 30 сек на вор-тексе, затем центрифугировали (3 мин., 3000 об/мин). Надосадочную жидкость переливали и добавляли к ней 16 мл хлороформа. Пробирки закрывали и интенсивно встряхивали (30 сек) на вортексе, затем центрифугировали при 8 С, 5 мин., 3000 об/мин. Одновременное охлаждение при центрифугировании позволяло обеспечить большую чистоту образцов. Для хроматографии отбирали 30 мкл водного слоя. Экстракция Mtx из сыворотки крови составила 82 %.

Определение Mtx проводилось на хроматографе Hewlett-Packard (hp) 1050;

Условия хроматографии: УФ-детектор hp с переменной длиной волны; интегратор hp 3396 А. Использовали колонку HyPersil ODS C|g 5 мкм, 200 х 4,6 мм. Температура колонки 40 °С, длина волны детекции 302 нм. Длина петли 20 мкл. Скорость потока 1,2 мл/мин. Подвижная фаза состояла из смеси фосфатного буфера, ацетонитрила и 0,1 % раствора трифторуксусной кислоты.

Приготовление подвижной фазы: к 450 мл 0,05 М раствора NaH2PO4 добавляли 65 мл ацетонитрила и 0,5 мл трифторуксусной кислоты.

Вычисление результатов. Концентрация Mtx определялась методом абсолютной калибровки. Стандартные растворы готовили следующим образом: точную навеску (1,85 мг) Mtx стандарта растворили в 4,0 мл подвижной фазы, из полученного стандартного раствора приготовили 6 калибровочных концентраций путем добавления различных объёмов стандартного раствора 400 мкл чистой сыворотки. Концентрации раствора Mtx для построения калибровочной кривой были следующие: С| = 2965,4; С2 = 1584,25; С3= 660,86; С4 = 257; С5 = 136,1; С6 = 25,7 нг/мл (рис. № 1). Образцы для построения калибровочной кривой и анализируемые образцы сыворотки крови больных обрабатывались идентично. ;

Рис. № 1. Калибровочная кривая Mtx. Рис. № 2. Суточная моча до введения Mtx. Рис. № 3. Моча через 24 ч. после введения Mtx.

2500000 ------------------------------------, |

2000000

1SOOOOO

|

=1000000 I ■

0 500 1000 \500 2000 2500 3000 нг/мл

«8 3 ^—

!

Mtx

На рис. № 1 по оси абсцисс — концентрация метотрексата, нг/мл; по оси ординат — площадь пика.

7-Olf-Mlx

3

7-ОН-Мгч

г-

Эндогенные вещества

I Эшкемкые ишссти

ЭНКвГ«»»» •■*!

Рис. Xs 4. Моча, 48 ч. после Mtx. Рис. № 5. Сыворотка, 48 ч. после Mtx. Рис. J4s 6. Сыворотка без Mtx. Рис. № 7. Стандарт Mtx.

В связи с недоступностью коммерческого образца основного метаболита Mtx (7^^ Mtx) его концентрацию определяли по калибровочной кривой Mtx, считая коэффициент молярного поглощения равным 1,0 по отношению к Mtx. Идентификация 7-ОН- Mtx проводилась по данным литературы, согласно порядку выхода соединений (1, - Mtx, 2 - 7-OH-Mtx) в работах реализующих аналогичный обратнофазный метод определения. Дополнительно для идентификации использовали полученные нами и описанные в литературе различные соотношения Mtx/7-OH-Mtx в крови и моче (рисунки № 2 - 4).-

Как видно из рисунка № 2 в суточной моче нет никаких эндогенных веществ, мешающих определению Mtx и 7-OH-Mtx. Из рис. № 3 видно, что в моче, собранной во время суточного введения препарата, содержится более высокая концентрация Mtx по сравнению с 7-OH-Mtx. На следующие сутки в этой же моче концентрация метаболита значительно возрастает (рис. № 4),,

тогда как уровень действующего вещества снижается, но по-прежнему остается больше, чем' концентрация его метаболита. В сыворотке крови, взятой через 48 часов после введения Mtx, ситуация обратная: 7-OH-Mtx значительно меньше, чем самого Mtx (рис. № 5).

Аналитическая пригодность метода была установлена по следующим критериям: специфичность,воспроизводимость, чувствительность ипригодностьхроматографической системы. Специфичность была подтверждена при анализе трех образцов плазмы, взятой у доноров (рис. № 6). Хроматограммы чистых образцов плазмы сравнивали с хроматограммами, полученными после добавления к этим образцам стандарта Mtx (рис. № 7) для того, чтобы удостовериться, что эндогенные вещества не дают перекрестной реакции с интересующим аналитом. В связи с тем, что все больные на фоне терапии Mtx получали также кальция фолинат (лейковорин) и фуросемид (лазикс), мы провели хроматографический анализ образцов плазмы с добавлением этих веществ. Полученные хроматограммы сравнивались с хроматограммой стандарта Mtx в сыворотке крови. Установлено, что ни кальция фолинат, ни фуросемид не мешали определению Mtx и 7-OH-Mtx.

Оценка воспроизводимости проводилась на высоких 2500 нг/мл и низких 27,5 нг/мл концентрациях; выражалась как процент стандартного отклонения последовательной серии измерений референсного раствора Mtx и составила 2,77 и 17,11 %, соответственно.

Для оценки чувствительности проводилось определение наименьшего количества анализируемого вещества, которое отличается от нуля, для Mtx это значение составило 0,8 10'3 мг/мл.

Для оценки пригодности хроматографической системы проводилось определение фактора симметрии, времениудерживания, эффективности колонки и очевидного числа теоретических,

тарелок. Фактор симметрии стандартного раствора Mtx составил 1,07. Время удерживания стандартного раствора Mtx в сыворотке крови (п = 6) 10,81 +/- 0,17 мин. Эффективность колонки и очевидное число теоретических тарелок составило 44 344.

2. Разработка нового экспресс-метода количественного определения метотрексата в инъекционных лекарственных формах.

Проблема выявления недоброкачественных препаратов Mtx при проведении количественного определения препарата очень актуальна. Для её решения необходимо разрабатывать новые более простые и удобные методики выполнения качественного и количественного анализа.

В действующих на настоящий момент фармакопеях Mtx рекомендуют определять методом,

i

ВЭЖХ - JP-XTV, ВР, ЕР-4, USP-24. и методом восходящей ТСХ относительно стандарта фолиевой кислоты с последующей спектрофотометрией (ФС 42-1592-88). В доступной нам литературе методики по применению метода ФПИА для количественного определения Mtx в ЛФ отсутствуют. Это послужило поводом для выявления возможности применения ФПИА в системе FLx при проведении количественного определения Mtx в инъекционных ЛФ, а также для разработки методики его определения. ,

Сущность разработанного метода количественного определения Mtx в инъекционных ЛФ заключалась в следующем: ЛП разбавляли 0,1 М фосфатным буфером (Abbott, USA) до предполагаемой концентрации 0,4 мг/мл; приготовленный раствор измеряли на анализаторе FLx, используя наборы реагентов для определения Mtx фирмы Abbott, USA; концентрацию метотрексата, полученную в мкмоль/л по формуле № 1 переводили в мг/мл, затем рассчитывали процентное содержание количества Mtx в ЛФ по формуле № 2.

где С\ - концентрация Mtx в инъекционной ЛФ (мг/мл); Сг - концентрация, полученная на приборе FLx (мкмоль/л), М. м - молярная масса Mtx (454,45г/моль); F- фактор разведения Mtx буфером; 1000коэффициент пересчета миллилитров влитры;X-количественное содержание Mtx в ЛФ (%), Сз - концентрация Mtx, указанная на флаконе.

Доказательством правомерности использования метода ФПИА, послужило проведение сравнительного количественного анализа Mtx в ЛФ данного метода с ВЭЖХ. Для этого один и тот же стандартный образец был определен двумя способами. Время удерживания стандарта Mtx 6,12+0,49 минут, п=7. Результаты измерения приведены в табл. № 1. Как видно из табл. № 1, полученные результаты не отягощены систематической ошибкой и являются правильными, по воспроизводимости сравниваемые методы одинаковы и, следовательно, мы можем сделать вывод, что метод ФПИА можно использовать для количественного анализа инъекционных ЛФ метотрек-сата. К достоинствам метода ФПИА также стоит отнести его простоту и возможность проведения количественного анализа в очень короткие сроки непосредственно в клиническом отделении.

Таким образом, установлена возможность применения ФПИА в системе FLx для проведения количественного определения ЛФ Mtx. Разработана высокочувствительная экспресс-методика количественного определения Mtx в инъекционных лекарственных формах с помощью системы FLx. Результаты, полученные методом ФПИА, согласуются с результатами, полученными с помощью метода ВЭЖХ. Время количественного определения метотрексата сокращается в 5 раз.

Таблицах» 1. Результаты количественного определения метотрексата в инъекционных ЛФ.

Табл. № 1. Количественное содержание метотрексата и примесей определенное в инъекционных препаратах различных фирм.

вэжх ФПИА

Х,^) - ОД 105; Std.Dev. - 0,0040; ДХ-0,0101;е(ср|-4,82% 1,011; t,„<t(p.O Х(ч0 = 0,2106; Std.Dev. - 0,0023; ДХ=0,0025; е(ср)"1,17% t.„= 1,628; t.m< t(p,0

Метрологические характеристики Р-95%, n=6; t(p,f)=2,S7

Торговая фирма N Содержание метотрексата в % Содержание примесей в %

Eur. Ph. 2004 Фактическое Eur. Ph. 2004 Фактическое

Ebewe 6 95-105 % 103,23+/-1,07 <2,5% 1,15+/-0,52

Lachema 7 98,47+/-0,71 1,94 +/- 0,49

Teva 7 109,07+/- 1,04 3,12+/-0,65

ЛЭНС 6 113,44+/-0,28 12,86+/-0,14

В табл. АЬ1—2 использованы следующие статистические обозначения: Х(ф — средняя выборки; Std.Dev. — стандартное отклонение; п — объем выборки; Р — доверительная вероятность; АХ - полуширина доверительного интервала; Б (ср) -относительная ошибка среднего результата; !(рЛ -табличное значение критерия Стыодента; вычисленный критерий Стыодента.

хц.

S S"!

Мк

§ 5

Мк

SS*

Mtx

J-LL

1 I ; 4 * » 7 « » 1» и к и 14*

Рис. № 8. 1Шх фирмы Тева.

На всех хроматограммах (рис. - 12) по оси абсцисс — время удерживайте мин; по оси ординат - поглощение при 302 нм.

JU

Mtx

Т"

_LL

t

1 il

Рис. № 9. М(х фирмы Эбеве. Рис. № 10.ЛИх фирмы Лахема.

1 2 3 Г" Рис. № 11. М4х фирмы ЛЭНС.

3. Качественный и количественный сравнительный анализ Mtx в инъекционных ЛФ, применяемых в онкологии, различных фирм производителей.

На отечественном рынке зарегистрировано десять торговых наименований инъекционных ЛФ Mtx для проведения ВДХТ в онкологии. Разобраться в таком многообразии препаратов достаточно сложно, а единственный критерий, по которому должен проводится выбор ЛП - это его качество, так как побочные действия Mtx могут быть фатальны. Количественное содержание: субстанции Mtx и примесей, заявленное в спецификациях фирм-производителей, может сильно варьировать: содержание Mtx от 92 до 115%, а суммарное содержание примесей от 2,0 до 5,0%. В НИИ ДОГ ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН для лечения детей с гемобластозами и остеогенными саркомами могут применяться дозы Mtx от 500 до 12000 мг/м2. В некоторых t случаях максимальная суммарная доза Mtx достигала 20000 мг. Учитывая тот факт, что дети' наиболее чувствительны к консервантам, стабилизаторам лекарственной формы и примесям, нами был проведен качественный и количественный анализ наиболее часто применяемых в детской онкологии препаратов Mtx, выпускаемых под различными торговыми названиями. Их качественная и количественная характеристика отражена в табл. № 2 и на рис. №8-11. Как видно из табл. № 2 количественное содержание субстанции Mtx достаточно сильно варьировало от 97,5 до 113,4 %, суммарное содержание примесей и консервантов могло различаться у разных фирм в десять раз.

Идентификация примесей проводилась по фармакопейным данным времени их удерживания, основанных на том, что вещества элюируются в следующем порядке: аминоптерин, метоптерин, Mtx. Количественное определение примесей проводилось по их суммарному содержанию в про-1 центах относительно площади пика стандарта Mtx. В расчет принимались только те примеси, для которых время удерживания отличается от времени удерживания Mtx не более чем в два раза.

Как показали наши исследования, из четырех препаратов, только три (Ebewe, Lachema и Teva) соответствовали требованиям собственных спецификаций, а требованиям ЕР-4 (количество субстанции Mtx 95 - 105 % и суммарное содержание примесей менее 2,5 % ) соответствовали только два препарата (Ebewe и Lachema).

4. Сравнительная оценка методов количественного определения метотрексата в сыворотке крови для проведения ТЛМ.

Целью ТЛМ Mtx является выявление больных с замедленным выведением препарата. По

литературным [McCrudden EA., 1999] и собственным данным - это 8-10 % от общего числа,

больных. Рядом авторов [Abrey E., 2001 и Lennard L, 1999] доказано, что высокий уровень Mtx'

(более 1 мкмоль/л на 42 час с момента введения) является токсичным для больного и поэтому

надо немедленно проводить коррекцию фармакологическим антидотом - кальция фолинатом

(лейковорином). Также необходимо дальнейшее определение концентрации препарата (каждые 6

часов), пока она не станет менее 0,15 мкмоль/л. Такие особенности проведения ТЛМ

обусловливают следующие критерии, которым должен соответствовать метод количественного

13

определения М1х: высокая точность и воспроизводимости метода; низкий предел обнаружения вещества; быстрота и простота выполнения анализа; экологическая чистота. Ранее в РОНЦ РАМН для проведения ТЛМ метотрексата применялся метод ВЭЖХ. Но при переходе на ВДХТ | М1х ВЭЖХ не смогла обеспечить быстроту и круглосуточность определения. Мы провели сравнение этих методов. Результаты количественного определения М1х методами ФПИА и ВЭЖХ в сыворотке крови приведены в табл. № 3.

Табл. № 3. Результаты сравнения методов количественного определения ]Мх в сыворотке крови.

Метод анализа Метрологические характеристики Название критерия Значение р

ФПИА N=23; Х(Ср) = 0,535; Std.Dev.(S) =0,552 Проверка гипотез по t- критерию Стьюдента р= 0,728

ВЭЖХ N=23; Х<ср) = 0,599; Std.Dev.(S) =0,679

В табл. Ni 3

использованы следующие статистические обозначения: Х~ - средняя выборки; StdDev. - стандартное отклонение; п - объем выборки; Р - доверительная вероятность; ДХ - полуширина доверительного интервала; е (ср) -относит-ельная ошибка среднего результата; t(pJ)-ma6nwHoe значение критерия Стьюдента; Г,ы,- вычисленный . критерий Стьюдента.

Статистическая проверка нулевой гипотезы (табл. № 3) показала, что значения рассчитанного уровня р > 0,05, а это значит, что нулевая гипотеза не отклоняется и различий межу средними значениями не существует. Следовательно, воспроизводимость различных методов определения Mtx в биологической жидкости сопоставима, но при этом метод ФПИА имеет ряд преимуществ -быстроту, надежность, чувствительность.

5. Изучение взаимосвязи метаболизма Mtx с токсическими проявлениями у детей, страдающих гемобластозамн.

Основным критерием нарушения элиминации Mtx считают его концентрацию в сыворотке крови, превышающую 1,0 мкмоль/л на 42 час от начала введения Mtx [Мое P.J., 2000 г., Wall M., 2000 г.]. Согласно клиническим данным возникновение побочных действий, характерных для Mtx I (нефротоксичности, рвоты, диареи, язвенно-некротических поражений слизистой оболочки полости рта и нейротоксичности), происходило и при более низких концентрациях. Таким образом, для более эффективного и безопасного проведения ВДХТ необходимо разработать надежные клинико-лабораторные показатели, с помощью которых можно будет судить о токсическом действии Mtx до клинического проявления.

По литературным данным основной метаболизм Mtx происходит в печени, где он под действием оксидазы превращается в 7-OH-Mtx. Этот метаболит считается малоактивным, так как обладает более низкой способностью (в 100 раз меньше по сравнению с Mtx) к ингибированию дигидрофолат редуктазы [McCrudden EA, 1999 г.].

Хроматографический анализ (рис. № 12) показал, что в двух отобранных нами группах наблюдается различное соотношение концентраций Mtx /7-OH-Mtx: в первой группе такое среднее соотношение было 1 : 1,8, тогда как во второй группе это соотношение было значительно

выше -1:7,3. Анализ изучения клинических данных переносимости проведения ВДХТ исследуемых пациентов показал, что у всех детей из первой группы (концентрация менее 1,0 мкмоль/л) возникали серьезные побочные осложнения, характерные для М1х. Вторую группу' после изучения историй болезни детей и сопоставления этих данных с хроматограммами М1х и 7-ОИ-М1х можно разделить на две подгруппы: П-А и П-В. В подгруппу П-А вошли 7 пациентов (33,3 %), у которых по клиническим данным наблюдались токсические проявления, характерные для М1х, различной степени тяжести, среднее соотношение концентраций М1х/7-ОИ-М1х у них было 1:2,5. В подгруппу П-В вошли 9 пациентов (42,9%), которые по клиническим данным успешно перенесли ВДХТ М1х, среднее соотношение концентраций М1х /7-ОИ-М1х у них было 1:12

Рнс. № 12. Примеры хроматограмм метотрексата в разных группах.

На рис. № 12 приведено 3 примера хроматограмм типичных для 1-ой (1) и 11-ой группы больных (2 - подгруппа П-А и 3 - подгруппа П-В).

Таким образом, в 1-ой группе и в подгруппе 11-А у больных соотношения концентраций М1х/7' ОИ-М1х было в 5-6 раз ниже такового по сравнению с подгруппой П-В. На основе этого можно сделать вывод, что нарушение данного соотношения приводит к токсическим проявлениям М1х.

Следовательно, можно предположить, что у пациентов с замедленным выведением препарата нарушается его метаболизм, что выражается в резком снижении концентрации 7-ОИ-М1х, что приводит к клиническим проявлениям токсичности.

Соотношение М1х/7-ОИ-М1х является важным прогностическим фактором, ориентируясь на который можно своевременно,- т.е. до наступления клинических проявлений проводить коррекцию побочных действий, связанных с влиянием М1х на органы и ткани. Особенно важно это соотношение у больных, концентрация М1х которых менее 1,0 мкмоль/л, что по современным протоколам не нуждается в дополнительной коррекции. ]

6. Изучение динамики изменения биохимических показателей у детей, страдающих гемо-бластозами и получающих химиотерапию.

В настоящее время оценка влияния ВДХТ М1х на функциональное состояние различных органов и систем у детей с гемобластозами является существенной и в то же время недостаточно изученной. Токсические осложнения полихимиотерапии (ПХТ) у больных, как правило, возникают при нарушении функции естественных систем детоксикации, к которым относятся интенсивность процессов СПОЛ и состояние системы антиоксидантной защиты (АОЗ). Это существенно ухуцшает течение гемобластозов у детей, затрудняет проведение ПХТ, так каю приводит к нарушению выведения метаболитов из организма и следовательно, к повышению в крови концентрации цитостатиков, а также продуктов цитолиза опухолевых и нормальных тканей. Для оценки выраженности синдрома эндогенной интоксикации в клинике используется интегральный показатель, характеризующий эндогенный токсикоз - МСМ. По данным В Б. • Ларионовой (1990) нарушение процессов СПОЛ лежит в основе механизма эндогенной интоксикации.

В табл. № 4 отражена динамика изменений некоторых показателей нейротоксичности (ВМК и МАНК), общей токсичности (МСМ), продуктов СПОЛ (МДА) и витаминов - антиоксидантов (ретинол, токоферол) и фермента АОЗ - каталазы у детей с гемобластозами в процессе ВДХТ. Для сравнения показателей использовалась контрольная группа практически здоровых детей в количестве 11 человек, полученные результаты также сравнивались с общепринятыми возрастными нормами (ВМК). Достоверность различий полученных значений оценивалась как относительно контрольной группы, так и относительно значений, полученных до начала лечения.

Значения концентрации МАНК до начала лечения составило 2,47 ± 0,7 мкм/л, что достоверно;

выше (р=0,0173) по сравнению со значениями группы контроля (1,89 ± 0,26 мкм/л). После первого (2,73 ± 0,76 мкм/л) и второго курсов (2,16 ± 0,23 мкм/л) ВДХТ значения концентрации N АНК оставались достоверно высокими (р=0,0022 и р=0,0257 соответственно) по сравнению с контрольной группой, но не менялись относительно значений до начала лечения После окончания химиотерапии значения концентрации МАНК - ЗДО ± 0,50 мкм/л были достоверно высокими не только относительно контрольной группы, но и значений, полученных до начала лечения этих больных (р=0,0001 и р=0,0282 соответственно). •

Учитывая тот факт, что МАНК входит в состав ганглиозидов и что её уровень увеличивается при деструкции нервной ткани, то можно следующим образом интерпретировать полученные данные: уровень МАНК у детей, страдающих гемобластозами (до лечения) выше уровня МАНК контрольной группы и связан с проявлением общей интоксикации и опухолевым процессом,' сохранение этой концентрации после проведения индукции и второго курса ВДХТ, а также значительное увеличение (по сравнение с уровнем до лечения) после проведенной терапии уже свидетельствует о нейротоксичности лечения.

Уровень концентрации ВМК в суточной моче у детей до начала лечения (2,41 ± 1,26 мг/сут) был выше возрастной нормы (табл. № 4), а после проведения первого курса химиотерапии значения ВМК возрастали до 3,44 ± 1,33 мг/сут (р=0,0643). После второго курса химиотерапии

16

значения ВМК - 3,29 ± 1,26 мг/сут были также недостоверно выше (р=0,1297), чем до проведения лечения. Увеличение концентрации не было достоверно связано со значительными возрастными, различиями набранной группы детей. Значимое увеличение (р=0,0009) концентрации ВМК в' суточной моче до 4,88 ± 1,37 мг/сут происходило после окончания терапии.

Функциональное состояние элементов нервной системы определяется структурно-функциональными свойствами липидного бислоя нейрональных мембран, обеспечивающего проводимость и регуляцию функциональных мембранных белков (рецепторов, каналов, ферментов) . Учитывая, что ВМК депонируется в окончаниях симпатических нервных волокон, то её увеличение на протяжении проведения химиотерапии, а также после окончания терапии свидетельствовало о нарастающей нейротоксичности в процессе лечения детей с гемобластозами.

Исследование процессов СПОЛ и уровня эндогенной интоксикации показало усиление процессов пероксидации и эндогенной интоксикации при неэффективной терапии, т.е. при сохранении большой опухолевой массы. Уровень МСМ до начала лечения - 1,26 ± 0,38 у.ед., что достоверно' превышает значения группы контроля - 0,86 ± 0,12 у.ед. (р=0,0031). После индукции (0,93 ± 0,26 у ед.), а также после второго курса химиотерапии (0,86 ±0,10 у.ед.) и окончания лечения (0,94 ± 0,13 у.ед.) значения концентрации МСМ достоверно снижались по сравнению со значениями МСМ до лечения (р=0,0211; р=0,0064 и р=0,0477 соответственно), и статистически не отличались от значений контрольной группы.

Высокий уровень концентрации МСМ до лечения свидетельствовал об эндогенной интоксикации, обусловленной опухолевым процессом. После проведения курса индукции уровень МСМ снижался до значений, сопоставимых с группой контроля, и оставался таким на протяжении всего лечения, а также после его окончания.

Концентрация МДА до начала лечения - 2,49 ± 0,85 мкм/л, что значимо не отличалось от таковой в контрольной группе детей - 3,10 ± 1,08 мкм/л (табл. № 4). Достоверное увеличение этого показателя происходило после курса индукции - 3,54 ± 1,33 мкм/л (р=0,0310). После второго курса химиотерапии значения МДА по сравнению с индукцией достоверно снижались -2,46 ± 0,73 мкм/л (р=0,0410) и статистически не отличались от значений группы контроля и детей, страдающих гемобластозами, до начала проведения лечения, такая же тенденция сохранялась и после окончания терапии (2,75 ± 1,79 мкм/л).

Установлено, что патогенетическими механизмами токсических эффектов являются интенсификация процессов СПОЛ и истощение АОЗ. Следует подчеркнуть, что достаточно полную информацию о процессах СПОЛ нельзя получить, основываясь на 1-2 критериях, в силу стадийности процесса СПОЛ, включающего ответную антиоксидантную активность. Исходя из упрощенной схемы конечного этапа образования продуктов СПОЛ, можно предположить обязательность исследования не только уровня содержания самих продуктов, но и оценки состояния системы АОЗ ее ферментного и неферментного звена (ВЛанкин, 2001; В.Байкова, 1998). Выявленные

корреляции между повышением содержания МДА и степенью интоксикации организма

17

позволило считать МДА маркером липидной пероксидации (Э.Горожанская, 2001). В нашем случае увеличение МДА происходило после проведения индукции химиотерапии, что на фоне снижения экзогенных антиоксидантов (витаминов А и Е) является признаками токсического влияния химиотерапии.

Уровень активности каталазы в эритроцитах до начала лечения - 37,50 ± 7,82 ммоль Н2О2* 109 эр/мл был сопоставим с уровнем группы контроля 37,00+8,00 ммоль Н2О2* 109 эр/мл. После первого блока - индукции наблюдалось достоверное (р=0,0001) снижение активности этого фермента (23,09+2,97 ммоль Н2О2* 10 эр/мл), причем снижение активности каталазы продолжилось и после второго блока 18,30+1,33 ммоль Н2О2* 10 эр/мл химиотерапии (р<0,0001). Уровень каталазы по окончании терапии резко увеличивался - 48,32+12,75 ммоль Н2О2* 109 эр/мл и был выше значений каталазы контрольной группы (р=0,0301) и значений ее" исследуемой группы детей до начала проведения лечения (р=0,0343).

Достоверное снижение уровня активности каталазы в эритроцитах после курсов индукции и ВДХТ М1х связано с угнетением активности этого фермента вследствие гематологической токсичности химиотерапии. Значительное увеличение после окончания терапии носит, по-видимому, компенсаторный характер.

В исследуемой группе до начала лечения было значительно снижено (р=0,0001) содержание витамина Е - 17,65 + 3,3 мкм/л, по сравнению с контрольной группой 25,83 + 0,47 мкм/л (таб. №4) Значения концентрации витамина А - 2,44 + 0,28 мкм/л до начала также были ниже рефе-ренсных значений 2,95 + 0,19 мкм/л (р=0,0001). После блока индукции значения концентрации токоферола (17,57 + 2,9 мкм/л) оставались ниже значений группы контроля (р=0,0001) и не изменялись относительно его концентрации до начала лечения, тогда как уровень ретинола - 2,05 + 0,31 мкм/л достоверно снижался (р=0,0038) по сравнению с его концентрацией до начала лечения. После высокодозной терапии М1х (второго курса химиотерапии) значения концентрации токоферола (15,82 + 3,64 мкм/л) также оставались ниже значений контрольной группы (р=0,0001) и не изменялись относительно его концентрации до начала и после блока индукции, такая же тенденция (16,27 + 1,07 мкм/л) сохранялась и после окончания терапии. Концентрация ретинола после второго курса - 3,02 + 0,62 мкм/л достоверно увеличивалась (р=0,0123) по сравнению с таковой до начала лечения и была сопоставима со значениями группы контроля, такая же тенденция (3,11 + 0,30 мкм/л) сохранялась и после окончания терапии.

По всей видимости, значительное снижение витаминов А и Е до начала лечения и после блока

индукции свидетельствует о ярко выраженном дефицитном состоянии в системе АОЗ, связанным

как с опухолевым процессом, так и с токсическим воздействием химиотерапии. Увеличение

концентрации ретинола, после проведения ВДХТ М1х и после окончания терапии на фоне

сниженной концентрации токоферола, вероятнее всего связано с тем, что пул витамина А даже

при патологических состояниях расходуется в последнюю очередь и способен быстро

пополняться. Таким образом, биохимические тесты показали, что у детей с гемобластозами до

18

Таблица № 4. Динамика изменений некоторых показателей нейротокснчностн, обшей токсичности, продуктов перекисного окисления лнпидов и витаминов у детей с лнмфобластнымн опухолями в процессе химиотерапии (М ± SD).

+Нормы концентрации ВМК в зависимости от возраста в мг/сут: до 5 лет-2,20; 6-10 лет - 3,60; 11-15 лет-4,80.

Достоверные различия показателей в динамике до качала и по еле курсов (р<0,05) химиотерапии

Достоверные различия между показателями значений группы сравнения и значениями исследуемой группы (р<0,05).-

Таблица №5. Достоверные взаимосвязи между ЭЭГ и биохимическими показателями.

Показатель Стадия N-AHK (мкмоль/л) МСМ (условные ед ) ВМК (мг/сут) МДА (мкмоль/л) Токоферол (мкмоль/л) Ретинол мкмоль/л Каталаза (ммоль HjOj . 10* эр/мл)

Корреляция с ЭЭГ до начала лечения Альфа(г--0,6330; р-0,0495) Тета (г--0.7300; р-0,0522) Дельта(г --0,7500; р-0,0522 ) Альфа(г--0.8857; р-0,0188) Тета (г--0,7714; D—0,0724)

Корреляция с ЭЭГ после индукции Альфа(г=Ч>,7857; р-0,0362) Бета-1(г--0,8805; р=0,007Э) Бета-2 (г-0,8928; р-0,0068) Ttrra (г --0,7567; р-0.0489) Бста-1 (г -0,8944; р-0,0405) Альфа|(г—0,8286, р-0.0416) \льфа 3 (г -0,9000; р= 0,0374) Альфа (г =0,9000; р-0,0374)

Корреляция с ЭЭГ после второго курса Бета| (г--0,8117; р-0,0498) Альфа(г = 0,7113; р-0,0317) Бета 1 (г- 0.7437; р-0,0216) Альфа (г -0.8829; р-0.0085) Бета1(г -0,9286; р-0,0025) Бета 2 г-0.8829 р—0,008) Тета (г -0,8001; р—0,0307) Альфа([=0,8201; р—0,0067) Бета! (г--0,8034; р—0,0091) Бета2 (г—-0,7280; р=0,02б;

Корреляция с ЭЭГ после окончания лечения Тета (г -0,8857; р-0,0188) Бета! (г-0.8857; р-0,0188)

Показатель Стадия N-AHK (мкмоль/л) МСМ (у- ед.) ВМК (мг/сут) МДА (мкмоль/л) Токоферол (мкмоль/л) Ретинол (мкмоль/л) Каталаза ммоль HiOj* 10® эр/мл

Группа контроля п = 11 1,89 ±0,26 0,86 ±0,12 + 3,10 ± 1,08 25,83 ± 0,47 2,95 ±0,19 37,00 ± 8,00

До начала лечения п = 12 2,47 ± 0,7 1,26 ±0,38 ** 2,41±1,26 2,49 ± 0,85 17,65 ±3,3 2,44 ± 0,28 37,50 ± 7,82

После Индукции п=12 2,73 ± 0,76 ** 0,93 ± 0,26 • 3,44 ± 1,33 3,54 ± 1,33 * 17,57 ±2,9 2,05±0,31 ••и» 23,09 ±2,97 ••и»

После второго курса п=11 2,16 ±0,23 ** 0,86 ±0,10 * 3,29 ± 1,26 2,46 ± 0,73 15,82 ± 3,64 ** 3,02 ± 0,65 » 18,30 ± 1,33 »• и»

После окончания лечения п=7 3,20 ± 0,50 **и* 0,94 ±0,13 • 4,88 ± 1,37 • 2,75 ± 1,79 16,27 ± 1,07 3,11 ±0,30 « 48,32 ± 12,75 ••и*

начала лечения имелась выраженная эндогенная интоксикация и снижение антиоксидантного потенциала, что связано с патологическим процессом. После первого и второго блока 1 химиотерапии показатели эндогенной токсичности снижались, в то время как имелась тенденция к увеличению маркеров нейротоксичности - уровня ВМК и МАНК. Также после первого и второго блока химиотерапии наблюдался выраженный дефицит системы АОЗ, что выражалось в низком уровне эндогенных антиоксидантов (витаминов А и Е) и антиокислительных ферментов (каталаза) Дальнейшее развитие медицинской науки несомненно будет способствовать расширению арсенала лабораторных критериев, позволяющих оценивать выраженность аутоагрессии при проведении ВДХТ. Основными источником таких поисков является неудовлетворенность информативностью общепринятых критериев.

7. Изучение взаимосвязи биохимических показателей с ЭЭГ исследованиями и данными мониторинга М1х.

Известно, что биоэлектрическая активность головного мозга детей с гемобластозами' отличается от таковой у здоровых детей. Изменения указывают на дисфункцию диэнцефальных структур мозга, которая, скорее всего, обусловлена расстройствами нейромедиаторного обмена в связи с патологическим процессом [Кузнецова Е.И ].

Многие из используемых для лечения химиопрепаратов вместе с лечебным эффектом оказывают неблагоприятное влияние, прежде всего на нервную систему. У детей с гемобластозами после ВДХТ возникают осложнения со стороны ЦНС, механизм которых недостаточно изучен. Поэтому для выяснения нейротоксичности ВДХТ на ЦНС мы наряду с изучением особенностей метаболических нарушений провели совместно со ст.н с. НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н Н. Блохина РАМН, к.б.н. Кузнецовой Е. И. изучение динамики ЭЭГ у детей с гемобластозами. '

По данным Кузнецовой Е. И. установлено, что до начала лечения у детей с гемобластозами изменения в ЭЭГ указывали на определенную дисфункцию диэнцефальных структур головного мозга, обусловленную метаболическими нарушениями в организме в связи с патологическим процессом. После индукции у большинства пациентов отмечалось усиление тормозных синхронизирующих влияний со стороны стволово-диэнцефальных структур на фоне снижения функциональной активности коры головного мозга, и снижение когнитивных функций. Результаты ЭЭГ- исследования, проведенные после курса индукции, свидетельствовали о токсическом влиянии химиотерапии на ЦНС.

После второго курса из 11 пациентов у 5-ти (45,5 %) были умеренные диффузные изменения биоэлектрической активности с признаками дисфункции диэнцефальных структур головного мозга с фокусом эпилептиформной активности в левой височной области. У одного ребенка в процессе лечения развились тонико-клонические судороги. У 5 (45,5 %) детей были значительные изменения ЭЭГ с наличием билатерально-синхронных вспышек дельта-волн, свидетельствующих

о высокой возбудимости стволово-диэнцефальных структур с эпилептиформной активностью в левой височной области.

После окончания лечения у всех наблюдаемых 7-ми детей в ЭЭГ имелась эпилептиформная активность в левой височной области. У 4-х (57,1 %) были умеренные диффузные изменения, у двоих детей легкие изменения ЭЭГ, и у 1-го - значительные. По сравнению со вторым курсом, после окончания лечения были менее выраженные изменения в ЭЭГ, однако сохранялся фокус эпилептиформной активности.

Таким образом, до начала лечения у детей с лимфобластными опухолями изменения в ЭЭГ указывали на определенную дисфункцию диэнцефальных структур головного мозга, обусловленную метаболическими нарушениями в организме в связи с патологическим процессом. После химиотерапии у большинства пациентов отмечалось усиление тормозных синхронизирующих влияний со стороны стволово-диэнцефальньгх структур на фоне снижения функциональной активности коры головного мозга. Результаты ЭЭГ-исследований, проведенных после ВДХТ, свидетельствовали о её токсическом влиянии на ЦНС, которое в дальнейшем усиливалось в процессе лечения и несколько уменьшалось после окончания лечения, однако сохранялось угнетение функциональной активности коры головного мозга с формированием фокуса паро-ксизмальной активности.

Исследование изменений функционального состояния головного мозга в результате экзогенных и эндогенных воздействий представляет значительный интерес. Особый же интерес представляет поиск корреляций между количественными нейрофизиологическими и биохимическими показателями, характеризующими отдельные метаболические изменения. В результате такого исследования может быть также решена важная практическая задача - поиск биохимических маркеров для диагностики нейротоксичности. Взаимосвязь между биохимическими показателями и ЭЭГ приведена в таблице № 5.

Сравнение биохимических показателей с ЭЭГ проводилось по натуральному логарифму мощности (Ln Power) в 8 частотных диапазонах: дельта (1-3 Гц), тета (4-6 Гц), альфа-1 (7-9 Гц),' альфа-2 (9,5-10 Гц), альфа-3 (10,5-13 Гц), бета-1 (14-19,5 Гц), бета-2 (20-21,5 Гц).

Как видно из таблицы № 5, до начала проведения лечения ЭЭГ детей с гемобластозами отличались от таковых у здоровых детей и определялись воздействием эндогенного патологического процесса. Выявленные корреляции с биохимическими показателями позволили показать, что повышение уровня интоксикации и ухудшение процессов АОЗ сопровождалось снижением уровня альфа-активности и повышением значений СП в тета-полосе частот.

Активация же катехоламииергических систем (уровень ВМК) коррелировала с уменьшением уровня тета- и дельта-активности.

После первого курса химиотерапии (индукции) у детей с гемобластозами были выявлены взаимосвязи биохимических показателей с ритмами ЭЭГ, свидетельствующие о влиянии химиотерапии на ЦНС.

Таким образом, после химиотерапии отмечались разнонаправленные тенденции в динамике биохимических показателей. Отмечалось некоторое снижение эндогенной интоксикации и усиление процессов СПОЛ. Это коррелировало с уменьшением активности бета-2 и тета-частот. С другой стороны, нарастали явления нейротоксичности, что проявлялось высоким уровнем М-АНК и коррелировало со снижением значений СП в широкой альфа-полосе частот и уменьшением уровня бета-1 активности.

Биохимические данные свидетельствовали об ухудшении процессов СПОЛ и состояния' системы АОЗ, что является показателем нейротоксического повреждения ЦНС. Интенсификация процессов СПОЛ (концентрации МДА) на фоне снижения антиоксидантов (витаминов А и Е) является признаком токсического влияния химиотерапии.

Повышение уровня катехоламинов коррелировало со снижением уровня альфа-1 активности и увеличением бета-1 активности полосы частот. Эти процессы могут быть связаны с дисфункцией гипатоламо-гипофизарной надпочечниковой системы.

Как видно из таблицы, после второго курса химиотерапии (высокодозной терапии М1х) у детей с гемобластозами были выявлены взаимосвязи биохимических показателей с ритмами ЭЭГ, свидетельствующие о влиянии химиотерапии на ЦНС.

Таким образом, после высокодозной терапии М1х обнаруженные тесные прямые зависимости между увеличением уровня ВМК и ЭЭГ-показателей, в частности тета-частотой (4-6 Гц) и бета-1 (14 - 19 Гц), свидетельствуют о нейротоксическом влиянии М1х на ЦНС. Наблюдаемая взаимосвязь снижения значений альфа-ритма со снижением уровня МСМ в сыворотке крови,' позволяет исключить влияние общей токсичности на ЦНС.

Уровень МАНК на фоне ВДХТ М1х значительно увеличивался - 2,51 + 0,23 мкм/л, где р=0,0001, относительно группы контроля (1,89 + 0,26 мкм/л), причем между значениями концентрации МАНК и М1х на 48 час, с момента его введения, была выявлена тесная, положительная корреляционная связь (г=О,8683; р<0,0001; п=30). У большинства пациентов при ЭЭГ отмечалось нарастание спектральной плотности (СП) в полосе 4 - 6 Гц в лобных областях и снижение в полосе альфа-ритма в затылочных областях.

Учитывая выявленную тесную, положительную корреляционную связь между значениями концентрации МАНК и М1х, а также тот факт, что увеличение концентрации МАНК связано с признаками деструкции нервной ткани, можно сделать вывод о существовании связи между уровнем М1х в крови и проявлением нейротоксичности при терапии ОЛЛ у детей. Изменения на ЭЭГ свидетельствовали о побочном токсическом влиянии на ЦНС.

После окончания терапии были выявлены взаимосвязи биохимических показателей с ритмами ЭЭГ (табл. № 5). Увеличение уровня ВМК после окончания проведения терапии тесно положительно коррелировало с увеличением мощности тета-ритма в сенсомоторных зонах коры головного мозга. По данным Горбачевской Н.Л. такое увеличение спектральной мощности тета-

ритма приводит к снижению когнитивных функций (памяти и внимания) у детей.

22

Компенсаторное увеличение уровня активности каталазы тесно положительно коррелировало с увеличением СП бета-1 ритма, нарастание которого может свидетельствовать о снижении функциональной активности коры головного мозга.

Таким образом, выявленные взаимосвязи электрофизиологических и нейрохимических показателей до начала лечения, в процессе химиотерапии и после окончания лечения свидетельствуют о влиянии на ЦНС патологического процесса и химиотерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема токсического повреждения, обусловленного воздействием ВДХТ Mtx при лечении ОЛЛ и НХЛ, остается актуальной, в связи с появлением новых ЛП Mtx, производимых различными фирмами, а также неотработанности процедуры проведения ТЛМ Mtx и проявлений его токсического действия. Ранее в НИИ ДОГ ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН терапия Mtx в дозах превышающих 1,0 г/м2 не проводилась, поэтому так важны и актуальны все лабораторные, функциональные и химико-фармацевтические разработки данного исследования. Для проведения ВДХТ Mtx необходимо убедиться в качестве препарата Mtx, провести тщательное определение его подлинности и чистоты в условиях клиники, провести ТЛМ Mtx до его полного выведения из организма, отработать прогностические критерии метаболизма Mtx, особенности его выведения, а также изучить острое и отсроченное токсическое действие его высоких доз. На все поставленные клинической практикой вопросы данное исследование предлагает конкретные, ответы.

Полученные данные о чистоте ЛП Mtx различных фирм-производителей не являются рекламой какой-либо фирмы, а жизненно необходимы, так как, к сожалению, препараты с концентрированными примесями не дают должного терапевтического эффекта и очень часто усиливают химическую токсичность.

Необходимость разработки экспресс-метода количественного определения Mtx в ЛФ с помощью ФПИА также диктуется той же задачей - вводить ребенку только качественный препарат.

Сравнение методов количественного определения Mtx в сыворотке крови диктовалось потребностью выбора более удобного в условиях клиники, быстрого, но не менее точного, селективного, воспроизводимого метода, позволяющего уловить разницу в сотых долях концентрации мкмоль/л. Ценой промедления и ошибки определения здесь является жизнь ребенка.

Получена существенная информация о взаимосвязи количественных значений Mtx в сыворотке крови больных и функционально - метаболическими изменениями, что свидетельствует о необходимости контроля за содержанием Mtx в процессе лечения для предупреждения токсических проявлений препарата.

Количественный анализ Mtx и его основного метаболита 7-OH-Mtx показал, что чем больше Mtx окисляется в печени ферментативным путем, тем меньшая токсичность сопутствует проведению лечения. Соотношение Mtx и 7-OH-Mtx - важный прогностический тест, который предложен впервые нами.

Количественный анализ показателей нейротоксичности - N-AHK и ВМК выявил закономерности изменения их концентрации в динамике процесса лечения и в сравнительном аспекте с группой практически здоровых детей. Показана прямая зависимость между увеличением концентрации Mtx и показателями N-AHK у больных детей. Выявлены корреляции между показателями нейротоксичности и данными ЭЭГ-исследований.

Исследования N-AHK и ВМК у больных гемобластозами детей находятся практически в начальной стадии, поэтому установленные закономерности могут способствовать выяснению механизмов нейротоксичности, обусловленной применением ВДХТ Mtx. He вызывает сомнений прикладное значение этих исследований, отражающих возможности степени травматизации нервной ткани Mtx, а также перспективы контроля за эффективностью проводимой терапии.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о возможности использования N-AHK и ВМК в качестве дополнительных критериев диагностики, мониторинга и прогноза нейротоксичности ВДХТ Mtx.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод количественного определения метотрексата и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови больных с помощью ВЭЖХ (предел обнаружения 0,8 10° мг/мл; коэффициент вариации 2,77%).

2. Установлена возможность применения ФПИА в системе FLx («Abbott», USA) для проведения количественного определения метотрексата в инъекционных ЛФ (предел обнаружения 4,5 10'3 мг/мл; коэффициент вариации 1,17%). Разработан экспресс-метод его количественного определения, сопоставимый по метрологическим характеристикам с методом европейской фармакопеи.

3. Проведенный сравнительный ВЭЖХ - анализ препаратов метотрексата, применяемых в детской онкологии и выпускаемых различными фирмами-производителями, показал, что они различаются по количественному содержанию примесей и действующего вещества. Наиболее качественными (отвечающими требованиям европейской фармакопеи - менее 2,5% и от 95 до 105% соответственно) являются раствор для инъекций метотрексата Лахема, Чехия (1,94+/-0,49; 98,47+/-0,71) и концентрат для приготовления инфузий метотрексата фирмы Эбеве, Австрия (1.15+/-0.52; 103,23+/-1,07).

4. Проведенный сравнительный анализ методов количественного определения метотрексата в сыворотке крови показал, что методы ВЭЖХ и ФПИА сопоставимы по точности (критерий Стьюдента р = 0,728) и воспроизводимости (96 и 99% соответственно). Метод ФПИА имеет ряд

преимуществ (более простой и быстрый) по сравнению с ВЭЖХ, что делает его более пригодным для проведения ТЛМ метотрексата в клинической практике.

5. Установлено, что при замедленном выведении М1х происходит изменение его метаболизма, которое выражается в нарушении соотношения концентрации Мй/7-ОН-М1х.

6. Изучена динамика изменения биохимических показателей в процессе химиотерапии детей с] гемобластозами и показана информативность следующих из них: МСМ, каталазы, витаминов А и Е для оценки общей токсичности и нарушений антиоксидантного статуса; М-АНК и ВМК для оценки нейротоксичности.

7. В период проведения высокодозной химиотерапии метотрексатом выявлен ряд корреляций между показателями нейротоксичности и данными ЭЭГ-исследований, свидетельствующих о влиянии на ЦНС патологического процесса и химиотерапии. Показана прямая зависимость между увеличением концентрации М1х и показателем нейротоксичности - МАНК (коэффициент корреляции Спирмена 0,8683).

Список сокращений: АОЗ - антиоксидантная защита; ВДХТ - высокодозная химиотерапия; ВМК - ванилминдальная кислота;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ЛП - лекарственный препарат;

ЛФ - лекарственная форма;

МДА - малоновый диальдегид;

МСМ - молекулы средних масс;

НХЛ - неходжкинская лимфома;

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз;

ПХТ - полихимиотерапия;

СПОЛ - свободнорадикальное перекисное окисление липидов;

ТЛМ - терапевтический лекарственный мониторинг;

ФПИА - флуоресцентно поляризационный иммуноанализ;

ЭЭГ - электроэнцефалография;

МАНК - М-ацетилнейраминовая кислота.

М1х - метотрексат;

7-ОН-М1х - 7-гидроксиметотрексат;

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ьаиков К.Э, Арзамасцев А.П., Родионова Г.М., Иванов А.В., Пич>гин А.В., Байкова В1Ь Адаптация метода Ф11ИА для мониторинга метотрексата в крови// IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2002. с. 575.

2. Иванов А.В., Байкова В.Н.. Слугии А.И., Киселев А.В. Результата адаптации ФПИА для определения концентрации метотрексата в сыворотке крови// X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Ии 2003, с. 195.

3. Иванов А.В., Байкова В.Н, Кузнецова Е.И., Ледовских МВ., Батурина ЮЛ. Изучение центральной нейротоксичиости метотрексата у детей с ОЛЛ, получающих химиотерапию// VII Российский онкологический конгресс, М., 2003, с. 171.

4. Кузнецова Е.И., Байкова В.Н., Иванов А.В., Ледовских М, В., Маякова С. А., Слугии А.И. Динамика ЭЭГ и биохимических маркёров в оценке центральной нейротоксичности у детей с лимфобластными опухолями в процессе химиотерапии ВБМ// XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», М.. 2004, с. 674.

5. Иванов А.В., Байкова В.Н., Родионова Г.М., Арзамасцев А.П. Количественный анализ джемериков метотрексата, применяемых в онкологии// XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», М., 2004, с. 871.

6. Кузнецова Е. И., Иванов А. В., Байкова В. II., Слугин А. И., Маякова С. А., Ледовскич М В. ЭЭГ и биохимические показа гели обшей токсичности и нейротоксичности у детей с лимфобластными опухолями, получающими химиотерапию// XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», М, 2004, с. 675.

7. Иванов А.В., Байкова В.Н., Родионова Г.М., Арзамасцев А.П. Сравнительная оценка методов определения концентрации метотрексата в сыворотке крови// XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», М., 2004. с. 871.

8. Денисова НА, Иванов А.В., Байкова В.Н., Ледовских МВ., Пдетенёва Т.В. Возможность использования МДА в качестве диагностическою маркёра для выявления ранней бессимптомной токсичности при терапии препаратами циклоспорина// XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», М, 2004, с. 652.

9. Кузнецова Е.И., Байкова В.Н., Иванов А.В., Ледовских М.В., Маякова С.А., Слупж А.И. Динамика ЭЭГ и биохимических маркеров центральной иейротоксичности у детей с лимфобластными опухолями в процессе химиогерапии ВГМ// Ш Съезд онкологов и радиологов стран СНГ, Минск, 2004, часть 2, с. 396.

10. Кузнецова Е И., Горбачевская Н.Л., Байкова В.Н., Иванов А.В., Митрофанов А.А. Динамика ЭЭГ и биохимических показателей у детей с лимфобластными опухолями в оценке нейротоксического влияния ВГМ-терапни// «Успехи современного естествознания» .У8 6, прилож. 1, г. 2, стр. 164-165.

11. Кузнецова Е.И, Иванов А.В., Байкова В.Н., Слугин А.И.. Маякова С А, Ледовскич М В. «Корреляции ЭЭГ и некоторых биохимических показателей у детей с лимфоЛдастными опухолями при проведении химиотерапии*. Ж. «Детская онкология» Л» 2, электронное СБ-приложение 1.1.3.

12. Кузнецова Е.И., Байкова В Н., Иванов А.В., Ледовских М.В., Маякова С.А., Стугин А.И. «'Изменение ЭЭГ и биохимических маркеров при оценке центральной нейротоксичности у дегей с лимфобластными опухолями в процессе химиотерапии». Ж. «Детская онкология» V 2, электронное СБ-приложение 1.1.4,

13. Кузнецова Е.И- Байкова В.Н.; Иванов А.В., Мздкова С А, Слунш А.И., Горбачевская Н.Л. «Биоэлектрическая активность головного мозга и биохимические показатели у детей с лимфобластными опухолями в оценке иейрогоксического влияния В БМ-химиотерапии». Ж. «Детская онкология* № 2, электронное СБ-приложение 1.1.7.

14. Иванов А.В., Родионова Г.М., Байкова В.Н., Арзамасцев АЛ. Сравнительная оценка методов количественного определения концентрации метотрексата в биологической жидкости и лекарственных формах// «Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии)» - 2004 г. - Кг 3. - С. 49 - 52.

15. Кузнецова Е.И , Байкоеа В Н., Иванов А.В.. Ледовских М.В, Дурное Л.А. Динамика биоэлектрической активности, головного мозга и биохимических показателей нейротоксичностн у детей с лимфоб'тстными ип\ холями, получающих химиотерапию// «Практикующий врач сегодня» - 2004 г. - Xs 2. - С. 35 - 37.

16. Делева ИВ., Иванов А.В., Печенников ВМ, Байкова В.Н. Выбор методов определения показателей аитнокендсиггиого баланса (общего ангиоксидантного статуса и сунсроксиддисмуташ) для проведения ммшортпа в клинической практике'/11$ Российский конгресс к Сов ременные техполо! ии в педиатрии и дегской хирургии». М.» 2004, с. 605.

17. Иванова НМ, Пегросян А.С., Игошин А.В., Иванов А.В., Байкова В.Н. Применение высоких доз метотрексага влечении метастатической остеосаркомы у детей'/ III Российский конгресс «Современные )ехнологни в педиатрии и детской хирургии», М. 2004, с. 405.

Служба множительной теши» ГУ ГОНЦ им. H.H. Блохина РАМН Подписано I печать 05.04.05 3a,<i" № 204 Т"Р»Ж 100

г '. - V

: •;' vr \ i • »

893

2 2 ДЛ? ÎCD5

Актуальность.

Прогресс в детской онкологии связан в первую очередь с развитием химиотерапии, успехи которой определили новые возможности лечения гемобластозов у детей. Химиотерапия превратилась из вида вспомогательной помощи в метод лечения, в большинстве случаев определяющий исход заболевания. Путь к улучшению результатов лечения лежит в интенсификации химиотерапии, что увеличивает риск, связанный с её проведением. Это потребовало создания комплекса мер, направленных на профилактику и лечение осложнений, возникающих в процессе проведения химиотерапии, что является не менее важной и не менее сложной задачей, чем лечение рака (JT.A. Дурнов, 2002, 2004). Следовательно, искусство проведения высокодозной химиотерапии (ВДХТ), в первую очередь, связано не с формальным соблюдением режима введения цитостатиков в организм больного, а профилактикой и лечением острых и отсроченных осложнений химиотерапии.

Метотрексат (Mtx) является одним из самых эффективных цитостатических препаратов, относящихся к антиметаболитам фолиевой кислоты. Как лекарственное средство он известен с 1948 года (А.Альберт, 1989). В России для использования в онкологической практике зарегистрировано десять его торговых марок. Выбор наиболее качественного из них, безусловно, является актуальной и важной задачей, решение которой позволит сделать более безопасным и эффективным проведение ВДХТ. Проведение химико-фармацевтического анализа Mtx, а также разработка экспресс-метода для его количественного определения в лекарственной форме (ЛФ) непосредственно перед началом лечения позволит полностью исключить введение больным недоброкачественного препарата.

Mtx конкурентно ингибирует дигидрофолатредуктазу, превращающую фолиевую кислоту в тетрагидрофолат, в результате чего косвенно тормозится синтез нуклеиновых кислот и клеточное деление в S-фазе клеточного цикла (J.Holland et al., 1997; R.Bast et al., 2000). В связи со способностью Mtx проникать через гистогематические барьеры использование высоких и сверхвысоких доз (1,0 - 12,0 г/м ) этого препарата является ключевым фактором, позволяющим добиться излечения детей, страдающих гемобласто-зами. Однако наряду с высокой противоопухолевой активностью Mtx проявляет серьезные побочные эффекты, главными из которых являются нейро-, нефро-, гепатотоксичность, миелодепрессия, поражения ЖКТ (П.Копосов, 2002). Фармакокинетика Mtx также является принципиальным аспектом в развитии системной Mtx токсичности и связанной с ней смертностью. Именно поэтому ВДХТ Mtx представляет собой именно тот случай, когда необходим тщательный терапевтический лекарственный мониторинг (TJIM) препарата и биохимических показателей токсичности в крови. Нейротоксичность может быть дозолимитирующим фактором, ограничивающим возможности противоопухолевого лечения Mtx. Известно, что в основе механизма нейротоксичности лежат различные поражения структур нервной ткани, вызывающие нейрональную и аксональную деструктуризацию и демиелинизацию. Разработка методологических подходов к диагностике и мониторингу нейротоксичности Mtx на основе комплекса биохимических методов исследования является одной из важных задач. Следует отметить, что в литературе отсутствуют работы, посвященные изучению биохимических маркеров нейротоксичности - N -ацетилнейраминовой (N-AHK) и ванилминдальной кислот (ВМК) в крови больных гемобластозами детей. В этом аспекте очевидна актуальность проведенного комплексного исследования.

Целью настоящего исследования является разработка современных методов количественного определения Mtx в инъекционных лекарственных формах различных фирм-производителей и сыворотке крови больных детей, страдающих гемобластозами, а также изучение его токсичности при новых высокодозных режимах применения.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод количественного определения Mtx и его основного метаболита (7-OH-Mtx) в сыворотке крови больных при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2. Установить возможность применения флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа (ФПИА) для проведения количественного определения Mtx в инъекционных ЛФ и разработать новый экспресс-метод его количественного определения.

3. Провести сравнительную оценку качества лекарственных препаратов Mtx, применяемых в детской онкологии.

4. Провести сравнительную оценку методов количественного определения Mtx в сыворотке крови и выбрать наиболее оптимальный для проведения ТЛМ Mtx.

5. Изучить взаимосвязь между нарушением элиминации Mtx и его метаболизмом у детей, страдающих гемобластозами.

6. У детей, страдающих гемобластозами, изучить динамику изменения биохимических показателей: нейротоксичности - N-AHK и ВМК; общей токсичности - молекулы средних масс (МСМ); продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ) - малоновый диальдегид (МДА); антиоксидантного статуса - ретинол, токоферол и катал аза.

7. С помощью корреляционного анализа у детей, страдающих гемобластозами, изучить взаимосвязь биохимических показателей с ЭЭГ исследованиями и данными мониторинга Mtx.

Научная новизна исследования:

Впервые разработан экспресс-метод количественного определения Mtx в инъекционных ЛФ с помощью ФПИА.

Впервые разработан метод количественного определения Mtx и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови больных с помощью ВЭЖХ.

Впервые изучен вклад Mtx в развитие нейротоксичности и общей токсичности у детей с гемобластозами. Выявлены биохимические маркеры: N-АНК, ВМК, МДА, каталазы, МСМ, позволяющие проводить оценку побочных действий при химиотерапии до их клинического проявления.

Впервые с помощью корреляционного анализа обнаружены взаимосвязи между метаболическими изменениями (показателями нейротоксичности, общей токсичности и СПОЛ), значением Mtx в сыворотке крови и ЭЭГ-данными у детей, страдающих гемобластозами.

Практическая значимость исследования:

Разработанный экспресс-метод количественного определения Mtx в ЛФ с использованием флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа позволяет в короткие сроки (20 минут) провести количественное определение, что исключает применение недоброкачественного препарата.

ВЭЖХ метод количественного определения соотношения концентраций Mtx и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови рекомендован для оценки и коррекции токсических проявлений Mtx.

Разработанные методики биохимической диагностики общей токсичности и нейротоксичности предлагаются для выявления и корректирования побочных действий при химиотерапии Mtx.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», номер государственной регистрации 01.200.110545, а также в рамках НИР РАМН РФ (ГУ НИИ ДОиГ и ГУ НИИ КО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН) «Особенности биоэлектрической активности головного мозга и нейромедиаторного обмена у детей с лимфопролиферативными заболеваниями в процессе противоопухолевого лечения», «Изучение общих биохимических механизмов синдрома токсичности у детей, страдающих злокачественными опухолями»: грантов РФФ «Изучение общих биохимических механизмов токсичности различных режимов высокодозной химиотерапии при злокачественных опухолях у детей» № 01-04-49828; № 00-15-97909; НШ-1110.2003.01.

выводы

1. Разработан метод количественного определения метотрексата и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови больных с помощью ВЭЖХ (предел обнаружения 0,8 10"3 мг/мл; коэффициент вариации 2,77%).

2. Установлена возможность применения ФПИА в системе FLx («Abbott», USA) для проведения количественного определения метотрексата в инъекционных ЛФ о предел обнаружения 4,5 10" мг/мл; коэффициент вариации 1,17%). Разработан экспресс-метод его количественного определения, сопоставимый по метрологическим характеристикам с методом европейской фармакопеи.

3. Проведенный сравнительный ВЭЖХ — анализ препаратов метотрексата, применяемых в детской онкологии и выпускаемых различными фирмами-производителями, показал, что они различаются по количественному содержанию примесей и действующего вещества. Наиболее качественными (отвечающими требованиям европейской фармакопеи - менее 2,5% и от 95 до 105% соответственно) являются раствор для инъекций метотрексата Лахема, Чехия (1,94 ± 0,49; 98,47 ± 0,71) и концентрат для приготовления инфузий метотрексата фирмы Эбеве, Австрия (1,15 ± 0,52; 103,23 ± 1,07).

4. Проведенный сравнительный анализ методов количественного определения метотрексата в сыворотке крови показал, что методы ВЭЖХ и ФПИА сопоставимы по точности (критерий Стьюдента р = 0,728) и воспроизводимости (96 и 99% соответственно). Метод ФПИА имеет ряд преимуществ (более простой и быстрый) по сравнению с ВЭЖХ, что делает его более пригодным для проведения ТЛМ метотрексата в клинической практике.

5. Установлено, что при замедленном выведении Mtx происходит изменение его метаболизма, которое выражается в нарушении соотношения концентрации Mtx/7-OH-Mtx.

6. Изучена динамика изменения биохимических показателей в процессе химиотерапии детей с гемобластозами и показана информативность следующих из них: МСМ, каталазы, витаминов А и Е для оценки общей токсичности и нарушений антиоксидантного статуса; N-AHK и ВМК для оценки нейротоксичности.

7. В период проведения высокодозной химиотерапии метотрексатом выявлен ряд корреляций между показателями нейротоксичности и данными ЭЭГ-иссле-дований, свидетельствующих о влиянии на ЦНС патологического процесса и химиотерапии. Показана прямая зависимость между увеличением концентрации Mtx и показателем нейротоксичности — N-AHK (коэффициент корреляции Спирмена 0,8683).

Практические рекомендации.

1. Разработана методология проведения ТЛМ Mtx у детей, страдающих гемобластозами.

2. Для количественного анализа инъекционных форм Mtx рекомендован метод ФПИА.

3. Разработаны биохимические критерии различных видов токсичности у детей, страдающих гемобластозами, которые применяются в отделение химиотерапии гемобластозов НИИ ДОиГ ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.