Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение шандры пустырниковой и шандры чужеземной флоры Северного Кавказа

Э-Га. правшу рукописи

МИКАЭЛЯН МАРИНА ФИЛИППОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ШАНДРЫ ПУСТЫРНИКОВОЙ И ШАНДРЫ ЧУЖЕЗЕМНОЙ ФЛОРЫ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА

Специальность 15.00.02 - фармацевтическая химия и

фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск, 2007

003174139

На правах рукописи

МИКАЭЛЯН МАРИНА ФИЛИППОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ШАНДРЫ ПУСТЫРНИКОВОЙ

И ШАНДРЫ ЧУЖЕЗЕМНОЙ ФЛОРЫ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА

Специальность 15 00 02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание >ченой степени кандидата фармацевтических на) к

Пятигорск, 2007

Диссертационная работа выполнена в государственном образовательном

учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Мелик-Гусейнов Валерий Владимирович

Пятигорская государственная фармацевтическая академия

доктор фармацевтических наук, профессор Оганесян Эдуард Тоникович

Пятигорская государственная фармацевтическая академия

кандидат фармагрвтических наук Челова Лариса Владимировна г Пятигорск, Санаторий «Родник»

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 6 MQpfjpX 2007 г в

JL

часов на заседании диссертационного Совета Д 208 069 01 при ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздра-ва» (357532, г Пятигорск, пр Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава»

Автореферат разослан «

3

2007 г

Ученый секретарь диссертационного Совыа доктор фармацевтических наук, профессор

К В Комнанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Одним из отрицательных моментов мирового прогресса явились «заболевания цивилизации» - сердечно-сосудистые, бронхо-легочные, желудочно-кишечные, онкологические и другие - возникающие из-за постоянного воздействия пероксидации на организм человека Кроме того, бурное развитие химико-фармацевтической промышленности привело к увеличению доли синтетических лекарственных препаратов, что в свою очередь, вызвало рост ток-сико-аллергических и хронических заболеваний В связи с этим, в России и за рубежом прослеживается устойчивая тенденция к увеличению потребительского спроса на лекарственные средства растительного происхождения

Возрождение фитотерапии в настоящее время требует пополнения номенклатуры лекарственных средств новыми видами растительного сырья и фитопрепаратами Изучение растений из арсенала народной медицины является одним из источников расширения ассортимента средств, применяемых в аптечной практике

Северный Кавказ располагает большими запасами ценных дикорастущих растений, использующихся в научной медицине Тем не менее, значительные экологические изменения и антропологическое воздействие на природу приводят к резкому сокращению их природных ресурсов, поэтому остро стоит вопрос о расширении сырьевой базы за счет новых видов растений К таковым относится шандра обыкновенная (Marrubium vulgae L ) из семейства яснотковых, которая успешно применяется не только в народной, по и в научной медицине Во многих странах мира ее траву используют для получения различных лекарственных препаратов, основные из которых позиционируют на фармацевтическом рынке как эффективные детоксикационные и регенерирующие средства для лечения печени и желчного пузыря, для профилактики онкологических заболеваний (Regalen) Сиропы, чаи, настойки в качестве отхаркивающих, спазмолитических и пртпвог_\берк\ 1сзпы\ срс icn¡ Свечи таб ictkh насюикидля печения мастопатии и различных гинекологических заболеваний Она является основной субстанцией многих гомеопатических средств и БАД как в России, так и за рубежом

Но в результате бесконтрольной заготовки и длительного экспорта сырья ее

запасы на территории России сильно истощены Однако во флоре Северного Кавказа распространены два дикорастущих вида из этого рода - шандра чужеземная (МаггиЬшш peregпnшn Ь) и ш пустырниковая (МаггиЬшт (еопигокЗеэ Оеэг), трава которых используется в народной медицине при тех же заболеваниях Это дает возможность рассматривать данные виды как дополнительные источники ценного сырья - шандры обыкновенной Широта использования, достаточная сырьевая база, но в тоже время неполная изученность химического состава и отсутствие научных сведений о фармакологическом действии послужили основанием для проведения настоящих исследований

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось научное обоснование возможности расширения сырьевой базы ценного лекарственного растения за счет малоизученных видов рода шандра, произрастающих на Северном Кавказе

Для этого необходимо решить следующие задачи

1 Провести исследования по выявлению мест произрастания шандры чужеземной и ш пустырниковой на территории Ставропольского края и Республики Дагестан и определить их ресурсные возможности

2 Изучить морфолого-анатомическое строение и определить основные диагностические признаки, позволяющие идентифицировать сырье

3 Изучить химический состав основных групп биологически активных веществ выбранных объектов исследования

4 Провести фармакологический скрининг спиртовых и водных извлечений с целью выявления у них наиболее активного действия

5 Выявить оптимальные условия экстрагирования, предложить схему получения настойки и разработать методы ее стандартизации

6 На основании проведенных исследований разработать НД на траву и проект ФСП на настойку

Научная повпзна полученных результатов Впервые определены основные районы распространения ш пустырниковой и ш чужеземной на территории Ставропольского края и Республики Дагестан и выявлен их сырьевой потенциал 4

Изучен химический состав двух видов рода МаггиЬшт флоры Северного Кавказа Впервые идентифицированы терпепоиды (вульгарол, эфирное масло), стероиды (Р-ситостерин), флавоноиды (рутин, кверцетин, гиперозид, тетраметилскутел-ляреин, диосмин), фенолкарбоновые кислоты и их производные (хлорогеновая, кофейная, розмариновая, феруловая), кумарины (умбеллиферон, 4-оксикумарин), проантоцианидины (катехин, эпикатехин), дубильные вещества, аминокислоты, азотистые основания (холин, бетаин), алкалоиды (бетошщин, дефедрин), витамины (аскорбиновая кислота, у-токоферол) Для некоторых из них определено количественное содержание Установлен состав эфирного масла и липофильной фракции

В результате изучения анатомического строения впервые установлены основные диагностические признаки сырья шандры пустырниковой и ш чужеземной

Проведен фармакологический скрининг водных и спиртовых извлечений, выявлены доминирующие антпоксидантная и антигипоксантная активности

Установлено родство химического состава и фармакологической активности, что позволяет рекомендовать траву шандры чужеземной и ш пустырниковой в качестве новых дополнительных сырьевых источников ш обыкновенной

Для стандартизации сырья предложены критерии оценю! качества и идентификации травы обоих видов по содержанию действующих веществ (флавонои-дов), общим числовым показателям, примесям и анатомическим признакам

Разработана технология настойки травы шандры чужеземной на основе спирта этилового 40%, определены нормы качества и сроки годности настойки, предложены методы ее стандартизации

Практическая значимость В результате проведенных исследований двух видов рода шандра расширена сырьевая база лекарственных растений для научной медицины Изучены запасы сырья и определен объем возможных ежегодных заготовок в Ставропольском крае и Республике Дагестан, позволяющие планомерно заготавливать сырье с \чстом охраны приролных рес\рсов

Результаты фармакологического скрининга 5 видов активности позволяют рекомендовать изучаемые объекты для проведения дальнейших исследований Разработаны нормативные показатели качества сырья, инструкции по сбору и

сушке травы, технологическая схема получения настойки и методы ее стандартизации Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования травы двух видов шандры наряду с шандрой обыкновенной, а также в качестве самостоятельного сырья для производства настойки

Уровень внедрения результатов исследования На основании проведенных исследований разработан проект ФСП «Шандры чужеземной настойка», который принят к рассмотрению в Институте стандартизации лекарственных средств ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора (письмо №1485 от 26 02 07 г) Положения, выдвигаемые на защиту

- итоги ресурсных исследований травы шандры пустырниювой и ш чужеземной на территории Ставропольского края и Республики Дап стан,

- морфолого-анатомическое строение и основные диагностические признаки изучаемых видов,

- результаты фотохимического изучения травы шандры чужеземной и ш пустырниковой сем яснотковых,

- результаты фармакологического скрининга,

- условия получения настойки на основе спирта этилового 40% в качестве антиоксидантного и антигипоксантного средства и методы ее стандартизации

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтнчс ских наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Росздрава» (номер государственной регистрации 01200112164)

Апробация полученных результатов Основные положения диссертационной работы доложены на научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии (57 и 62) По материалам диссертации опубяиювдно 11 работ

Объем и структура диссертации Работа изложена на 151 странице машинописного (компьютерного) текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части, включающей 4 главы, обсуадения рез>льта-тов и выводов, списка литературы и приложений, иллюстрирована 37 таблицами, 46 рисунками и графиками, 16 формулами Список литературы состоит из 162 ис-

точников, из них 28 иностранных

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

СЫРЬЕВАЯ БАЗА

Объектом исследования служита надземная часть двух видов рода Marrubium шандра пустырниковая - Marrubium leonuroides Desr и ш чужеземная - Marrubium peregnnum L , семейства Lamiaceae Lindl

Для изучения сырьевой базы выбранных объектов проведены экспедиционные обследования некоторых районов Ставропольского края и Республики Дагестан с учетом экологической приуроченности изучаемых видов Оценку сырьевых запасов проводили по методике ВИЛАР на конкретных зарослях методом учетных площадок по нижнему пределу Результаты определения запасов травы ш пустырни-ковой и ш чужеземной в исследуемых районах представлены в таблицах 1 и 2

Табшца 1 - Запасы травы шаидры ч}лезеинон в исследованных районах

Район Шанрра чужеземная

площадь заросли, (га) урожайность, г/м2 биолог запас, (кг) эксплуат запас, (кг) объем возм ежег загот (еозд-сух), кг

КМВ 2,8 62±3,8 1736 ±208 1389 ± 167 174 ± 21

Предгорный р-н 1 8 59±4,2 1062± 116 850 ± 93 105 ± 12

Буденовский р-н 0 9 32±2,1 288 ±26 260 ± 23 33 ± 3

Республика Дагестан 2,5 84±8 1 2100 ±201 1680 ±161 210 ± 20

Всего 8,0 5186± 551 4179 ±444 522 ± 56

Таблица 2 - Запасы травы шандры п)стырнпковой в исследованных районах

Район Шавдра пустырниковая

площадь заросли, (га) урожайность, гУм2 биолог запас, (кг) эксплуат запас, (кг) объем возм ежег загот (возд-сух),и-

КМВ 1,3 61 ±48 793 ± 87 634 ± 69 80 ±8,1

Минераловодский р-н 1 4 42 ±3 9 588 ±70 471 ± 56 61 ±7,1

Предгорный р-н 1 0 69 ± 6 4 690 ± 64 552 ± 51 69 ± 6,4

Всего 3 7 207U221 1657± 176 210 ± 22

Таким образом, установлено, что объем возможных ежегодных заготовок в пересчете па hoi i\iiiho-c\\oc сырье (коффпцпепт \c\iiikii 1 4) составит - дня травы шандры чужеземной 522 ± 56 кг, для травы ш пустырниковой - 210 ± 22 кг ФНТОХИМНЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ Ш ПУСТЫРНИКОВОЙ Н Ш ЧУЖЕЗЕМНОЙ Изучение терпеиоидов Наличие данного класса соединений в траве изучае-

мых объектов подтверждали реакциями Либермана-Бурхарда, Сальковского, с фурфуролом (в присутствии концентрированной кислоты серной) с ацетоновыми и хлороформными извлечениями (1 10)

В виду отсутствия специфических качественных реакций, позволяющих отличать сескви-, ди- и тритерпены друг от друга, для выявления индивидуальности был выбран метод тонкослойной хроматографии Хроматогрлфирование ацетоновых экстрактов (1 10) проводилось на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей бензол-ацетон (17 3) с последующей обработкой веществ конц кислотой серной при нагревании Полученные значения Rj на фоматограммах при сравнении с данными литературы позволили выделенные соединения отнести к вульгаролу (вещество I - Rf 0,22), перегринолу (II - R{ 0,46), р-ситостерину (III - R] 0,53) Два вещества - IV (Rj 0,82) и V (R, 0,84) - не были идентифицированы Для уточнения полученных данных были изучены масс-спектры элюирован-ных ацетоном пятен на масс-спектрометре «Termo Trays D S Q > (США) Обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения ChemStation фирмы «Agilent» (США) и библиотеки данных SPECMA

Установлено, что вещество I соответствует вульгаролу, II — пе регринолу, III -в-ситостерину, IV - перегринину и V - дигидроперегринину

При анализе суммарной ацетоновой фракции (1 10) методом газо-хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) было подтверждено присутствие обнаруженных соединений, а также не выявленных на хроматограмме фитола и терпеноидов с М м 408 и М м 448, структура которых пока не установлена В этой группе соединений был обнаружен сквален Результаты определения отражены в таблице 3 Для подтверждения структуры выделенного перегринола был изучен его масс-спектр Установлено, что формирование молекулярного иона 150 характеризуется очень высокой интенсивностью

Проведен элементный анализ перегринола С 70,48%, Н 11,45%, Н1кт 1,16, что соответствует общей формуле С20Н38О4

Для доказательства наличия дитерпеноида вульгарола, впервые обнаруженного нами в траве ш чужеземной, был также изучен его масс-спектр, который 8

оказался идентичным таковому стандартного образца вульгарола, полученного из ш обыкновенной

Таблица 3 - Масс-хроматографическая характерпстнкаданных анализа

Время выхода, RT,мин Наименование вещества

шаццра чужеземная шандра пустырниковая

15 199 фитол фитот

15 732 Р-ситостерин Д-ситостерин

17 540 вульгарол —

17 691 перегринол М м = 342 фрагментарный ион 308 перегринол Мм = 342 фрагментарный ион 308

18 880 перегринин -

18 896 — дигидроперегринин

20 249 сквален сквален

20 701 терпеноид М м - 408 —

20 935 — терпеноид М м = 448

Количественное определение терпеноидов проводилось гравиметрически при последовательной обработке смолистых веществ Установлено, что суммарное количество терпеноидов во фракции смолистых веществ составляет -53% у ш пустырниковой и 68% у ш чужеземной от их общей массы (5,85 % и 7,42% соответственно)

Изучение эфирного масла Эфирное масло выделяли методом гидродистилляции Масло светло-желтого цвета и ванильно-лимонного запаха Его компонентный состав определяли методом хромато-масс-спектрометрии (таблица 4)

Табл ица 4 - Компонентный состав эфирного масла

Время удерживания Шандра пустырниковая Шандра чужеземная

10 901 р-бурбонен Р-бурбонен

И 085 ванилин ванилин

11 208 транс-кариоф иллин транс-кариоф иллин

11 269 цис-кариофиллин цис-кариофиллин

11 486 — а-пинен

11 507 а-копасн а-копаен

11 654 гермакрен -с1 гермакрен-с!

11 720 — каларен

11 877 8-ка чинен 6-качинен

12 022 — а муурочен

12 440 кариофиллин оксид кариофиллин оксид

12 530 — камфен

Определено, что компонентный состав эфирного масла довольно разнообра-

зеп, в нем наиболее широко представлены кариофиллин и его изомеры Кроме того, в эфирном масле обоих растений найден ванилин

Изучение полмфенолыюго состава Выделение полифенолов осуществлялось экстракцией сырья спиртом этиловым 50% Дальнейшее исследование проводилось методом ВЭЖХ (хроматограф «Милихром А-02») в градиентном режиме с детекцией при длинах волн 260, 280, 240, 300 и 360 нм Обращенно-фазовый сорбент - ProntoSil 120-5С AQ Подвижная фаза эшоент А - 0,1% раствор кислоты трифторуксусной, элгоент Б — ацетонитрил На хроматограмме и ¡влечения, соответствующего ш чужеземной, наблюдалось 33 пика, ш пустырниговой - 29 пиков Однако достоверно было идентифицировано только 11 соединений (таблица 5)

Таблица 5- Полифенольный состав травы исследуемых объектов

№ Наименование вещэсгва Шаццра пустырни новая Шачцра чужеземная

время удерживания (мин) площадь пика (мкл) время удерживания (мин) площадь пика (мкл)

1 Хлорогеновая к-та 7,54 22 345 7 69 9,568

2 Кофейная к-та 8,94 17 259 9,18 19,768

3 Розмариновая к-та 9,22 22 050 9,30 9,108

4 Умбеллиферон 12,02 27,825 12,00 55,343

5 4-оксикумарин 12,34 6 317 12,34 10,620

6 Неидент кумарин 12.73 20,184 12,73 32,612

7 Феруловая к-та 13 17 11 677 13,19 15,749

8 Кверцетин 14,44 1 1 604 15,29 13,750

9 Рутин 15,31 8 701 15,73 8,855

10 Гиперозид 15 65 5,333 15,73 8,425

11 Неидент флавоноид 16 26 16,145 16,42 16 122

12 Неидент флавоноид - - 16,46 13,190

13 Катехин 22,85 9,134 22,91 11,094

14 Эпикатехин 23,57 2,771 23,63 3,440

15 Неидентифиц вещество (предпол эпигаллокатехмн) 24 17 1 906 24 18 2,177

На хроматограммах извлечений был также выявлен пик, характеризующийся временем удерживания 1,98 мин (площадь пика- 137,489)дляш пустырнико-вой, и 2,10 мин (площадь пика - 69,302) для ш чужеземной и идентифицированный нами как аскорбиновая кислота

Состав флавоноидов был изучен хроматографически с использованием хро-могенных реагентов Установлено, что вещество с 1Ц 0,30 являете я кверцетином (3,5,7,3',4'-пентаоксифлавон), с Яг0,64,0,74 - 3-гликозидами юзерцетина - ру-тином и гиперозидом соответственно, с 0,87 - 3,5,7,4' тетраме гоксифлавоном

или тетраметилскутелляреином, с Я, 0,92- диосмином

Количественное определение флавоноидов проводили спектрофотометри-чески по методике, описанной в ГФ XI, в основу которой положена реакция комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом Обнаружены максимумы поглощений спиртовых извлечений, которые находятся в области 405410 нм и совпадают с максимумом поглощения рутина Содержание флавоноидов в пересчете на рутин в траве ш чужеземной составляет 1,2±0,04 %, а в траве ш пустырниковой - 0,7±0,04%

Нами также установлено количественное содержание флавоноидов в 4 сериях образцов травы ш чужеземной, собранных в различных ценопопуляциях (Ставропольский край и Республика Дагестан) Статистически обработанные результаты из шести определений отражены в таблице 6

Таблица 6 - Количественное содержание флавоноидов в траве шандры ч)леземной различных районов произрастания

Район Содержание флавоноидов, % Метрологические характеристики

КМВ 1 19 Б=0 03 1 Бх=0 007 Дх=0 03 е%=2 75

Предгорный р-н 1 10 Б=0 026, Эх=0 010 Лх-0 03, е%=2 53

Буденовский р-н 0 83 Ь=0 019 5х-0 008 Дх-0 02, е%-2,39

Республика Дагестан 1 39 Б-О 028 Эх=0 011 Лх=0 03 г%=2 11

Таким образом, содержание флавоноидов в пересчете на рутин в траве ш чужеземной колеблется от 0,83% (Буденновский район) до 1,39% (республика Дагестан)

Для установления оптимальных сроков сбора сырья была выявлена динамика накопления флавоноидов по фазам вегетации в надземной части ш чужеземной Анализу подвергались 5 серий образцов, собранных в различных местах районы КМВ {Пятигорск, ст Белый Уголь), окрестности г Буденновска, станица Суворовская (Предгорный р-н), Ачикулакское лесничество (Республика Дагестан) Опретсчсио что сотер/капие фтапопощов тостнгает максимума I! псрпот бутонизации и начала цветения, снижается во время плодоношения Выявленная динамика накопления флавоноидов по различным органам растений в фазу бутонизации показала, что максимальное количество флавоноидов накапливается в соц-

ветиях и листьях, стебли же, несмотря на значительную массу и размер, оказались с минимальной продуктивностью Данные исследований приведен! 1 в таблицах 7,8 Таблица 7 - Динамика накопления флавоноидов по фазам вегетации (%)

Вид Начало цветения Бутонизация Цветение Начало плодоношения Конец плодоношения

Шандра чужеземная 0 73± 0,03 1,21±0 04 1 10±0,03 0 78±0 01 0 65±0 03

Таблица 8 - Динамика накопления

Вид | Соцветия Листья Стебли

Шандра чужеземная | 1 36±0 04 1 2±0 04 0 06±0 001

Таким образом, рекомендуется заготавливать только верхушечную часть растений (20-25 см) с соцветиями, исключая грубые стебли толщиной более 5 мм, в фазу бутонизации и начала цветения

Изучение дубильных веществ С помощью качественных реакций обнаружено присутствие дубильных веществ, относящихся к группе конденсированных Содержание дубильных веществ в сырье определяли фармакопейным пер-манганатометрическим методом в пересчете па танин в траве ш чужеземной -5,22 ± 0,18%, а в траве ш пустырниковой - 4,0 ± 0,15%

Изучение азотистых основании Качественными реакциями с фосфорно-вольфрамовой кислотой и реактивом Манделина установлено г аличие азотистых оснований бетаинной природы Для идентификации холина и бетаина использовали метод бумажной хроматографии в системе н-бутанол—уксусная кислота-вода (4 1 5) После проявления хроматограммы реактивом Драгендорфа в обоих случаях проявились темно-оранжевые и оранжевые зоны с ЯГ 0,17, ЯГ 0,20, ЯГ 0,47 и ЯГ 0,57 (последняя у ш пустырниковой), которые совпадают с известными значениями (±0,01) Эти соединения идентифицированы нами как бетаин (ЯГ0,17), холин (ЯГ0,20), бетоницин (ЯГ0,47) и только в траве ш пустырниковой предположительно стахидрин (ЯГ 0,57)

Определение суммы азотистых оснований проводили фотоколориметричес-ки по методике, модифицированной Д А Муравьевой, К О Гаспарян, при длине волны 400 нм Сумма азотистых оснований составляет 4,31±0,05% в траве ш пустырниковой и 3,54±0,08% - в траве ш чужеземной Это подтверждает выво-12

ды о характерном высоком содержании азотистых оснований (до 5%) в роде МаггиЬшт (подсемейство МаггиЫеае Епс11 )

Обнаружение алкалоидов для получения более достоверного результата осуществлялось в извлечешш, полученном экстракцией сырья подкисленной водой С 3% раствором кислоты фосфорно-вольфрамовой и 1% раствором кислоты кремне-вольфрамовой появлялась слабая опалесценция При добавлении общеалкалоидных реактивов характерных осадков не наблюдалось, однако отмечалось легкое помутнение, что может свидетельствовать о присутствии следовых количеств алкалоидов

При анализе суммарной ацетоновой фракции методом хромато-масс-спект-рометрии на капиллярной колонке с метилсшшконовой привитой фазой в обоих видах шандры обнаруживался характерный пик со временем выхода 12,144 мин, что соответствует алкалоиду бетоницину, а у ш пустырниковой наблюдался пик, время выхода которого - 9,803 мин, идентифицированный как алкалоид дефед-рин Идентификацию веществ по времени удерживания осуществляли с помощью компьютерной базы данных масс-спектров

Изучение аминокислот проводилось с помощью аминокислотного анализатора марки АА-33 (Чехия) в водном извлечении В траве ш пустырниковой найдено 14, в траве ш чужеземной -15 аминокислот, а их содержание находится в пределах от 0,4 до 4,6 % Установлено, что 63-66% от общего числа составляют незаменимые и полузаменимые аминокислоты, из которых доминируют аргинин, лейцин (свободная), валин, изолейцин (свободная) Из заменимых преобладает глутаминовая кислота Количественное содержание индивидуальных аминокислот значительно выше в траве ш чужеземной

Лппофильную фракцию получали методом мацерации, используя в качестве экстрагента хлороформно-метанольную смесь (метод Фолча) в соотношении 1 2 Экстракцию проводили троекратно по 30 минут Объединенные фракции промыва пи несколько раз воюй очищенной дгтя лдатепня водорастворимых компонентов Полученную смесь анализировали методом ГХ-МС (таблица 9)

Результат проведенного анализа говорит о широком номенклатурном составе липофилыюй фракции, в состав которой входят высшие жирные кислоты,

спирты, сквален и у-токоферол

Таблица 9 - Состав липофнлыюн фракции исследуемых видов сырья

Вещества Время удерж., мин (ш. пустырниковая) % от суммы Время удерж., мин (ш чужеземная) % от суммы

Миристиновая кислота 13 31 3 3 - -

Метилгпльмитат 14 20 4 7 1421 2 4

Пальмитиновая кислота 14 20-14 60 7,9 1444 6 1

Этилпальчитат - - 14 56 3,4

Линоленовая кислота - . 15 36 7 1

6 9,12-октадекатриеновая кислота (гамма-линолейновая) 15 42 9 2 1542 8 3

9 12,15-эйкозатриеновая к-та 15 47 4,1 - -

Трикозан 16 088 6 2 16 088 2 7

Эйкозановая кислота 16 556 3,9 - 2 1

Деоксикерхинон - - 16 955 2 1

Пентакозан 17 27 4 3 1727 1,8

Гептакозан 18 896 3,1 1888 2 7

Сквален 20 246 21 7 20 21 27 2

Нонокозан 21 286 6 7 21 22 44

у-токоферол 24 478 19,6 24 455 29 7

Унтриаконтан 24 929 5 3 - -

Всего 100 100

Изучение элементного состава проводилось методом полутличественного спектрального анализа озоленных проб на спектрофотографе ИСП-30 Установлено, что из 30 (ш пустырниковая) и 29 элементов (ш чужеземная) основное количество приходится на эсссенциальные макроэлементы - калий, магний, кальций, натрий Сравнительные данные о биологически активных соединениях, по результатам проведенных исследований, двух изучаемых видов и официально применяемой ш обыкновенной представлены в таблице 10

Таблица 10-Содержание БАВ(%) в изучаемых объектах

БАВ Ш пустырниковая Ш чужеземная 111 обыкновенная

Азотистые основания 4 4* 3 4* 0 5-2

Аминокислоты 31 03* 11 82* данные отсут

Алкалоиды следы* следы* 0,04-0,05

Эфирное масло 0 06 0 1 0 04-0 2

Дитерпены 1 32 2 74 0 36-2 54

Тритерпеноиды не обнаруж не обнаруж 0,12

Стероиды (Р-ситостерин) +* +* 0,12-0,17

Фенолкарбоновые к-ты 1 23* 1,38* 4

Флавоноиды 0 7 1 2 1,12

К\мчринн 4* +* 4

Дебильные вещества 4 0* 5 2* 2 63-6 5

Витамины (к-та аскорбиновая у-токоферол) + * +* к-та аскорбиновая

Примечание * - впервые обнаруженные соединения, + - колич содержание не определялось

Таким образом, иами установлено химическое родство исследуемых видов шандры и ш обыкновенной, так как качественный состав соединений идентичен, хотя в количественном содержании некоторых из них имеются отклонения СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТРАВЫ ИЗУЧАЕМЫХ ОБЪЕКТОВ

С целью стандартизации определены числовые показатели и нормы качества сырья обоих видов рода шандра Результаты стандартизации показаны в таблице 11

Таблица 11 - Нормы качества сырья изучаемых объектов

Показатель Ш чужеземная Ш пустырниковая

Содержание флавоноидов,% не менее 0 8 % не менее 0,6 %

Влажность не более 10 % не более 10 %

Зола общая не более 10 % не более 10 %

Зола не растворимая в 10% НС) не более 2 % не более 2 %

Экстрактивные вещества (спирт этиловый 40%) не менее 24% не менее 22%

Органические примеси не более 1 % не более 1 %

Минеральные примеси не более 1 % не более 1%

Частицы проходящие сквозь сито 7 мм не более 5 % не более 5 %

Испытания микробиологической чистоты изучаемых видов сырья проводили в соответствии с требованиями ГФ XI, вып 2, с 193 и Изменения № 3 "Методы микробиологического контроля лекарственных средств" Сырье соответствует категории 4 а

Кроме того, было проведено подробное морфолого-анатомическое изучение травы ш чужеземной и ш пустырниковой, позволившее выявить основные диагностические признаки сырья, которые отображены на рисунках 1-6

Основные диагностические элементы эпидерма состоит из одного слоя клеток со слабоизвилистыми антиклинальными стенками Устьиц значительно больше на нижней эпидерме, что говорит о ксерофитности растений Устьич-ный аппарат аномоцитного типа Железки типа яснотковых с 4-х-клеточной головкой и одноклеточной ножкой Обнаружены очень характерные трихомы -мутовчато-ветвистые с одноклеточной ножкой и мутовчато-ветвистые на подставке отпа из веточек удишена и имеет 2 метки Кроме того прис\тств\тот звездчатые волоски с одной базалыюй и многочисленными апикальными клетками, а также простые одноклеточные и крупные однорядные двуклеточные острооканчивающиеся волоски

Рисунок 1- Эпидерма листа ш. чужеземной

1 - основные клетки эпидермы; 2 - мутовчато-ветвистый волосок на одноклеточной ножке; 3 - простой волосок; 4 — устьице; 5 - основные клетки эпидермы по жилкам

I

Рисунок 2- Эпидерма листа ш. чужеземной

1 - основные клетки эпидермы; 2 - звездчатый волосок; 3 - простой одноклеточный волосок; 4 - простой двухклеточный; 5 - основные клетки эпидермы по жилкам; 6 - устьице; 7 - железка

Рисунок 3 -Черешок ш. чужеземной

1 - эпидерма; 2 - колленхима, 3 - флоэма 4 - ксилема; 5 - склеренхима; 6 - паренхима, 7 - звездчатый волосок,8 - простой волосок; 9 - железка.

Рисунок 5- Стебель ш. чужеземной I — покровная ткань; П - коря; Ш - центральный цилиндр

Рисунок 6 - Стебель ш. пустырниковой

I — покровная ткань; В - кора; Ш — центральный цилиндр

Рисунок 4 - Черешок ш. пустырниковой

1 - эпидерма; 2 - колленхима, 3 - флоэма; 4 - ксилема; 5 - склеренхима; б - паренхима; 7 - звездчатый волосок; 8 -мутовчато-ветвистый на подставке

Черешок листа ш чужеземной на срезе имеет вогнутую форму, черешок ш пустырниковой более выпуклый Два центральных сосудисто-волокнистых пучка ш чужеземной почти слились, проводящая система коллатерального типа, тогда как у ш пустырниковой пучки близко примыкают друг к другу и являются агрегатными коллатеральными

Перициклическая склеренхима стебля ш чужеземной на поперечном срезе представлена одиночными или группами по 2-3 клетки склереидами, у ш пустырниковой она имеет вид прерывистого кольца Ксилема ш чужеземной в 5 раз, аш пустырниковой - в 2 раза больше флоэмы Сердцевина ш пустырниковой занимает около 50 % объема стебля

Описанные признаки являются наиболее выраженными и рекомендуются для проведения диагностики с целью установления подлинности сырья

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЙ СКРИНИНГИ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ Для фармакологических испытаний использовали водные и спиртовые извлечения (40% и 70% этанол)

Изучение острой токсичности полученных извлечений проводили по таким показателям как летальность, двигательная активность, дыхание, наличие судорог, координация движений, реакция на раздражители, тонус скелетной мускулатуры, состояние кожных покровов, шерсти и окраски видимых слизистых оболочек, потребление воды и пищи, масса тела животных

В ходе эксперимента технически возможной для перорального введения оказалась доза - 6000 мг/кг Поскольку при этом гибели животных не наблюдалось, то это позволило отнести анализируемые извлечения к классу «практически нетоксичных» (>5000 мг/кг при введении рег об)

На модели хлоркальциевой аритмии (белые крысы-самки массой 180-200 г линии Вистар) водное извлечение травы ш пустырниковой в дозе 100 мг/кг при однократном введении п 2 раза \вечпчппает протот/китсчьность жизни животных по сравнению с контролем Семидневное профилактическое введение в дозе 100 мг/кг, увеличивает продолжительность жизни животных в 5,3 раза Курсовое профилактическое введение водного извлечения из ш пустырниковой в дозе 100

мг/кг при моделированной строфантиновой аритмии повышает выживаемость экспериментальных животных на 50%

Диуретическим эффектом обладает водное извлечение ш чужеземной в дозе 50 мг/кг с максимумом действия на 2-3 часе после введения белым беспородным крысам - самкам массой 200,0 г Эффективность определяли по интенсивности диуреза Конечный объем мочи достоверно превышал контрольный показатель на 69%

Спиртовое (70%) извлечение из ш чужеземной обладает выраженной желчегонной активностью в дозе 25 мг/кг в течение всего времени наблюдения с максимумом действия на 2 часе (42%) после стимуляции экстрактом Для эксперимента использовались наркотизированные беспородные белые крысы — самцы Растворы (0,25%, 0,5% и 1%) водных извлечений из ш пустырниковой и ш чужеземной обладают выраженной дозозависимой формой антиоксидантного действия Из спиртовых — наибольшим эффектом обладают извлечения из ш чужеземной, полученные на основе спирта этилового 40% Исследования проводили in vitro по степени накопления малонового диальдегида и на модели эрит-роцитарного гемолиза Антиоксидантную активность ш чужеземной и ш пустырниковой сопоставляли с активностью стандартного антиоксиданта и антиги-поксанта - 1% раствора эмоксипина, взятого в эквивалентных количествах (0,2 мл 1% раствора) Результаты эксперимента приведены в таблице 12

Таблица 12 - Антиоксидантная активность по отношению к стандартному образцу-эмоксипину

Исследаемое извлечение (п=12) Показатель экстинции М+т % снижения экстинции к контролю

Контроль 0,27±0 006 -

1% р-р эмоксипина 0 06±0 003 77

1% водный р-рш чужеземной 0 005±0 0002 98

1% водный р-р ш пустырниковой 0 005±0 0002 98

1% р-р спирт извл (40%) ш чужеземной 0 004±0,0001 99

1% р-р спирт извл (40%) ш п\стырпиковой 0 03±0 0006 89

Из результатов эксперимента видно, что 1% растворы водных и спиртовых (40%) извлечений ш чужеземной и ш пустырниковой в адекватных дозах и условиях эффективнее стандартного образца — эмоксипина в 1,3 и 1,2 раза соответственно

Изучение антигипоксической активности на моделях острой гипобарической гипоксии (ОГТП) показало, что все извлечения, на основе спирта этилового различ-18

пых концентраций, способствуют увел тчению выживаемости животных (белые мыши - самцы, 18-20 г) при ОГГП, а наиболее выраженное действие оказывает спиртовое извлечение (40%), увеличивая время жизни мышей в 2 раза (198%) при однократном и в 6,1 раза при семидневном профилактическом введении по сравнению с контролем, то есть, значительно повышая устойчивость организма животных к гипоксии По антигипоксической активности данное извлечение превышает действие эмок-снпина в 1,6 раза Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют, что применение извлечения из ш чужеземной, полученного с помощью спирта этилового 40%, способствует увеличению резистентности организма животных к оксидант-ному и гипоксическому факторам и усиливает его адаптогенные свойства РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ, АНАЛИЗ II СТАНДАРТИЗАЦИЯ НАСТОЙКИ На основании проведенного фармакологического скрининга и выявленного доминирующего эффекта выбор остановили на настойке шандры чужеземной 40%

Для теоретического обоснования оптимальных условий проведения экстракции, расчета эффективности процесса, прогнозирования и нормирования качества настойки, нами экспериментально определены технологические показатели сырья, а именно - коэффициент поглощения сырья (Кп), коэффициент образования внутреннего сока (К) и коэффициент увеличения объема при растворении экстрактивных веществ (Х) Результаты определения Кп, К, Ъ отражены в таблице 13

Таблица 13 - Техно югические показатели качества травы шандры (п=6)

Коэффициент Шандра чужеземная

К см7г 2 51±0 09

Кп, см7г 2 20±0,11

Ъ см*/г 0 40±0 03

Поскольку сырье не содержит сильнодействующих веществ, то соотношение «сырье экстрагент» классическое - 1 5 Выбор метода дробной мацерации с периодическим сливом (способ многоступенчатой прямоточной экстракции) обосновывали тем что помимо ряда преим\ щсств (максимальное истощение сырья в результате неоднократной обработки сырья чистым экстрагентом), он является наиболее часто используемым в условиях производства

Экспериментально установлено, что увеличение числа ступеней экстракции

до п=4 при у=5 приводило к рост) эффективности экстрагирования до 86,7%, при этом концентрация сухих веществ была достаточно высока - 4,27%

Экстрагирование проводили на одном перколяторе Первый слив осуществляли через 24 часа, а затем через каждые 6 часов сливали вторую, третью и четвертую порции готовой продукции Объединенные извлечения отстаивали не менее 2 суток при температуре 10"С, фильтровали На основании полученных данных нами предложена общая технологическая схема получения настойки ш чужеземной на основе спирта этилового 40% в условиях производства Установлены основные параметры настойки Оценку качества полученной настойки в 5 сериях проводили по показателям, рекомендованным ГФ XI изд внешнему виду, содержанию спирта этилового, сухому остатку, содержанию действующих веществ (флавоноидов), определению тяжелых металлов (таблица 14)

Таблица 14-Норны качества настойки шандры чужеземной

Показатель качества Значение, %

Сухой остаток 4,27 н 0 11

Содержание спирта этилового 36 07+ 1 02

Содержание флавоноидов 0 ЗП 001

Содержание тяжелых металлов не бопее 0 001

Предложены методики стандартизации для определения основньтх действующих веществ в настойке 1) проба Chinoda на присутствие флавоноидов и спе ктрофотометри-ческое определение количественного содержания их в пересчете на рутин (0,31±0,01%) Валидационную оценку методики проводили в соответствии с проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов» Установлено, что линейная зависимость оптической плотности от концентрации флавоноидов в растворе наблюдается в пределах от 0,001 до 0,0031 г/мл

Воспроизводимость метода оценивали по величине систематической ошибки (она составила 0,35), сходимости двух параллельных определЕ ний (результат удовлетворительный), числу параллельных определений (при относительной ошибке методики 2 42 % результат составил 0 87) Таким образом предложенная методика количественного определения флавоноидов в настойке шандры методом спектрофотометрии отличается достаточной точностью, высокой чувствительностью и воспроизводимостью 20

2) метод ВЭЖХ — качественное и количественное определение ванилина, которого должно быть не менее 34,24 мг/%

Изучение стабильности настойки проводили в естественных условиях температура 20°С, склянки из бесцветного прозрачного стекла На хранение закладывалось 6 серий настойки При наблюдении оценивали - соответствие описанию, качественное п количественное содержание действующих веществ Установлен срок годности, равный 2 годам По испытаниям на микробиологическую чистоту, настойка соответствует требованиям ГФ XI изд, вып 2, с 193 и Изменения № 3 от 19 06 03 - категории ЗБ

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1 Выявлены места произрастания и определены ресурсные возможности изучаемых растений объем возможных ежегодных заготовок в обследованных районах составляет для травы ш чужеземной - 522±56 кг, для травы ш пустыр-никовой -210±22 кг воздушно-сухого сырья

2 В результате химического изучения травы ш пустырниковой и ш чужеземной идентифицированы дитерпеноиды (вульгарол, перегринол, перегринин, дигидроперегринип), стероиды (Р-ситостерин), фенолкарбоновые кислоты и их производные (хлорогеновая, кофейная, розмариновая и феруловая), кумарины (кумаровая кислота, 4-оксикумарин, умбеллиферон), флавоноиды (рутин, кверце-тин, гиперозид, тетраметилскутелляреин, диосмин), проантоцианидины (катехин, эпикатехин, эпигаллокатехин), дубильные вещества (преимущественно конденсированной группы), азотистые основания (бетаин, холин), алкалоиды (дефедрин и бетоницин), аминокислоты, витамины (аскорбиновая кислота, у-токоферол) Изучен компонентный состав эфирного масла у шандры пустырниковой обнаружено 8 соединений, у ш чужеземной — 12, которые в основном представлены кариофил-лином и его изомерами В липофильной фракции найдены сквален у-токоферол

3 Определено количественное содержание в траве ш пустырниковой и ш чужеземной соответственно смолистых веществ (5 85% 7 42%) нзнихтерпепоитов (3,12%, 5,10%), флавоноидов (0,62-0,73%, 0,83-1,39%), фенолкарбоновых кислот (1,23%, 1,38%), проантоцианидинов (1,65%, 2,46%), дубильных веществ (4,0%, 5,26%), аминокислот (11,81%, 36,82%), азотистых оснований (4,31%, 3,51%), мак-

ро- и микроэлементов (8,73%, 5, 99%) Определены товароведческие показатели травы шандры пустырниковой и ш чужеземной влажность соответственно (7,799,11% и 6,78-9,02%), зола общая (8,89-9,46% и 6,98-8,21%), зола, нерастворимая в 10%растворе кислоты хлористоводородной (1,21-1,45%и 1,12-1,31%)

4 Изучена динамика накопления флавоноидов по органам и фазам развития растений Максимальное их количество наблюдается в соцветиях (1,36%) и листьях (1,2%) в фазу бутонизации (1,21%) и начала цветения (1,10%)

5 Проведены подробные морфолого-анатомические исследования и установлены основные диагностические признаки сырья мутовчато-ветвистые, звездчатые и простые волоски, анамоцитный тип устьиц, 4-х клеточные железки, форма среза и проводящая система черешков, перициклическая склеренхима на поперечном срезе стебля

6 По результатам фармакологического скрининга установлены следующие виды активности антиаритмическая, антиоксидантная, антигипоксическая, желчегонная, диуретическая Доминирующими являются антиоксидантное и анти-гипоксическое действия, превышающие таковое у лекарственного препарата эмоксипин в 1,3 и 1,6 раза соответственно

7 Предложены оптимальные условия экстрагирования - соотношение 1 5, число ступеней экстракции - 4 Разработана технологическая схема получения настойки (40%) из травы шандры чужеземной и методы ее стандартизации, а также проект ФСП «Настойка шандры чужеземной», который утвержден предприятием-изготовителем (ОАО «Марбиофарм» г Йошкар-Ола)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Морфолого-анагомическэе шучение шандры пустырниковой и шандры чужеземной // Регион конф по фармации, фармакологии и подготовке кадров (57, 2002, Пятигорск) материалы -Пятигорск ПятГФА, 2002 - С 23-24 (Соавтор Челомбитько В А)

2 Элементный состав шандры пустырниковой и шандры чужеземной // Регион конф по фармации, фармакологии и подготовке кадров (57 2002 Пятигорск) материалы -Пятигорск ПятГФА, 2002 - С 24-25 (Соавтор Челом битько В А )

3 Изучение элементного состава шандры пустырниковой и шандры чужеземной // Владикавказский медию-биол вестник-(гВладикавказ)-2005-Т5-Еып 9-10-С 195 22

4 Фармакологическое исследование суммарного экстракта из шандры пустыр-никовой и шандры чужеземной//Человек и лекарство тез докл 13 Рос нац конгр 3-7 апр 2006 г-М, 2006 - С 558 (Соавторы Крикова А В , Мелик-Гусейнов В В )

5 Изучение некоторых растений рода Marrubium и перспектива их дальнейшего использования // Новые технологии в медицине материалы науч -практ конф (3, 2006, Махачкала) - Махачкала ДГМА,2006-С 291-294 (Соавтор Мелик-Гусейнов В В )

6 Изучение антиаритмического действия суммарных препаратов, полученных из шандры пустырниковой и шандры чужеземной (семейство Губоцветные) // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - 2006 -№ 4 -С 25-28 (Соавторы Крикова А В , Мелик-Гусейнов В В )

7 Изучение аминокислотного состава травы шандры пустырниковой и шандры чужеземной (семейство Губоцветные) // Вестник Воронежского гос ун-та Серия химия, биология, фармация - 2006 -№2-С 313-314 (Соавтор Мелик-Гусейнов В В )

8 Сравнительная морфолого-анатомическая характеристика двух видов рода шандра (Marrubium-сем Lamiaceae) // Актуалыи питания фармацевтичио1 та ме-ДИЧН01 науки та практики - Збфник наукових статей -Запормокя Видавництво ЗДМУ, 2006 - Вип 15, Т1 -С 253-254 (Соавторы Елисеева Л M , Мелик-Гусейнов В В )

9 Исследования антиоксида]mюго и антиаритмнческого действия суммарных экстрактов из шандры пустырниковой и ш чужеземной (Сем Lamiaceae) // Науюво-тех-н1чний прогрес 1 оптим1защя технолопчних процесш створення лнсарських препаратш матер1али М1жнар науково-практ конф (1, 6-7 квггня 2006 р ,Тернопшь) -Терношль Укрмедкнига, 2006-С 161-162 (Соавторы Реккандт С А, Мелик-Гусейнов В В )

10 Изучение желчегонного действия водных и спиртовых экстрактов из шацдры пустырниковой и шандры чужеземной (семейство Lamiaceae) // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр Пятигорск.ГФА -Выл 62 -Пя-тигорск,2007-С 506-507 (Соавторы РеккшщтСА,КульбеювЕФ,Мел1ж-ГусейновВВ)

11 Изучение мочегонного тенствия с\\и\ экстрактов из шандры ч\жезем-ной и шандры пустырниковой (семейство Lamiaceae) // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб иауч тр Пятигорск Г-ФА-Вып62-Пятигорск,2007-С 507-508 (Соавторы РеккацдгСА,Мелик-ГусейновВВ)

МИКАЭЛЯН МАРИНА ФИЛИППОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ШАНДРЫ ПУСТЫРНИКОВОЙ И ШАНДРЫ ЧУЖЕЗЕМНОЙ ФЛОРЫ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати_Формат бумаги 60x84 1/16

Бумага книжно-журнальная Печать ротапринтная Уел печ л 1,0

Тираж 100 экз Заказ №_

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, г Пятигорск, пр Калинина, 11)