Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Биофармацевтический анализ антидотных свойств кальция фолината при высокодозной химиотерапии метотрексатом остеосаркомы у детей

V

На правах рукописи

Кошечкин Константин Александрович

Биофармацевтический анализ антидотных свойств кальция фолината при высокодозной химиотерапии метотрексатом остеосаркомы у детей

15.00.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з 0 о:.;Т

Москва - 2008 г.

003451389

Работа выполнена экспресс-лаборатории НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН и на кафедре фармацевтической и токсикологической хим Российского университета дружбы народов

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Байкова Валентина Николаевна

доктор химических наук, профессор

Плетенева Татьяна Вадимовна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук профессор Берлянд Александр Семенович кандидат биологических наук Балышев Александр Владимирович

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится «21» ноября 2008 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д.212.203.13 при Российском университете дружбы народов (117198 г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РУДН (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).

Автореферат разослан «20» октября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук профессор

Е.В. Лукашева

Актуальность темы

Создание и внедрение в клиническую практику эффективных противоопухолевых препаратов значительно расширило возможности воздействия на злокачественные опухоли детей (Алиев М.Д., Иванова Н.М., 2006). К сожалению, большинство из применяемых противоопухолевых препаратов обладают рядом существенных недостатков: низкой избирательностью действия, небольшой терапевтической широтой, токсическим действием на различные органы и системы организма, возникновением лекарственной устойчивости. Трудности и несовершенство метода полихимиотерапии (ПХТ) опухолей у детей диктуют необходимость изыскания не только новых оригинальных противоопухолевых препаратов, но и разработки оригинальных методик проведения лечения, включающих режимы и дозы их введения в организм. В последнее время в программном лечении онкологических заболеваний у детей стали применяться высокие дозы (ВД) противоопухолевых препаратов. Это требует тщательного биофармацевтического исследования их безопасности, фармакокинетики и фармакодинамики.

В настоящее время в мировой лечебной практике разработаны протоколы лечения онкологических заболеваний с максимальными дозами противоопухолевых препаратов, строго регламентированными периодами их проведения. Многие больные дети такой интенсивной терапии не выдерживают и их исключают из протокола лечения. По этой причине в последнее время начинает развиваться персонализированная медицина, которая подразумевает назначение конкретного противоопухолевого препарата конкретному больному на основании фармакокинетических и фармакогеномных сведений пациента. Назначение кальция фолината (СаРо1) при высокодозной химиотерапии (ВДХТ) метотрексатом (ТуИх) является одним из аспектов индивидуального подхода к лечению. Применение СаРо1 на фоне лечения М1х, дозы которого стократно превышают стандартные, поддерживает нормальную жизнедеятельность клеток со сниженным уровнем фолатов и позволяет осуществлять антидотную терапию. Антагонисты фолиевой кислоты (ФК), одним из которых является М1х, занимают особое место среди противоопухолевых препаратов: с их помощью были получены первые полные ремиссии при лейкозах. Интерес к антагонистам ФК еще больше повысили достижения ВДХТ в сочетании с СаРо1, снижающим токсичность препаратов. Благодаря этому расширился спектр противоопухолевой активности ]Шх, теперь его назначают при остеосаркоме (ОС), на которую препарат в стандартных дозах не действовал. Оптимальная схема введения ВД М1х в сочетании с СаРо1 при ОС до сих пор не разработана. ВДХТ ГМх чревата тяжелыми побочными эффектами (Переводчикова Н.И., 2005), лечение должно проводиться под строгим контролем ряда лабораторных показателей (в частности, терапевтического лекарственного мониторинга концентрации 1Мх), по значениям которых определяется необходимая доза СаРо1. Фактически, при ВДХТ КИх осуществляется "resque" - спасение препаратами СаРо1. Успех лечения во многом зависит от качества этих лекарственных средств (ЛС), что повышает требования к их фармацевтическому анализу, независимо от источника поступления на отечественный фармацевтический рынок. В настоящее время в РФ действует семь регистрационных удостоверений на препараты СаРо1. Выбор наиболее безопасного и эффективного из них, безусловно, является актуальной и важной задачей, решение которой позволит снизить токсические эффекты ВДХТ М1х. Фармацевтический анализ этих ЛС (определение подлинности, испытания на чистоту, количественное определение) в условиях детской онкологической клиники, модификация существующих и разработка новых аналитических методик позволит повысить эффективность спасительной терапии СаРо1.

Высокая отсроченная токсичность М1х является серьезным ограничением в достижении максимального лечебного действия, что в большинстве случаев обусловливает возникновение у больных серьезных побочных эффектов со стороны различных органов и систем. Проявление гепато- и нефротоксичности служат показанием для прерывания, и даже прекращения эффективного лечения, приводя к повышению частоты рецидивов основного заболевания. При ВДХТ исключительно большое значение имеют адаптационные и компенсаторные системы, способствующие мобилизации защитных механизмов организма. Важным звеном в их проявлении является состояние антиоксидантной системы (АОС), обеспечивающей резистентность организма при экстремальных воздействиях.

Разработка методологических подходов к диагностике и мониторингу токсичности ВД 1УИх на основе комплекса биохимических методов исследования, контроль детоксикационного действия проводимой сопроводительной терапии (СТ) на основе биокинетических подходов является одной из актуальных задач онкологии, решаемых в том числе и биофармацевтическими подходами. Следует отметить, что в литературе отсутствуют работы, посвященные изучению биохимических маркеров токсичности, не разработан алгоритм контроля качества препаратов СаРо1 в условиях клиники при проведении ВДХТ ГуНх. В этом аспекте очевидна актуальность проведенного комплексного исследования.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка методики количественного определения СаБо1 в инъекционных лекарственных препаратах (ЛП) различных фирм-производителей методом ВЭЖХ и биокинетическая оценка антидотной активности СаРо1 при ВДХТ ГуНх ОС у детей.

Для реализации поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать методику количественного определения кальция фолината в инъекционных лекарственных препаратах и в сыворотке крови методом ВЭЖХ.

2. Провести сравнительную оценку качества инъекционных препаратов кальция фолината различных фирм-производителей.

3. Оценить влияние кальция фолината на показатели гепатотоксичности на различных курсах лечения при проведении ВДХТ МЬс у детей с ОС. Рассчитать биокинетические параметры восстановления показателей гепатотоксичности и АОС на основе их длительного мониторинга при лечении ОС у детей ВДХТ №Их.

4. Изучить состояние АОС при терапии ВДХТ М1х ОС у детей для оценки и взаимосвязи с токсическими осложнениями. Рассчитать биокинетические параметры изменения состояния АОС на основе длительного мониторинга ее показателей пр лечении ОС у детей ВДХТ М1х.

5. Провести сравнительное исследование биохимических показателей на фон применения вспомогательного гепатопротектора.

Научная новизна исследования

Разработана унифицированная экспресс-методика определения (метод ВЭЖХ СаРо1 в лекарственных формах и сыворотке крови (модельные системы). Различные сери препаратов разных производителей охарактеризованы по показателям «подлинность» «испытания на чистоту», «количественное определение».

Впервые проведена оценка антидотной активности СаБо1 при ВДХТ М& ОС детей на основе длительного мониторирования биохимических показателей крови маркеров гепатотоксичности, нефротоксичности, водно-электролитного и кислотно основного баланса.

Впервые количественно охарактеризованы изменение состояния ферментов АОС организма при терапии ВД Mtx ОС у детей и проведена оценка их взаимосвязи с токсическими осложнениями.

Научно-практическая значимость исследования

Разработаны и внедрены в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН методики определения CaFol в лекарственных препаратах разных производителей и сыворотке крови.

Для зарегистрированных на отечественном рынке препаратов CaFol проанализировано соответствие декларированных показателей качества фактическим. Выданные рекомендации по предпочтительному использованию одного из препаратов позволят улучшить показатели выживаемости и качество жизни у исследуемой категории пациентов.

На основании проведенной биокинетической оценки показателей гепатотоксичности (константа скорости, период полувосстановления до нормы, максимальные значения в момент введения антидота) даны рекомендации по периодичности СТ.

На основании пролонгированных кинетических исследований АОС организма при ВДХТ Mtx рекомендована сопутствующая антиоксидантная терапия.

Внедрение в практику

Экспресс-метод количественного определения CaFol и идентификации примесей используется в ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Рекомендации по CT на основе анализа ЛП CaFol различных фирм-производителей. Биокинетическая оценка показателей гепатотоксичности и АОС больных ОС применяются в ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН и активно используются в рамках обеих дисциплин.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены: на XIII Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2006 г.); на секционном семинаре «Судебно-химические и химико-токсикологические экспертные исследования» в рамках XI международной выставки «Интерполитех-2007»; на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование - XXI век. Концепции болезней цивилизации», проведенном на базе Российского университета дружбы народов; семинаре с участием кафедры и фармацевтической и токсикологической химии, кафедры биологии и общей генетики РУДН, судебно-химического отдела Российского центра судебно-медицинской экспертизы и ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 162 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 150 источников, и приложений. Работа иллюстрирована 47 рисунком и 40 таблицами.

Связь задач исследования с научным планом НИР ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и Российского университета дружбы народов

Диссертационная работа выполнена в рамках НИР ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН: № 00-15-97909 «Биохимические механизмы токсикокинетики различных режимов химиотерапии при злокачественных опухолях у детей», «Изучение общих биохимических механизмов синдрома токсичности у детей, страдающих злокачественными опухолями».

И НИР РУДН №033301-0-000 «Кинетические исследования биологической активности лекарственных средств, совершенствование контроля их качества, биофармацевтических и фармакоэкономических критериев создания и обращения на фармацевтическом рынке».

Положения, выносимые на защиту:

• Методика качественного и количественного определения CaFol и его родственны примесей в инъекционных JIÜ и сыворотке крови методом ВЭЖХ.

• Результаты сравнительного фармацевтического анализа качества препаратов CaFol выпускаемых различными фирмами-производителями.

• Обоснование возможности применения биокинетических подходов для оценк токсических эффектов ПХТ и расчета оптимальных интервалов введения.

• Обоснование необходимости сочетания мониторинга показателей гепатотоксичности состояния АОС организма с последующей СТ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для проведения сравнительной оценки качества ЛП CaFol, применяемых дл антидотной терапии у детей, получавших ВД Mtx, использовали: лиофилизированны порошок CaFol для приготовления раствора для инъекций фл. 50 мг «Лэнс-Фарм (Россия), лиофилизированный порошок CaFol для приготовления раствора для инъекци фл. 25 мг «Lachema» (Чешская Республика), раствор для инъекций CaFol 10 мг/мл фл. мл «Teva» (Израиль).

В работе были использованы следующие реактивы: стандартные растворы CaF (ICN Biomedicals, США) и ФК (Fluka Biochemica, Швейцария); компоненты подвижно фазы - тетрабутиламмония гидроксид (ТБАГ) «осч», ацетонитрил (HPLC grade, Acros метанол (HPLC grade, Merc), натрия дигидрофосфат «хч».

В ходе работы в динамике (2003-2007гг) обследованы 50 детей, получавши лечение ВД Mtx по протоколу комплексной химиотерапии «ОС-2003», разработанному утвержденному в НИИ ДОГ ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Возраст обследуемы детей от 10 до 15 лет, средний возраст больных составил 12,2+1,8 лет. Больные ОС был распределены на 8 групп в соответствии с курсом терапии ВДХТ Mtx. Все пациент получали CaFol для снятия токсических эффектов после получения ВДХТ Mt Исследование включало одновременное определение биохимических показател гепатотоксичности (уровень ферментов цитолиза - АЛТ и ACT, мембраносвязанно фермента у-ГТ, цитоплазматического фермента ЛДГ, пигментного обмена - содержан общего билирубина, общего белка, альбумина в сыворотке крови) и АОС - фермент супероксиддисмутазы (СОД), глутатионредуктазы (ГР) и общего антиоксидантно статуса (ОАОС) на протяжении всего лечения (до начала лечения и в течение каждого восьми курсов ВДХТ Mtx, а также после окончания лечения).

В контрольную группу детей (30 человек) вошли практически здоровые пациент Распределение их по полу и возрасту в контрольной группе соответствовало таковому исследуемой группе больных. Возраст обследуемых детей был от 9 до 15 лет, среди возраст 12±1,4 лет.

Идентификацию и количественное определение CaFol в ЛП и сыворотке кро проводили методом ВЭЖХ на хроматографе Metrohm 844 UV/VIS Compact (Швейцария). Неподвижная фаза - хроматографическая колонка PRONTOSIL С18 а EPS 5ц 150x4.6, США. Подвижную фазу готовили следующим образом: ТБАГ разводи водой до 25% в объеме 20 мл, смешивали со 150 мл ацетонитрила и 800 мл воды, доводили до 7,5±0,1 натрия дигидродфосфатом. Перед использованием подвижную ф

фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазировали, обрабатывая раствор ультразвуком. Скорость потока элюента составляла 1,75 мл/мин. Объём вводимой пробы - 20 мкл.

При ВДХТ Mtx CaFol начинали вводить больным ОС с 24 ч от начала введения Mtx. Дозу CaFol рассчитывали после определения методом ФПИА содержания Mtx в сыворотке крови на 4, 24, 42, 48 ч, затем каждые б ч, пока концентрация Mtx не достигала 0,02 ммоль/л. Если концентрация Mtx на 48 ч от начала введения превышала 1 ммоль/л, то дозу CaFol рассчитывали с учетом массы тела больного по полученной эмпирически формуле: m(CaFol) = C(Mtx)xmxkxl, где m(CaFol) - необходимая доза CaFol (мг), C(Mtx) - концентрация Mtx в крови больного (мкмоль/л), m - масса больного (кг), коэффициенты к (мг/ммоль) и 1 (л/кг) подобраны эмпирически.

Оценку биохимических показателей, значений ОАОС, активностей СОД, ГР, у-ГТ определяли на биохимическом анализаторе ALCYON фирмы «Abbott» (США). Измерение проводили при шести длинах волн: 340, 380, 405, 500,550, 600 нм. Использовали реактивы фирмы Randox (GB).

При анализе результатов определения активности ферментов AJIT, ACT, у-ГТ, ЛДГ, ЩФ в сыворотке контрольной группы (30 человек) значительная вариабельность показателей была характерна только для ЩФ и ЛДГ (табл. 1).

Таблица 1.

Значения биохимических показателей сыворотки крови у детей контрольной

группы (п = 30)

Биохимические Средние Пределы нормы Пороговые значения

показатели значения (справочные данные) (контрольная группа)

Билирубин (мкмоль/л) 6,8 ± 1,0 2,9 - 20,5 8

АЛТ (ед/л) 23,3 ±4,2 10,4-62,7 40

ACT (ед/л) 28,8 ±1,8 16,0-44,3 40

ЛДГ (ед/л) < 10 лет 490 ±25 371 -651 650

> 10 лет 340 ±26 259-490 490

ЩФ (ед/л) <10 лет 663 ± 52 400-854 -

>10 лет 420 ± 78 105-777 -

у-ГТ (ед/л) 11,8 ±1,3 5,0-35,0 15

СОД (ед/л) 963,5 ±45,8 820-1200 1200

ГР (ед/л) 57,4 ± 12,6 33-73 73

ОАОС (ммоль/л) 1,5 ±0,12 1,30-1,77 1,77

В качестве биохимических критериев нарушения функции печени использовали пороговые значения АЛТ, ACT, ЛДГ, Г-ГТ, общего билирубина, активности СОД, ГР, ОАОС, установленные нами в контрольной группе детей (см. табл. 1), а также стандартные показатели гиперферментемии и гипербилирубинемии, предложенные Американской ассоциацией по клинической химии - 1998 г.(табл. 2).

Таблица 2.

Оценка нарушения функции печени в соответствии со стандартными

биохимическими критериями

Степень нарушения Лабораторные показатели

АЛТ, ACT Общий билирубин

Незначительная N*-2,5N N*-2,5N

Умеренная 2,5N - 10N 2,5N-5N

Тяжелая >10N >5N

Где N* - верхняя граница нормы; АЛТ, ACT - 40 ед/л; билирубин - 20,5 мкмоль/л.

Биокинетический анализ. Определение кинетических параметров восстановления показателей гепатотоксичности и АОС осуществляли в компьютерной программе «Origin 40». Для определения константы скорости реакций первого порядка использовали полулогарифмические координаты lnC(t). Уравнение прямой вида y=a-bx (lnC=lnCo-kt) сопровождалось указанием значений коэффициентов а и Ь. Это не требовало дополнительных расчетов константы скорости (k=-b). Периоды полувосстановления исследуемых показателей гепатотоксичности и АОС вычисляли по формуле: tj/2=ln2/k. Начальную концентрацию биохимического показателя С0 (а=1пС0 при t=0) определяли из графика или рассчитывали по кинетическому уравнению.

Статистическую обработку результатов исследования и корреляционный анали проводили с помощью программы «Origin 40», пакета прикладных программ для персо нального компьютера Statistica 6 и программ пакета Microsoft Office XP-Excel. Метрологическую характеристику методик количественного определения CaFol препаратах и сыворотке крови проводили по ФС: «Статистическая обработка результате химического эксперимента и биологических испытаний» (ГФ XI).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Методика количественного определения CaFol в лекарственных препарата различных фирм-производителей и сыворотке крови.

При разработке методики принимали во внимание возможность присутствия как ЛП, так и в сыворотке крови, ФК и ее производных, близких к CaFol по строению, значит, и по хроматографическим характеристикам. Разделение пиков ФК и CaFo необходимо также в связи с использованием более доступного стандарта ФК дл определения CaFol в сыворотке крови и лекарственных препаратах методом внутреннег стандарта. Их совместное обнаружение возможно в интервале рН, соответствующе преобладанию молекулярных форм. В ряде экспериментов был использован цитратно фосфатный буфер (рН 2,6). Смещение равновесия в сторону преобладания молекулярны форм определяемых веществ в растворе можно добиться добавлением ТБАГ образующего с анализируемыми соединениями растворимые в органически растворителях неионизированные продукты взаимодействия (рН = 7,5).

На этапе подбора оптимальных условий хроматографирования нами был исследованы подвижные фазы разного состава (табл. 3). Хроматографические пики полученные при использовании каждой подвижной фазы, оценивали по показателям: t время удерживания, R - степень разделения и а - селективность.

При использовании систем 4 и 7, пики практически не разделялись из-з недостаточной количества реагентов переводящих определяемые соединения неионизированные формы. Применение систем с меньшим содержанием органическог компонента (1 и 8) приводило к увеличению времени удерживания и уширению пиков из за замедления вымывания определяемых веществ с сорбента.

При использовании системы с большим количеством ацетонитрила (2), пи] выходили слишком рано, CaFol практически не разделялся с пиком растворителя Применение системы 3 позволило достичь оптимального разделения пиков, однако он были недостаточно симметричны.

Таблица 3

Составы подвижных фаз для разделения производных ФК

№ системы Компоненты подвижной фазы, об. %

Ацетонитрил ТБАГ Вода Раствор натрия дигидрофосфата, 2 моль/л Цигратно-фосфатный буфер, рН 2,6

1 10 2 86 2

2 18 2 78 2

3 15 2,5 80 2,5

4 15 1 83 1

5 15 2 81 2

6 8 92

7 10 90

8 6 94

Полного разделения пиков при минимальном времени анализа удалось достичь при использовании систем 5 и 6. Но мобильная фаза 6 на основе цитратно-фосфатного буфера характеризовалась более низкой селективностью и воспроизводимостью по сравнению с системой 5 (рис. 1).

Параметр CaFol ФК

t 3,91 5,97

к' 1,6 3,0

N 1 498 903

а 1,8

R 2,1

Рис. 1 Хроматограмма CaFoI (t 3,91) и ФК (t 5,97) для подвижной фазы №5 и параметры их разделения.

Таким образом, в результате экспериментальных исследований была подобрана изократичная система: ТБГА - ацетонитрил - вода - раствор натрия дигидрофосфата 2 моль/л (2:15:81:2) с рН 7,5, которая оказалась оптимальной для разделения производных ФК на колонке с силикагелем, связанным с октадецилсиланом PRONTOSIL С18 ace-EPS 5р 150x4,6 (см. рис. 1).

Подобранная хроматографическая система показала достаточную селективность (1,8) и разделяющую способность (2,1) для производных ФК. Эффективность системы -500-900 теоретических тарелок для обоих соединений - позволила использовать ее для определения CaFol в ЛП и сыворотке крови. Нижний предел обнаружения CaFol (сигнал j превышал тройной уровень флуктуации линии фона) составил 1,2 мг/л.

Параметры количественного определения и метрологические характеристики методики.

Содержание CaFol и ФК определяли методом абсолютной калибровки по градуировочному графику. Для его построения использовали стандартные образцы определяемых веществ. Параметры количественного определения свидетельствуют о

возможности применения методики для контроля качества ЛП СаРо1 и определения его сыворотке крови (табл. 4).

Таблица

Параметры анализа ФК СаКо1

Нижний предел обнаружения, мг/л 1,6 1,2

Нижняя граница определяемых концентраций, мг/л 7,4 6,9

Диапазон линейных концентраций мг/л 1-1000 1-1000

По результатам семи определений стандартных образцов СаРо1 и ФК был рассчитаны метрологические характеристики разработанной нами методики (табл. 5).

Таблица 5

Определяемое вещество X, мг/л в в2 Р% Л*, мг/л Е,%

СаРо1 161,4 1.788 3,20 95 2,78 2.22 1,38

ФК 134,3 1.938 3,70 95 2,78 2.75 2,05

Таким образом, разработанная методика определения СаБо1 и ФК характеризуете приемлемой относительной погрешностью (1,38% и 2,05% соответственно) и свободн от систематической погрешности.

Определение СаРо1 в сыворотке крови (модельные системы). Для определен: содержания СаРо1 в сыворотке крови методом ВЭЖХ проводили многостадийну пробоподготовку. В стеклянные пробирки на 3 мл отбирали 400 мкл сыворотки крови которую осаждали двумя объемами ацетонитрила (800 мкл). Пробирки закрывали и интен сивно встряхивали в течение 30 с, затем центрифугировали (3 мин, 3000 об/мин) Надосадочную жидкость отделяли и добавляли к ней четыре объёма хлороформа (1,6 мл) Пробирки закрывали и 10 мин интенсивно встряхивали, затем центрифугировали при 8° в течение 5 мин (3000 об/мин). Одновременное охлаждение при центрифугировани позволяло обеспечить большую чистоту образцов за счет уменьшения растворимост ацетонитрила в хлороформе. Для хроматографии отбирали 100 мкл верхнего слоя содержащего СаРо1.

Специфичность методики была подтверждена при анализе образцов сыворот взятых у здоровых детей. Хромато граммы этих образцов (рис. 2) сравнивали хроматограммами, полученными после добавления к ним СаРо1 (рис. 3).

в\; ?

Ю-

&

»

Ц- а ? Л

и 5 1

10 льч ' '

1 : » 1 1 i i 9 1в 11 15 М И I.

АиС АиС%

Пик 1 3.10 1.01 0.79

Пик 2 3.43 32.31 50.48

Пик 3 5.02 12.14 43.50

51.91 100.0

Рис. 2. Хроматограмма сыворотки крови здорового человека (без добавления к не СаРо!).

я 3 1

льи 1 '

1 ! I > I 1 » Г

лис лис%

Пик 1 2.86 1.37 0.19

Пик 2 3.33 8.85 6.07

СаРо! 4.86 214.83 93.37

284.94 100.0

Рис. 3. Хроматограмма сыворотки крови здорового человека после добавления к ней СаРо1.

Это позволило убедиться в отсутствии перекрестной реакции эндогенных веществ с определяемым соединением. Как видно из хроматограмм, в условиях, используемых для детектирования производного ФК в сыворотке крови человека, обнаружено несколько хроматографических пиков. Это свидетельствует о наличии родственных эндогенных соединений в исследуемых образцах.

После добавления к сыворотке крови СаБо! на хроматограмме появляется пик СаРо1, десятикратно превышающий интенсивность пиков эндогенных фолатов (см. рис. 3).

Разработанная методика определения СаРо1 и ее модификация для сыворотки крови с использованием в качестве внутреннего стандарта ФК может быть использована для:

а) оценки качества лекарственных препаратов различных фирм-производителей;

б) контроля его содержания в крови при корректировке доз, необходимых для снятия токсических эффектов \Их с сохранением терапевтического действия основного препарата.

2. Определение подлинности и содержания СаРо1 в инъекционных лекарственных формах, применяемых в онкологии

Для снижения побочных эффектов при ВДХТ М1х детей с ОС применяют высокие суммарные дозы СаРо1. В связи с этим необходим строгий контроль качества используемых ЛП. При этом важно не только подтверждение соответствия показателей качества ФСП, но и выбор самого безопасного препарата из представленных на отечественном рынке. Нами были проанализированы препараты СаРо1 трех фирм-производителей (табл. 6). Было обнаружено, что содержание действующего вещества и показателей чистоты (родственные примеси, определяемые в тех же хроматографических условиях), заявленные в спецификациях, заметно отличаются для разных производителей (табл. 6). Относительное содержание СаРо1 и родственных примесей определяемых в тех же хроматографических условиях было определено по соотношению площадей под кривыми соответствующих пиков.

Таблица 6

Содержание СаРо1 и примесей в инъекционных препаратах различных фирм__производителей (п=7, Р=95%)_

Производитель Содержание CaFol, % Содержание примесей, %

НД Фактическое ( X ± А* ) НД Фактическое (X ± Дх)

Teva 90-110 96,13 ±0,28 <3,0 2,45± 0,65

Lachema 90-110 98,23 ± 0,80 <3,0 1,83 ±0,51

лэнс 90-120 108,77 ± 1,12 <5,0 2,79 ± 0,75

На рис. 4 показаны хроматограммы, полученные при анализе препаратов указанных производителей. Подлинность действующего вещества была определена по совпадению времен удерживания анализируемого образца и стандарта. Определение примесей также проводили в соответствии с временами удерживания, опираясь на данные НД производителя.

Вещество к AUC AUC,%

ABGA 1,87 9,64 0,68

РАВА 2,23 7,8 0,55

FFA 2,79 4,39 0,31

CaFol 3,91 876,7 61,78

ФК 6,00 520,51 36,68

1419,08 100

b

Вещество tR AUC AUC,%

АВОА 1,89 4,71 0,33

РАВА 2,27 7,6 0,53

FFA 2,81 4,15 0,29

CaFol 3,92 888,52 62,13

ФК 6,08 525,13 36,72

1430,1 100

с

Рис. 4 Пример хроматограммы (а) и хроматографические параметры препаратов СаРо! различных фирм-производителей: Ь - «Тега» (Израиль), с - «ЬасЬеша» (Чешская республика), (1 -«ЛЭНС - Фарм» (РФ)

Оценку содержания СаРо1 проводили методом внутреннего стандарта. Содержание

, ^ л „ АТС. хС хУхАГхЮ0% ^ „

СаКо) в образце вычисляли по формуле: Сл (%) =-1-2-. Где С5( -

А11С2 хт

концентрация стандартного раствора ФК, мг/мл; АиС| - площадь пика СаРо1 в анализируемой пробе; АиС2 - площадь пика стандарта ФК; V - общий объём 12

Вещество «R AUC AUC,%

ABGA 1,85 8,62 0,56

РАВА 2,24 6,01 0,39

FFA 2,78 10,01 0,65

CaFol 3,89 983,85 63,88

ФК 5,95 531,6 34,52

1539,99 100

d

растворителей с учетом всех разведений, мл; m - масса препарата, мг; К - коэффициент, учитывающий различие в УФ - поглощении внутреннего стандарта и анализируемого вещества (К = 1,86).

Как видно из полученных результатов, все препараты CaFol по показателям качества соответствовали требованиям Европейской фармакопеи и НД производителя. Но следует особо подчеркнуть, что верхняя граница регламентируемых производителем содержаний CaFol на 10-20% превышает максимально возможное (см. табл.6). Это является свидетельством присутствия в ЛП родственных примесей, определение которых производитель допускает совместно с действующим веществом.

Учитывая важность СТ CaFol при ВДХТ Mtxn его высокие суточные дозы, в первую очередь следует рекомендовать для применения препарат фирмы «Лахема» (Чешская республика). Для него характерно наибольшее содержание действующего вещества (98,23±0,80)% и наименьшее количество примесей (1,83±0,51)% по сравнению с препаратами других производителей. Низкое содержание примесей снижает вероятность проявления их комбинированной и кумулятивной токсичности.

Выявленное нами соответствие критериев качества препарата CaFol фирмы «Лахема» требованиям НД и наиболее точная дозировка действующего вещества по сравнению с его аналогами позволяет предполагать снижение токсических эффектов Mtx при снижении дозировки его антидота - CaFol.

3. Биокинетический анализ показателей гепатотоксичности при проведении антидотной терапии CaFol

При ВДХТ Mtx тяжелая токсичность, оцениваемая по стандартным критериям (см. табл.2), встречалась в 82,1% случаев, умеренная - в 17,9% случаев. Для своевременного предупреждения токсического воздействия Mtx проводили мониторинг биохимических и общеклинических показателей крови в течение восьми курсов терапии. Это позволило оценить кинетические параметры не только за период отдельных курсов, но и провести их сравнительный анализ.

Широкий спектр определяемых в сыворотке крови показателей (креатинин, мочевина, общий билирубин (ОБ), белок общий, альбумин, АЛТ, ACT, ЛДГ, ЩФ, Са2+, электролиты и газы крови, а также общие клинические показатели крови) позволил выявить биокинетические индикаторы токсичности Mtx и антидотного действия CaFol. Отклонение от нормы АЛТ, ACT, ЛДГ и ОБ свидетельствовали о гепатотоксичности Mtx. Наиболее значительные изменения наблюдали для ферментов цитолиза АЛТ и ACT. Показатели гепатотоксичности резко возрастали сразу после введения Mtx. Введение CaFol на 24 ч после начала курса лечения Mtx способствовало снижению значений АЛТ, ACT, ЛДГ, ОБ (рис.5).

с. yen. ел

О 10 20 110 120

t. дни

Рис. 5. Общая кинетическая схема токсического действия Mtx и антидотного влияния CaFoI на показатели гепатотокснчности АЛТ, ACT, ЛДГ и ОБ (а) и пример «С-t» - кривых для АЛТ одного из пациентов (Ь).

Оказалось, что из всех исследованных биохимических показателей токсичности Mtx только для АЛТ, ACT, ЛДГ и ОБ кинетика восстановления до значений нормы соответствовала первому порядку: экспоненциальная зависимость C=Cmaxe"kl линеаризовалась в полулогарифмических координатах (InC-t). Кинетические параметры биохимических показателей - k, ti/2, С0 - рассчитывали, используя однокамерную модель и допуская, что исследуемые маркеры распределены в камере равномерно (гомогенная система).

Константа скорости восстановления нормального содержания в крови того или иного показателя гепатотокснчности характеризует скорость достижения его физиологической нормы при единичной концентрации (табл. 7).

Таблица 7

Кинетические характеристики некоторых показателей гепатотокснчности после

введения метотрексата (п=7, случайная выборка пациентов и курсов ВДХТ Mtx)

Биохимический показатель Кинетические параметры

к, сут"1 ti/2, сут Со Норма

ACT 0,44+0,10 1,58 506,6±28,3 <38 Е/л

АЛТ 0,32±0,08 2,20 427,9±23,4 <40 Е/л

ЛДГ 0,22+0,06 3,15 1077,7+57,3 226-451 Е/л

ОБ 0,10±0,04 6,93 16,06±4,9 3,4-17,1 мкмоль/л

Кинетический подход для интерпретации биохимических показателей токсичности позволил также оценить их максимальные значения (С0), соответствующие моменту введения СаБок Эти экстремальные значения представляют чрезвычайный интерес для практической медицины. Они не могут быть определены экспериментально. По этой причине существующие официальные оценки нарушения функции печени в соответствии со стандартными биохимическими критериями (см. табл. 2) имеют лишь приблизительный характер.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что скорость восстановления показателей до нормы падает в ряду АСТ>АЛТ>ЛДГ>ОБ. Значения периодов

полувосстановления нормального содержания показателей гепатотоксичности колеблется в интервале от 1,6 до 7,0 суток. Вычисленные значения максимального содержания ферментов печени в крови (С0) превышают норму в десятки раз (см. табл. 7). Принимая во внимание, что МКх удерживается в течение нескольких недель в почках и в течение месяцев в печени, из полученных нами результатов следует, что особенно существенное проявление гепатотоксичности наблюдается в первые сутки от начала курса лечения. Это объясняет необходимость начала антидотной терапии СаРо1 24 ч от начала терапии.

Проведение крупномасштабного биокинетического анализа гепатотоксичности включало характеристику 4 показателей (рис. 6) для 50 пациентов по 8 курсам ВДХТ (по 1600 значений к, С0).

Рис. 6. Кинетика восстановления уровня показателей гепатотоксичности для разных курсов терапии. О - значения до начала лечения (п=50, р=95%).

j В результате было установлено, что с ростом номера курса ВДХТ константа

скорости для AJIT имеет тенденцию к увеличению - в среднем до 0,40 сут"1 (рис. 7), тогда как для ЛДГ значения констант скорости колеблются в интервале (0,15-0,35) сут1, имея тенденцию к снижению (рис. 8). Для ACT и ОБ не было выявлено зависимости константы скорости от курса лечения. Как и следовало ожидать, для АЛТ существует антибатный характер между изменениями к и С0.

Обращает на себя внимание тот факт, что случайная выборка пациентов и курсов ВДХТ (см. табл.7) позволила получить результат, численно сопоставимый с расчетами для репрезентативной выборки с учетом всех курсов лечения._

12345678

N5 курса

Рис. 7. Кинетика восстановления уровня АЛТ (а); изменение константы скорости первого порядка (Ь) и максимальной концентрации АЛТ в момент введения СаРо1 (с) на разных курсах терапии ]Шх.

I, сут N куРса

Рис. 8. Кинетика восстановления уровня ЛДГ (а) и колебание значений константы скорости первого порядка в зависимости от курса терапии (Ь).

Таким образом, после введения КИх содержание ферментов печени и общего билирубина резко возрастает, но благодаря введению СаРо1 восстанавливается до показателей, позволяющих продолжать протокол лечения. Определение кинетических параметров показателей гепатотоксичности открывает возможности оценки продолжительности их восстановления до нормы на фоне антидотной терапии. Это, в свою очередь, позволяет определить оптимальный промежуток времени между введениями КЙх для минимизации токсичности при сохранении максимальной эффективности.

4. Состояние антиоксидантной системы как маркер токсических осложнений при высокодозной химиотерапии метотрексатом остеосаркомы у детей

Особое значение в токсической патологии, в том числе и поражении печени, придается состоянию АОС. В литературе отсутствуют сведения о влиянии на некоторые показатели АОС высокодозной терапии М(х. Эти зависимости особенно важны для ферментной составляющей АОС (СОД, ГР) и ОАОС, поскольку в механизмах действия М1х задействованы и биоантиоксидантные системы. Нами было изучено состояние АОС при получении ВД 1Мх (8-12 г/м2) детьми с ОС.

При изучении показателей АОС было обнаружено, что при ВДХТ 1Мх к 4 ч резко снижается ОАОС и активность ГР (рис. 9). К 24 ч показатели достигают исходных значений и далее, увеличиваясь, значительно превышают их. Симбатный характер изменения ОАОС и ГР предполагает, что основной вклад в антиоксидатный статус вносит именно глутатионредуктаза. Выявленная статистически значимая корреляция между активностью ГР и ОАОС (г=0,92) также подтверждает правильность сделанного вывода.

Рис. 9. Кинетика восстановления уровня показателей АОС для разных курсов лечения остеосаркомы (N=50, р=95%).

Два других фермента - СОД и у-ГТ - резко активируются к 4 ч после введения М1х. Затем их активность падает, постепенно достигая значений нормы для у-ГТ. Таким образом, антибатный характер активации и ингибирования этой пары ферментов по отношению к ОАОС и ГР обеспечивает в среднем стабильность АОС организма.

Для всех четырех показателей АОС характерны резкие различия между 1-5 и 6-8 курсами. Так, восстановление показателей ОАОС и ГР, подчиняясь кинетике первого порядка, практически не изменяется на первых шести курсах и несколько возрастает на 7 и 8 курсах терапии (рис.10). Для СОД и у-ГТ 7 и 8 курсы терапии характеризуются

самыми низкими скоростями восстановления. Для СОД характерно снижение скорости восстановления, подчиняющееся прямолинейной зависимости (рис.11).

сод

Рис. 11. Кинетические прямые в полулогарифмических координатах (а) и зависимость константы скорости первого порядка (Ь) для СОД на разных курсах терапии МКх.

Таким образом, состояние АОС, и в первую очередь активность СОД, являются показателями токсических осложнений при терапии КИх ОС у детей.

Для восстановления показателей токсичности ВДХТ М1х в дополнение к СаРо1 используют препараты-гепатопротекторы.

5. Коррекция гепатотоксичности препаратом Гептрал совместно с CaFol при высокодозной химиотерапии метотрексатом остеосаркомы у детей

В последние годы широко внедряются в СТ ОС гепатопротекторные препараты, обладающие детоксикационными, мембраностабилизирующими, желчегонными и другими свойствами. Гепатопротекторы в СТ дают возможность осуществлять точный график проведения протокола лечения. В настоящее время компанией Эббот (США) разработан гепатопротекторный препарат - Гептрал (адеметионин), который рекомендован при проведении ВДХТ Mtx. Он особенно продуктивно восстанавливает функцию печени в комплексе с препаратами ФК, например, CaFol. CaFol и гептрал представляют собой универсальный антидотный комплекс ЛП при ВДХТ Mtx. Клиническое и биохимическое изучение препарата Гептрал проведено у 45 больных ОС, имеющих тяжелую степень гепатотоксичности. Контрольная группа состояла из 10 детей, получающих только основную терапию. Изучение эффективности препарата Гептрал проводили для купирования клинических симптомов поражения печени и нормализации биохимических показателей (АЛТ, ACT, ЛДГ, ГР, у-ГТ, ОАОС). Гептрал, являясь детоксикационным, мембраностабилизирующим, желчегонным, антиоксидантным препаратом, назначали в дозе 800 мг внутривенно; продолжительность курса составляла в среднем 20 дней. Препарат назначали при уровне трансаминаз в сыворотке крови более 4 норм.

Изучение эффективности гептрала показало, что в группе детей, находившихся на программном лечении и получавших гептрал, быстрее купировались клинические симптомы интоксикации, по сравнению с больными, находящимися на базисной терапии. Нормализация АЛТ, ACT, ЛДГ в группе детей, имеющих токсическое поражение печени в процессе программного лечения и принимающих наряду со стандартной терапией препарат Гептрал, наступала в среднем на 10 дней раньше и в 2-3 раза быстрее по сравнению с группой детей, не получавших Гептрал (табл. 8).

Таблица 8

Динамика биохимических показателей сыворотки крови у детей с ОС при применении Гептрала в процессе ВДХТ 1УНх

Обследуемые Дети, принимавшие Гептрал Дети, не принимавшие Гептрал

показатели Уровень до День Уровень до начала День

начала достижения лечения, ед/л достижения

лечения, ед/л нормы нормы

АЛТ 450,08 ± 48,5± 7,5 ±2,1* 850,0±75,7 24,3 ± 5,9*

ACT 650,5 ± 86,3 8,2 ± 1,9* 790,6 ± 90,5 22,0 ± 4,3*

ЛДГ 798 ± 240,6 10,4 ± 1,7* 697,5 ± 135,6 20,6 ± 4,8*

ОАОС 0,91 ±0,18 2,1 ±0,3* 0,88 ±0,14* 5,7 ±2,1*

ГР 54,6 ±12,7 1,9 ±0,6* 58,49 ± 12,9 18,8 ±3,6*

* - статистически достоверные значения между группами

Следовательно, для более быстрого купирования токсического эффекта ВДХТ у детей с ОС, своевременное назначение Гептрала, является важной составляющей сопроводительного корригирующего лечения.

выводы

1. Разработана методика количественного определения CaFol в ЛП и сыворотке крови. В результате экспериментальных исследований была подобрана изократичная система: ТБГА - ацетонитрил - вода - 2 моль/л раствор Na2HP04 (2:15:81:2), рН 7,5, характеризующаяся высокой селективностью (1,8), разделяющей способностью (2,1) и эффективностью (500-900 теоретических тарелок).

2. Проведена сравнительная оценка качества инъекционных препаратов кальция фолината различных фирм-производителей. Выявлено различное содержание действующего вещества и родственных примесей в препаратах. Рекомендован препарат CaFol с наиболее точной дозировкой действующего вещества (98,23 ± 0,80)% и наименьшим содержанием примесей (1,83 ± 0,51)% - порошок для инъекций фирмы Лахема (Чешская республика).

3. Установлено, что при ВДХТ Mtx в 82,11% случаев наблюдаются тяжелые нарушения печени (АЛТ и ACT >10N), в 17.9% - умеренные (2,5N - 10N). Использование в качестве антидота CaFol снижает гепатотоксические эффекты. Скорость восстановления показателей до нормы падает в ряду АСТ>АЛТ>ЛДГ>ОБ. С ростом номера курса ВДХТ скорость восстановления до нормы АЛТ увеличивается, достигая 0,40 сутдля других показателей такая зависимость не обнаружена.

4. Проведено биофармацевтическое исследование состояния АОС (СОД, ГР, ОАОС, у-ГТ) в процессе терапии ВД Mtx ОС у детей. Установлено, что состояние АОС, и в первую очередь активность СОД, являются показателями токсических осложнений Восстановление показателей ОАОС и ГР, подчиняясь кинетике первого порядка, практически не изменяется на первых шести курсах и несколько возрастает на 7 и 8 курсах терапии. Для СОД и у-ГТ 7 и 8 курсы терапии характеризуются самыми низкими скоростями восстановления. Для СОД установлена прямолинейная зависимость снижения скорости от номера курса лечения. Полученные результаты свидетельствует о необходимости проведения сопутствующей антиоксидантной терапии.

5. Проведено сравнение сроков восстановления биохимических показателей до нормы у детей, получавших Гептрал совместно с CaFol при ВДХТ Mtx. Установлено сокращение сроков восставновления уровня ферментов печени: АЛТ в 3.2 раза, ACT в 2.7 раза, ЛДГ в 2 раза; состояния АОС: ОАОС в 2.7 раза, ГР в 9,9 раза. Это позволило рекомендовать применение дополнительных гепатопратекторов при ВДХТ Mtx ОС у детей.

Практические рекомендации

1. На основе детального мониторинга концентрации Mtx, биохимических показателей гепатотоксичности (АЛТ, ACT, ЛДГ, общего билирубина) и состояния АОС (СОД, ГР, у-ГТ и ОАОС) в крови предложена схема индивидуального дозирования CaFo при ВДХТ Mtx больных ОС

2. Рекомендована к использованию разработанная методика определения CaFol в Л методом ВЭЖХ.

3. Для более быстрого купирования токсического эффекта ВДХТ у детей с ОС рекомендовано своевременное назначение гепатопротекторного препарата Гептр; в сочетании с CaFol.

4. , Список сокращений:

AJIT-аланинаминотрансфераза АОС - антиоксидантчая система ACT- аспартатаминотрансфераза ВДХТ- высокодозная химиотерапия ВЭЖХ-высокоэффективная жидкостная хроматография уГТ --{-глутамилтрансфераза ГР - глутатионредуктаза ЛДГ - лактатдегидрогеназа ЛВ - лекарственное вещество ЛС - лекарственное средство ЛП-лекарственный препарат ЛФ - лекарственная форма Mtx - метотрексат

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ivanova N., Savlaev К., Dzampaev A., Sharova A., Petrosjan A., Ivanov A., Koshechkin К., Baykova V., Aliev M. / The pripary treatment results by using of high doses of methotrexate for the children with osteosarcoma // Journal of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS; 2006 M. - P. 34

2. Ivanova N., Savlaev K., Dzampaev A., Sharova A., Petrosjan A., Ivanov A., Koshechkin K., Baykova V., Aliev M. / The pripary treatment results by using of high doses of methotrexate for the children with osteosarcoma // Treatment of pediatric traumas and diseases of the musculoskeletal system. Abstact book; 2006 Baku. - P. 56

3. Байкова B.H., Банков К.Э., Иванов A.B., Кошечкин K.A., Калинкина A.B., Паршина H.A., Арзамасцев А.П., Дурнов Л.А./Антиоксидантные препараты их место и роль в детской онкологии// «Практикующий врач сегодня» - М., 2005 г. - № 1. — С. 29 — 32.

4. Байкова В.Н., Иванов A.B., Кошечкин К.А., Кадагидзе З.Г., Валентей Л.В./Опыт организации экспресс-лаборатории в НИИ детской онкологии и гематологии ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН//«Детская онкология» - М., 2007 г. - № 1.-С. 10 - 13.

5. Иванов A.B., Курмуков И.А., Будько А.П., Кошечкин К.А., Громова Е.Г., Кузнецова Л.С., Байкова В.Н., Маякова С.А. / Особенности метаболизма и элиминации метотрексата при проведении высокодозной терапии у детей и взрослых с гематобластозами // Детская онкология. - М. 2006 г. -№ 2-3, С. 19-24

6. Кошечкин К.А., Байкова В.Н., ПлетеневаТ.В. / Фармакохимическая характеристика кальция фолината — антидота метотрексата — при высокодозной терапии остеосаркомы у детей // Материалы VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI; Концепции болезней цивилизации» Москва С. 251

7. Степанова H.A., Плетенева Т.В., Байкова В.Н., Кошечкин К.А. Биокинетические подходы для оценки токсичности метотрексата при остеосаркоме у детей I Международная конференция "Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине",- Туапсе 2007.- с. 46

8. Плетенева Т.В., Байкова В.Н., Кошечкин К.А. Биокинетические параметры показателей токсичности высоких доз метотрексата.- Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» Москва.- 2007.-С. 186-189.

9. Кошечкин К.А., Иванов A.B., Степанова H.A., Надра М., Плетенева Т.В., Байкова В.Н. Изучение токсичности терапии высокими дозами метотрексата у детей с остеосаркомой "XIV Российский национальный конгркесс «Человек и лекарство» Сборник материалов конгресса". Москва 2007 с.706

10. Кошечкин К.А., Иванов A.B., Савлаев К.Ф., Байкова В.Н., Иванова Н.М. Кинетика восстановления показателей гепатотоксичности после введения высоких доз метотрексата детям с остеосаркомой "XIV Российский национальный конгркесс «Человек и лекарство» Сборник материалов конгресса". Москва 2007 с.706

11. Плетенева Т.В., Степанова Н.С., Байкова В.Н., Кошечкин К.А. Биокинетические параметры показателей токсичности высоких доз метотрексата - Вестник Российского университета дружбы народов.-М. 2008 г.-№3, С. 10-14

ОАОС - общий антиоксидантньш статус ОБ-общий блирубин ОС - остеосаркома ПХТ-полихимиотерапш СОД - супероксиддисмутаза СТ- сопроводительная терапия ТБАГ- тетрабутиламмония гидроксид ЩФ - щелочная фосфатаза ФК-фолиевая кислота

АВйА -Ы-(п-аминобензоил)-Ь-глутаминовая к-та

СаРо1 - кальция фолинат

БРА - Ы10-формилфолиевая кислота

РАВА - п-аминобензойная кислота

Аннотация диссертационной работы Кошечкина Константина Александровича, представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Тема: Биофармацевтический анализ антидотных свойств кальция фолината при высокодозной химиотерапии метотрексатом остеосаркомы у детей .

В клинической практике для лечения остеосаркомы у детей применяют высокие дозы метотрексата - до 12,0 г/м2. Это позволило снизить детскую смертность при остеосаркоме и достичь 4-летней выживаемости в 76 %, 5-летней безрецидивной выживаемости в 37-50 %. Но высокая токсичность метотрексата требует сопроводительной терапии препаратами кальция фолината, от качества которых зависит его терапевтическая активность.

Разработана унифицированная ВЭЖХ-методика для качественного количественного анализа препаратов кальция фолината. По результатам исследовани рекомендован для применения в детской онкологии порошок для инъекций фирмь Лахема, Чешская республика, содержащий наибольшее количество действующег вещества (98,23 ± 0,80)% и незначительное количество примесей (1,83 ± 0,51)%. Дл оценки биологической активности кальция фолината проведены биокинетически исследования с участием 50 детей с остеосаркомой. Установлено, что с ростом номер курса ВДХТ константа скорости для АЛТ имеет тенденцию к увеличению (до 0,40 сут-1) а для ЛДГ находятся в интервале 0,15-0,35 сут-1, имея тенденцию к снижению с росто номера курса. Для всех четырех показателей АОС характерны резкие различия между 1-и 6-8 курсами. ОАОС и ГР, подчиняясь кинетике первого порядка, практически н изменяется на первых шести курсах и резко возрастает на 7 и 8 курс ах терапии.

Konstantin A. Koshechkin "Biopharmaceutical tests of antipoisonous characteristics of Calciui folinate in high dose treatment of children's osteosarcoma by methotrexate"

Calcium folinate acts as antipoison agent in treatment by methotrexate in high doses, allows to use methotrexate in doses up to 12 g/m2 in clinical practice. Usage of methotrexate i high doses allowed to bring down infant mortality by osteosarcoma and achieve 4 years surviv at 76 %, 5 years survival with no relapse at 37-50 %. Research of Calcium folinate produced b different companies biological action valuation was performed in group of 50 children wit osteosarcoma.

It was developed unified HPLC method for Calcium folinate quality and quantit determination. Three medicinal preparations were tested, and most suitable for usage in pediatr' oncology was found: powder for preparing solution for injection by Pliva-Lachema, Czec Republic (active substance content 98,23 ± 0,80 and admixture content 1,83 ± 0,51%). I biochemical research was found, that recovery constants of ALT, LDG, AST and comm billirubin are different, and that cause differs in their restoration time. On the background methotrexate treatment we found reduction in compensative abilities of antioxidant system increasing numbers of treatment courses, which indicates accompanying antioxidant treatme necessity.

Кошечкин Константин Александрович

Биофармацевтический анализ аитидотных свойств кальция фолината при высокодозной химиотерапии метотрексатом остеосаркомы у детей

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 16.10. 08 Формат 60x84/16. Бумага офсетная. _Тираж 100 экз. Заказ № 672__

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Цель и задачи исследования.9

Научная новизна исследования.10

Научно-практическая значимость исследования.11

Внедрение в практику.11

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.12

1.1. Высокодозная химиотерапия метотрексатом на фоне антидотной терапии кальция фолинатом остеосаркомы у детей.12

1.2. Механизм действия метотрексата и роль сопроводительной терапии кальция фолинатом.13

1.3. Токсические проявления метотрексата, купируемые введением кальция фолината. 14

1.4. Значение применения кальция фолината при высокодозной терапии метотрексатом 17

1.5. Химическое строение, фармакокинетические и фармакологические характеристики кальция фолината.19

1.5.1. Химическое строение и свойства кальция фолината.19

1.5.2. Фармакологическое действие кальция фолината.20

1.5.3. Роль фолиевой кислоты и ее производных в организме человека и их метаболизм.22

1.5.4. Способы применения и дозы кальция фолината.25

1.5.5. Препараты кальция фолината.27

1.6. Контроль качества препаратов кальция фолината по данным государственных фармакопей и НД производителей.29

1.6.1. Обзор государственных фармакопейных статей на субстанцию кальция фолитата.29

1.6.2. Обзор фармакопейных статей предприятий на лекарственные формы кальция фолитата.36

1.6.3. Мониторинг производных ФК в сыворотке крови.40

1.7. Мониторинг биохимических показателей крови.42

1.7.1.Некоторые клинические и молекулярные аспекты токсических осложнений

ВДХТМ1х.42

1.7.2. Биохимические показатели в оценке поражения печени при ВДХТ Mtx ОС у детей.44

1.8. Нарушение состояния антиоксидантной системы.52

1.8.1. Механизм возникновения свободных радикалов.53

1.8.2. Методики для определения активности АОС.57

1.9. Математическое моделирование биокинетики.59

Заключение по главе 1.62

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.64

2.1. Характеристика группы больных остеосаркомой и аспекты проводимой терапии .64

2.1.1. Характеристика группы больных остеосаркомой.64

2.1.2. Схема проведения химиотерапии больным остеосаркомой.65

2.1.3. Введение кальция фолината больным остеосаркомой.67

2.1.4. Клиническая характеристика результатов проводимой терапии.67

2.2. Методы определения лекарственных препаратов кальция фолината.69

2.2.1. Оборудование и реактивы.69

2.2.2. Стандартные образцы.69

2.2.3. Объекты анализа.70

2.2.4. Оценка хроматографических параметров.71

2.2.5. Расчет количественного содержания кальция фолината.71

2.3. Определение биохимических показателей крови при ВДХТ М1х остеосаркомы у детей.72

2.4. Определение показателей состояния антиоксидантной системы.75

2.4.1. Методика определения общего антиоксидантного статуса в сыворотке крови. 75

2.4.2. Методика определение активности супероксиддисмутазы в эритроцитах.77

2.4.3. Методика определение активности глутатионредуктазы.79

2.4.4. Методика определения активности у— глутамилтрансферазы.80

2.5. Определения кинетических параметров биохимических показателей крови.80

2.6. Статистическая обработка результатов.83

Заключение по главе II.84

3.1 Разработка методики определения кальция фолината.85

3.1.1 Подготовка стандартных растворов.85

3.1.2. Подбор оптимальных условий разделения кальция фолината и фолиевой кислоты.85

3.1.3. Выбор условий детектирования.89

3.1.4. Параметры разделения и метрологическая характеристика методики.90

3.2 Определение подлинности и содержания кальция фолината в инъекционных лекарственных формах.92

3.2.1 Подготовка проб для хроматографического анализа.92

3.2.2 Анализ лекарственных препаратов кальция фолината.92

3.2.3 Определение концентрации кальция фолината методом ВЭЖХ в сыворотке крови.96

3.3. Мониторирование биохимических показателей гепатотоксичности и их роль при проведении сопроводительной терапии кальция фолинатом.99

3.3.1. Динамика содержания общего белка и альбумина.100

3.3.2. Динамика содержания креатинина и мочевины.102

3.3.3. Динамика содержания кальция.105

3.3.4. Динамика содержания АСТ.105

3.3.5. Динамика содержания AJIT.108

3.3.6. Динамика содержания ЛДГ.111

3.3.7. Динамика содержания общего билирубина.114

3.3.8. Кинетические характеристики показателей гепатотоксичности.117

3.4. Показатели состояния антиоксидантной системы и их значение в проведении антидотной терапии кальция фолинатом.121

3.4.1. Результаты мониторинга показателей АОС.121

3.4.2. Биокинетика изменения показателей АОС при сопроводительной терапии кальция фолинатом.127

3.5. Применение препарата Гептрал совместно с кальция фолинатом.130

Заключение по главе 3.133

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.135

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.144

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.145

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ у-ГТ - у-глутамилтрансфераза

7-ОН-МТХ - 7-гидроксиметотрексат

ABGA — ^(п-фминобензоил)-Ь-глутаминовая кислота

Br.Ph. - Британская фармакопея

CaFol - кальция фолинат

Eur. Ph. - Европейская фармакопея

Mtx — метотрексат

РАВА - n-аминобензойная кислота

USP - фармакопея США

АК — аскорбиновая кислота

AJIT — аланинаминотрансфераза

АОК — антиоксидантный комплекс

АОС - антиоксидантная система

ACT — аспартатаминотрансфераза

АФК — активные формы кислорода в/в - внутривенно

ВД - высокие дозы

ВДХТ — высокодозная химиотерапия в/м - внутримышечно

ВМК — ванилминдальная кислота

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография

ИФА - иммуноферментный анализ

JIB - лекарственное вещество

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛП - лекарственный препарат

ЛС - лекарственное средство

ЛФ - лекарственная форма

МДА — малоновый диальдегид

МСМ — молекулы средних масс

ОАОС — общий антиоксидантный статус

ОБ - общий билирубин

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ОС - остеосаркома

ПОЛ - пероксидное окисление липидов ПХТ — полихимиотерапия ПЭ — полная эффективность СМЖ - спинномозговая жидкость СОД - супероксиддисмутаза

СПОЛ — свободнорадикальное пероксидное окисление липидов

СТ - сопроводительная терапия

ТБАГ - тетрабутиламмония гидроксид

ТБК — тиобарбитуровая кислота

ТЛМ - терапевтический лекарственный мониторинг

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФК - фолиевая кислота

ФПИА - флуоресцентно поляризационный иммуноанализ ФФК - 10-формилфолиевая кислота ЦНС - центральная нервная система ЧЭ - частичная эффективность ЩФ — щелочная фосфатаза

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Создание и внедрение в клиническую практику эффективных противоопухолевых препаратов значительно расширило возможности воздействия на злокачественные опухоли детей. К сожалению, большинство из применяемых противоопухолевых препаратов обладают рядом существенных недостатков: низкой избирательностью действия, небольшой терапевтической широтой, токсическим действием на различные органы и системы организма, возникновением лекарственной устойчивости. Трудности и несовершенства метода полихимиотерапии (ПХТ) опухолей у детей диктуют необходимость изыскания не только новых оригинальных противоопухолевых препаратов, но и разработки оригинальных методик проведения лечения, включающих режимы и дозы их введения в организм. В последнее время в программном лечении онкологических заболеваний у детей стали применяться высокие дозы противоопухолевых препаратов [84, 124, 128, 131, 137, 152]. Это требует тщательного изучения их безопасности, фармакокинетики, фармакодинамики.

В настоящее время в мировой лечебной практике разработаны протоколы лечения онкологических заболеваний с максимальными дозами противоопухолевых препаратов, строго регламентированными периодами их проведения. Многие больные дети такой интенсивной терапии не выдерживают и их исключают из протокола лечения. По этой причине в последнее время начинает развиваться персонализированная медицина, которая подразумевает назначение конкретного противоопухолевого препарата конкретному больному на основании фармакокинетических и фармако-геномных сведений пациента. Назначение кальция фолината при высокодозной химиотерапии (ВДХТ) метотрексатом (Mix) является одним из аспектов индивидуального подхода к лечению [34, 111]. Применение кальция фолината на фоне лечения Mtx, когда дозы последнего многократно превышают стандартные, поддерживает нормальную жизнедеятельность клеток со сниженным уровнем фолатов и позволяет осуществлять антидотную терапию. Антагонисты фолиевой кислоты (ФК), главным из которых является ]Шх, занимают особое место среди противоопухолевых препаратов: с их помощью были получены первые полные ремиссии при лейкозах [19, 23,]. Интерес к антагонистам ФК еще больше повысили достижения ВДХТ в сочетании с кальция фолинатом, снижавшим токсичность препаратов. Благодаря этому расширился спектр противоопухолевой активности МЪс, теперь его назначают при остеосаркоме (ОС), на которую препарат в стандартных дозах не действовал. Оптимальная схема введения ВД М1х в сочетании с кальция фолинатом при ОС до сих пор не разработана. ВДХТ МЪс чревата тяжелыми побочными эффектами, лечение должно проводиться под строгим контролем многих лабораторных показателей, в частности, терапевтического лекарственного мониторинга (ТЛМ) концентрации МЬс, по значениям которых определяется необходимая доза кальция фолината. Фактически, при ВДХТ М1х осуществляется "resque" - спасение кальция фолинатом. Успех лечения во многом зависит от качества кальция фолината, что повышает требования к его фармацевтическому анализу, независимо от источника поступления на отечественный фармацевтический рынок. В настоящее время в РФ действует 7 регистрационных удостоверений- на препараты кальция фолината. Выбор наиболее безопасного и эффективного из них, безусловно, является актуальной и важной задачей, решение которой позволит снизить токсические эффекты ВДХТ М1х. Анализ этих ЛС в условиях детской онкологической клиники, модификация существующих и разработка новых аналитических методик позволит повысить эффективность спасительной терапии кальция фолинатом [35].

Высокая отсроченная токсичность МЪс является серьезным ограничением в достижении максимального лечебного действия, что в большинстве случаев обусловливает возникновение у больных серьезных побочных эффектов со стороны различных органов и систем. Проявление гепато- и нефротоксичности служат показанием для прерывания, и даже прекращения эффективного лечения, приводя к повышению частоты рецидивов основного заболевания. При ВДХТ исключительно большое значение имеют адаптивные и компенсаторные системы организма, способствующие мобилизации защитных потенциалов - это состояние антиоксидантной системы (АОС), обеспечивающее резистентность организма в процессе экстремального воздействия.

Разработка методологических подходов к диагностике и мониторингу токсичности ВД Mtx на основе комплекса биохимических методов исследования и контроль детоксикационного действия проводимой сопроводительной терапии на основе биокинетических подходов является одной из актуальных задач детской онкологии [19]. Следует отметить, что в литературе отсутствуют работы, посвященные изучению биохимических маркеров токсичности, не разработан алгоритм обследования и дозы кальция фолпната при проведении ВДХТ Mtx. В этом аспекте очевидна актуальность проведенного комплексного исследования.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка методики количественного определения кальция фолината в инъекционных лекарственных препаратах (ЛП) различных фирм-производителей методом ВЭЖХ и биокинетическая оценка антидотной активности кальция фолината при ВДХТ Mtx остеосарком у детей.

Для реализации поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать методику количественного определения кальция фолината в инъекционных ЛП и в сыворотке крови методом ВЭЖХ.

2. Провести сравнительную оценку качества инъекционных препаратов кальция фолината различных фирм-производителей.

3. Оценить влияние кальция фолината на показатели гепатотоксичности на различных курсах лечения. Рассчитать биокинетические параметры восстановления показателей гепатотоксичности на основе их длительного мониторинга при проведении ВДХТ М1х у детей с ОС.

4. Изучить состояние АОС (показатели активности СОД, ГР и ОАОС) и оценить их взаимосвязи с токсическими осложнениями. Рассчитать биокинетические параметры изменения состояния АОС на основе длительного мониторинга ее показателей при лечении ОС у детей ВДХТ ]Шх.

5. Провести сравнительное исследование биохимических показателей (гепатотоксичности и состояния АОС) на фоне применения вспомогательного гепатопротектора - «Гептрала»).

Научная новизна исследования

Разработана унифицированная экспресс-методика определения (метод ВЭЖХ) кальция фолината в ЛФ и сыворотке крови (модельные системы). Несколько серий препаратов разных производителей качественно и количественно охарактеризованы.

Впервые проведена оценка антидотной активности кальция фолината при ВДХТ М1х ОС детей на основе длительного мониторирования биохимических показателей крови — маркеров гепатотоксичности, нефротоксичности, водно-электролитного и кислотно-основного баланса.

Впервые количественно охарактеризовано изменение состояния ферментов АОС при терапии ВД М1х ОС детей и проведена оценка их взаимосвязи с токсическими осложнениями.

Впервые рассчитаны биокинетические параметры показателей гепатотоксичности и состояния АОС.

Научно-практическая значимость исследования

Разработана и внедрена в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН методика определения кальция фолината в ЛП разных фирм-производителей и сыворотке крови.

Проанализировано соответствие декларированных показателей качества фактическим для зарегистрированных на отечественном рынке и применяемых в ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН препаратов кальция фолината. Выданные рекомендации по предпочтительному использованию одного из препаратов позволят улучшить показатели выживаемости и качество жизни у исследуемой категории пациентов.

На основании проведенной биокинетической оценки биохимических показателей крови (константа скорости и период полувосстановления до нормы) даны рекомендации по периодичности сопроводительной терапии.

На основании установленных изменений активности ферментов АОС при ВДХТ Mtx рекомендована сопутствующая антиоксидантная терапия.

Внедрение в практику

Экспресс-метод определения содержания кальция фолината и примесей в ЛП внедрен в ГУ РОНЦ им. Н:Н. Блохина РАМН.

Рекомендации по сопроводительной терапии на основе анализа ЛП кальция фолината различных фирм-производителей, биокинетические исследования показателей гепатотоксичности и состояния АОС больных ОС применяются в ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана методика количественного определения кальция фолината в ЛП и сыворотке крови. В результате экспериментальных исследований подобрана изократичная система: ТБГА — ацетонитрил — вода - 2 моль/л раствор Na2HP04 (2:15:81:2), рН 7,5, характеризующаяся высокой селективностью (1,8), разделяющей способностью (2,1) и эффективностью (500900 теоретических тарелок).

2. Проведена сравнительная оценка качества инъекционных препаратов кальция фолината различных фирм-производителей. Выявлено различное содержание действующего вещества и родственных примесей в препаратах. Рекомендован препарат кальция фолината с наиболее точной дозировкой действующего вещества (98,23 ± 0,80)% и наименьшим содержанием примесей (1,83 ± 0,51)% - порошок для инъекций фирмы Лахема (Чешская республика).

3. Установлено, что при ВДХТ Mtx в 82,1% случаев наблюдаются тяжелые нарушения печени (АЛТ и ACT >10N) , в 17,8% - умеренные (2,5N — 10N). Использование в качестве антидота кальция фолината снижает гепатотоксические эффекты. Скорость восстановления показателей до нормы падает в ряду АСТ>АЛТ>ЛДГ>ОБ. С ростом номера курса ВДХТ Mix скорость восстановления до нормы АЛТ увеличивается, достигая 0,40 сут"1, для других показателей такая зависимость не обнаружена.

4. Проведено биофармацевтическое исследование состояния АОС (активности СОД, ГР, у-ГТ и ОАОС,) в процессе терапии ВД Mtx ОС у детей. Установлено, что состояние АОС, и в первую очередь активность СОД, являются показателями токсических осложнений Восстановление показателей ОАОС и ГР, подчиняясь кинетике первого порядка, практически не изменяется на первых шести курсах и несколько возрастает на 7 и 8 курсах терапии. Для СОД и у-ГТ 7 и 8 курсы терапии характеризуются самыми низкими скоростями восстановления. Для СОД установлена прямолинейная зависимость снижения скорости от номера курса лечения. Полученные результаты свидетельствует о необходимости проведения сопутствующей антиоксидантной терапии.

5. Проведено сравнение сроков восстановления биохимических показателей до нормы у детей, получавших Гептрал совместно с кальция фолинатом при ВДХТ Mtx. Установлено сокращение сроков восставновления уровня ферментов печени: AJIT в 3.2 раза, ACT в 2.7 раза, ЛДГ в 2 раза; состояния АОС: ОАОС в 2.7 раза, ГР в 9,9 раза. Это позволило рекомендовать применение дополнительных гепатопротскторов при ВДХТ Mtx ОС у детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для оценки состояния тяжести токсического действия ПХТ у детей, получающих ВД Mtx необходимо определять следующие биохимические показатели: Mtx до концентрации 0,02 мкмоль/л, ОАОС, ОБ, активность ферментов - АЛТ, ACT, ЛДГ, ГГТ, СОД, ГР.

На основе детального ТЛМ концентрации Mtx, биохимических показателей гепатотоксичности (АЛТ, ACT, ЛДГ, общего билирубина) и состояния АОС (СОД, ГР, у-ГТ и ОАОС) в крови предложена схема индивидуального дозирования кальция фолината при ВДХТ Mtx больных ОС.

Рекомендована к использованию разработанная методика определения кальция фолината в ЛП методом ВЭЖХ.

Для более быстрого купирования токсического эффекта ВДХТ Mtx у детей с ОС, рекомендовано своевременное назначение гепатопротекторного препарата Гептрал (адеметионин) в сочетании с препаратами кальция фолината.