Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Экспериментальная фармакокинетика фенотропила

На правах рукописи

АНТОНОВА Марита Ивановна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОКИНЕТИКА ФЕНОТРОПИЛА

15.00.02 - фармацевтическая хпмпя, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Московском государственном медико-стоматологическом университете.

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор Берлянд Александр Семенович Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Попков Владимир Андреевич Доктор химических наук, профессор Пржевальский Николай Михайлович

Ведущая организация:

Институт фармакологии РАМН

Защита состоится » _ 2005 г. в /? час. на

заседании диссертационного совета Д212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, у п. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

Автореферат разослан « » ¿¿Z&'f 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д212.203.13 кандидат фармацевтических наук,

доцент

Т.П.Лагуткина

МФ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Исследования в области синтеза биологически активных веществ и создание на их основе новых лекарственных препаратов приобретает всё большее значение. Важное место занимает исследование психофармакологических средств, так как в последние годы по данным Всемирной организации здравоохранения процент больных, страдающих клиническими формами душевных расстройств, продолжает возрастать.

Широкое распространение получили психотропные препараты нового класса, оказывающие активирующее влияние на интегральные механизмы мозга, улучшающие память и умственную деятельность, - ноотропы. Эти препараты повышают устойчивость мозга к агрессивным воздействиям, улучшают кортико-субкортикальные связи.

Среди них наибольшее применение получил пирацетам (2-оксо-1-пирролидинацетамид):

/>

НуМ-С-СНг-Ы

Однако, существующие препараты этого класса недостаточно эффективны при целом ряде заболеваний, поэтому поиск новых ноотропных препаратов весьма актуален.

СбН,

В ЛГПИ было синтезировано новое циклическое производное гамма аминомасляной кислоты (ГАМК) — фенотропил (Ы-карбамоил-метил-4-фенил-2-пирролидон), обладающее ноотропной и психостимулирующей активностью, значительно превышающей аналогичную активность известных ноотропов, в том числе и пирацетама.

Комплекс исследований, которые необходимо провести при создании нового синтетического лекарственного препарата включает множество этапов, прежде чем лекарственное средство будет допущено к клиническим испытаниям. Неотъемлемой частью доклинических исследований потенциального препарата является всестороннее изучение его фа^макокинетики. Данные фармакокинетических исследований во многом способствуют лучшему пониманию механизма действия лекарственных препаратов.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ |

внклиетЕм I

\

Следует подчеркнуть, что проведение этого комплекса работ невозможно без использования современных физико-химических методов анализа веществ таких, как газожидкостная хроматография (ГЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ) и др. Применение этих методов позволяет решать самые сложные задачи, возникающие при проведении фармакокинетических исследований.

Цель и задачи исследования.

Разработать высокоэффективную специфическую методику определения нового оригинального ноотропного лекарственного средства в биологических жидкостях и с помощью этой методики изучить экспериментальную фармакокинетику фенотропила, в том числе распределение по органам, биодоступность лекарственных форм, метаболизм.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:

1. Разработка высокочувствительной и специфической методики количественного определения фенотропила в биообъектах.

2. Исследование экспериментальной фармакокинетики фенотропила в экспериментах на крысах при внутрисосудистом и внесосудистых способах введения.

3. Изучение экспериментальной фармакокинетики фенотропила на кроликах при внутрисосудистом и пероральном введении.

4. Изучение метаболизма фенотропила.

5. Изучение биодоступности таблеток фенотропила.

Научная новизна.

Впервые разработан газохроматографический способ определения микроколичеств фенотропила в биологических жидкостях, позволяющий провести исследования по изучению фармакокинетики препарата у различных видов животных (крысы, кролики).

Впервые исследована фармакокинетика фенотропила в организме экспериментальных животных (крысы, кролики), проведена оценка ■ биологической доступности фенотропила при различных путях его введения.

Впервые установлено, что фенотропил в организме практически не метаболизирует при пероральном введении крысам.

Впервые установлена биологическая доступность таблеток фенотропила в эксперименте in vivo и определена скорость высвобождения действующего начала из таблеток в эксперименте in vitro.

Впервые изучено распределение фенотропила по органам при пероральном введении.

Практическая значимость работы.

Разработанный способ количественного определения фенотропила в плазме крови и моче дает возможность определять микрограммовые количества фенотропила в биологических жидкостях, что особенно важно для изучения как экспериментальной, так и клинической фармакокинетики препарата.

Способ количественного определения фенотропила в биологических жидкостях основан на использовании отечественного оборудования, отличается простотой и высокой чувствительностью, что делает его доступным для практического использования в условиях клинического исследования.

Установленный факт более высокой биодоступности фенотропила при пероральном введении по сравнению с внутримышечным позволяет дать рекомендации о перспективности использования в качестве лекарственной формы таблеток фенотропила.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены

на:

- Межкафедральных конференциях кафедр медико-биологического профиля МГМСУ;

- XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2004 г.);

Публикации.

По результатам исследований опубликовано 8 работ.

На защиту выносятся:

- Методика количественного определения фенотропила в биообъектах.

- Результаты изучения экспериментальной фармакокинетики фенотропила у крыс при различных способах его введения.

- Результаты изучения распределения фенотропила по органам крыс при его пероральном введении.

- Результаты изучения экспериментальной фармакокинетики фенотропила у кроликов при различных способах его введения.

- Результаты изучения метаболизма фенотропила у крыс при его пероральном введении.

- Изучение биодоступности таблеток фенотропила в экспериментах in vivo и in vitro.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальной части, обсуждения результатов, заключения, списка литературы из 125 наименований, из них 45 зарубежных, иллюстрирована 29 таблицами и 28 рисунками.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

Первая глава представляет собой обзор отечественной и зарубежной литературы, касающийся изучения фармакологических свойств ноотропных препаратов, методов физико-химического анализа лекарственных средств в биологических жидкостях, фармакокинетических исследований некоторых ноотропных лекарственных средств.

Во второй главе (экспериментальной части) описаны материалы и методы исследований, дано описание синтеза фенотропила, проводится подробная характеристика объектов, методов исследования, приборного оснащения, используемого в процессе работы.

В третьей главе представлены результаты разрабо1ки методики газохроматографического определения содержания фенотропила в биожидкости и органах экспериментальных животных.

В четвёртой главе приведены результаты исследования фармакокинетики фенотропила у крыс при различных способах введения (внутривенном, внутримышечном и пероральном), изучено распределение фенотропила по органам крыс при пероральном введении.

Пятая глава посвящена изучению метаболизма фенотропила в организме крыс методами ТСХ и ГЖХ, исследованию биодоступности таблеток фенотропила в экспериментах in vitro и in vivo у кроликов.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, рисунках, которые приводятся в тексте.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фенотропил - (Ъ1-карбамоилметил-4-фенил-2-пирролидон) представляет собой белый или белый с желтоватым или кремоватым оттенком кристаллический порошок горьковатого вкуса без запаха. Впервые был синтезирован в Ленинградском педагогическом институте.

Экспериментальные животные.

1. Крысы.

Изучение фармакокинетики фенотропила проводили на беспородных крысах-самцах массой 200±20г. Фенотропил вводили внутривенно, внутримышечно и перорально в дозе 100 мг/кг в виде 1% водного раствора. Через определенные интервалы времени животных забивали декапитацией и отбирали кровь. На каждый временной интервал эксперимент проводили с 5 крысами.

2.Кролики.

Исследование относительной биодоступности фенотропила проводили на кроликах массой 3,0±0,1 кг. До исследования животные находились в течении 12 час. на водной диете. Фенотропил вводили перорально в виде 1% водного раствора (стандартная лекарственная форма) и в виде таблеток по 0,1 г в дозе 100 мг/кг. Кровь отбирали из краевой ушной вены для контрольной точки (до введения препарата) и далее через 15, 30, 45мин., 1, 2, 4, 8, 12час. после введения. На каждый временной интервал эксперимент проводили с 4 кроликами.

Методы исследования.

Определения концентрации фенотропила в биожидкостях проводили методом газожидкостной хроматографии на хроматографе JIXM-8 МД, модель 5, при следующих условиях: колонка стальная длиной 1м и

внутренним диаметром Змм, заполнялась 15% Апиезоном-L на Хроматоне N-AW-DMCS 0,160-0,200мл. Температура колонки 240°С, температура испарителя 350°С, скорость газа-носителя (азота) - 35мл/мин. Детектор -пламенно-ионизационный. Скорости вспомогательных газов: водород — 35мл/мин, воздух - ЗООмл/мин.

Определение содержания фенотропила в гомогенатах органов проводили на хроматографе JIXM-80 при следующих условиях: колонка стальная длиной 1м с внутренним диаметром Змм, заполненная НЖФ 5% OV-17 на Инертоне супер 0,16-0,20мм, температура колонки — 240°С, испарителя -=350°С, скорость газа-носителя (азот особой чистоты) - 40мл/мин. Количественное содержание фенотропила в биообъектах определяли методом внутренней стандартизации. В качестве внутреннего стандарта использовали производное бициклических бисмочевин 2,4,5,7,8,10-гексаметил-2,4,8,10-тетраазабицикло/4,4,0/декандион-3,9 (А-13), близкий по своей летучести и термической устойчивости к фенотропилу. Измеряемый параметр на хроматограмме - площадь пиков.

Изучение биодоступности таблеток фенотропила проводили на комплексе «Dissolutest» (фирма Prolabo, Франция) с автоматическим сканирующим спектрофотометром ЕЕ 599 Cecil (Англия); данные обрабатывали на персональном компьютере Apple II с, запись на приборе Epson LX-800. Оптическую плотность измеряли в проточных кюветах (d=10 мм) при 258 нм, в случае водных растворов HCl - каждую минуту, в случае водно-спиртовых растворов HCl - каждые три минуты, латентное время to=l,2 минуты.

Исследование метаболизма фенотропила проводили методом ТСХ с использованием хроматографических пластинок Силуфол УФ-254.

Гомогенаты органов получали на приборе «Микроизмельчитель тканей» РТ 2.

В работе использовали реактивы и растворители марки ч.д.а и х.ч.

Разработка методики газохроматографического определения содержания Фенотропила в биожидкостях.

С целью установления возможности анализа фенотропила методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) без предварительной дериватизации был проведен дифференциально-термический анализ препарата (ДТА). Дифференциально-термический анализ проводили на приборе Q-1000 в токе азота. На основании полученных данных можно заключить, что фенотропил обладает достаточной летучестью для анализа его содержания методом ГЖХ.

Учитывая устойчивость и достаточную летучесть фенотропила при высоких температурах, его анализ проводили на насадочных колонках с использованием неподвижных жидких фаз (НЖФ) различной полярности.

На основании данных литературы по газохроматографическому определению циклических амидов (к которым можно отнести изучаемый препарат) нами исследовалась возможность применения следующих НЖФ

(фазы приведены в порядке увеличения ич полярносш) SI'-2IU0, Анисзон I . JXR, OV-225.

Варьировались длима колонки и условия хромаю! рафиропапия

В результате проведенного исследования разработка мешлпка количественного газохроматографическог о определения фенофонила с использованием метода внутренней стандартизации Показана принципиальная возможность анализа фенолроннла на среднеполярных и неполярных фазах. При этом предпочтение следует огдаль неполярным неподвижным жидким фазам, так как на более молярных фазах (OV-225) наблюдается существенная сорбция препарата и, вследствие этого, снижение чувствительности его определения. В случае использования немолярных фаз (SP-2I00 Апиезон L) чувствительность определения фенотропила составляет не менее 0,5мкг вещества в хроматографнруемой пробе, что свидетельствует о возможности применения разработанного метода анализа фенотропила для определения его содержания в биологических объектах.

Разработанный нами метод состоит из двух основных этапов: выделения фенотропила из исследуемого биоматериала путем экстракции и количественного газохроматофафического определения содержания препарата в экстрактах.

На основании данных по растворимости фенотропила в органических растворителях, не смешивающихся с водой, в качестве экстрагента был выбран хлороформ. Для определения оптимальною объема экстрагента, кратности и времени экстракции были экспериментально установлены значения коэффициентов распределения фенотропила в системах хлороформ-вода и хлороформ-плазма крови, хлороформ-моча.

На основании найденных значений коэффициентов распределения были теоретически рассчитаны оптимальные условия извлечения препарата из плазмы крови и мочи - однократная экстракция сорокократным объемом хлороформа. Время встряхивания - 20 мин.

С целью изучения полноты извлечения фенотропила, готовили его модельные растворы в плазме крови и моче в концентрациях, близких к • реальным концентрациям в изучаемых биожидкостях после введения фармакологически активных доз препарата животным. При этом установлено, из плазмы крови фенотропил извлекается в среднем на 84%, а из мочи - на 92%. Полученные результаты свидетельствуют о высокой степени извлечения фенотропила из биожидкостей при указанных выше условиях и позволили в последующих экспериментах ¡n vivo судить об истинном содержании препарата в биологическом материале.

На основании полученных данных нами была разработана методика количественного газохроматографического определения фенол ропнла в биологических объектах.

По 1,0 мл биожидкостей помещали в цилиндры с притертыми пробками на 50мл, добавляли 40мл хлороформа и перемешивали на шейкере в лечение 20 мин. После перемешивания цилиндры помещали в морозильную камеру с температурой -15°С. Водный слой замерзал, а хлороформную фазу отделяли

и упаривали на роторном испарителе до объема 2-Змл. Остаток количественно переносили в микропробирку с дном, оттянутым в капилляр, и упаривали досуха в токе азота. К сухому остатку добавляли соответствующее количество 0,1% раствора внутреннего стандарта (А-13) в хлороформе, и содержание фенотропила определяли методом ГЖХ.

На рис 1. представлена типичная хроматограмма хлороформного экстракта из плазмы крыс, содержащего фенотропил и внутренний стандарт А-13.

Т, мин

Рис 1 Типичные хроматограммы хлороформных экстрактов из плазмы крови крыс и интактной плазмы крови: Л-экстракт из плазмы крови интакгных крыс; В-экстракт из' плазмы крови крыс после введения фенотропила в дозе 100мг/кг; I-пик фенотропила, II-пик внутреннего стандарта А-13.

Применение методики газохроматографического определения фенотропила для анализа хлороформных экстрактов плазмы и мочи крыс позволило получить удовлетворительное разделение пиков фенотропила, внутреннего стандарта (А-13) и эндогенных соединений, содержащихся в хлороформных экстрактах плазмы крови и мочи. Следовательно, селективность газохроматографического определения является достаточно высокой, что позволяет исключить стадию дополнительной очистки экстрактов.

Для проверки воспроизводимости и точности методики были приготовлены модельные растворы фенотропила в плазме крови и моче следущих концентраций: 50 мкг/мл; 20 мкг/мл; 10 мкг/мл; 5 мкг/мл; 2 мкг/мл. С помощью разработанной методики и учетом степени экстракции фенотропила из плазмы крови и мочи крыс, были определены концентрации фенотропила в модельных растворах.

Расчет доверительных интервалов проводился при доверительной вероятности Р = 0,95 с применением программы STATGRAPH1CS (Statistical Graphics System).

Проведен эксперимент с пятью концентрациями фенотропила в плазме крови и моче при п = 10 и рассчитаны метрологические характеристики, позволяющие оценить достоверность и точность используемой методики.

Полученные данные свидетельствуют о том, что разработана высокоселективная методика количественного газохроматографического определения фенотропила в биологических жидкостях (относительная ошибка определения не превышает ±5,4% в моче и ±6,2% в плазме крови). Чувствительность определения - 5-10"7г.

Исследование фармакокинетики фенотропила у крыс.

Исследование фармакокинетики фенотропила проводили на беспородных крысах-самцах массой 200±20г. Фенотропил вводили внутривенно, внутримышечно и перорально в дозе 100 мг/кг в виде 1% водного раствора. Содержание фенотропила в плазме определяли методом ГЖХ по приведенной выше методике.

Динамика концентрации препарата в плазме крови при разных способах введения удовлетворительно описывается уравнениями:

при внутривенном

С(0 = 36,9еГи7'+60,Зе-°-25'

при пероральном

С(0 = 67,3е~0,229' -141,1е'4 6241

при внутримышечном:

С(0 = 85,85е~0'256' -107,4е1'713'

В табл. 1 представлены результаты определения фенотропила в плазме крови крыс в различные интервалы времени после его введения, а на рис.2-кинетическая зависимость динамики концентрации фенотропила в плазме крови крыс от времени после его введения (в полулогарифмических координатах).

Таблица 1.

Динамика концентрации фенотропила в плазме крыс при различных

способах его введения в дозе 100 мг/кг

Т,ч Концентрация препарата, мкг/мл

Внутривенно Перорально Внутримышечно

0,25 82,20±2,85 20,67±1,22 9,28±1,33

0,50 69,20±12,75 43,28±9,23 31,62±4,94

0,75 63,00±3,19 52,45±2,33 40,60±8,83

1,0 57,60±4,10 56,3б±4,51 49,46±10.13

1,5 46,10±б,49 50,58±4,25 52,14±6,77

2,0 34,40±7,42 37,08±2,67 51,92±3,08

4,0 22,60±3.12 30,27±0,86 32,45±2,47

8,0 9,00±3,15 10,58±0,37 10,29±4,75

16,0 1,11 ±0,03 1,71 ±0,34 1,47±0,37

Ig С, мкг/мл 'Я С, мкг/мл

Ig С, мкг/мл

Рис 2 Динамика концентраций фенотропила в плазме крови крыс в зависимости от ► времени I - после внутривенного, II - после перорального, III - после внутримышечно: о

введения (в полулогарифмических координатах)

Рассчитанные при помощи этих моделей фармакокинетические параметры приведены в табл.2.

Таблица 2

Значения некоторых фармакокинетических параметров фенотропила в плазме крыс после различных способов введения его в дозе 100 мг/кг

Значения фармакокинетических параметров фенотропила Внутривенно Перорально Внутримышечно

Период полуэлиминации lfn,4 2,77±0,12 з,оз±о,п 2,71 ±0.21

Период полувсасывания г,°/2,ч 0,15±0,04 0,405±0.09

Константа скорости элиминации Кэл, ч"' 0,312±0,035 0,229±0,009 0,256±0,021

Константа скорости всасывания Kot.M'1 4,624±0,773 1,713±0.362

Кажущийся объем распределения V,, мл/кг 1028 162U51 1424±72

Начальная концентрация, С0, мкг/мл 61,7±2,2 70,2±4,0

Клиренс общий CL,=V, Кэл, мл мин' кг1 6,22±0,05 6,19±0,02 6,08±0,18

Время достижения максимальной концентрации, Тмлкс, ч 0,84±0,09 1,45±0,15

Максимальная концентрация, Смакс, мкг/мл 52,6±1,2 70,2±2,3

Площадь под кривой, S°"\ мкг ч мл' 279,8±2,0 278,3±1,4 281,3±4,5

Степень биодоступности, F, % 100 -100 -100

Латентное время, Т0, ч 0,168 0,154

Анализ динамики концентрации фенотропила в плазме крыс при разных способах введения показал, что препарат быстро всасывается в кровь как при внутримышечном, так и при пероральном способах введения, что согласуется с его хорошей растворимостью в воде и малополярных растворителях.

Значения объема распределения при всех способах введения препарата превышает объем крови у крысы, что свидетельствует об интенсивном распределении фенотропила внутри клеток.

Значения константы скорости элиминации говорят о сравнительно медленной элиминации фенотропила из организма крыс.

Общий клиренс фенотропила при всех способах введения препарата ниже клиренса креатинина (1,6 мл/мин на крысу), что свидетельствует о возможной реабсорбции фенотропила в почечных канальцах.

Скорость всасывания фенотропила при пероральном введении существенно выше, чем при внутримышечном, это свидетельствует о перспективности создания лекарственной формы таблеток фенотропила

Распределение фенотропила по органам крыс.

При изучении распределения фенотропила по органам крыс после введения препарата перорально в дозе 100мг/кг, готовили водные гомогенаты сердца, печени, почек и мозга, в которых определяли содержание фенотропила методом ГЖХ по методике, аналогичной для плазмы крови.

Предварительные исследования показали, что при анализе хлороформных экстрактов органов в качестве неподвижной жидкой фазы целесообразнее использовать не 15% Апиезон Ь на Хроматоне Ы-ААУ-ОМСБ, а 5% ОУ-17 на Инертоне супер 0,16-0,20мм.

В табл.3 представлены результаты определения содержания фенотропила в органах крыс.

1 аблица 3

Динамика концентрации фенотропила в органах крыс.

введения препарата, ч мтг сердце печень ночки 337213.4 37,5±4,0

0,25 1,6±0,2 3,7±0,6 25,6-Ь2,4

0,50 2,0±0,3 7,9±0,9 30,1±4,3

1,00 6,4±0,8 10,Ш,0 75,8±8,2 55,7±5,8

1,50 4,0±0,6 14,2±1,3 67,7±7,1 50,4±6,0

2,00 1,2±0,3 12,6±1,2 59,б±5,4 37,2±4,1

4,00 0,4±0,2 8,4±1,0 30,2±3,4 28,0±3,2

6,00 - 5,4±0,8 17,7±2,1 16,0±2,1

8,00 - - 11,4±1,6 10,1±1,3

Из данных, представленных в табл.3 видно, что фенотропил быстро распределяется по органам, и максимальное содержание его в органах достигается практически одновременно с достижением максимального содержания в крови (через 1 час).

Экспериментальные данные по динамике концентрации фенотропила удовлетворительно апроксимируются следующими уравнениями:

для мозга при КТНч СО) = сумма трапеций при 1>Т=1чС(1) = 6,4»е||5,11)

для сердца при КТ=1,5ч СО) = сумма трапеций при 1>Т=1,5ч С(1) = 14,1 •е 2""1'5'

для почек

при 1<Т~1ч С(0 = сумма трапеций при 1>Т=1 ч С(0 = 53,2«е 7""1)

для печени при 1<Т~\ ч СО) = сумма трапеций при 1>Т=1ч СО) = 76,5»е 5(И)

Необходимо отметить, что уровень содержания фенотропила в ночках и печени в различные интервалы времени близок к уровню содержания препарата в плазме крови, в то время как в сердце и особенно в мозге уровень содержания фенотропила значительно ниже.

Фенотропил достаточно быстро достигает органов и его максимальная концентрация в крови, в печени, почках и мозге наблюдается через 1 час после введения препарата, а для сердца - через 1,5 часа. Фенотропил относительно медленно выводится из печени, почек и сердца (Т|/2Г|СЧСиь=2,43 ч; Т^поч^^г^г ч; Т|/2ссрдцс~3,26 ч; Т,/2мозг=0,602 ч).

Степень тропности фенотропила к различным органам неодинакова. Ее можно оценить по условной величине площади под кривой, описывающей динамику изменения содержания препарата в органе. По величине площади под кривой органы располагаются в следующей последовательности: печень, почки, сердце, мозг (рис.3).

I Г I I

печень почки сердце мозг

Рис. 3. Степень тропности фенотропила к тканям печени, почек, сердца и мозга

Высокая тропность фенотропила к тканям почек и печени может быть обусловлена их выводящей функцией.

Наличие фенотропила в мозге свидетельствует о способности его проникать через гематоэнцефалический барьер.

Изучение экскреции фенотропила из организма крыс.

Исследована экскреция фенотропила при пероральном введении.Для установления путей выведения фенотропила из организма крыс при пероральном введении в дозе 100 мг/кг изучали экскрецию препарата с мочой. Водный раствор препарата вводили перорально беспородным крысам (200±20г). Сбор мочи проводили в течение 48 часов в интервале 0-2, 2-4, 4-6, 6-8, 8-24, 24-48 часов. Кроме того в отдельном эксперименте собирали мочу в течение 72 часов после введения препарата. Из полученных образцов фенотропил экстрагировали 20-кратным объемом хлороформа при встряхивании на шейкере в течение 20 минут. Содержание фенотропила в экстрактах определяли методом ГЖХ.

Проведенные исследования показали, что за 24 часа с мочой выводится в среднем 7,74 мг препарата, что составляет 38,7% от введенной дозы. За 48 часов фенотропил выводится в количестве 39,8% от введенной дозы, причем за 24 часа выводится примерно 97,2% от общего количества выведенного с мочой препарата. За вторые сутки после введения выводится около 3%. в течение третьих суток в моче обнаруживаются следовые количества фенотропила.

Дня анализа кинетики фенотропила в моче применили уравнение кумулятивной экскреции: Me(t) = Ме°{ 1-е

где: Me(t) - количество препарата, элиминированного за время t

Л/*' - количество препарата, которое в конечном счете

выделится с мочой за время 1™ Найденные методом наименьших квадратов константы элиминации у крыс (п=6) показали их большую индивидуальную вариабильность. Среднее значение константы элиминации, найденное по данным мочевой экскреции, составляет 0,134 ч"1, меньше значения константы элиминации пренарша, рассчитанной на основании данных по кинетике препарата в плазме крови (Кэл=0,229ч_|). Вследствие этого следует относиться с осторожностью к значениям фармакокинетических параметров, рассчитанных по данным мочевой экскреции.

Таким образом, проведенные исследования показали, что с мочой выводится около 40% от введенной дозы фенотропила, причем основное количество препарата выводится в течение 24 часов.

Как будет показано ниже, препарат практически не метаболизирует в организме крыс, это означает, что мочевая экскреция является не единственным путем выведения фенотропила. Очевидно, препарат выводится из организма крыс и другими путями, например, желчью, потом

Исследование метаболизма фенотропила.

Крысам массой 200±20г перорапьно вводили 2 мл 1% водного раствора фенотропила. Суточную мочу экстрагировали 40-кратным объемом СНСЬ, водный маточник обрабатывали соляной кислотой до рН1 (для гидролиза возможных конъюгатов) и вновь экстрагировали хлороформом.

Обезвоженные (прокаленным сульфатом магния или вымораживанием) хлороформные экстракты упаривали в вакууме при температуре не выше 40°С. Остатки подвергали хроматографированию на пластинках Силуфол УФ 254 в сравнении с образцами, полученными при аналогичной обработке интактной мочи, детектирование проводили в УФ-свете и парах иода.

На хроматограммах образцов, полученных после обработки соляной кислотой, дополнительных пятен не выявили, что говорит о том, что фенотропил в моче не образует продуктов конъюгации.

Многократное хроматографирование при различных нагрузках позволяет представить хроматограмму в системе этанол-хлороформ 1:5 (рис.4).

1 2 3

Рнс 4 Хроматограмма хлороформных экстрактов 1 - интактная моча; 2 -фенотропил; 3 - моча после введения фенотропила.

На хроматограмме экстракта мочи после введения фенотропила отчетливо проявляется пятно самого препарата, других же пятен, отсутствующих в экстракте интактной мочи, не выявлено, из чего следует, что в организме крыс, фенотропил не метаболизирует Этот вывод подтверждают результаты хроматографирования в системах различной полярности и кислотности-этанол-хлороформ 1:7, этанол-уксусная кислота-вода 3:1:1, этанол-водный аммиак-вода 3:1:1, где значение Rf фенотропила изменялось от 0,35 до 0,77

Также изучен метаболизм фенотропила у крыс методом ГЖХ.

При хроматографировании экстрактов плазмы крови крыс и мочи в режиме программирования от 190° до 240° также не было обнаружено каких-то дополнительных пиков по сравнению с экстрактами плазмы крови и мочи интактных животных.

Таким образом, проведенные исследования показали, что фенотропил не подвергается метаболизму в организме крыс.

Исследование биодоступности таблеток фенотропила.

Изучена биодоступность таблеток фенотропила в эксперименте in vitro Одним из факторов, определяющих биодоступность таблеток фенотропила является полнота и скорость высвобождения действующего начала из таблеток.

Изучение динамики высвобождения фенотропила из таблеток проводили в 0,1н водном и 0,1н водно-спиртовом растворе HCl. В качестве среды растворения одной таблетки фенотропила 0,1 г использовали 500 мл воды и 500 мл 0,1н HCl в смеси этанол-вода 3:7 (по 5 параллельных опытов), скорость вращения мешалки 100 об/мин, t=37°C. На рис.5 представлена динамика высвобождения фенотропила из таблеток.

Т, мин

Риг *> Динамика высвобождения фенолропила из 1аблегок 1- в 0,1н водной соляной кислоте; 2 - в 0,1 и водно-спиртовой соляной кислоте

Для описания динамики высвобождения фенотропила из таблеток использовали «экспоненциальную модель», согласно которой доля высвободившеюся препарат (F, в % от дозы) зависит от времени в

F

cooiBeiciBiii! с уравнением: '"О~ у^) = -ío)

где: К<; - константа скорости высвобождения, мин"1

t0 - латентный период, мин

С помощью метода наименьших квадратов рассчитаны значения констант скорости высвобождения фенотропила из таблеток: в водно-спиртовом растворе НС1 - Ks=0,4 мин'1, а в водном растворе НС1 - Ks=0,53 мин"1.

Из данных, представленных на рис.5, видно, что полное высвобождение фенотропила из таблеток происходит примерно за 15 минут.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой скорости высвобождения фенотропила нз таблеток в эксперименте in vitro. Эти данные хорошо согласуются с быстрым всасыванием препарата (К»для крыс=4, 62ч ) при пероралыюм введении препарата в эксперименте in vivo.

Изучение биодоступности таблеток фенотропила в эксперименте in vivo проводили на кроликах.

Кроликам вводили фенотропил в виде 1% водного раствора (стандартная лекарственная форма) и в виде таблеток по 0,1 г в дозе 100мг/кг.

Содержание фенотропила в плазме крови кроликов определяли меюдом I ЖХ но методике, аналогичной анализу плазмы крови крыс.

В табл.4 представлены результаты определения содержания фенофонила в плазме кроликов в различные интервалы времени после введения препарата, а на рис.6 - кривая динамики концентрации фенотропила в плазме кроликов в зависимости от времени после его введения.

Таблица 4.

Динамика концентрации фенотропила в плазме кроликов.

1, мае Стандартная лека рствепная форма Таблетки

Экснерим. С, мкг/мл Рассчнт. С, мкг/мл Экспернм. С, мкг/мл Рассчнт. С, мкг/мл

0,25 31,4±1,4 27,6 0,6±0,08 0,4

0,50 4б,0±2,3 50,1 9,5±0,б 8,0

0,75 60,2±2,4 60,35 13,8±0,9 14,5

1,00 73,6±3,0 62,45 17,5±1,0 21,1

2,00 54,6*2,2 57,8 35,3±1,8 34,7

4,00 39,3±1,8 42,7 57,4±2,6 43,4

8,00 25,2±1,3 23,04 33,6±1,8 35,5

12,00 12,1 ±0,7 12,4 26,1±1,6 24,7

С, мкг/мл

Рис.6 Динамика концентрации фенотропила в плазме кроликов 1 - стандартная лекарственная форма 2 - таблетки

Динамика концентрации фенотропила в плазме кроликов после приема стандартной формы (водный раствор препарата) удовлетворительно описывается в рамках одночастевой модели со всасыванием уравнением:

С(/) = 79,0е~°'154' -101,2£?"2'955',

а после приема таблеток уравнением-

С(0 = 81,1 е-0'099' -89,6е~0'517'

В табл.5 представлены значения фармакокинетических параметров фенотропила у кроликов.

Из данных, представленных в табл.5, видно, что скорость всасывания фенотропила после приема таблеток значительно ниже, чем при приеме стандартной формы (водный раствор)

Таблица 5

Фармакокинетические параметры фенотропила.__

Параметр Стандартная лекарственная форма Таблетки

Кэп„ ч 1 0,154±0,006 0,099±0,012

'С, 2,4 4,51 ±0,23 7,03±0,76

К„ Ч"1 2,955±0,231 0,517±0,112

'°п 0,234±0,043 1,340±0,140

Со, мкг/мл 74,0±2,3 64,1±4,7

Тщ|Х1 Ч 1,05±0,12 3,96±0,24

Тлат» Ч 0,088 0,238

VI, мл-кг"1 1352,1±50,5 1559,3±97,4

СЦ, мл мин ' кг"1 3,47±0,14 2,56±0,18

Аис0--, мкг-ч-мл"1 480,3±21,8 657,5±39,5

Вместе с тем степень относительной биодоступности фенотропила после приема таблеток выше, чем при приеме стандартной лекарственной формы. Это, очевидно, связано с тем, что хотя максимальная концентрация фенотропила в крови после приема таблеток достигается относительно медленнее, время циркуляции препарата в крови при введении испытуемой лекарственной формы существенно больше.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высокой относительной биодоступности таблеток фенотропила.

Сравнение фармакокинетических параметров фенотропила у крыс и кроликов при пероральном введении препарата свидетельствует о том, что фенотропил медленнее всасывается и медленнее выводится у кроликов. Также, как и у крыс,высокое значение объема распределения у кроликов свидетельствует об интенсивном внутриклеточном распределении препарата.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан газохроматографический метод определения содержания фенотропила в биообъектах, обладающий высокой специфичностью и точностью.

2. Изучена фармакокинетика феногропила при различных способах введения крысам и кроликам. Установлено, что препарат быстро всасывается и распределяется по органам и тканям, и относительно медленно выводится из организма животных.

3. Установлено, что абсолютная биодоступность внесосудистых способов введения фенотропила ыхмавляет ~ 100%. Найдено, что 40% фенотропила экскретируется с мочой.

4. С использованием методов ТСХ и ГЖХ установлено отсутствие метаболизма фенотропила в организме крыс и кроликов.

5. Изучено распределение фенотропила по органам крыс при пероральном его введении и установлено, что он проникает через гематоэнцефалический барьер.

6. Исследована биодоступность таблеток фенотропила в экспериментах in vitro и in vivo. Установлена высокая относительная биодоступность таблетированной лекарственной формы фенотропила.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В.И., Берлянд A.C. Количественный анализ фенотропила в биологических объектах методом газожидкостной хроматографии. // Хим.-фарм.журн.-2003.-№10.-С.46-47.

2. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В И., Берлянд А С. Экспериментальная фармакокинетика фенотропила у крыс. // Хим.-фарм.журн.-2003.-№11.-С.7-8.

3. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В.И., Берлянд A.C. Исследование биодоступности таблеток в экспериментах in vivo для разработки рациональной фармако1ерапии препаратом // Тез. докл. XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- Москва.2004,-С.756.

4. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В.И., Берлянд А.С Химико-фармацевтическое изучение фенотропила // Актуальные проблемы биологии медицины и экологии: Сб. науч. статей. - Томск,2004.-С 274.

5. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В.И., Берлянд A.C. Изучение биодоступности таблеток фенотропила в экспериментах in vitro и in vivo. // Хим.-фарм. журн.-2004.-№10.-С.10-11.

6. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В.И, Берлянд A.C. Изучение экскреции препарата фенотропил из организма крыс. // Хим.-фарм.журн.-2004.-№ 11 .-С.6-7.

7. Антонова М.И., Берлянд A.C., Прокопов A.A. Сравнительная фармакокинетика фенотропила и пирацетама. // Естествознание и гуманизм: Сб. науч. статей. - Томск,2005.-С.5.

8. Антонова М.И., Берлянд A.C., Прокопов A.A. Распределение фенотропила по органам животных. // Естествознание и гуманизм: Сб. науч. статей. - Томск,2005.-С.5-6.

■ -Ч ,

Антонова Марита Ивановна (Россия) Экспериментальная фармакокинетнка фенотропила.

Разработана селективная и высокочувствительная меюдика газохроматографического определения содержания нового оригинального ноотропного препарата фенотропила в биообъектах. Изучена экспериментальная фармакокинетнка фенотропила у крыс и кроликов при внесосудистых и внутрисосудистых способах введения. Установлено, что препарат быстро всасывается и относительно медленно выводится из организма животных, интенсивно распределяется внутри клеток. Основной путь выведения препарата - экскреция с мочой. Фенотропил практически не метаболизирует в организме животных. Изучение распределения препарата по органам животных показало, что он проходит через гематоэнцефалический барьер. Установлена высокая относительная биодоступность таблеток фенотропила. Проведенные исследования могут быть использованы для изучения клинической фармакокинетики препарата и установления режима его дозирования.

Marita I. Antonova (Russia) Experimental pharmacokinetics of phenotropilum

Selective and sensitive assay of novel nootropic drug phenotropilum in biological samples by gas chromatography has been developed. Experimental pharmacokinetics of phenotropilum in rats and rabbits at intravascular and extravascular ways of excretion has been studied. It was stated that the drug was rapidly absorbed and relatively slowly excreted from the animals, being randomly distributed among the cells. The major way of the drug elimination is urinary excretion. Metabolic conversion of phenotropilum in the tissues is negligible and it is excreted in the unaltered form, Study of phenotropilum tissue distribution showed that it can permeate through the blood-brain barrier. Relatively high bioavailability of phenotropilum pills was proved. The results may be used in the studies of clinical pharmacokinetics of the drug and its allowable dosages in humans.

л

1

<)

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 1 Подписано в печать 2005 г.

Тираж 100 экз.

«16558

РНБ Русский фонд

2006-4 12870