Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-фармакологическое исследование нативных гуминовых кислот торфов Томской обл.

На правах рукописи

ГОСТИЩЕВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ХИМИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАТИВНЫХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ТОРФОВ ТОМСКОЙ ОБЛАСТИ

15.00.02-фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.00 25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь - 2008

003451344

Работа выполнена на базе кафедры химии ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Росздрава (г. Томск), Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ СибГМУ (г. Томск) и Испытательной лаборатории агроэкологии ГОУ ВПО «Томский государственный педагогический университет». Отдельные разделы работы выполнены совместно с: кафедрой оперативной хирургии и патологической анатомии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (г. Томск), Лабораторией экспериментальной кардиологии НИИ Кардиологии Томского научного центра СО РАМН, Лабораторией реологии крови НИИ Биологии и Биофизики при ТГУ (г. Томск), НИИ Химии Нефти СО РАН (г. Томск), НИИ Химической кинетики и горения СО РАН (г. Новосибирск).

Научные доктор фармацевтических наук, профессор

руководители' Белоусов Михаил Валерьевич

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, чл.-корр. РАСХН Инишева Лидия Ивановна

Официальные доктор фармацевтических наук, профессор оппоненты. Хомов Юрий Александрович

доктор медицинских наук, профессор Котегов Виктор Петрович

Ведущая ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский

организация: университет» Федерального агентства по здравоохранению и

социальному развитию

Защита диссертационной работы состоится «25» ноября 2008 г в 13® часов на заседании диссертационного совета Д 208.068 01 при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Роздрава по адресу: 614990, ГСП-277, г. Пермь, ул. Ленина, 48. Тел.:(342) 212-90-60.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46

Автореферат разослан «{¿^ октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор

Ярыгина Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поиск новых сырьевых ресурсов биологически активных веществ (БАВ) природного происхождения для разработки на их основе новых лекарственных препаратов является актуальной задачей современной фармации. Одним из перспективных источников БАВ является торф, содержащий уникальный комплекс биологически активных соединений (гуминовые кислоты, углеводы, полифенолы и др.) и обладающий значительными, и что немаловажно, возобновляемыми сырьевыми ресурсами. Являясь продуктом частичного распада болотных растений, торф сохраняет присущие растительным биоценозам те или иные физиологически активные соединения, устойчивые к биологическим разрушениям, и пополняется новыми веществами как растительного происхождения, так и метаболитами жизнедеятельности микро- и макроорганизмов, населяющих торфяную залежь. Специфическую и наиболее представительную в количественном отношении группу БАВ торфа составляют гуминовые кислоты (ГК), являющиеся сложной смесью высокомолекулярных и полифункциональных соединений алициклической, гидроароматической, ароматической и гетероциклической природы.

В настоящее время в научной литературе имеется большое количество сведений о биологической активности солей ГК и применении препаратов на их основе в медицине и ветеринарии. Фармакологические свойства и токсичность нативных ГК практически не изучены. Кроме того, необходимо отметить, что химическая структура и фармакологические эффекты гуминовых препаратов могут существенно различаться в зависимости от происхождения торфа, способов извлечения, очистки и фракционирования препаратов. Эти обстоятельства делают практически невозможными попытки внеэкспериментального прогнозирования особенностей их токсических и фармакологических свойств по общим элементам структуры, и, соответственно, обуславливают необходимость химической и биологической стандартизации каждого из образцов ГК торфов различного происхождения.

По объемам запасов торфа, Томская область занимает 2-е место в России (32,8 млр тонн, что составляет 20,9 % Российских ресурсов) (Инишева Л.И., 2005).

Таким образом, недостаточная изученность химической структуры и биологической активности нативных ГК торфов Томской области, наряду с их огромными сырьевыми ресурсами, определяет необходимость их системного химико-фармакологического изучения.

Цель: химико-фармакологическое исследование нативных гуминовых кислот торфов Томской области, как перспективных объектов для разработки новых лекарственных средств.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительное химико-фармакогностическое исследование ряда торфов Томской области.

2. Провести сравнительное изучение химической структуры нативных гуминовых кислот, выделенных из исследуемых торфов, современными методами физико-химического анализа.

3. На основании полученных данных выбрать наиболее перспективный сырьевой источник и разработать методы его стандартизации.

4. Подготовить проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».

5. Исследовать токсикологические и фармакологические свойства гуминовых кислот наиболее перспективного сырьевого источника.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное фармакогностическое исследование ряда торфов Томской области и сравнительное изучение химической структуры их нативных ГК современными методами физико-химического анализа. Определены основные группы БАВ исследуемых торфов и установлено, что ГК

являются наиболее представительной в количественном отношении группой БАВ торфа. Показано, что низинный древесно-травяной торф месторождения «Клюквенное», в силу особенностей химической структуры их ГК, является наиболее перспективным сырьевым источником ГК. Впервые проведена стандартизация ГК, определены показатели их подлинности и качества. Впервые изучены токсикологические и фармакологические свойства нативных ГК наиболее перспективного сырьевого источника. Проведена оценка острой токсичности ГК при разных способах введения, выявлены органы-мишени, показано прямое кардиотоксическое действие ГК. На экспериментальных моделях патологий установлены выраженные антигипоксические и гепатозащитные свойства ГК.

Работа поддержана грантами: Роснауки 2005-РИ-111.0/002/049, РФФИ № 05-0798002, № 06-04-58593, Грантом Главы Администрации (Губернатора) Томской области научных разработок молодых ученых № 340, стипендией Президента РФ, стипендией Фонда им. Шамахова Ф.Ф.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований низинный древесно-травяной вид торфа обоснован как наиболее перспективный источник получения гуминовых препаратов высокого качества. Полученные результаты и сделанные выводы важны для решения задач, связанных с использованием ГК из торфа в ветеринарии и медицине. Проведена стандартизация и определены критерии оценки доброкачественности - качественной и количественной идентификации ГК торфа. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».

Результаты работы использованы для создания базы данных по физико-химическим свойствам ГК торфов Томской области в клиент-серверной технологии (РФФИ №05-07-98002).

По результатам выполненных исследований получен патент РФ №2300103 «Способ определения биологической активности гуминовых кислот торфов».

Результаты работы используются в учебном процессе Сибирского государственного медицинского университета: в лекционном курсе и на практических занятиях интернов и студентов.

По материалам диссертации подготовлено и издано три учебные пособия.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ «Изыскание и изучение фармакологических средств. Вопросы фармации» (№ гос. регистрации темы 01.02.00. 101708) и по заказу Главы Администрации Томской области (№ 340 от 18.07.2007 г).

Апробация работы. Результаты и основные положения работы представлены на: III Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Болота и Биосфера» (г. Томск, 2004); VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005); IV Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Болота и Биосфера» (г. Томск, 2005); Международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии» (г. Минск, Республика Беларусь, 2006); 13th Meeting of the International Humic Substances Society «Humic Substances - Linking Structure to Functions» (Karlsruhe, Germany, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. Академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (г. Москва, 2006); V Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Болота и Биосфера» (г. Томск, 2006).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 22 печатных работы: 19 статей и материалов научных конференций, из них 7 в реферируемых Российских журналах, 1 в реферируемом зарубежном журнале, 3 учебных пособия, получен 1 патент РФ на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты сравнительного фармакогпостического исследования ряда торфов Томской области.

2. Результаты сравнительного изучения химической структуры ГК исследуемых торфов современными методами физико-химического анализа.

3. Обоснование выбора наиболее перспективного сырьевого источника ГК.

4. Результаты стандартизации и определения критериев оценки подлинности и качества исследуемых ГК торфа.

5. Результаты исследования токсикологических и фармакологических свойств нативных ГК наиболее перспективного сырьевого источника.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 189 страницах компьютерного текста, содержит 32 таблицы, 16 рисунков, включает введение, обзор литератур (глава 1), экспериментальную часть (главы 2-5), список литературы, содержащий 291 библиографический источник, из которых 76 на иностранных языках, и Приложение.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, определены научная и практическая значимость работы.

В первой главе представлен обзор литературы, в котором торф рассмотрен как источник БАВ, проведен анализ используемых в современной литературе методов и подходов к исследованию химической структуры и биологической активности ГК торфов, приведена сравнительная характеристика гуминовых препаратов, применяемых в медицине и ветеринарии.

Во второй главе описаны объекты и методы исследования.

Третья глава посвящена сравнительному фармакогностическому исследованию ряда торфов Томской области, изучению химической структуры их нативных ГК современными методами физико-химического анализа.

В четвёртой главе изложены исследования по разработке методов стандартизации нативных ГК для фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».

Пятая глава посвящена изучению токсикологических и фармакологических свойств ГК низинного древесно-травяного торфа месторождения «Клюквенное» Томской области.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве объектов исследования использовали репрезентативные образцы торфа низинного, переходного и верхового типов, разных по ботаническому составу, степени разложения и зольности с олиготрофного и эвтрофного типов болот Томской области, характеристики которых приведены в табл. 1. Заготовка образцов проводилась в летний период 2004 года на типовых участках представительных месторождений торфа Томской области - на отрогах Большого Васюганского болота и торфяном месторождении «Клюквенное».

Методы исследования. Отбор проб торфа проводили буром ТБГ-1 в генетических центрах представленных торфяных месторождений, из середины однородного по ботаническому составу горизонта.

Для определения общетехнических свойств торфов (степени разложения и зольности), ботанического состава использовали стандартные методики (ГОСТы).

Таблица 1

Характеристика объектов исследования_

Тип, вид торфа Место отбора проб Глубина отбора проб, см Степень разложения, % мае. Зольность, % мае

Верховой сосново-пушицевый Большое Васюганское болото, участок «Высокий рям» 10-50 35 6,3

Переходный осоковый Большое Васюганское болото, участок «Низкий рям» 150-200 45 4,8

Низинный травяно-моховой 200-250 40 4,3

Низинный травяной Большое Васюганское болото, участок «Осоково-сфагновая топь» 230-250 45 10,4

Низинный древесно-травяной т/м «Клюквенное» 10-50 25 8,1

Примечание, т/м - торфяное месторождение

Обнаружение основных групп БАВ в торфе проводили общепринятыми в фитохимическом анализе качественными реакциями, количественное определение БАВ проводили титриметрическим, гравиметрическим и спектрофотометрическим методами. Групповой состав органического вещества торфов определяли по методу H.H. Бамбалова (1998 г). В результате химического анализа были выделены следующие группы соединений: липиды (битумы), водорастворимые (ВРВ), легкогидролизуемые (ЛГВ), гуминовые вещества (ГВ): гуминовые кислоты (ГК) и фульвокислоты (ФК), трудногидролизуемые (ТГВ) вещества и лигнин (негидролизуемый остаток).

Методы исследования химической структуры гуминовых кислот Элементный состав образцов ГК определяли методом пиролиза на C,H,N -анализаторе «Carlo Erba Strumentazione» модель 1106 (пр-во Италия), содержание кислорода определяли по разности. Регистрацию электронных спектров поглощения 0,001 %-ных водных растворов ГК проводили на УФ - спектрофотометре Uvikon943 (пр-во Италия) в диапазоне длин волн 190-700 им в кварцевой кювете толщиной 1 см. Регистрацию ИК-спектров ГК проводили на ИК - Фурье - спектрометре Nicolet 5700 (пр-во Thermo Electron corp., США). Анализ образцов проводили по методу прессования с КВг в соотношении 1:100 соответственно, в интервале значений частоты от 500 до 4000 см"1. Регистрацию ЭПР спектров осуществляли при 20-25°С в атмосфере воздуха на Bruker ЕМХ EPR спектрометре Х-частотного диапазона (пр-во Германия). Регистрацию спектров ПМР и ЯМР осуществляли в растворе на радиоспектрометре ЯМР фирмы Bruker (пр-во Германия) с использованием методики Фурье-преобразования с накоплением сигнала в интервале времени от нескольких часов до суток. ВЭЖХ анализ выполняли на эксклюзионной колонке Supelco PROGEL-TSK GMPXL 300x7.8mm (пр-во Япония), сорбент - 13 микрон, эффективность колонки -ПОООт.т. Подвижная фаза - вода, 1 мл/мин. Использовался хроматограф Agilent 1100 (пр-во Германия) с вакуумным дегазатором, чегырехканапьным градиентным насосом и колоночным термостатом. Регистрация компонентов проводилась с помощью спектрофотометрического детектора - детекция на длине волны 190 нм. Содержание кислых функциональных групп определяли методами обратного титрования: баритовым (сумма фенольных и карбоксильных групп) и кальций-ацетатным (содержание карбоксильных групп) согласно стандартным методикам (Данченко Д.Д., 1998). Содержание фенольных гидроксилов находили по разности между суммарным содержанием функциональных групп и содержанием карбоксильных групп.

Методы исследования биологической активности гуминовых кислот Экспериментальные животные. Эксперименты проведены на 450 половозрелых белых беспородных мышах-самцах массой 18-22 г и 250 половозрелых белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г из питомника Рассвет (г. Томск). Содержание лабораторных животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных. Животные

содержались на стандартном лабораторном рационе в условиях свободного доступа к пище и воде. Все манипуляции с животными осуществлялись в осенне-зимний период, в первой половине дня. Экспериментальные исследования проведены в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г «Об утверждении правил лабораторной практики», Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005 г).

Оценка острой токсичности проведена в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005 г). Эксперименты проведены на 100 половозрелых белых беспородных мышах-самцах массой 18-22 г и 100 половозрелых белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Острую токсичность оценивали при внутрижелудочном и внутрибрюшинном способах введения.

Патоморфологическое исследование. Проводили вскрытие погибших животных - крыс, макроскопическое и микроскопическое исследование внутренних органов. Кусочки органов фиксировали в формалине и заливали в парафин. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Исследование динамики концентраций в сыворотке крови. Эксперименты проведены на белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г, при двух способах введения: внутрижелудочном и внутрибрюшинном. В сыворотке крови экспериментальных животных проводили определение концентрации ГК спектрофотометрическим методом при длине волны >.=465 нм (спектрофотометр Uvikon 943). Концентрацию ГК рассчитывали по калибровочной кривой.

Исследование влияния на реологические свойства крови. О влиянии на реологические свойства крови судили по изменению показателей обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ) крыс при внесении исследуемого препарата in vitro в пробу цельной крови крыс. Регистрацию показателей ОАЭ осуществляли фотометрическим вибрационным методом (Тухватулин, 1986). Расчетным путем определялся индекс агрегации - Ja = Ud / т, характеризующий соотношение агрегационных и дезагрегационных процессов.

Оценка антигипоксической активности проведена на половозрелых белых беспородных мышах-самцах массой 18-22 г. Антигипоксическую активность исследуемого препарата ГК оценивали на модели гемической гипоксии (Хабриев Р.У., 2005) и модели гипоксии объема (Островская Р.У., 1982; 1993) при внутрижелудочном профилактическом 5-кратном введении исследуемых ГК в диапазоне доз 25-100 мг/кг. Контролем служила группа интактных животных.

Гепатозащитную активность исследуемого препарата оценивали на модели острого токсического гепатита у крыс-самцов. Острый токсический гепатит вызывали подкожным введением крысам 50 % масляного раствора четыреххлористого углерода (ССЦ) из расчета 0,4 мл ССЦ на кг массы в течение 4 дней один раз в сутки. Исследуемый препарат вводили внутрижелудочно в дозах 25-100 мг/кг 2 раза в сутки, по лечебно-профилактической схеме. В качестве препарата сравнения использовали гепатозащитный препарат Карсил. На 5-ые сутки эксперимента животных декапитировали под легким эфирным наркозом и осуществляли забор образцов крови и печени. В сыворотке крови определяли уровень общего билирубина и малонового диальдегида, активность печеночноспецифических ферментов :аспартат- и апанин-аминотрансфераз (АсАТ и АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамил-транспептидазы (у-ГГТ), по общепринятым методам, используя стандартные наборы фирм Cormay, Biocon (Германия), Vital Diagnostics (Санкт-Петербург), Вектор-Бест (Новосибирск). В гомогенате печени определяли МДА, содержание МДА рассчитывали в нмоль/г ткани. При расчете использовался коэффициент молярной экстинкции 1,56 х 105 ммоль"' см2. Кусочки печени фиксировали в формалине и заливали в парафин.

Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили микроскопическое исследование образцов печени.

Оценка влияния ГК на окислительное фосфорилирование в митохондриях печени и головного мозга мышей проведена на 72 белых беспородных мышах-самцах массой 18-22 г. в условиях нормобарической гиперкапнической гипоксии при курсовом профилактическом внутрибрюшинном введении ГК в сравнении с дигидрокверцетином. Контролем служила группа интактных животных. Функциональное состояние митохондрий (MX) оценивали по дыхательной активности гомогената головного мозга и печени полярографическим методом на анализаторе «Эксперт-001-401» (Эконикс-Эксперт, Москва), имеющем датчик измерения растворенного в воде кислорода. Рассчитывали скорости потребления кислорода MX в метаболических состояниях до (V4„), во время (V3) и после (V40) цикла фосфорилирования 1-Ю"4 М АДФ при окислении сукцината (ЯК, 5-Ю"3 М) или НАД-зависимых субстратов малата и глутамата (МГ, по З-Ю"3 М) в присутствии ингибитора СДГ малоната (МЛН, 2-10"3 М) или ингибитора аминотрансфераз аминооксиацетата (АОА, 5-10"4 М). Для оценки энергетического статуса вычисляли коэффициенты стимуляции дыхания (C/I=WV4„), дыхательного контроля (ДК=Уз/У4о) и сопряженности окислительного фосфорилирования - АДФ/О. Во всех измерениях абсолютные значения скоростей потребления кислорода выражены в нгат. о/мин мг белка (нанограмм атомарного кислорода в минуту на 1 мг белка MX)

Статистическая обработка результатов. При обработке результатов исследований использовали параметрический (t-критерий Стьюдента) и непараметрические (U-критерий Манна-Уитни, W-критерий Вилкоксона и х2 -критерий) методы с определением средней арифметической (X) и ее стандартной ошибки (Дх). Значимость различий считали достоверной при Pt, Р„ < 0,05. Расчеты проводили с использованием программы Statistica 6.0 для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования показали (табл. 2), что в каждом случае ботанический состав отражает принадлежность исследуемых торфов к конкретной единице растительных ассоциаций, развивающихся в определенных условиях, в зависимости от трофности болотной среды, в которой происходило образование торфа.

Таблица 2

Ботанический состав исследуемых торфов_

Описание объекта исследования Ботанический состав Характеристика торфа

Большое Васюганское болото, участок «Высокий рям», 1=10- 50см, Я=35%, А=6,3%. Pinus sylvestris (15); Сагех lasiocarpa (5); Eriophorum vaginatum (25); Sphagnum magetlanicum (15); Sphagnum angustifolium (25); Кустарнички (10) Верховой тип сосново-пушицевый вил

Большое Васюганское болото, участок «Низкий рям», 1=150-200см, 11=45%, А=4,8% Pinus sylvestris (5); Carex limosa (5); Сагех lasiocarpa (55); Eriophorum vaginatum (5); Menyanthes trifoliate (5); Sphagnum magellanicum (10); Кустарнички (10) Переходный тип осоковый (лазиокарпа) вид

Большое Васюганское болото, участок «Низкий рям», 1=200-250см, Я=40%, А=4,3% Betula nana (5); Carex lasiocarpa (15); Carex rostrata (10); Eriophorum polystachyon (5); Menyanthes trifoliate (10); Equisetumsp. (10); Sphagnum centrale (10), Drepanocladus sendtneri (20) Низинный тип Травя но-моховый вид

Большое Васюганское болото, участок «Осоково-сфагновая топь», 1=230-250см, Я=45%, А=Ю,4%. Pinus sylvestris (5); Betula nana (5); Carex lasiocarpa (20); Carex omskiana (5); Menyanthes trifoliate (5); Equisetum sp. (30); Sphagnum sectcuspidata (5); Sphagnum centrale (5), Drepanocladus sendtneri (10) Низинный тип Травяной вид

Торфяной месторождение «Клюквенное», 1=10-50см, Я-25%, А=8,1% Carex lasiocarpa (10); Carex cespitosa (5); Carex omskiana (15); Menyanthes trifoliate (25); Equisetum fluviatile (10); Sphagnum centrale (5), Древесина кустарников (30) Низинный тип Древес но-травяной вид

Примечание' /, см - глубина образца; Н. % - степень разложения торфа; А, % - зольность торфа

Исследуемые торфа относятся к трем типам - верховой, переходный и низинный, и согласно процентным соотношением растительных остатков, представлены пятью различными видами: сосново-сфагново-пушицевым, осоковым, травяно-моховым, травяным и древесно-травяным.

Из результатов анализа группового состава органического вещества (табл. 3) пяти видов торфа следует, что все отклонения в содержании основных групп связаны с ботаническим составом, наиболее представительной в количественном отношении

является группа ГК, содержание которой во всех торфах максимально.

Таблица 3

_Групповой состав органического вещества исследуемых торфов (%, ОВ)_

Содержание Лигшды Гуминовые вещества ВРВ+ЛГВ ТГВ НГВ

ОВ, % от СВ всего ГК ФК (лигнин)

Сосново-сфагново -пушнцевый верховой торф, 11=35%

93,70±0,13 9,51 43,48 38,41 5,07 14,72 4,92 27,37

±0,33 ±0,28 ±0,14 ±0,30 ±0,52 ±0,13 ±0,28

Осоковый (лазиокарпа) переходный торф, И=45%

95,11±0,13 6,74 44,91 40,40 4,51 1541 6,50 26,44

±0,23 ±0,30 ±0,11 ±0,35 ±0,44 ±0,12 ±0,36

Т равяно-моховын низинный торф, К=40%

95,74±0,12 3,62 42,78 39,18 3,60 16,33 8,55 28,72

±0,10 ±0,25 ±0,12 ±0,24 ±0,40 ±0,10 ±0,30

Травяной низинный торф, И=45%

89,63±0,11 3,91 34,65 31,04 3,61 17,92 8,82 34,70

±0,18 ±0,23 ±0,12 ±0,28 ±0,27 ±0,10 ±0,20

Древесно-травяной низинный торф, К-25'с

91,92±0,10 5,14 50,00 43,60 6,40 17,10 7,34 20,42

±0,20 ±0,31 ±0,12 ±0,45 ±0,64 ±0,12 ±0,32

Пр1шечание: ОВ - органическое вещество, СВ - сухое вещество, ГК - гуминовые кислоты, ФК -фульвокислоты, ВРВ+ЛГВ - водорастворимые и легкогцдролизуемые вещества, ТГВ -трудиогидролизуемые вещества (целлюлоза), НГВ - негидролизуемые вещества (лигнин), Я, % - степень разложения торфа.

Методами фотохимического анализа (табл. 4) доказано присутствие таких групп БАВ как флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, антраценпроизводные, фенолкарбоновые кислоты, полисахариды. Не обнаружены сапонины и алкалоиды.

Таблица 4

Общий штохимический анализ исследуемых торфов

Группа БАВ Тип, вил торфа

Верховой сосново-пушицевый Переходный осоковый Низинный травяно-моховый Низинный травяной Низинный древесно-травяной

Флавоноиды + + + + +

Кумарины + + + + +

Дубильные вещества + + + + +

Антраценпроизводные + + + + +

Фенолкарбоновые кислоты + + + + +

Полисахариды + + + + +

Сапонины - - - - -

Алкалоиды - - - - -

Примечание-. «+» - данная группа веществ присутствует в исследуемом сырье, «-» - данная группа веществ отсутствует в исследуемом сырье.

Результаты количественного содержания (табл. 5) в торфах веществ фенольной природы показали, что фенольные соединения представлены в основном флавоноидами. Остальные группы (фенолкарбоновые кислоты и кумарины) во всех образцах торфа показаны незначительным содержанием, и количественно практически не различаются между собой.

Таблица 5

Количественное содержание веществ фенольной природы в торфах

Группа БАВ Количественное содержание, %

Тип, вид торфа

Верховой сосново-пушицевый Переходный осоковый Низинный травяно-моховый Низинный травяной Низинный древесно-травяной

Сумма фенольных соединений 1.700 ±0,020 1,200 ±0,020 1,500 ±0,025 1,300 ±0,020 1,300 ±0,030

Флавоноиды 1,550 ±0,030 1,150 ± 0,010 1,400 ±0,010 1,200 ±0,030 1,250 + 0,020

Фенолокислоты 0,016 ±0,002 0,010 ±0,001 0,013 ±0,002 0,010 ±0,002 0,010 ±0,001

Кумарины 0,070 ±0,003 0,030 ±0,001 0,060 ± 0,002 0,040 ± 0,002 0,030 ±0,001

Таким образом, результаты изучения состава торфов различных типов и ботанической принадлежности показывают, что все они имеют одинаковый набор БАВ. Различия наблюдаются лишь в количественных соотношениях, и в целом между пятью видами торфа они незначительны. Из всех БАВ, присутствующих в торфах, наибольшее содержание отмечено для ГК, максимальное количество которых содержится в низинном древесно-травяном виде торфе с месторождения «Клюквенное». Таким образом, ГК в силу своего высокого удельного содержания, являются наиболее представительной группой веществ для дальнейшего изучения.

Химическую структуру ГК исследовали современными физико-химическими методами.

Согласно результатам элементного анализа (табл. 6), ГК древесно-травяного торфа имеют существенные отличия от ГК других исследуемых объектов. Так, от ГК переходного и верхового торфов, они отличаются более высоким содержанием кислорода, более низкой долей углерода при практически одинаковом количестве водорода, что может свидетельствовать о большем содержании активных кислых групп (гидроксильных, карбоксильных), амидных и аминогрупп в молекулах ГК этого вида торфа. От двух других низинных торфов они отличаются меньшей степенью ароматичности и конденсированности молекулы, что может свидетельствовать о большем вкладе алифатических структур в строение молекулы данных ГК. Весьма существенным и важным отличием ГК древесно-травяного торфа является также самое высокое содержание азота.

Таблица б

Элементный состав и атомное отношение в гуминовых кислотах торфов

Тип,вид торфа Элементный состав, масс. % на беззольную навеску Атомное отношение

С Н N О в Н/С еда О/С

Верховой сосново-пушицевый 51.50 5.10 3.0 40.02 0.38 1.19 20.03 0.58

Переходный осоковый 52.10 5.60 3.58 38.25 0.47 1.29 16.98 0.55

Низинный травяно-моховый 50.40 4.35 2.48 42.39 0.38 1.04 23.71 0.63

Низинный травяной 50.50 4.38 2.54 42.15 0.43 1.04 23.20 0.64

Низинный древесно-травяной 47.00 5.50 3.80 43.50 0.20 1.40 14.43 0.69

Абсорбционные спектры ГК в УФ области (рис. 1) выглядят как пологие кривые, имеют сплошное поглощение в интервале 220 - 800 нм, резко возрастающее в коротковолновую сторону.

ТеЯзи1 КСГЛТШ Ш1КО! 9П0 гтгп

Рис. /. УФ-спектры гуминовых кислот исследуемых торфов (1 -верхового сосново-пушгщевого; 2 - переходного осокового; 3 - низинного травяно-мохового; 4 - низинного травяного; 5 - низинного древесно-травяного).

Все спектры имеют одинаковую форму и характеризуются двумя максимумами в УФ-области при длинах волн: 245 нм (обусловленным фенольными, карбоксильными группами, полиеновыми цепями) и 295 нм (свидетельствующим о наличии циклических, ароматических и гетероароматических структурных единиц, относящихся к производным бифенила, кумарина, хромона, ксантона, хинона.

Исходя из характера УФ-спектров также можно предположить наличие в структуре ГК ката-конденсированных и периконденсированных ароматических систем, типа «аценов», «фенов», пиренов, периленов и т.д.

Оптические свойства ГК (табл. 7) являются важным диагностическим показателем при их исследовании. Судя по данным электронной спектроскопии, более высокую оптическую плотность при 465 нм имеют ГК низинных травяного и травяно-мохового, а также верхового торфов, что может свидетельствовать о более высокой степени ароматичности их молекул, по сравнению с ГК других видов торфа.

Таблица 7

Оптические свойства гуминовых кислот исследуемых торфов_

Тип. вид торфа рО.Ш %П< 465/101,1™ 770.001%/'^ Ь50пт,\ст е.«/

Верховой сосново-пушицевый 0,029 0,0079 3,67

Переходный осоковый 0,024 0,0054 4,44

Низинный травяно-моховый 0,030 0.0082 3,66

Низинный травяной 0.033 0,0094 3,51

Низинный древесно-травяной 0,020 0,0041 4.88

Сравнивая полученные результаты с данными ранее описанного элементного анализа можно отметить, что для ГК, имеющих наиболее высокие значения оптической плотности ( Е|";.™465„„ ) характерны самые высокие атомные отношения С/Н. Как и показано выше, это может свидетельствовать об относительном увеличении содержания полисопряженных связей в молекулах ГК и повышении их ароматичности. Падение оптической плотности ( Е"™'^ „.„) и увеличение значения коэффициентов цветности у ГК древесно-травяного торфа указывает на уменьшение размеров систем полисопряжения в их макромолекуле.

Самое высокое значение коэффициента цветности ГК древесно-травяного торфа, судя по результатам элементного анализа и оптических свойств, может быть связано,

прежде всего, с максимальным содержанием кислорода и азота, наряду с низким содержанием углерода в макромолекуле этих ГК.

Полученные ИК-спектры ГК исследуемых торфов (рис. 2) имеют высокую степень подобия - основные характеристические для ГК максимумы поглощения обнаруживаются во всех образцах, это указывает на близость их химической структуры.

Максимальная интенсивность полос поглощения в спектрах ГК отмечена для: гидроксильных, карбонильных, карбоксильных групп, алифатических и ароматических фрагментов.

Рис. 2. ИК-спектры гуминовых кислот:]- низинного древесно-травяного; 2- низинного травяного; 3- низинного травяно-мохового; 4- переходного осокового; 5- верхового сосново-пушицевого видов торфа

Также дана количественная оценка (табл. 8) содержания функциональных групп по данным ИК-спектроскопии на основании отношений оптических плотностей полос поглощения кислородсодержащих групп к оптическим плотностям, соответствующим ароматическим полисопряженным системам и алифатическим заместителям.

Таблица 8

Соотношение оптических плотностей полос поглощения при определенных длинах

волн по данным ИК-спектроскопии

Вид торфа Низинный Низинный Низинный Переходный Верховой

древесно- травяной травяно- осоковый сосново-

травяной моховыи пушицевый

Ао-н34И)'Ас=с |бш 1,05 0,97 0,99 1,07 1,15

Ас=0 172о/Ас=С 1610 1,05 0,97 0,93 0,91 0,87

Ас-0122.5^Ас=С 1610 0,88 0,87 0,84 0,79 0,77

Ас-О и С-О-С 1035 !Ас=с 1610 0,74 0,74 0,76 0,64 0,74

Асалк2920/Ас=с 1610 1,00 0,90 0,94 0,97 0,94

Ао-113400 /Асалк 2920 1,05 1,11 1,07 1,11 1,24

Ас=О1720/Аса:ж2920 1,05 1,11 0,93 0,93 0,93

Ас-О 1225/Асалк 2920 0,88 0,99 0,89 0,82 0,83

Ас-ОиС-О-С 103.5 /Асалк 2920 0,74 0,84 0,83 0,66 0,79

Примечание: А - оптическая плотность.

Результаты показали, что молекулы ГК верхового и переходного торфов имеют различия в содержании карбоксильных групп, в сравнении с низинными торфами, содержащими наибольшее количество карбоксильных групп, максимальное количество которых отмечено для ГК древесно-травяного торфа. И, наоборот, в молекулах ГК верхового и переходного торфов в сравнении с ГК низинных - наблюдается большее содержание гидроксильных групп, исключение составляет один вид низинного торфа -древесно-травяной, в котором их содержание высокое, что также подтверждается данными функционального анализа (табл. 9).

В целом можно отметить, что ГК древесно-травяного торфа имеют весьма значительные отличия от других торфов и представляют собой соединения с высокой долей алифатических фрагментов и возможно меньшей степенью бензоидности, а также с высоким содержанием активных кислых групп (карбоксильных, гидроксильных).

Таблица 9

Функциональный состав гуминовых кислот исследуемых торфов_

Тип,вид торфа Активные кислые группы, мг*экв/г

-СООН -ОНф™,,,,.,,,.,, I

Низинный древесно-травяной 2,86±0,14 3,22±0,19 6,08±0,17

Низинный травяной 2,48±0,12 3,06±0,15 5,54±0,14

Низинный травяно-моховый 2,38±0,14 3,14±0,18 5.52±0,16

Переходный осоковый 2,29±0,11 3,32±0,17 5,61±0,17

Верховой сосново-пушицевый 2,26±0,13 3,78±0,19 6,04 ±0,14

Анализ формы ЭПР спектров исследуемых ГК показал, что все они представляют собой относительно симметричную синглетную линию с фактором их спектроскопического расщепления близким к ^-фактору свободного электрона, обусловленную ароматическими структурами полнсопряженш. Параметры сигналов ЭПР различных ГК принципиально не отличаются между собой, что также свидетельствует о подобии строения их конденсированных ароматических ядер (табл. 10).

Таблица 10

Параметры ЭПР-спектроскопии гуминовых кислот торфов_„—,

Тип, вид торфа Полуширина синглетной линии (АН, Г с) Интенсивность сигнала 10'' спин/грамм Концентрация ПМЦ

Верховой сосново-пушицевый 3,8 1.8

Переходный осоковый 3,9 2,3

Низинный травяно-моховый 4,5 1,6

Низинный травяной 4,5 2,3

Низинный древесно-травяной 4,8 2,6

По интенсивности сигнала (¡¡¡ж) можно отметить, что наибольшее содержание парамагнитных центров (ПМЦ) характерно для ГК низинных древесно-травяного и травяного, а также переходного торфов, далее по убываншо идут верховой и низинный травяно-моховый торфа. Самый высокий парамагнетизм (ПМЦ=2,6) ГК древесно-травяного торфа, вероятно, обусловлен высоким удельным содержанием карбоксильных групп и фенольных гидроксилов, принадлежащих непосредственно ароматическим кольцам. Полученные результаты хорошо согласуются с данными ИК-спектроскопии и функционального анализа.

Протонный анализ (рис. 3) показал, что спектры всех ГК выглядят одинаково сложно, сигналы протонов имеют уширенную форму, и на спектре можно выделить три основных области:

• первая область от 0.5 м.д. до 2.5 м.д. можно отнести к сигналам алифатических протонов (-СН3, -CH2-, -СН).

• вторая область от 2.5 м.д. до 4.0 м.д. можно отнести к сигналам протонов атомов углерода, связанных с гетероатомами (RO-СНг-, RjN-Clb-, где R=H, Alk, углеводы).

• третья область от 6.5 м.д. до 8.0 м.д. являются областью химических сдвигов ароматических протонов.

Интегрирование сигналов в различных областях полученного спектра позволило оценить распределение протонов по важнейшим фрагментам ГК: первая область

алифатических цепей ~ 56%, вторая область углеводов - =25% и третья область ароматических протонов = 19%.

П Т Ii 7 TÍ м

В спектрах ЯМР ИС (рис. 4) выделены более узкие области:

• сигналы в области 10.00-43.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра "С в

Сачкт.»

• сигналы в области 50.00-60.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра |3С в СНз-О-Садкил, СНэ-О-Аг, СНэ-0-С=0;

• сигналы в области 62.00 - 80.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра 13С moho-, ди- и полигидроксильным (углеводным) фрагментам ГК;

• сигналы области 90.00-110.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра ,3С ацетальным или кетальным углеводным фрагментам полисахаридной цепи ГК;

• сигналы в области 112.00-160.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра 13С в ароматических фрагментах ГК;

• сигналы в области 170.00-180.00 м.д. соответствуют резонансным сигналам ядра |3С в -СООН, -COOR, -CONH2.

Как видно из спектра ЯМР|3С (рис. 4) интенсивность метоксильных (-О-СНз) и метилонатных (СНз-0-С=0) групп высокое. Распределение углерода по важнейшим фрагментам ГК составляют следующие значения: алифатический С - 32,8 %; углеводный С - 21,8 ароматический С - 32,2 % и карбонильный С - 13,2 %.

На основе химического исследования ГК низинного древесно-травяного вида торфа нами проведена их стандартизация, определены показатели подлинности и качества (соответствие коэффициентам экстинкции (1 см 0,001 % растворы ГК должны

соответствовать: прп длине волны 465 им - 0,020±0,002, при длине волны 650 им -0,0041+0,0004, коэффициент цветности (465/650) должен соответствовать 4,88±0,05); совпадение спектров в УФ-, ИК-областях и молекулярно-массового распределения, а также, содержание углерода в ГК (не более 47,0 %) и азота (не менее 3,8 %); молекулярная масса должна составлять 1000-1200 кДа). Полученные показатели внесены в проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».

Таким образом, результаты исследования химической структуры ГК различных видов торфа выявили ряд индивидуальных особенностей строения их макромолекул, на основании чего был определён низинный древесно-травяном торф как наиболее перспективный источник ГК для дальнейших исследований. Высокое удельное содержание ГК в данном виде торфа, высокая концентрация парамагнитных центров, наибольшее содержание азота и кислородсодержащих функциональных групп (карбоксильных, хиноидных, фенольных гидроксилов) в структуре его ГК, а так же низкая степень бензоидности и конденсированности их макромолекулы позволяют предположить у ГК низинного древесно-травяного торфа более высокую степень тропности их молекул к биологическим структурам клеток (рецепторам, активным группам ферментов и т.д.), и, соответственно, более выраженные фармакологические эффекты. В связи с этим, исследования биологической активности проведены с данными ГК.

Исследование острой токсичности ГК. Средняя летальная доза (ЛД5о) исследуемого препарата ГК при внутрижелудочном введении мышам составила 4658,40 мг/кг. При внутрижелудочном введении исследуемого препарата крысам в аналогичном диапазоне доз не наблюдали гибели животных и картины острого отравления в течение двух недель наблюдения, что возможно связано с более медленным всасыванием ГК в желудочно-кишечном тракте крыс. Таким образом, исследуемые ГК при внутрижелудочном введении мышам и крысам являются малотоксичными и относятся к III или IV классам опасности соответственно. При внутрибрюшинном введении лабораторным животным ГК проявляют более выраженные токсические свойства: ЛДад исследуемого препарата ГК при внутрибрюшинном введении мышам составила 532,89 мг/кг, а при внутрибрюшинном ведении крысам величина ЛД50 исследованного препарата составила 480,12 мг/кг.

Патоморфологическое исследование погибших животных. Для установления причин летальности и выявления возможных органов-мишеней, поражаемых при остром токсическом воздействии, проводили патоморфологическое исследование трупов крыс, погибших при внутрибрюшинном введении заведомо летальных доз препарата ГК. Судя по результатам патологанатомического исследования гибель лабораторных животных (крыс) при введении летальных доз ГК наступала от острой сердечной недостаточности, возникающей в результате ишемической дистрофии миокарда.

Исследование кардиотоксического действия ГК. Судя по результатам патоморфологического исследования, одной из причин летальности при внутрибрюшинном введении ГК может быть их прямое кардиотоксическое действие. Мы провели регистрацию электрокардиограммы (ЭКГ) и определение порога фибрилляции желудочков (ПФЖ) у крыс-самцов после внутрибрюшинного введения ГК в заведомо летальной дозе (480,00 мг/кг).

Однократное внутрибрюшинное введение ГК вызывает значительно снижение ПФЖ (в 1,8 раза) в сравнении с интактными животными. В тоже время, наблюдалось достоверное укорочение (в 2,8 раза) комплекса QRS в сравнении с интактными животными. Судя по полученным результатам, однократная инъекция ГК в летальной дозе (480,0 мг/кг) индуцирует снижение электрической стабильности сердца, о чём наглядно говорит падение ПФЖ и снижение величины комплекса QRS. Подобное

снижение электрической стабильности сердца может быть причиной внезапной сердечной смерти подопытных животных.

Исследование влияния ГК на реологические свойства крови. Другим возможным механизмом острого нарушения гемодинамики под влиянием ГТС может быть их негативное влияние на реологические свойства крови. Мы исследовали влияние ГК на реологические свойства крови фотометрическим вибрационным методом. Судя по полученным результатам, ГК in vitro вызывают существенное (в 2,26 раза) в сравнении с показателями интактной пробы увеличение показателя индекса обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ). Это может приводить к значительному увеличению вязкости крови, усиленному тромбообразованию, нарушению кровоснабжения миокарда и обусловливать негативное кардиотропное воздействие препарата ГК в летальных дозах.

Таким образом, острое нарушение гемодинамики и последующая гибель животных могут быть обусловлены одновременно, как снижением электрической стабильности сердца, так и негативным влиянием ГК на реологические свойства крови.

Исследование динамики концентраций ГК в сыворотке крови крыс. Нами была изучена динамика концентраций ГК в сыворотке крови крыс при обоих способах введения. Для исследования суточного профиля концентраций ГК вводили крысам однократно (внутрижелудочно или внутрибрюшинно) в дозе 100 мг/кг (рис. 5).

Рис. 5. Суточная динамика концентраций ГК в сыворотке крови крыс-самцов после однократного введения в дозе 100 мг/кг при внутрижелудочном и внутрибрюшинном

способах введения

Из полученных результатов (рис. 5) видно, что существуют значительные различия в суточных профилях концентраций ГК сыворотке крови животных в зависимости от способа введения:

1. Наблюдается практически 10-кратное различие в максимальных уровнях концентрации Стах ГК в сыворотке крови животных при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении (0,04 мкг/мл и 0,46 мкг/мл соответственно).

2. Время достижения максимальной концентрации Ттах при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении различается в три раза (2,0 и 6,0 часов соответственно).

3. В данных условиях эксперимента, при внутрижелудочном введении спустя 4,0 часа после введения, ГК не определяются в сыворотке крови, вследствие крайне низкой концентрации. В тоже время, при внутрибрюшинном введении ГК обнаруживаются в сыворотке крови и через 24,0 часа после последнего введения.

С полученными результатами согласуются наши экспериментальные данные о более выраженных токсических свойствах ГК и способности их к кумуляции при внутрибрюшинном введении, что на наш взгляд, может быть обусловлено значительно более длительной циркуляцией ГК в системном кровотоке по сравнению с

пероральным введением. Различия в суточных профилях концентраций ГК могут указывать на весьма выраженный эффект «первичного прохождения через печень» при их пероральном введении. По-видимому, в случае внутрибрюшинного введения в брюшной полости создается «депо», из которого ГК, медленно всасываясь, попадают в системный кровоток, не подвергаясь предварительной биотрансформации в печени. Это обуславливает более длительную (более 24 часов) циркуляцию ГК в крови животных, по сравнению с внутрижелудочным введением. При этом, полученные значения Тшах, указывают на то, что ГК при внесосудистых способах введения (как при внутрижелудочном, так и при внутрибрюшинном) довольно медленно всасываются, что вероятно связанно с большими размерами их молекул. С другой стороны, медленное всасывание, существенное влияние «эффекта первичного прохождения через печень» обуславливает значительно менее длительную циркуляцию в крови и невозможность кумуляции ГК при внутрижелудочном способе введения. Вероятно, в данном случае нельзя исключать и возможность потери части невсосавшихся ГК за счет естественной перистальтики кишечника.

Исследование иитопротективных свойств ГК торфа. Анализ литературных данных показывает, что ГК, как правило, проявляют наиболее выраженную биологическую активность в условиях экспериментальных моделей связанных с повреждающим воздействием экстремальных факторов различной природы. Мы провели экспериментальную оценку цитопротективных свойств ГК в условиях острого токсического ССЦ-гепатита и различных гипоксических состояний.

Оценка гепатопротективных свойств ГК. Известно, что развитие многих заболеваний обусловлено активацией свободнорадикальных процессов, приводящих к повреждению клеточных структур. Исходя из этих представлений, мы исследовали влияние ГК как потенциальных антиоксидантов на развитие острого токсического ССЦ-гепатита, в патогенезе которого существенная роль принадлежит перекисному окислению липидов (ПОЛ). Исследуемые ГК обладают выраженной гепатопротекторной активностью при остром ССЦ-гепатите (табл. 11).

Таблица 11

Влияние введения ГК и Карсила на биохимические показатели сыворотки крови и на содержание малонового диапьдегида (МДА) в гомогенате печени крыс-самцов

при ССЦ-гепатите (Х±Дх; п=10)

Группы В сыворотке к рови МДА, Мкмоль/л

животных ЩФ, 7-ГГТ АсАТ, АлАТ, Билируби в в

Е/Л Е/Л Е/Л Е/Л н общий, Мкмоль/л сыворотке крови гомогена те печени

Интактные 350.50 5,45 167,00 84,50 2.30 1,90 1,15

±29.20 ±0.28 ±9.16 ±3,33 ±0.30 ±0.3 ±0.06

СС14-гепатит 447,60 8,68 416,80 148,30 12,80 3,60 11,98

±25.00* ±1,53* ±21,50* ±8,16* ±0,72* ±0,28* ±0,66*

Г К (25 мг/кг)+ 404.80 5,96 347.80 123,80 3,10 2,30 4,15

СС14-гепатит ±46.20 ±0.96** ±16,00** ±1,50 ±0.41** ±0.15** ±0,31**

ГК (50 мг/кг)+ 345,60 6,02 292,30 109.50 2,30 1,80 2,62

СС14-гепатпт ±18.40»* ±0,28** ±33,00** ±8.50** ±0.08** ±0.22** ±0,06**

ГК (100 мг/кг)+ 356,50 4,25 207,50 76,30 2,40 1,30 2,00

СС14-гепатит ±26.50** ±0,55** ±22,50** ±0,33** ±0.06** ±0,13** ±0,12**

Карсил 395.60 6,86 356,80 119,30 9,80 2,70 7,45

(100мг/кг)+ ±27,00 ±1,74** ±19,80** ±7,19 ±0,86 ±0,19 ±0,43**

СС14-гепатит

Примечание. * - различия достоверны для группы ССЦ-гепатит по сравнению с группой интактных животных, при р<0,05; **Я'1Я групп животных получавших ГКТ или Карснл - по сравнению с группой ССЦ-гепатит, при р<0,05; п - количество животных в группах.

Судя по полученным экспериментальным данным, их внутрижелудочное введение в диапазоне доз 25-100 мг/кг препятствует повреждающему действию тетрахлорметана на функционально-метаболические и морфологические показатели

печени крыс: существенно снижается интенсивность процессов липопероксидации и разрушения мембран гепатоцитов, выраженность цитолитического синдрома, улучшается экскреторная функция печени, не развиваются фиброзные изменения в печени экспериментальных животных (табл. 11).

Наиболее выраженные гепатозащитные свойства ГК, превосходящие аналогичное действие препарата сравнения Карсила наблюдаются в дозе 100 мг/кг. Исходя из выраженного снижения концентрации малонового диапьдегида в гомогенате печени и в сыворотке крови экспериментальных животных, получавших ГК - их гепатозащитное действие может быть обусловлено выраженными антиоксидантными свойствами (табл. 11).

Исследование антигипоксической активности ГК. Наличие антиоксидантных и хелатирующих свойств у исследуемых ГК указывает на их потенциальные антигипоксические свойства (Лукьянова Л.Д., 1997; Козин В.М., 2005; Кашицкий Э.С., 1999). Это побудило нас оценить их антигипоксическую активность на моделях гистотоксической (тканевой) гипоксии и гипобарической гипоксической гипоксии (гипоксии объема), а также на окислительное фосфорилирование в митохондриях в условиях нормобарической гиперкапнической гипоксии.

Исследование влияния ГК на выживаемость животных при различных гипоксических состояниях. Судя по полученным нами данным, ГК в условиях гипобарической гипоксической гипоксии в дозах 25-100 мг/кг обладают выраженным антигипоксическим действием - на 38-50 % увеличивая продолжительность жизни мышей (табл. 12) и снижая летальность от гипоксии на 24-36 % соответственно.

Таблица 12

Влияние 5-кратного внутрижелудочного введения ГК на продолжительность жизни

мышей в условиях гипобарической гипоксической гипоксии, (Х±Ах)

Группы животных Количество животных Время жизни, мим (^критерий Стьюдента) Легальность от гипоксии (X1 -критерий)

Контроль 25 1Ш±1,13 92%

ГК (25 мг/кг) 25 13,72±1,24 84%

ГК (50 мг/кг) 25 16,44±],19' 76%

ГК(Ю0 мг/кг) 25 17,80±1,3 Г" 64%

Примечание■ - достоверное различие (р<0,05) по сравнению с контролем, - достоверное различие (р<0,05) по сравнению с гуминовыми кислотами 25 мг/кг.

Аналогичные результаты были получены на модели гистотоксической тканевой гипоксии - ГК в диапазоне доз 25-100 мг/кг в условиях гистотоксической гипоксии проявляют антигипоксическое действие, на 72,6% увеличивая продолжительность жизни мышей (табл. 13).

Таблица 13

Влияние 5-кратного внутрижелудочного введения ГК на продолжительность жизни

мышей в условиях гистотоксической гипоксии, (Х±Ах)

Группы животных Количество животных Продолжительность жизни

в минутах в % от контроля

Контроль (нитропруссид натрия) 25 9,45±2,78 -

ГК (25 мг/кг) + нитропруссид натрия 25 11,83±1,73* 125.20

ГК (50 мг/кг) + нитропруссид натрия 25 14,10±1.87* 148,80

ГК (100 мг/кг) + нитропруссид натрия 25 16.32±1.48-'" 172,60

Примечание * - достоверное различие (р<0,05) по сравнению с контролем, - достоверное различие

(р<0,05) по сравнению с гуминовыми кислотами 25 мг/кг.

Исследование влияния ГК на окислительное фосфорилирование в митохондриях в условиях гипоксии. Согласно литературным данным, гипоксическое воздействие сопровождается усилением процессов ПОЛ и разобщением окислительного

фосфорилирования в митохондриях (МХ) в результате свободнорадикапьного повреждения клеток (Зозуля Ю.А., 2000). Исходя из этого, с целью выявления возможных механизмов антигипоксического действия ГК мы провели исследование влияния их профилактического курсового введения (100мг/кг) на окислительное фосфорилирование в митохондриях головного мозга и печени на фоне гипоксического воздействия в сравнении с антиоксидантом и антигипоксантом дигидрокверцетином в условиях гипоксии средней степени тяжести - на модели нормобарической гиперкапнической гипоксии у мышей (табл. 14-17).

В данных условиях эксперимента гипоксия приводила к возрастанию скоростей поглощения кислорода МХ головного мозга мышей при окислении эндогенных субстратов, а также к снижению величин СД, ДК и АДФ/О, по сравнению с митохондриями интактных животных (табл. 14). Подобная закономерность наблюдалась также и при утилизации МХ головного мозга экзогенных субстратов -сукцината (ЯК) и смеси малат-глутамат (МГ). При этом, наиболее выраженные нарушения, деэнергизация МХ проявлялись при окислении органеллами НАД-зависимых субстратов (малата и глутамата), что также сопровождалось снижением метаболического контроля дыхания органелл. На это указывает повышение скоростей контролируемого окисления субстратов (У4П У^ в значительно большей степени, чем фосфорилирующего (Уз), снижение величин СД, ДК и существенное снижение эффективности окислительного фосфорилирования - коэффициента АДФ/О.

Таблица 14

Функциональное состояние митохондрий головного мозга интактных мышей и

мышей в условиях гипоксии (Х±Ах, п = 6)

Субстраты: нгат. 02/мин мг белка СД ДК АДФ/О Тр,с

V,

состояние митохондрий головного мозга интактных мышей

Энд. суб. 30.48 64.00 30,19 2,10 2,12 2,45 52,55

±1.95 ±2,85 ±1.25 ±0.05 ±0,05 ±0,06 ±2.12

ЯК 65,91 105,46 65,91 1,60 1,60 1,85 42,05

±2,05 ±2,22 ±1,15 ±0.04 ±0.03 ±0,05 ±3,11

МГ 33,68 85,88 35,02 2,55 2,45 2,65 45,55

±1,45 ±2,45 ±1,75 ±0,05 ±0.06 ±0,05 ±2,97

МГ 26,12 64.00 25,81 2,45 2.48 3,15 52,32

+МЛН ±1.22 ±2,00 ±2,04 ±0.06 ±0,07 ±0,07 ±3.50

МГ 22,43 58,31 23.32 2,60 2,50 3.45 60,22

+АОА ±1,88 ±3,05 ±0.85 ±0.10 ±0.08 ±0.04 ±2,55

состояние митохондрий головного мозга мышей в условиях гипоксии

Энд. суб. 56.56 90.50 53.23 1,60 1,70 1.85 45,30

±1,84» ±2,85* ±1,35» ±0.05* ±0,04* ±0,05* ±5,15

ЯК 90,74 136.11 93,87 1,50 1.45 1,63 34,22

±2,11» ±4.11* ±1,94* ±0,02* ±0.04* ±0,04» ±2,50*

МГ 62,27 115.20 65.83 1,85 1,75 2,25 42,10

±3,00» ±2.00* ±2,50» ±0,05* ±0,06* ±0.06* ±2,15

МГ 40,12 93,89 40,82 2,34 2,30 2,45 50,00

+МЛН ±2,65* ±2,70* ±2,21» ±0,10 ±0,08 ±0,05» ±3.45

МГ 36.57 92,16 36,14 2.52 2,55 3,15 56,45

+АОА ±1,85* ±2.45» ±1.90* ±0.06 ±0,05 ±0.05* ±2,45

В МХ печени мышей гипоксическое воздействие вызывало изменения, сходные с таковыми в ткани головного мозга (табл. 15). Так, при окислении эндогенных субстратов наблюдалось увеличение скоростей дыхания (У4„, Уз У40) и уменьшение коэффициентов СД, ДК, АДФ/О относительно показателей группы интактных животных (табл. 15). Это прямо указывает о разобщение окислительного фосфорилирования на фоне гипоксии. Окисление сукцината сопровождалось увеличением скоростей поглощения кислорода МХ печени, уменьшением

коэффициентов СД и АДФ/О, что также свидетельствует о снижении эффективности окислительного фосфорилирования.

Таблица 15

Функциональное состояние митохондрий печени интактных мышей и __мышей в условиях гипоксии (Х±Ах, п = 6)_

Субстраты: нгат. Ог/мин мг белка СД дк АДФ/О Тр, с

\'4„ V, V*

состояние митохондрий печени интактных мышей

Энд. суб. 38,34 85,12 37,83 2,22 2,25 2,60 48,75

±0,75 ±3,25 ±0,95 ±0,02 ±0,05 ±0.06 ±2,00

ЯК 71,53 125,17 69,54 1,75 1,80 2,00 38,44

±1,95 ±3,00 ±2,14 ±0,04 ±0,04 ±0,04 ±4,25

МГ 40,85 102,12 40,85 2,50 2,50 2,50 41,50

±2,12 ±4,00 ±2,45 ±0,05 ±0,05 ±0,04 ±1,25

МГ 31,40 83,21 30,82 2,65 2,70 2,85 46,20

+МЛН ±2,50 ±1,55 ±2,31 ±0.06 ±0,03 ±0,07 ±2,50

МГ 29,08 75,60 27,49 2,60 2,75 3,45 54,00

+АОА ±2,14 ±2,50 ±1,50 ±0.05 ±0,04 ±0,03 ±2,30

состояние митохондрий печени мышей в условиях гипоксии

Энд. суб. 62,38 115,40 61,38 1,85 1,88 2,20 51,00

±2.00« ±2,11« ±2,02* ±0,05» ±0,06* ±0.05* ±2,75

ЯК 98.59 152.81 89,89 1,55 1,70 1.85 36,00

±2,11 ±3,10* ±1,50» ±0,06* ±0,05 ±0,06* ±3,15

МГ 65,85 135,00 64,29 2,05 2,10 2,15 44,20

±1,44* ±1,66* ±1,25» ±0,06* ±0,05* ±0,06» ±3,45

МГ 37,89 98,50 37,89 2,60 2,60 3,15 46,35

+МЛН ±1,50 ±3,45* ±1,35 ±0,05 ±0,04 ±0,07* ±2.85

МГ 32,27 82,30 31,41 2,55 2,62 3,50 58,56

+АОА ±1,15 ±3.32 ±1,40 ±0,07 ±0,05 ±0,04 ±3.75

Примечание: *р<0,05 по сравнению с контролем, X — среднее значение, ДХ - стандартное отклонение.

Таблица 16

Влияние гуминовых кислот и дигидрокверцетина на функциональное состояние

Субстраты: нгат. Ог/мин мг белка СД ДК АДФ/О Тр, с

У4п V, У4„

влияние гуминовых кислот

Энд. суб. 39,50 75,05 38,49 1,90 1.95 2,20 44,52

±1,75# ±2,00# ±0,80# ±0,06# ±0,05 ±0,04# ±2,14

ЯК 63,57 114,43 66,53 1,80 1,72 1.95 37,55

±0,95 ±4,22# ±1,43 ±0,04# ±0,03# ±0,03# ±1.55

МГ 40,47 90,25 40,65 2,23 2,22 2,50 42,62

±1,22# ±3,15# ±1,40# ±0,03# ±0,05# ±0.08# ±1,75

МГ 26,18 64,15 25,46 2.45 2,52 2,50 51,04

+МЛН ±2,02# ±2,70# ±1,30 ±0,06 ±0,06# ±0,11 ±3,14

МГ 23.12 58,75 24,17 2,54 2,43 3,08 55,50

+АОА ±2,07# ±3,15# ±1,26# ±0,05 ±0,04 ±0,09 ±3,50

влияние дигидрокверцетина

Энд. суб. 60,70 100,15 60,70 1,65 1,65 2,20 48,51

±1,55 ±3,65+ ±1,44 ±0,04+ ±0,04+ ±0,04# ±3,05

ЯК 70,15 122,76 70,15 1,75 1,75 1,90 34,54

±0,85# ±1,92# ±0,78# ±0,05# ±0,05# ±0.03# ±4,15

МГ 57,50 92,60 59,00 1.61 1,57 3,50 46,25

±2,75 ±3,3 5# ±2,60 ±0,06+ ±0,07+ ±0,06# ±2,55

МГ 30,18 75,50 32,40 2,06 2,33 3,20 52,50

+МЛН ±1,50# ±2,43# ±1,25# ±0,08 ±0,06 ±0,08# ±3,25

МГ 22,80 60,08 24,25 2,63 2,48 3,10 58,50

+АОА ±1,03# ±4,12# ±1.25# ±0,05 ±0,03 ±0,06 ±6,00

Таким образом, в наших экспериментах установлено, что ГК обладают выраженными аитигипоксическим действием на модели нормобарической гиперкапнической гипоксии, нормализуя при профилактическом введении активность сукцинат- и НАД-зависимых процессов энергопродукции в головном мозге и печени мышей и предотвращая разобщение окислительного фосфорилирования (табл. 14,15).

Таблица 17

Влияние гуминовых кислот и дигидрокверцетина на функциональное состояние _ митохондрий печени мышей при гипоксии (Х±Ах, п = 6) _

Субстраты: нгат. 0;/мнн мг белка сд дк АДФ/О Тр, с

V*, V, V,.

влияние гуминовых кислот

Энд. суб. 42,95 90,20 41,95 2.10 2,15 2,40 46.52

±2.35# ±3,20# ±2,22# ±0,07» ±0,06# ±0,05# ±5.15

ЯК 64,04 115.28 62,31 1.80 1,85 2.00 30,55

±1,75» ±3.05# ±1,60# ±0,05# ±0,04# ±0,058 ±2,80

МГ 40,80 105,50 42.20 2.59 2,50 2,50 40,50

± 1,408 ±2,60# ±1,35# ±0,10# ±0.07# ±0,07# ±3,60

МГ 30.89 68,57 30,47 2,22 2.25 2,95 47.20

+МЛН ±2,11# ±2.85# ±1.05# ±0,06# ±0,04# ±0.15 ±3,50

МГ 20.20 52,52 20,20 2,60 2,60 3,65 52,50

+АОА ±1.85# ±4,15# ±1,45# ±0.05 ±0.05 ±0.11 ±6,35

влияние дигндрокверцетиня

Эйд. суб. 57.60 115.20 57,66 2,00 2,00 2,38 50,00

±2.00+ ±2,45+ ±2,14+ ±0.03№ ±0,03# ±0,05№ ±2,75

ЯК 72,62 134,35 72,62 1,85 1,85 1,95 31.25

±1.85# ±2,05#+ ±1,00» ±0,04# ±0.06# ±0,06# ±3.35

МГ 49.96 117,40 49,33 2,35 2,38 2.35 42,02

±1.85# ±3,22#+ ±1,65# ±0,06#+ ±0,05» ±0,04#+ ±3,85

МГ 27,40 68,50 27.40 2.50 2,50 3,20 48,05

+МЛН ±0.96#+ ±2.т ± 1.00Я+ ±0,04+ ±0,04+ ±0,06 ±4,15

МГ 21,37 54,50 21,37 2.55 2.55 3,65 54,22

+АОА ±1,35# ±1,97# ±1.22# ±0,02 ±0,04 ±0,08 ±4,50

Примечание. #р<0,05 по сравнению с гипоксией, +р<0,05 по сравнению с группой, получавшей ГК.

Антигипоксическое действие ГК не уступает эффектам у эталонного антигипоксанта дигидрокверцетина в головном мозге и превосходит таковое в печени (табл. 16, 17). Выявленная под действием ГК нормализация окислительного фосфорилирования в митохондриях головного мозга и печени, вероятно, обусловлена протекторными свойствами ГК^предотвращающих свободнорадикальное повреждение клеток и органелл в условиях гипоксии.

ВЫВОДЫ:

1. Исследуемые торфа по ботаническому составу относятся к пяти видам: сосново-сфагново-пушицевому, осоковому, травяно-моховому, травяному, древесно-травяному. Химический состав исследуемых торфов зависит от их ботанической природы и представлен гуминовыми веществами (до 50%), полифенолами, липидами, сахарами, лигнином.

2. Низинный древесно-травяной торф месторождения «Клюквенное» является перспективным источником гуминовых кислот, исходя из наибольшего их удельного содержания, а так же особенностей их химической структуры - меньшей степени бензоидности и конденсированности макромолекулы, высокой доли алифатических фрагментов, активных кислородсодержащих функциональных групп (карбоксильных, хиноидных, фенольных гидроксилов), азота и концентрации парамагнитных центров.

3. На основе выявленных особенностей химической структуры гуминовых кислот разработаны методы их стандартизации, определены показатели их подлинности и качества, и составлен проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».

4. Нативные гуминовые кислоты низинного древесно-травяного торфа месторождения «Клюквенное» при внутрижелудочном введении мышам и крысам являются малотоксичными веществами и относятся к III и IV классам опасности соответственно. При внутрибрюшинном введении токсичность гуминовых кислот значительно повышается. При внутрибрюшинном введении летальных доз гуминовых кислот крысам смерть наступает от острой сердечной недостаточности, возникающей в результате ишемической дистрофии миокарда.

5. Исследуемые гуминовые кислоты обладают выраженной гепатозащитной активностью в условиях острого CCLi-гепатита. Их предварительное внутрижелудочное введение препятствует повреждающему действию тетрахлорметана на функционально-метаболические и морфологические показатели печени крыс.

6. Гуминовые кислоты обладают выраженным антигипоксическим действием -увеличивая срок жизни животных и снижая летальность в условиях гистотоксической и гипобарической гипоксической гипоксии при профилактическом внутрижелудочном введении мышам. В условиях нормобарической гиперкапнической гипоксии гуминовые кислоты предотвращают разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях, нормализуя активность сукцинат- и НАД-зависимых процессов энергопродукции в митохондриях головном мозга и печени мышей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гостищева М.В. Сравнительный анализ методов определения фракционно-группового состава органического вещества торфа // Материалы третьей научной школы «Болота и биосфера». Томск: ЦНТИ. 2004. С. 170-177.

2. Федько И.В., Гостищева М.В., Писниченко Е.О. Химико-фармакологическое исследование гуминовых комплексов торфов Западной Сибири Н Сборник научных трудов «Информационные системы мониторинга окружающей среды». Томск. 2004. С. 54-58.

3. Федько И.В., Гостищева М.В., ИсматоваР.Р. Медицинские аспекты использования биологически активных гуминовых кислот // Химия растительного сырья. 2005. № 1.С. 49-52.

4. Федько И.В., Гостищева М.В. Исследование антиоксидантной активности гуминовых комплексов торфа // Сборник статей по материалам VI конгресса молодых учёных и специалистов «Науки о человеке». Томск. 2005. С. 101-102.

5. Федько И.В., Гостищева М.В. Исследование специфических веществ торфов // Сборник статей по материалам Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации». Новосибирск. 2005. С. 420-421.

6. Гостищева М.В., Кузьменко O.A. Характеристика некоторых видов торфа Томской области // Материалы четвёртой научной школы «Болота и биосфера». Томск: ЦНТИ. 2005. С. 151-156.

7. Завацкая Е.С., Гостищева М.В., Горчаков J1.B. Создание базы данных по физико-химическим свойствам гуминовых кислот // Материалы четвёртой научной школы «Болота и биосфера». Томск: ЦНТИ. 2005. С. 193-196.

8. Гостищева М.В., Федько И.В. Изучение свойств гуминовых кислот разных видов торфа Томской области // Becui нацыянальнай акадэмн навук Беларусь Серыя xiMinHbix навук. 2006. № 5. С. 38-40.

9. Гостищева М.В., Инишева Л.И., Федько И.В. Исследование химических и биологических свойств гуминовых кислот торфов различного происхождения // Сборник статей по материалам международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии». Минск. 2006. С. 181-184.

Iû. Федько И.В., Гостищева M В , Исматова P.P. Фармацевтическая оценка свойств гуминовых веществ торфов, полученных различными способами // Сборник статей по материалам международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии». Минск. 2006. С. 249-251.

11. Gostishcheva M.V., Inisheva L I., Fedko I.V. Research of Biological Activity Humic Acids of Peats // 13th Meeting of the International Humic Substances Society «Humic Substances - Linking Structure to Functions». Karlsruhe, Germany. 2006. P. 445-448.

12. Гостищева M.B. Характеристика химических и биологических свойств различных фракций гуминовых кислот торфов и сапропелей // Материалы пятой научной школы «Болота и биосфера». Томск: ЦНТИ. 2006. С. 168-175.

13. Гостищева М.В., Федько И.В., Солдаткина М.А. Антиоксидантная активность гуминовых кислот торфов Западной Сибири // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых и И школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты», Москва. 2006. С. 88-89.

14. Федько И.В, Гостищева М.В., Исматова P.P., ЗиганшииА.У. К вопросу о химическом составе пелондов Томской области // Вестник Башкирского университета. 2007. №1. С.32-33.

15. Гостищева М.В., Федько И.В., Исматова P.P., Щеголихина А И. Сравнительная оценка молекулярных параметров гуминовых кислот торфа различных типов // Башкирский химический журнал. 2007. №2. С.48-56.

16. Гостищева М.В. Сравнительная характеристика гуминовых кислот торфов Томской области // Известия Томского политехнического университета. 2007. № 2. Том 310. С. 163-166.

17. Гостищева М.В., Федько И.В., Исматова P.P. Сравнительное изучение химического состава и биологической активности торфа в зависимости от степени его разложения // Химия растительного сырья. 2008 № 1. С 127-130.

18. Гостищева М.В., Белоусов М.В., Исматова P.P., Васильев К.Ю, Дмитрук С.Е., Юсубов M С. Изучение химико-токсикологических свойств гуминовых кислот низинного торфа Томской области // Башкирский химический журнал. 2008. Том 15. № 2.С. 19-24.

19. Гостищева М.В., Белоусов М.В., Юсубов М.С., ИсматоваР.Р., Дмитрук С.Е. Сравнительные ИК-спектральные характеристики гуминовых кислот торфов Томской области различного генеза // Химико-фармацевтический журнал. 2008. Л» 3. том 42.

20. Федько И.В., Гостищева М.В Фармацевтические аспекты использования торфа / Учебное пособие. Томск: Изд-во СибГМУ, 2006. 20 с

21. Инишева Л.И., ГостищеваМ.В., Порохина Е.В., Сергеева MA., Федько И.В. Большой практикум, физикохимия, биология и комплексная переработка торфа / Учебное пособие. Томск: Изд-во ТГПУ 2007. 120 с.

22. Гостищева М.В , Исматова P.P., Дмитрук С Е., Белоусов М.В. Фармацевтические аспекты использования пелоидов Сибири / Учебное пособие для студентов фармацевтического факультета. Томск. 2008.42 с.

Патенты на изобретение

23. Инишева Л.И, Гостищева М.В, Тухватулин Р Т. Способ определения биологической активности гуминовых кислот торфов: Патент Лгг 2300103 РФ, МПК G 01 N33/48 от 27 05.2007 г

Тираж 100. Заказ №904. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

Актуальность темы: Поиск новых сырьевых ресурсов биологически активных веществ (БАВ) природного происхождения для разработки на их основе новых лекарственных препаратов является актуальной задачей современной фармации. Одним из перспективных источников БАВ является торф, содержащий уникальный комплекс биологически активных соединений (гуминовые кислоты, углеводы, полифенолы и др.) и обладающий значительными, и что немаловажно, возобновляемыми сырьевыми ресурсами. Являясь продуктом частичного распада болотных растений, торф сохраняет присущие растительным биоценозам те или иные физиологически активные соединения, устойчивые к биологическим разрушениям, и пополняется новыми веществами как растительного происхождения, так и метаболитами жизнедеятельности микро- и макроорганизмов, населяющих торфяную залежь. Специфическую и наиболее представительную в количественном отношении группу БАВ торфа составляют гуминовые кислоты (ГК), являющиеся сложной смесью высокомолекулярных и полифункциональных соединений алициклической, гидроароматической, ароматической и гетероциклической природы.

В настоящее время в научной литературе имеется большое количество сведений о биологической активности солей ГК и применении препаратов на их основе в медицине и ветеринарии. Фармакологические свойства и токсичность нативных ГК практически не изучены. Кроме того, необходимо отметить, что химическая структура и фармакологические эффекты гуминовых препаратов могут существенно различаться в зависимости от происхождения торфа, способов извлечения, очистки и фракционирования препаратов. Эти обстоятельства делают практически невозможными попытки внеэкспериментального прогнозирования особенностей их токсических и фармакологических свойств по общим элементам структуры, и, соответственно, обуславливают необходимость химической и биологической стандартизации каждого из образцов ГК различного происхождения.

По объемам запасов торфа, Томская область занимает 2-е место в России (32,8 млр. тони, что составляет 20,9 % Российских ресурсов) [73, 74, 260].

Таким образом, недостаточная изученность химической структуры и биологической активности нативных ГК торфов Томской области, наряду с их огромными сырьевыми ресурсами, определяет необходимость их системного химико-фармакологического изучения.

ЦЕЛЬ: химико-фармакологическое исследование нативных гуминовых кислот торфов Томской области, как перспективных объектов для разработки новых лекарственных средств.

Для достижения цели были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Провести сравнительное химико-фармакогностическое исследование ряда торфов Томской области.

2. Провести сравнительное изучение химической структуры нативных гуминовых кислот, выделенных из исследуемых торфов, современными методами физико-химического анализа.

3. На основании полученных данных выбрать наиболее перспективный сырьевой источник и разработать методы его стандартизации.

4. Подготовить проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».

5. Исследовать токсикологические и фармакологические свойства гуминовых кислот наиболее перспективного сырьевого источника.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное фармакогностическое исследование ряда торфов Томской области и сравнительное изучение химической структуры их нативных ГК современными методами физико-химического анализа. Определены основные группы БАВ исследуемых торфов и установлено, что ГК являются наиболее представительной в количественном отношении группой БАВ торфа. Показано, что низинный древесно-травяной торф месторождения «Клюквенное», в силу особенностей химической структуры их ПС, является наиболее перспективным сырьевым источником ГК. Впервые проведена стандартизация ГК, определены показатели их подлинности и качества. Впервые изучены токсикологические и фармакологические свойства нативных ГК наиболее перспективного сырьевого источника. Проведена оценка острой токсичности ГК при разных способах введения, выявлены органы-мишени, показано прямое кардиотоксическое действие ГК. На экспериментальных моделях патологий установлены выраженные антигипоксические и гепатозащитные свойства ГК.

Работа поддержана грантами: Роснауки 2005-РИ-111.0/002/049, РФФИ № 05-07-98002, № 06-04-58593, Грантом Главы Администрации (Губернатора) Томской области научных разработок молодых ученых № 340, стипендией Президента РФ, стипендией Фонда им. Шамахова Ф.Ф.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований низинный древесно-травяной вид торфа обоснован как наиболее перспективный источник получения гуминовых препаратов высокого качества. Полученные результаты и сделанные выводы важны для решения задач, связанных с использованием ГК из торфа в ветеринарии и медицине.

Проведена стандартизация и определены критерии оценки доброкачественности - качественной и количественной идентификации ГК торфа. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа» (Акт сдачи-приемки результатов ннаучно-технических работ по Договору № 1390 от 06 сентября 2007 г на выполнение НИР по теме: «Разработка методов стандартизации и проекта фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа»», действующего на основании договора № 154 от 16 марта 2007 г. о научно-техническом сотрудничестве ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава и ООО «Инновационные коммуникации» - Приложения 1-3).

Проведенные исследования легли в основу выполнения НИОКР по проекту Администрации Томской области «Разработка новых оригинальных средств для нужд ветеринарии на основе продуктов глубокой переработки торфов Томской области» (Акт сдачи-приемки результатов НИОКР по Договору № 340 от 18 июля 2007 г на финансирование проекта, победившего в областном конкурсе научныхразработок молодых ученых в 2007 году -Приложение 4).

Результаты работы использованы для создания базы данных по физико-химическим свойствам ГК торфов Томской области в клиент-серверной технологии (РФФИ № 05-07-98002).

По результатам выполненных исследований получен патент РФ № 2300103 «Способ определения биологической активности гуминовых кислот торфов» (Приложение 5).

Результаты работы используются в учебном процессе Сибирского государственного медицинского университета: в лекционном курсе и на практических занятиях интернов и студентов на кафедрах фармацевтической технологии (Акт внедрения учебно-методического пособия № 1 от 14.01.2008 «Фармацевтические аспекты использования пелоидов Сибири» Приложение 6).

По материалам диссертации подготовлены и изданы следующие учебные пособия:

1. Учебное пособие «Фармацевтические аспекты использования торфа».

2. Учебное пособие «Большой практикум: физикохимия, биология и комплексная переработка торфа».

3. Учебное пособие «Фармацевтические аспекты использования пелоидов Сибири».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ «Изыскание и изучение фармакологических средств. Вопросы фармации» (№ гос. регистрации темы 01.02.00. 101708).

Апробация работы. Результаты и основные положения работы представлены на следующих научных форумах: Ш Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Болота и Биосфера» (г. Томск, 2004); VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005); IV Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Болота и Биосфера» (г. Томск, 2005); Международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии» (г. Минск, Республика Беларусь, 2006); 13й Meeting of the International Humic Substances Society «Humic Substances - Linking Structure to Functions» (Karlsruhe, Germany, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых и П школы им. Академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (г. Москва, 2006); V Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Болота и Биосфера» (г. Томск, 2006).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 21 печатных работы: 18 статей и материалов научных конференций, из них 6 в реферируемых Российских журналах, 1 в реферируемом зарубежном журнале, 3 учебных пособия, получен 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 189 страницах компьютерного текста, содержит 32 таблицы, 16 рисунков, включает введение, обзор литератур (глава 1), экспериментальную часть (главы 2-5), список литературы, содержащий 291 библиографический источник, из которых 76 на иностранных языках, и Приложение.

ВЫВОДЫ:

1. Исследуемые торфа по ботаническому составу относятся к пяти видам: сосново-сфагново-пушицевому, осоковому, травяно-моховому, травяному, древесно-травяному. Химический состав исследуемых торфов зависит от их ботанической природы и представлен гуминовыми веществами (до 50%), полифенолами, липидами, сахарами, лигнином.

2. Низинный древесно-травяной торф месторождения «Клюквенное» является перспективным источником гуминовых кислот, исходя из наибольшего их удельного содержания, а так же особенностей их химической структуры - меньшей степени бензоидности и конденсированности макромолекулы, высокой доли алифатических фрагментов, активных кислородсодержащих функциональных групп (карбоксильных, хиноидных, фенольных гидроксилов), азота и концентрации парамагнитных центров.

3. На основе выявленных особенностей химической структуры гуминовых кислот разработаны методы стандартизации, определены показатели их подлинности и качества, и составлен проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые кислоты торфа».

4. Нативные гуминовые кислоты низинного древесно-травяного торфа месторождения «Клюквенное» при внутрижелудочном введении мышам и крысам являются малотоксичными веществами и относятся к Ш и IV классам опасности соответственно. При внутрибрюшинном введении токсичность гуминовых кислот значительно повышается. При внутрибрюшинном введении летальных доз гуминовых кислот крысам смерть наступает от острой сердечной недостаточности, возникающей в результате ишемической дистрофии миокарда.

5. Исследуемые гуминовые кислоты обладают выраженной гепатозащитной активностью в условиях острого ССЬггепатита. Их предварительное внутрижелудочное введение препятствует повреждающему действию тетрахлорметана на функционально-метаболические и морфологические показатели печени крыс.

6. Гуминовые кислоты обладают выраженным антигипоксическим действием - увеличивая срок жизни животных и снижая летальность в условиях гистотоксической и гипобарической гипоксической гипоксии при профилактическом внутрижелудочном введении мышам. В условиях нормобарической гиперкапнической гипоксии гуминовые кислоты предотвращают разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях, нормализуя активность сукцинат- и НАД-зависимых процессов энергопродукции в митохондриях головном мозга и печени мышей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Торф содержит уникальный комплекс биологически активных соединений и обладает значительными, и, что немаловажно, возобновляемыми сырьевыми ресурсами. Являясь продуктом частичного распада болотных растений, торф сохраняет присущие растительным биоценозам те или иные физиологически активные соединения, устойчивые к биологическим трансформациям и пополняется новыми веществами растительного и животного происхождения. При этом, несмотря на наличие большого количества общих элементов структуры, биологическая активность ГК -наиболее представительной группы органических веществ торфа - полученных из разных месторождений, может существенно различаться, что обусловлено высокой степенью полиморфизма их химического состава. Это делает практически невозможными попытки обобщения и внеэкспериментального прогнозирования особенностей токсических и фармакологических свойств ГК по общим элементам структуры и обуславливает необходимость фармацевтической и биологической стандартизации образцов ГК из каждого месторождения. Это определило необходимость их системного химико-фармакологического изучения.

Фармакогностическое исследование различных видов торфа показало, что в каждом случае ботанический состав отражает принадлежность исследуемых торфов к конкретной единице растительных ассоциаций, развивающихся в определенных условиях, в зависимости от трофности болотной среды, в которой происходило образование торфа. Исследуемые торфа относятся к трём типам - верховой, переходный и низинный, и согласно процентным соотношением растительных остатков, представлены пятью различными видами: сосново-сфагново-пушицевым, осоковым, травяно-моховым, травяным и древесно-травяным.

Методами фотохимического анализа доказано присутствие во всех видах исследуемых торфов флавоноидов, дубильных веществ, кумаринов, антраценпроизводных, фенолкарбоновых кислот, полисахаридов. Результаты количественного содержания в торфах веществ фенольной природы показали, что фенольные соединения представлены в основном флавоноидами.

Из результатов анализа группового состава органического вещества пяти видов торфа следует, что все отклонения в содержании основных групп связаны с ботаническим составом, наиболее представительной в количественном отношении является группа ПС, содержание которой во всех торфах максимально.

Согласно результатам элементного анализа, ГК древесно-травяного торфа имеют существенные отличия от ПС других исследуемых объектов. Так, от ПС переходного и верхового торфов, они отличаются более высоким содержанием кислорода, более низкой долей углерода при практически одинаковом количестве водорода, что может свидетельствовать о большем содержании активных кислых групп (гидроксильных, карбоксильных), амидных и аминогрупп в молекулах ГК этого вида торфа. От двух других низинных торфов они отличаются меньшей степенью ароматичности и конденсированности молекулы, что может свидетельствовать о большем вкладе алифатических структур в строение молекулы данных ГК. Весьма существенным отличием ГК древесно-травяного торфа является таюке самое высокое содержание азота.

Абсорбционные спектры ГК в УФ области имеют сплошное поглощение в интервале 220-800 нм, имеют подобную форму и характеризуются двумя максимумами в УФ-области при длинах волн: 245 нм (фенольные, карбоксильные группы, полиеновые цепи) и 295 нм (циклические, ароматические и гетероароматические структурные единицы - производные бифенила, кумарина, хромона, ксантона, хинона).

Полученные ИК-спектры ГК исследуемых торфов имеют высокую степень подобия - основные характеристические для ГК максимумы поглощения обнаруживаются во всех образцах, это указывает на близость их химической структуры. Максимальная интенсивность полос поглощения в спектрах ГК отмечена для: гидроксильных, карбонильных, карбоксильных групп, алифатических и ароматических фрагментов.

Количественная оценка содержания функциональных групп по данным ИК-спектроскопии показала значительные отличия ГК древесно-травяного торфа от других торфов. Они представляют собой соединения с высокой долей алифатических фрагментов и меньшей степенью бензоидности, а также с высоким содержанием активных кислых групп (карбоксильных, гидроксильных).

Параметры сигналов ЭПР различных ГК принципиально не отличаются между собой. Специфика сигналов ЭПР исследуемых ГК наиболее вероятно связана с делокализацией неспаренных электронов по различным областям полисопряжения, находящихся в пределах одной макромолекулы. По интенсивности сигнала можно отметить, что наибольшее содержание парамагнитных центров характерно для ГК низинного древесно-травяного торфа. Самый высокий парамагнетизм ГК древесно-травяного торфа вероятно обусловлен высоким удельным содержанием карбоксильных групп и фенольных гидроксилов, принадлежащих непосредственно ароматическим кольцам.

Результаты спектроскопии ЯМР подтвердили данные других спектральных методов об особенностях химической структуры ГК низинного древесно-травяного вида торфа, показали общие типовые признаки строения, а также позволили оценить распределение углерода и протонов по важнейшим фрагментам структуры исследуемых ГК.

Таким образом, в результате исследования химической структуры ГК различных видов торфа был определен перспективный объект - ГК низинного древесно-травяного вида торфа, которые по сравнению с другими объектами, отличаются меньшей степенью бензоидности и конденсированности макромолекулы, высокой долей алифатических фрагментов, активных кислородсодержащих функциональных групп (карбоксильных, хиноидных, фенольных гидроксилов), азота и концентрацией парамагнитных центров. Выявленные особенности химической структуры данных ГК позволили предположить у них более высокую степень тропности их молекул к биологическим структурам клеток (рецепторам, активным группам ферментов и т.д.), и, соответственно, более выраженные фармакологические эффекты.