Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Методологические аспекты изучения экспериментальной фармакокинетики и метаболизма новых психотропных, ноотропных и антиоксидантных лекарственных средств

На правах рукописи

ПРОКОПОВ АЛЕКСЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКИ И МЕТАБОЛИЗМА НОВЫХ ПСИХОТРОПНЫХ, НООТРОПНЫХ И АНТИОКСИДАНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

15.00.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена в Московском государственном медико-стоматологическом университете (ГОУ ВПО МГМСУ РОСЗДРАВА).

Научный консультант:

Доктор фармацевтических наук, профессор Берлянд Александр Семёнович Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, Орлова Марина Алексеевна

Доктор химических наук, профессор Граник Владимир Григорьевич

Доктор фармацевтических наук, доктор педагогических наук, академик РАО, профессор Попков Владимир Андреевич

Ведущая организация: ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН.

диссертационного совета Д 212.203.13 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

Защита состоится <

г.

часов на заседании

Автореферат разослан

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 212.203.13 доктор фармацевтических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования в области создания современных лекарств отличаются принципиально новыми методологическими подходами, сейчас невозможно внедрить препарат в лечебную практику без детального изучения его фармакокинетики.

Во всём мире ведётся интенсивный поиск биологически активных соединений для лечения психических расстройств, хотя арсенал психотропных средств весьма разнообразен. Растёт объём исследований по разработке препаратов с антиоксидантными свойствами, предопределяющими, в частности, адапгогенный эффект при экстремальных воздействиях на организм.

В Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН были синтезированы новые производные бициклических бисмочевин и диазирддинов, проявляющие антидепрессантную активность; в Санкт-Петербургском государственном педагогическом институте получены новые циклические аналоги у-аминомасляной кислоты (ГАМК) с иоотропным действием; в Институте химической физики им. И.Н.Семёнова РАН у ряда пространственно-затруднённых фенолов выявлена значительная антиоксидантная активность.

На основании фармакологического скрининга в качестве потенциальных лекарственных средств отобраны два представителя бициклических бисмочевин: альбикар и бикарэт, они имеют преимущества перед препаратами аналогичного действия (седуксен, амитриптилин и др.), сочетая в себе свойства анксиоли-гаков и антидепрессантов.

Среди диазиридинов наиболее перспективен антидепрессант тетрамезин, в опытах на животных он проявляет меньшую токсичность в сравнении с имипрамином и ниаламидом, не уступая им по выраженности фармакологического эффекта.

Из циклических производных ГАМК особенный интерес представляет фенотропил, ноотропная активность и психостимулирующий эффект которого выше, чем у пирацетама.

Фенозан-кислота, представитель пространственно-затруднённых фенолов, противодействуя перекисному окислению липидов в мембранных структурах мозга, является активным антиоксидантом с антигипоксическим действием.

Таким образом, фармакологические свойства альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила являются основанием для выполнения работ по созданию на основе этих веществ повых лекарственных препаратов.

К началу настоящих исследований систематическое изучение альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила не проводилось. В литературе практически отсутствуют сведения о методиках их количественного определения в биологических объектах. Не изучена доклиническая фармакокинетика этих соединений, не исследованы пути их биотрансформации, не имеется данных о биологической доступности их лекарственных форм. Не существует и единого методологического подхода к проведению минимально необходимого, но достаточного объёма исследований

на стадии изучения экспериментальной фармакокинетики новых перспективных биологически активных соединений.

В настоящее время большинство доклинических фармакокинетггческих исследований при создании новых лекарственных средств проводится в некотором отрыве друг от друга. Это тормозит внедрение новых препаратов в медицинскую практику в нашей стране. Поэтому разработка методологического подхода, который позволит комплексно охарактеризовать возможное лекарственное средство на этапе его доклинического фармакокинетического исследования, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка высокочувствительных методик количественного определения альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила в биообъектах; методологическое обоснование и изучение доклинической фармакокинетики, метаболизма и биофармацевтических свойств потенциальных лекарственных средств; выработка рекомендаций по наиболее эффективным способам введения лекарств, созданию лекарственных форм и регламенту проведения фармакокинетических исследований па 1-й стадии клинических испытаний.

Для достижения поставлешшх целей необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать высокочувствительные способы количественного определения лекарственных средств в биологических объектах.

2. Обосновать основные этапы изучения доклинической фармакокинетики лекарственных средств.

3. Изучить фармакокинетику лекарственных средств на животных при внутрисосудистом и внесосудистых способах введения, определить наиболее эффективный способ введения лекарственных средств.

4. Исследовать биодоступность таблеток альбикара, бикарэта, тетрамезина, фснозан-кислоты и фенотропила.

5. Установить основные пути биотрансформации потенциальных лекарственных средств в организме животных, идентифицировать основные метаболиты.

6. Дать рекомендации по регламенту проведения фармакокинетических исследований lia 1-й фазе клинических испытаний лекарственных средств.

Научная новизна. Разработаны оптимальные условия извлечения лекарственных средств из биологических объектов методом жидкостно-жидкостной экстракции.

. Впервые разработаны высокочувствительные воспроизводимые методики анализа альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила методом ГЖХ. Относительные ошибки количественного определения изучаемых веществ в биологических объектах, даже при низких концентрациях (< 1 мкг/мл), находятся в интервале от 2,7 до 9,2%, что свидетельствует о достаточньгх точности и чувствительности этих методик для изучения фармакокинетики препаратов.

Впервые изучена доклиническая фармакокинетика альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила при различных способах введения; на основании полученных результатов даны рекомендации по выбору наиболее эффективного способа внесосудистого введения лекарственных средств, созданию лекарственных форм и регламенту проведения исследований на 1-й фазе клинических испытаний.

Впервые установлены основные пути биотрансформации исследованных лекарственных средств в организме животных и идентифицированы основные метаболиты.

Определены скорости высвобождения действующих начал из лекарственных форм в экспериментах in vitro, изучена биодоступность лекарственных форм в экспериментах in vivo.

Обоснованы методологические аспекты изучения доклинической фармакокинетики новых потенциальных лекарственных средств.

Получены положительные решения Федерального института промышленной собственности (ФИПС) о выдаче трёх патентов на способы количественного определения изучаемых веществ в биообъектах.

Практическая значимость. Данные по изучению доклинической фармакокинетики альбикара и фенотропила вошли в документацию, на основании которой получено разрешение МЗ и CP РФ на проведение клинических испытаний этих лекарственных средств.

Разработанные методики количественного определения альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила в биологических жидкостях используются в практической работе и при проведении различных биофармацевтических исследований, что подтверждено актами внедрения из Пятигорской государственной фармацевтической академии.

Предложенный методологический подход к изучению доклинической фармакокинетики лекарственных средств может быть использован в качестве рекомендации по объёму и порядку проведения исследований при изучении экспериментальной фармакокинетики новых лекарственных средств.

Методологические основы фармакокинетических исследований используются в учебном процессе, находя своё отражение в лекционном, семинарском и элективном курсах общей химии МГМСУ.

Положения, выносимые на защиту:

методики количественного определения фенотропила, альбикара, бикарэта, фенозан-кислоты, тетрамезина в биологических объектах;

результаты фармакокинетического доклинического исследования оригинальных психотропных препаратов (альбикара, бикарэта, тетрамезина), препарата ноотропного действия (фенотропила) и антиоксиданта (фенозан-кислоты);

предложенные пути метаболических превращений альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты в организме животных;

усовершенствованная методология доклинического изучения экспериментальной фармакокинетики новых лекарственных веществ.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены па: III Всесоюзной конференции по фармакокинетике (Москва, 1991), XI и XIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2004, 2006), Российском научном форуме «Скорая помощь» (Москва, 2004), II Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов» (Москва, 2005), VI Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», (Москва, РУДН, 2005), IV Всероссийском симпозиуме «Боевой стресс: механизмы стресса в экстремальных условиях» (Москва, ПШИИ ВМ МО РФ, 2005), V Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа, ИОХ НЦ РАН, 2005), 61-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 работ, в том числе 18 статей в центральных журналах, рекомендованных ВАК, и 3 патента РФ на изобретения (положительные решения ФИПС о выдаче).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, списка литературы и приложешш, изложена на 328 стр., содержит 40 рисунков, 51 таблицу, 2 схемы. Список литературы включает 263 источника, из них 144 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования служили новые биологически активные соединения, рассматриваемые в качестве потенциальных лекарственных препаратов:

Альбикар Бикарэт

2,6-диметил-4,8-диэтил-2,4,6,8-тетрааза- 2,4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетрааза-бицикло[3.3.0]о1сгандион-3,7 бицикло[3.3.0]октандион-3,7

РН3

Н3С

Н3С-

■СНз

■о

N

Li

Тетрамезин

NH

Фенотропил

>Т,ТЧ'-этилен-бис(3,3-диметилдиазиридин) Ы-карбамоилметил-4-фепил-

пирролидон-2

о-"х>н

СН3 Фенозан-кислота

4-гидрокси-3,5-ди-7ирел?-бутилфенилпропио1Ювая кислота

СН3

Общий подход при разработке методики количественного определения указанных лекарственных веществ (ЛВ) в биологических объектах заключался в извлечении действующего начала методом жидкостно-жидкостной экстракции с предварительным выбором экстрагента, определением продолжительности и необходимой кратности экстракции. Последующее количественное определение веществ проводили методом ГЖХ на неполярных фазах или фазах средней полярности с использованием внутренних стандартов. Предварительно на основании данных дифференциально-термического анализа подбирали температурные режимы испарителя и колонки. Значения относительных ошибок количественного определения и минимально детектируемые количества альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила, полученные в опытах на модельных смесях, свидетельствуют, как указывалось выше, о высокой точности и чувствительности разработанных методик.

Основное внимание в работе уделено изучению доклинической фармакокинетики альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила, проявляющих фармакологическую активность в близких нозологических группах. Обобщение результатов, полученных при использовании комплекса современных физико-химических методов, позволило предлоясить универсальную схему изучения фармакокинетики оригинальных лекарственных препаратов с оценкой эффективности и целесообразности каждой стадии выполняемой экспериментальной работы.

При исследовании экспериментальной фармакокинетики были решены следующие задачи: определена биодоступность препаратов (при внесосудистом введении), выявлена скорость поступления активных начал в системный кровоток, изучены биотрансформация и экскреция соединений.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОКИНЕТИКА ПРЕПАРАТОВ РЯДА БИЦИКЛИЧЕСКИХ БИСМОЧЕВШ1.

Кинетика альбикара и бикарэта в крови при различных способах введении. Фармакокинетику альбикара и бикарэта при внутривенном (в/в), внутримышечном (в/м) и пероральном (п/о) способах введения изучали на крысах. При в/в введении альбикара динамика его концентраций в плазме-крови описывается уравнением одночастевой, а для бикарэта - уравнением двухчастевой модели.

Рис. 1. Динамика концентрации альбикара и бикарэта в плазме крови крыс в зависимости от времени после внутривенного введения.

Фармакокинетические профили JIB в плазме после их в/в введения в дозе 200 мг/кг приведены на рис. 1, а в табл. 1 — основные фармакокинетические параметры препаратов при этом способе введения. И альбикар, и бикарэт быстро распределяются по кровеносному руслу (у альбикара фаза распределения практически не выявлена) и относительно медленно выводятся из организма. Объёмы распределения в обоих случаях превышают объём крови у крысы, что указывает на интенсивный захват ЛВ тканями.

Как показывает сравнение общего клиренса альбикара и бикарэта с клиренсом креатинина (8 мл-мин"1-кг"1), более 50% от дозы обоих препаратов реабсорбируется в почечных канальцах.

' Таб.пща 1. Фармакокинетические параметры альбикара и бикарэта при внутривенном введении крысам

Параметр Альбикар Бикарэт

Константа скорости элиминации, ч"1 0,29 ± 0,02 0,23 ± 0,02

Объём распределения, л-кг"1 0,54 ± 0,03 0,56 ± 0,01

Клиренс общий, мл-мин"'-кг"1 2,61 ±0,18 3,36 ± 0,05

Среднее время удерживания, ч 3,4 ±0,1 4,3 ± 0,1

Рис. 2 отражает динамику концентрации препаратов в плазме при п/о введении. Фармакокинетические кривые симбатны, это характерно для кинетики первого порядка.

С, мкг/мл

Альбикар Бикарэт

Рис. 2. Динамика концентраций альбикара и бикарэта в плазме крови после перорального введения в различных дозах (1 - 200, 2 - 500 мг/кг).

Динамика концентраций альбикара и бикарэта в плазме крови при п/о введении описывается одночастевыми моделями со всасыванием. Величины фармакокинетических параметров этих ЛВ практически не зависят от вводимой дозы (табл. 2), что подтверждает распределение обоих препаратов в организме крыс в соответствии с уравнениями первого порядка.

Таблица 2. Фармакокинетические параметры альбикара и бикарэта при

пероральном введении крысам.

Параметр Альбикар Бика] ээт

200 мг/кг 500 мг/кг 200 мг/кг 500 мг/кг

Константа скорости абсорбции, ч"1 2,96±0,42 3,05±0,40 2,68±0,17 2,70±0,05

Константа скорости элиминации, ч"1 0,21±0,01 0,19±0,01 0,17±0,01 0,17±0,01

Объём распределения, л-кг"1 0,54±0,04 0,52±0,03 2,14±0,01 2,14±0,04

Клиренс общий, МЛ'МНН^'КГ"1 1,89±0,15 1,65±0,13 6,06±0,02 6,06±0,05

Среднее время удерживания, ч 4,8 ± 0,2 5,3 ± 0,3 5,9 ± 0,3 5,9 ± 0,3

Абсолютная биодоступность, % 79 86 55 55

Альбикар и бикарэт интенсивно всасываются в кровь из ЖКТ, поступление препаратов в систему кровообращения происходит в короткие сроки после их введения. Распределите ЛВ с потоком крови по организму характеризуется высоким значением объёма распределения, следовательно, обоим препаратам свойственно внутриклеточное проникновение.

Наиболее активно процесс всасывания как альбикара, так и бикарэта происходит в течение 1 ч после введения, восходящие ветви графиков отражают процесс поступления препаратов в кровь.

Когда максимальные концентрации JIB достигнуты, всасывание завершается; дальнейшее изменение содержания действующих веществ в плазме характеризуют нисходящие ветви графиков.

При в/м введении динамика концентраций альбикара описывается одночастевой моделью, а бикарэта — двухчастевой моделью, в обоих случаях с учётом всасывания. Параметры фармакокинетики ЛВ при в/м введении представлены в табл. 3: скорость всасывания обоих препаратов выше, чем при п/о введении, причём для альбикара эта разница весьма существенна.

В/м введение альбикара и бикарэта характеризуется медленным очищением организма от препаратов: их клиренс в пересчёте на одну крысу составляет 0,45 и 0,54 мл-мин"1 соответственно.

Таблица 3. Фармакокинетические параметры альбикара и бикарэта при внутримышечном введении крысам.

Параметр Альбикар Бикарэт

Константа скорости абсорбции, ч"' 18,18 ±4,25 3,06 ±0,16

Константа скорости элиминации, ч"1 0,25 ± 0,01 0,18 ±0,01

Объём распределения, лкг"' 0,54 ± 0,04 0,90 ± 0,01

Клиренс общий, мл-мин"1-кг"1 2,25 ±0,10 2,70 ± 0,04

Среднее время удерживания, ч 4,0 ± 0,2 5,6 ±0,3

Абсолютная биодоступность, % 77 69

Экскреция альбикара и бикарэта. Мочевая экскреция является основным путём выведения .альбикара - так выводится 99% всосавшегося препарата от введённой крысам дозы, причём около 90% экскретируется в неизменённом виде.

Рассчитанная по уравнению кумулятивной экскреции константа скорости элиминации альбикара 0,22 ч'1 достоверно не отличается от величины кэл=0,21 ч"1, найденной при изучении кинетики препарата в плазме. Совпадение значений км позволяет определить ряд параметров, не используя инвазивные способы отбора биопроб.

Ренальный клиренс альбикара 1,83 мл-мшГ'-кг'1 соответствует общему клиренсу препарата (1,89 мл-мин^-кг'1). Определённая опытным путём величина экскреторного клиренса совпадает с общим клиренсом и с его расчетным значением.

Основным путём экскреции бикарэта также является выделение с мочой, в неизменённом виде выводится только 15% от введённой дозы (с фекалиями - не более 1,5%), а всё остальное количество препарата подверг ается метаболизму и элиминируется с мочой уже в виде метаболитов.

Метаболизм альбикара и бикарэта. Метаболизм альбикара и бикарэта исследовали у крыс после п/о введения препаратов в дозе 500 мг/кг. Пробы мочи подвергали стандартной обработке и анализировали на хроматомасс-спектрометре «Finnigan 3200». На рис. 3 и 4 представлены типичные хроматограммы экстрактов мочи крыс, получавших препараты.

Относительное содержание альбикара (рис. 3) составляет 90%, метаболита 1 - 6%, метаболита 2 - 3%. Масс-спектры метаболитов 1 и 2 близки между собой, а их молекулярные ионы с m/z 242 превышают массу молекулярного иона альбикара на 16 а.е.м., что говорит о появлении в молекуле дополнительного атома кислорода. Резкое снижение интенсивности ионов метаболитов (0,5-0,7% от ПИТ) по сравнению с ионом альбикара (6,4% от ПИТ) объясняется наличием гидроксильной группы в продуктах биотрансформации альбикара.

I

Рис. 3. Газожидкостная хроматограмма хлороформного экстракта мочи крысы, получившей альбикар: 1—альбикар; 2 - метаболит 1; 3 -метаболит 2.

Масс-спектры альбикара и продуктов его биотрансформации однотипны. Разница во временах удерживания метаболитов незначительна, что позволяет считать их диастереомерами. Характер фрагментации метаболитов альбикара соответствует структурам А и Б, однако более вероятна структура Б, способная существовать в виде диастереомеров.

но

А Б

Аналогичные изомеры соответствуют метаболитам бикарэта V и V* (рис. 4), всего же на хроматограмме суммы продуктов биотрансформации бикарэта выявлены пики ещё трёх метаболитов VI-VIII. Анализ масс-спектров указывает на метаболиты с дополнительным атомом кислорода; без этильного радикала (мажорный метаболит); без этильного радикала с дополнительным атомом кислорода, а также N-ацетнльного производного дезэтилированного продукта.

17 18,0119,28 20,06 21,20 Т, мин

19,02 19,39

Рис. 4. Газожидкостная хроматограмма хлороформного экстракта мочи крысы, получившей бикарэт: IV - бикарэт, V, V*,VI,VII,VIII - метаболиты бикарэта.

Таким образом, основным направлением биотрансформации бикарэта является хорошо известная реакция лекарственного метаболизма - N-■ дезэтилйрование. Но образующийся при этом метаболит VI, структура которого йодгвёрждена - встречным синтезом, является не первичным продуктом метаболизма, а ■ образуется из диастереомеров а-гидроксиэтильного производного бикарэта. Кроме того, в организме крыс образуются продукты

гидроксилирования этильной группы триэтильного производного и К-ацетилировалия этого соединения (в скобках приведены знат1е1шя относительного содержания вещества в сумме метаболитов):

н,с

-----

-со-

н3с—^—сн3 бикарэт (24%)

Н3С---^ ^-—СНз

з=<Х>=

7^-ОН -С

Н3с--^ ^---СНз

N^.___^-N

N N Н ^

СН,

метаболиты V и V* (18%) метаболит VI (54%)

н3с—^ но.

.м-___^.N

=<х>=°

м-"

^----

Н3С—, НО.

л

.4__^N

°=<Х>=°

N'— N

^—СН;

метаболит VII (2%) метаболит VIII (2%)

Сравнительная биодоступность алъбикара и бикарэта в опытах in vitro и in vivo. С целью установления принципиальной возможности оценки биодоступности соединений ряда бициклических бисмочевин in vivo па основании данных, полученных in vitro, изучены скорости и степени высвобождения бикарэта и альбикара из их таблеток. Биодоступность препаратов в опытах in vitro определяли на установке «Dissolutest» с автоматическим сканирующим спектрофотометром в условиях, обеспечивающих протекание процесса высвобождения по первому порядку, что характерно и для кинетики обоих ЛВ в плазме крови. На рис. 5 представлена динамика высвобождения бикарэта из таблеток.

Рис. 5. Динамика высвобождения бикарэта из таблеток в опыте in vitro.

Экспоненциальное уравнение кинетики высвобождения бикарэта имеет

вид:

ln(l - £7100) = - 0,26(t -1<>) + 0,61,

где f - доля высвободившегося препарата (в % от дозы); to -латентный период, мин; t - время высвобождения бикарэта, мин.

Значение константы скорости высвобождения бикарэта из таблеток Ks=0,26 мин"1 несколько ниже, чем у структурно близкого альбикара (Ks=0,71 мин"1), что связано с большей гидрофобностыо молекулы бикарэта.

Абсолютную биодоступность субстанций и таблеток альбикара и бикарэта in vivo определили на кроликах и крысах. Динамика бикарэта в плазме крови кроликов после в/в введения в дозе 100 мг/кг описывается двухчастевой моделью, фармакокинетические параметры представлены в табл. 4.

В организме кроликов при в/в введении бикарэт так же быстро распределяется по органам и тканям, как и в организме крыс (период полураспределения у обоих видов животных практически одинаков: 0,2 ч), но отмечается более медленная элиминация (ti/2,p = 5,0 ч) по сравнению с крысами (tic.p = 3,0 ч).

Табмща 4. Фармакокинетические параметры бикарэта при внутривенном введепии кроликам

Параметр Величина

Константа скорости элиминации, ч"1 0,14 ±0,01

Объём распределения, л-кг"1 0,92 ± 0,02

Клиренс общий, мл-мин"'-кг'1 2,15 ± 0,03

Среднее время удерживания, ч 7,1 ± 0,2

' Поскольку элиминация бикарэта из организма кроликов замедлена, уменьшилась и •величина общего клиренса: С1,=2,15 мл мин' кг1. Высокое значение объёма распределения свидетельствует об интенсивном захвате бикарэта тканями и у этих животных.

Динамика концентрации бикарэта в плазме крови кроликов после п/о введения субстанции и таблеток в дозе 100 мг/кг (рис. 6) описывается уравнениями одночастевой модели с учётом всасывания, параметры фармакокинетики представлены в табл. 5. При п/о введении бикарэт быстро всасывается: максимальная концентрация в крови достигается через 1,3 ч при введении субстанции и через 1,6 ч при введении таблеток.

С, мкгумл

Рис. 6. Динамика концентрации бикарэта в плазме крови кроликов после перорального введения субстанции (I) и таблеток (И) в дозе 100 мг/кг.

~i—i—;—i—i—I—i—i—i—i—Í—i—г

2 3 4 5 Л 7 S Í 10 11 12 13 14

Г. ч

Таблица 5. Фармакокинетические параметры бикарэта при пероральном введении субстанции и таблеток кроликам.

Параметр Величина

Субстанция Таблетки

Константа скорости абсорбции, ч"' 2,58 ± 0,39 1,68 ±0,27

Константа скорости элиминации, ч"1 0,16 ±0,01 0,16 ±0,01

Объём распределения, л-кг"' 1,91 ±0,08 2,33 ±0,10

Клиренс общий, мл-мин"1-кг"1 5,09 ± 0,20 6,21 ±0,13

Среднее время удерживания, ч 6,2 ± 0,4 6,2 ±0,4

Абсолютная биодоступность, % 43 35

В опытах на крысах при п/о введении субстанции альбикара его абсолютная биодоступность равна 79% (для бикарэта — 55%), а при в/м введении - 77% (для бикарэта - 69%). Данный показатель альбикара и бикарэта в опытах на крысах после введения таблеток - соответственно 70 и 41%, а в опытах на кроликах - 43 и 35%. Относительно низкая степень биодоступности альбикара и бикарэта для обоих видов животных при довольно высоких скоростях всасывания связана с метаболизмом препаратов. Причём, более глубоким метаболическим превращениям бикарэта вполне соответствует и его более низкая биодоступность. Из этого следует, что в/м введение данных JIB является предпочтительным для достижения в короткие сроки их эффективной концентрации в крови.

Полученные данные, в целом, дают основание полагать, что имеет место межвидовая вариабельность фармакокинетических параметров альбикара и бикарэта при переходе от мелких животных к крупным. Сравнительно низкая биодоступность субстанций и таблеток альбикара и бикарэта у кроликов так

же, как и у крыс, обусловлена пресистемным метаболизмом лекарственных средств.

В опытах in vitro для альбикара и бикарэта во всех случаях в течение 5-10 мин наблюдается 90% высвобождение действующего начала. На этом основании прогнозируется, что высвобождение данных потенциальных лекарственных средств не может являться лимитирующей стадией в процессе всасывания при введении таблеток. Прогноз нашёл своё подтверждение в опытах in vivo: высокая скорость всасывания при введении таблеток соответствует быстрому высвобождению действующих начал. Сравнительная фармакокинетика препаратов ряда биниклических бисмочсвин. Альбикар, бикарэт и мебикар (2,4,б,8-тетраметил-2,4,6,8-тетраазабицик-ло[3.3.0]октандион-3,7), имея родственную структуру и сходную фармакологическую активность, характеризуются довольно близкими фармакокинетическими показателями. В интервале фармакологически активных доз бициклические бисмочевины практически не связываются с белками плазмы, для соединений этого ряда характерно их связывание с эритроцитами: степень связывания с эритроцитами составляет для альбикара 34-45%, для бикарэта 40-44%, для мебикара 33-45%.

После внесосудистого введения эти препараты быстро поступают в системный кровоток, максимальная концентрация в крови при п/о введении достигается примерно через 1 ч, при в/м введении — через 20-30 мин. Высокая скорость всасывания объясняется их своеобразными физико-химическими свойствами: хорошей растворимостью как в воде, так и в липидах, отсутствием ионизации при любых значениях рН. Альбикар, бикарэт и мебикар одинаково легко проникают через эпителий ЖКТ, и всасывание этих веществ происходит как из желудка, так и из кишечника.

Все препараты этого ряда интенсивно захватываются тканями, медленно выводятся из организма крыс, причём скорость элиминации из органов примерно такая же, как и из крови. Экскреция ЛВ осуществляется, в основном с мочой, но, если мебикар и альбикар выводятся преимущественно в неизмененном виде, то большая часть бикарэта элиминируется в виде метаболитов.

Абсолютная степень биодоступности при п/о введении (крысы) снижается от максимума у мебикара . (75-81%) до минимума у бикарэта (55%). Эта же последовательность сохраняется при в/м введении (мебикар — 99%, бикарэт — 69%), и при введении таблеток препаратов (мебикар - 87%, бикарэт - 35%). Низкая биодоступпость бикарэта объясняется пресистемным его метаболизмом в печени и кишечной стенке.

Действительно, как нами установлено, интенсивность метаболических превращений производных данного ряда химических соединений увеличивается при возрастании напряжённости бициклической системы - от минимальной у неметаболизирующего мебикара до максимальной у бикарэта, около 80% которого подвергается метаболизму.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОКИНЕТИКА ТЕТРЛМЕ31ША.

Кинетика тетрамезина в крови при различных способах введения. Динамика концентраций тетрамезина в плазме после в/в введения в дозе 200 мг/кг описывается уравнением двухчастевой модели, значения параметров фармакокинетики приведены в табл. 6.

Таблица 6. Фармакокинетические параметры тетрамезина при внутривенном

введении крысам

Параметр Величина

Константа скорости элиминации, ч"1 1,67 ±0,16

Объём распределения, л-кг"' 1,25 ±0,06

Клиренс общий, мл-мин"1-кг"1 34,79 ± 2,50

Среднее время удерживания, ч 0,6 ±0,1

Тетрамезин быстро распределяется по органам и тканям, константа скорости перехода из крови в ткани высока и составляет ki2=2,01 ч"1, переход из тканей в кровь происходит ещё быстрее: k2i=3,99 ч"1. Коэффициент равновесного распределения препарата между периферической и центральной камерами модели (ki2/k2i) равен 0,504; таким образом, после достижения равновесия в тканях периферической камеры находится около 67% его дозы.

Период полуэлиминации, который очень мал и составляет 0,4 ч, говорит о быстром выведении препарата из организма путём экскреции и биотрансформации. Через 3 ч после введения тетрамезин в плазме крови обнаруживается лишь в следовых количествах.

Относительно высокий клиренс тетрамезина, (6,96 мл-мин"1 на крысу) указывает на быстрое очищение организма от вещества, в основном, за счёт метаболической элиминации. Объем распределения, составляющий 1,25 л-кг"1, значительно превышает объём крови у крысы; следовательно, тетрамезин захватывается тканями.

Для проверки линейности фармакокинетической модели тетрамезин вводили крысам в/м в дозах 200 и 500 мг/кг, данные представлены на графиках (рис. 7).

Динамика плазменных концентраций тетрамезина описана одночастевой моделью со всасыванием, при этом сравнивали два механизма процесса всасывания: по первому порядку и по нулевому. Минимизация ошибки определения достигается во втором случае, поэтому предпочтение отдали всасыванию по нулевому порядку с постоянной скоростью R. Значение р (комплексный параметр Р-фазы) взяли из данных после в/в введения.

С.мкг/кл

С.ш-'.гЛ'л

Рис. 7. Динамика концентрации тетрамезина в плазме крови крыс после внутримышечного введения: А - в дозе 200 мг/кг; Б - в дозе 500 мг/кг.

Общий вид уравнений:

Я

если 0<1<ТК, то С, = -—

если 1>ТК, то

где Тх - время окончания абсорбции.

Для в/м введения тетрамезина в дозе 200 мг/кг:

при 0 < I <! 0,4 Сг = 154 (1 - е"2'14'); (1)

.при 1>0,4 С, = 88,5-е-2Л4(1-°'4);

для в/м введения в дозе 500 мг/кг:

при 0 <1 <0,38 С, = 483( 1 -е"1'81); (2)

при I > 0,38 С, = 239-е"Ш1_0'38).

Значения фармакоюшстичсских параметров для в/м введения тетрамезина, рассчитанные на основании уравнений (1) и (2), представлены в табл. 7.

При в/м введении тетрамезин быстро поступает в систему кровообращения животных. Это согласуется с хорошей растворимостью препарата в воде, поскольку при введении в мышцу водных растворов гидрофильных препаратов

наблюдается их быстрое всасывание в кровь, максимальная концентрация тетрамезина в плазме достигается уже через 23-24 мин.

Как видно из графиков па рис. 7, наклон их терминальных участков, а, следовательно, скорости выведения тетрамезина из организма, близки между собой при в/м введении в разных дозах. Если первое уравнение в системе уравнений 1 и 2 служит для описания процесса всасывания, то второе — для процесса выведения тетрамезина из организма. Значения констант kei роо) ~ 2,14 ч" и k«i (5оо) =1,80 ч'1 говорят о быстрой элиминации препарата. Абсолютная биодоступность тетрамезина при в/м введении составляет соответственно 64% и 76% для доз препарата 200 и 500 мг/кг.

Таблица 7. Фармакокинетические параметры тетрамезина _при внутримышечном введении крысам _

Параметр Доза 200 мг/кг Доза 500 мг/кг

Величина Величина

Константа скорости абсорбции, ч"1 Константа скорости элиминации, ч"1 Объём распределения, л кг"1 Клиренс общий, мл-мшг'-кг"1 Среднее время удерживания, ч Абсолютная биодоступность , % 2,17 ±0,13 2,14 ± 0,08 0,97 ±0,10 34,60 ± 2,77 0,5 ± 0,1 64 1,82 ±0,19 1,80 ±0,08 1,15 ± 0,11 34,50 ± 2,59 0,6 ± 0,1 76

Изучению фармакокинетики тетрамезина при п/о способе введения придавали особое значение, поскольку предполагаемой лекарственной формой препарата являются таблетки. На рис. 8 изображён график изменения концентрации действующего вещества во времени при данном способе введения препарата.

Рис. !>'. Динамика концентрации тетрамезина в плазма крови крыс после пероралъного введения а лозе 200 тиг/кг.

Фармакокинетические параметры тетрамезина рассчитали в рамках двухкамерной модели с учётом всасывания. Общий вид фармакокинетической

кривой при внесосудистом введении формализуется трёхэкспоненциальным уравнением. При внесосудистом введении в ряде случаев лучшее приближение удаётся получить при учёте времени, необходимого препарату для достижения кровеносного русла. Введя величину латентного периода ^=0,025 ч, мы получили хорошее приближение расчётной кривой С=Г(1) к экспериментальным данным. В табл. 8 представлены значения фармакокинстических параметров тетрамезина после п/о введения в дозе 200 мг/кг.

Таблица 8. Фармакокинетические параметры тетрамезина _при пероральном введении крысам_

Параметр Величина

Латентное время, ч Константа скорости абсорбции, ч"1 Константа скорости элиминации, ч"1 Объём распределения, л-кг"1 Клиренс общий, мл-мин"'-кг1 Среднее время удерживания, ч Абсолютная биодоступность, % 0,025 ± 0,003 44,16 ± 1,99 3,10 ±0,34 0,67 ± 0,05 34,62 ±3,81 0,3 ± 0,1 10

Для многих слабоионизирующих соединений коэффициент распределения в системе органический растворитель - вода соответствует скорости их проникновения через мембрану Даниелли. Таким образом, тетрамезин, имеющий Драсп.=0,63 в системе хлороформ-вода, с высокой скоростью проникает через мембраны по типу простой диффузии или пассивного транспорта, чем и объясняется высокая скорость всасывания ЛВ. То обстоятельство, что константа скорости абсорбции при п/о введении тетрамезина значительно выше, чем при в/м введении, возможно объяснить образованием комплексов ЛВ с белками мышечной ткани, что приводит к более медленному всасыванию препарата из мышц.

Рис. 9. Величина биодоступности тетрамезина при различных способах введения.

Низкая степень биодоступности тетрамезина при п/о введении, составляющая около 10%, соответствует факту пресистемного метаболизма и гидролиза препарата. Величина абсолютной биодостушюсти тетрамезина при различных способах введения у крыс изменяется в порядке, представленном на рис. 9. При назначении тетрамезина внутрь необходимо перенесение места всасывания препарата за пределы желудка. Этого можно достичь использованием для таблеток в качестве плёнкообразователей веществ, нерастворимых в воде и желудочном соке, но растворимых в кишечных жидкостях.

Экскреция тетрамезина. Экскрецию тетрамезина с мочой и фекалиями изучали после в/м введения крысам в дозе 200 мг/кг. Неизменённого препарата с мочой выводится, учитывая степень биодоступности, всего около 5% от введённой дозы, незначительная часть выводится с фекалиями. Большая часть J1B подвергается биотрансформации, и из организма выводятся продукты его метаболических превращений.

Кинетику тетрамезина в моче анализировали с использованием уравнения кумулятивной экскреции. Константы элиминации тетрамезина, рассчитанные по данным мочевой экскреции, дают среднее значение, несущественно отличающееся от константы элиминации, найденной при изучении кинетики препарата в плазме крови после в/м введения. Близость значений констант элиминации даёт возможность определять некоторые фармакокинетические параметры тетрамезина, не используя инвазивные способы отбора биопроб, -например, значение периода полуэлиминации 0,37 ч, рассчитанное по данным мочевой экскреции, хорошо соответствует ti/2,p=0,32 ч, определённому для кинетики препарата в плазме крови при в/м способе введения.

В то же время значение константы скорости мочевой экскреции кэ=0,1 ч"1 резко отличается от константы скорости элиминации тетрамезина из организма 2,1 ч"1. Это даёт основание считать, что основным путём элиминации препарата из организма крыс является его биотрансформация. Рассчитанный по мочевой экскреции общий клиренс 30,3 мл-мин^-кг"1 практически совпадает с общим клиренсом 34,6 мл-мин '-кг"1, рассчитанным по плазменным концентрациям препарата.

Расчётное значение ренального клиренса составляет 2,5 мл-мин'-кг1, т.е. из всего объёма распределения только небольшая часть освобождается от тетрамезина за счёт его выведения с мочой. Полученные данные могут быть полезны при изучении клинической фармакокинетики тетрамезина и его терапевтическом мониторинге.

Связывание тетрамезина белками крови. Метаболизм тетрамезина. Тетрамезин не обладает выраженными кислотно-основными свойствами, поэтому его связывание с белками крови может происходить не по типу кислотно-основного взаимодействия, а за счёт участия третичных атомов азота в образовании водородных или Ван-дер-Ваальсовых связей с белковыми молекулами.

Взаимодействие тетрамезина с белками плазмы изучили методом равновесного диализа, для чего использовали стабилизированную кровь доноров, из которой получали плазму, результаты приведены в табл. 9.

Таблица 9. Изучение связывания тетрамезина белками плазмы.

Концентра- Найдено тетрамезина,

Время ция исходных мкг/мл Связан-

инкуби- растворов Определено во Контроль ного

рования, тетрамезина в внешней тетраме-

ч буфере, камере в Внутрен- Внешняя зина,

мкг/мл условиях няя камера камера %

опыта

1 300 154,0 ±22,0 206,0 222,7 28,1 ±2,1

200 101,0 ±6,6 137,8 146,3 28,9 ±2,2

20 9,8 ± 0,4 14,8 13,9 31,9 ±2,9

2 300 153,2 ± 16,9 216,6 217,7 29,4 ± 2,8

200 103,9 ± 15,9 153,7 154,7 32,7 ± 2,0

20 9,7 ±0,4 13,4 14,9 31,5 ±2,1

В эксперименте in vitro около 30% взятого в опыт количества тетрамезина в интервале от 20 до 300 мкг/мл связывается с белками плазмы крови. Равновесие между свободным тетрамезином и его белковым аддуктом устанавливается в течение часа. '

Сравнительную тонкослойную хроматографию экстрактов мочи крыс после в/м и п/о введения тетрамезина, а также интактных крыс проводили с использованием систем различной полярности. С учётом того, что возможным метаболитом тетрамезина является 1-(|3-аминоэтил)-3,3-диметилдиазиридин, в качестве свидетеля использовали образец этого вещества, В результате установлено следующее:

а) тетрамезин частично выводится с мочой в неизменённом виде;

б) как при п/о, так и при в/м введении тетрамезин частично выводится в виде метаболита - 1-(р-аминоэтил)-3,3-диметилдиазиридина;

в) метаболит тетрамезина обнаруживается в моче крыс уже в течение . первого часа после введения, и из организма он исчезает довольно быстро:

основное его количество выводится в течение 4 ч после введения;

г) тетрамезин не разлагается в моче даже при весьма длительной экспозиции.

Анализ мочи собак после п/о введения им тетрамезина свидетельствует об идентичности его биотрансформации. Допустимо предположить, что и в организме человека будет образовываться 1-(Р-аминоэтил)-3,3-диметилдиазиридин в качестве основного метаболита тетрамезина.

Методом препаративной ТСХ выделены продукты биотрансформации

тетрамезина, которые подвергли дальнейшему ГХ-МС изучению. Этим же мртгтом анализиоовали экстракты суточной мочи крыс до и после введения

препарата. На рис. 10 представлена газожидкостная хроматограмма суммы метаболитов тетрамезина после его п/о введения.

и

ю

I - 1-(Р-аминоэтил)-3,3-Д"метилдиазиридии

II - второй метаболит тетрамезина Ш - тетрамезин

IV - эндогенное соединение

Т, мин

Рис. 10. Газожидкостная хроматограмма суммы метаболитов после перорального введения тетрамезина крысам.

Хроматограммы суммы метаболитов тетрамезина после п/о и в/м введения содержат по четыре основных пика, из которых III пик соответствует тетрамезину. При обоих случаях введения препарата присутствует интенсивный пик соединения I со временем удерживания 4,5 мин, его масс-спектр идентичен масс-спектру полученного встречным синтезом l-(ß-аминоэтил)-3,3-днметилдиаз!фидпна и метаболита, выделенного ранее препаративно. Пик IV принадлежит эндогенному соединению. Масс-спектр, снятый на вершине пика соединения П, принадлежит пока не идентифицированному метаболиту тетрамезина, хотя характер фрагментации позволяет предполагать, что данное соединение близко по строению к диазиридинам.

Биодоступность таблеток тетрамезина. Относительную биодоступность таблеток тетрамезина определяли на собаках (три собаки по 20 кг) при однократных введениях. 1-й собаке вводили в/в тетрамезин в виде водного раствора, а также внутрижелудочно через зонд водный раствор и таблетки препарата, покрытые кшпечнорастворимой оболочкой. Другим собакам также вводили в/в водный раствор действующего вещества и п/о таблетки. Динамика концентрации тетрамезина в плазме крови 1-й собаки после п/о введения в виде таблеток и в виде водного раствора субстанции показана на рис. 11.

Рис. 11. Динамика концентрации тетрамезина в плазме крови собаки № 1 после пероралыюго введения раствора субстанции (I) и таблеток (II),

Фармакокинетические параметры тетрамезина при различных способах его введения собаке, рассчитанные методом статистических моментов, представлены в табл. 10.

В организме собаки, по сравнению с крысами, тетрамезину при п/о введении свойственно более быстрое распределение по органам и тканям и более медленная элиминация из организма.

Таблица 10. Фармакокинетические параметры тетрамезина, _рассчитанные для собак._

Способ введения тетрамезина (доза 100 мг/кг)

Параметр Внутривенное Пероральное введение субстанции Пероральное введение таблеток

Константа скорости абсорбции, ч"1 - 20,31 15,85

Константа скорости элиминации, ч"1 1,25 0,62 0,59

Клиренс общий, мл-мин"'-кг"1 8,75 8,47 8,46

Объём распределения, л-кг"1 0,42 0,82 0,86

Среднее время удерживания, ч 0,8 1,6 1,7

Абсолютная биодоступность, % 100 53 71

Поскольку элиминация тетрамезина из крови собак замедлена, то меньшую величину имеет и общий клиренс. По всей видимости, большее время полуэлиминации препарата для собак связано с меньшей, чем в организме крыс, активностью ферментов, индуцирующих биотрапсформацию тетрамезина.

Кишечнорастворимая оболочка таблеток тетрамезина позволила увеличить абсолютную биодоступность лекарственной формы ЛВ, по сравнению с и/о введением субстанции, от 53 до 71%.

Значения времени удерживания для п/о введения субстанции и таблеток тетрамезина близки между собой и отличаются от времени удерживания для в/в введения, что является понятным, поскольку в первом случае после введения препарата требуется определённое время для поступления лекарственного вещества в системное кровеносное русло.

Абсолютная биодоступность таблеток тетрамезина у собак подвержена значительной индивидуальной вариабельности (табл. 11).

Таблица 11. Значения абсолютной биодоступности таблеток тетрамезина у

собак.

Параметр Собака 1 Собака 2 Собака 3

Площадь под кривой «концентрация-время» при внутривенном введении, МКГ'Ч'МЛ"1 198 204 172

Площадь под кривой «концентрация-время» при введении таблеток, мкг-ч-мл 140 132 79

Абсолютная биодоступность, % 71 65 46

Полученные данные указывают на межвидовую флуктуацию фармакокинетичсских параметров тетрамезина при переходе от мелких к крупным животным, заключающуюся, в частности, в более медленной элиминации тетрамезина в организме собак по сравнению с крысами. Можно прогнозировать уменьшение клиренса и увеличение значений среднего времени удерживания тетрамезина в организме человека.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОКИНЕТИКА ФЕНОТРОШ1ЛА

Кинетика фенотропила в крови при различных способах введения. Фармакокинетику фенотропила изучали на крысах, которым вводили препарат в/в, в/м и п/о в дозе 100 мг/кг. Динамика концентраций фенотропила в плазме при в/в введении описывается уравнением двухчастевой модели; при п/о -уравнением одночастевой модели с учётом всасывания; при в/м введении -уравнением одночастевой модели с учётом всасывания.

В табл. 12 представлены фармакокинетические параметры фснотропила при различных способах введения его крысам.

Фенотропил быстро всасывается при внесосудистом введении крысам, причём, при п/о введении - гораздо быстрее, чем при в/м. Значения констант элиминации близки между собой при различных способах введения ЛВ и соответствуют относительно медленному выведению препарата из организма крыс.

Таблица 12. Фармакокинетические параметры фенотропила для крыс

Параметр Способ введения фенотропила

Внутривенно Перорально Внутримышечно

Константа скорости абсорбции, ч"1 - 4,62 ± 0,27 1,71 ±0,18

Константа скорости элиминации, ч"1 0,36 ± 0,02 0,23 ± 0,02 0,26 ± 0,02

Объём распределения, л • кг"1 1,03 ±0,18 1,62 ±0,21 1,42 ±0,26

Клиренс общий, мл-мин"1-кг"1 6,18 ± 0,32 6,21 ±0,44 6,15 ±0,26

Среднее время удерживания, ч 2,8 ± 0,2 4,3 ± 0,4 3,8 ± 0,3

Абсолютная биодоступностъ, % - 100 100

Сравнительно высокие значения кажущегося объёма распределения фенотропила у крыс указывают на его интенсивное внутриклеточное распределение. Общий клиренс фенотропила ниже клиренса креатинина, это характерно для реабсорбции препарата в почечных канальцах. Высокая скорость всасывания фенотропила и практически 100%-я биодоступпость при внссосудистых способах введения связаны с его липофильностью и отсутствием выраженных кислотно-основных свойств. Перспективными лекарственными формами фенотропила являются как таблетки, так и растворы для инъекций, однако для достижения эффективной концентрации препарата в крови в короткий интервал времени таблетированная форма является предпочтительной.

Экскреция фенотропила. Экскрецию фенотропила изучали на крысах после п/о введения в дозе 100 мг/кг. С мочой выводится 39% от введённой дозы, причём за 24 ч элиминируется примерно 94% от общего количества выведенного с мочой ЛВ, на третьи сутки в моче обнаруживаются лишь следовые количества препарата.

• Для анализа кинетики фенотропила в моче применили уравнение кумулятивной экскреции, линеаризированная форма которого (см. рис. 12) удовлетворительно описывает экспериментальные данные. Константы

элиминации фенотропила, рассчитанные по данным мочевой экскреции, (табл. 13) указывают на их значительную индивидуальную вариабельность у крыс. I» оч, - М)

1.00.90,80.7-О.й-0.50.40.30.20.1 -

О 2 4 6 8 Т, ч

Таблица 13. Константы элиминации фенотропила из организма крыс.

Крыса № К*ь ч1 Кэл (средн.), ч-1 Метрологические характеристики (п = 6)

1 0,190

2 0,081 р = 0,95

3 0,180 0,134 5Х = 1,84 • 10"2

4 0,115 К,л = 0,134 ± 0,047

5 0,094

6 0,143

Величина константы элиминации 0,13 ч"1, найденная по данным мочевой экскреции, меньше значения к51 = 0,23 ч"1 препарата, рассчитанной на основании данных по его кинетике в плазме. Вследствие этого следует с осторожностью относиться к значениям параметров, рассчитанным по данным мочевой экскреции.

Распределение Фенотропила по органам животных. При изучении распределения фенотропила по органам крыс его вводили и/о в дозе 100 мг/кг; для исследования брали печень, почки, сердце, мозг. Готовили гомогенаты органов, в которых определяли содержание фенотропила, результаты представлены в табл. 14.

Таблица 14. Динамика концентрации фенотропила в органах крыс.

Время после введения препарата, ч Концентрация фенотропила в мкг препарата на грамм органа

мозг сердце печень почки

0,25 1,6 ± 0,2 3,7 ± 0,6 25,6 ±2,4 33,2 ± 3,4

0,50 2,0 ± 0,3 7,9 ± 0,9 30,1 ±4,3 37,5 ± 4,0

1,00 6,4 ± 0,8 10,1 ± 1,0 75,8 ± 8,2 55,7 ± 5,8

1,50 4,0 ± 0,6 14,2 ± 1,3 67,7 ±7,1 50,4 ± 6,0

2,00 1,2 ±0,3 12,6 ± 1,2 59,6 ± 5,4 37,2 ±4,1

4,00 0,4 ± 0,2 8,4 ± 1,0 30,2 ± 3,4 28,0 ± 3,2

6,00 - 5,4 ± 0,8 17,7 ±2,1 16,0 ±2,1

8,00 - - 11,4 ± 1,6 10,1 ±1,3

Фенотропил быстро распределяется по органам, и максимальное содержание его в органах достигается практически одновременно с достижением максимального содержания в крови.

В табл. 15 приведены фармакокинетические параметры фенотропила для различных органов крыс при п/о применении ЛВ. Уровень содержания фенотропила в почках и печени в различные интервалы времени близок к уровню содержания в плазме крови, в то время как в сердце и, особенно в мозге, уровень содержания значительно ниже. Из печени, почек и сердца фенотропил выводится довольно медленно.

Таблица 15. Фармакокинетические параметры фенотропила в органах крыс

Параметр Орган

Мозг Сердце Почки Печень

Константа скорости элиминации, ч"1 1,2 0,2 0,2 0,3

Объем распределения, л • кг"1 10,5 6,0 1,6 1,2

Клиренс общий, мл-мин"'-кг"1 210,0 20,0 .5,3 6,0

Среднее время удерживания, ч 1,5 5,4 4,6 4,0

Как показано на рис. 13, степень тропности фенотропила к различным органам неодинакова и убывает в последовательности: печень, почки, сердце, мозг. Высокая тропность фенотропила к тканям почек и печени может быть обусловлена их выводящей функцией. Наличие фенотропила в мозге свидетельствует о его способности проникать через гематоэнцефалический барьер.

с 3

«рдц* иозг

л(1«нь почки

Рис. 13. Степень тропности фенотропила к тканям печени, почек, сердца и

РТзучение метаболизма фенотропила. Биодоступпость таблеток фснотропила в экспериментах in vitro и in vivo. Для изучения возможного метаболизма фенотропила крысам вводили п/о водный раствор препарата в дозе 100 мг/кг. Анализ экстрактов суточной мочи методом ТСХ не выявил метаболизма JIB в организме крыс.

Для подтверждения этого факта расширили область исследования, и возможный метаболизм изучали методом ГЖХ при п/о, в/м и в/в введении крысам. Хроматографировали хлороформные экстракты плазмы крови, мочи, гомогенатов органов (мозг, сердце, почки, печень) животных, при этом на хроматограммах также не было обнаружено каких-либо дополнительных пиков по сравнению с аналогичными экстрактами, полученными у интактных животных. Таким образом, фенотропил практически не подвергается метаболизму в организме крыс.

Биодоступность таблеток фенотропила in vitro была изучена на установке «Dissolutest» в соответствии с описанной ранее процедурой, концентрацию препарата определяли спектрофотометрически.

мозга крыс.

In (1-f'lOO)

Рис. 14, Динамика высвобождения фенотропила из таблеток:

I — в 0,1 н. водном растворе HCl,

II — в 0,1 н. водно-сниртовом растворе

HCL

На рис. 14 представлена зависимость степени высвобождения фенотропила из таблеток от времени. Полученные дашше свидетельствуют о высокой биодоступиости таблеток фенотропила в опытах in vitro, на что указывает как большая скорость (константа скорости высвобождения фенотропила из таблеток Ks=0,4-0,5 мин"1), так и полнота высвобождения действующего вещества (через 15 мин после начала опыта высвобождается практически 100% препарата).

Рис. 15. Динамика концентрации фенотропила в плазме крови кроликов после перорального введения препарата. 1 - стандартная лекарственная форма; 2 - таблетки.

Введение кроликам п/о водного раствора (стандартная лекарственная форма) и таблеток фенотропила позволило определить относительную биодоступность лекарственной формы in vivo. Рис. 15 отражает динамику концентрации препарата в плазме крови кроликов.

Динамика концентраций фенотропила в плазме крови кроликов после введения стандартной лекарственной формы и таблеток в дозе 100 мг/кг описывается одночастевой моделью со всасыванием, фармакокинетические параметры представлены в табл. 16.

Таблица 16. Фармакокинетические параметры фенотропила (в опытах на

Параметр Стандартная лекарственная форма Таблетки

Константа скорости абсорбции, ч"1 2,96±0,23 0,52±0,11

Константа скорости элиминации, ч"1 0,15±0,01 0,10±0,01

Объём распределения, л-кг"1 1,35±0,05 1,56±0,10

Клиренс общий, мл-мин"'-кг"' 3,38±0,14 2,60=ь0,18

Среднее время удерживания, ч 6,7 ± 0,4 10,0 ± 1,0

Скорость всасывания фенотропила после приема таблеток значительно ниже, чем при приёме стандартной лекарственной формы. Время достижения максимальной концентрации в плазме крови после приёма таблеток почти в 4 раза превышает время после приёма стандартной лекарственной формы. Вместе с тем, после приёма таблеток скорость выведения фенотропила из организма кроликов меньше, чем после введения им водного раствора препарата. Об этом же свидетельствуют и значения периодов полуэлиминации фенотропила. Биодоступность таблеток фенотропила практически совпадает с биодоступностью стандартной лекарственной формы.

Таким образом, хотя максимальная концентрация фенотропила в крови после приёма таблеток достигается медленнее, чем при введении раствора препарата, время циркуляции в крови кроликов после приёма таблеток существенно больше, чем после введения стандартной лекарственной формы. Следует отметить определённые корреляционные тенденции между высокой скоростью высвобождения фенотропила из таблеток в эксперименте in vitro и высокой относительной биодоступностью таблеток в эксперименте in vivo ira кроликах.

Сравнительная фармакокинетика Фенотропила и пирацетама. Ноотропная и психостимулирующая активность фенотропила значительно выше, чем у известных ноотропов, в том числе и эталонного препарата - пирацетама. Сопоставление пирацетама и фенотропила по их важнейшим фармакокинетическим характеристикам делает информационное поле по ноотропным препаратам более целостным, приближает к пониманию механизмов их действия.

И фенотропил, и пирацетам хорошо всасываются из ЖКТ: биодоступность обоих препаратов близка к 100%, их концентрация в сыворотке крови достигает максимума за время, не превышающее 1 ч. В случае в/м введения фенотропила это время составляет примерно 1,5 ч, т.е. скорость всасывания последнего при п/о применении больше.

Значения объёма распределения пирацетама, составляющие примерно 200 мл, а для фенотропила изменяющиеся от 280 мл при в/м введении до 320 мл на одну крысу при п/о применении препарата, косвенно подтверждают отсутствие биотрансформации у обоих препаратов. В то же время большее значение объёма распределения у фенотропила указывает и на его более интенсивное внутриклеточное распределение.

Оба препарата хорошо проникают в печень, почки, обнаруживаются в сердце и, что особенно важно для препаратов этого вида действия, в головном мозге. Однако если у пирацетама концентрация в мозге максимальна через 2-3 часа, то фенотропил быстрее проникает через гемагоэнцефалический барьер, и максимальное содержание его в органах достигается одновременно с кровью.

Скорости выведения обоих препаратов из мозга различаются весьма существенно - период полуэлиминации пирацетама составляет 2,6 ч, а у фенотропила этот период более, чем в 4 раза короче.

В организме крыс препараты не кумулируют, период полуэлиминации

ттттпяттр.тлм'я nanpw 1 S ït a v гЬлиптплпитта ли у^п^ьтрптга^т^о тгтлпочттт! л-г О 7

ч при в/м введении до 3,0 ч при в/в, что свидетельствует об относительно медленном, по сравнению с пирацетамом, его выведении из организма крыс.

Таким образом, фармакокинетика фенотропила во многом сходна с фармакокинетикой пирацетама, оба лекарственных соединения не метаболизируют в организме крыс. В то же время наблюдаются и различия в фармакокинетике сравниваемых препаратов, связанные, возможно, с присутствием дополнительного, по сравнению с пирацетамом, фенильного ядра в молекуле фенотропила, не влияющего на его кислотно-основные свойства, но увеличивающего липофильность соединения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОКИНЕТИКА ФЕНОЗАН-

КИСЛОТЫ

Хроматомасс-спектрометрия. Фенозан-кислота (ФК) среди пространственно-затрубнённых фенолов по антиоксидантпой активности представляет наибольший интерес в качестве потенциального лекарственного препарата. Калиевая соль ФК (феноксан), сохраняя в себе все достоинства изучаемого соединения, хорошо растворима в воде, что в лечебной практике часто является решающим преимуществом.

С целью изучения доклинической фармакокинетики ФК разработан способ идентификации исследуемого соединения в многокомпонентном биологическом материале методом хроматомасс-спектрометрии. Использовали хроматомасс-спектрометр Hewlett-Packard 5980 в составе системы, состоящей из масс-селекгивного детектора HP 5971А и станции обработки данных HP 59970С. Количественное определение действующего вещества проводили по метиловому эфиру фенозан-кислоты (МЭФ) после предварительной дериватазации анализируемого соединения диазометаном. По сравнению с ФК у МЭФ лучшие характеристики, связанные с летучестью, хроматографической подвижностью, термической устойчивостью.

Количественное определение проводили в режиме мониторинга селективных ионов, m/z для МЭФ 277 (количественный), 292 и 219 (подтверждающие идентификацию); для внутреннего стандарта (додекана) m/z 170 (количественный) и 85 подтверждающий.

Методика количественного анализа ФК в биологических объектах состоит в следующей последовательности стадий: экстракция препарата, этерификация кислоты, разделение на колонке и регистрация с помощью масс-селективного детектора.

Фармакокинетика ФК в крови при внутривенном и пероральном введении. Экспериментальную фармакокинетику феноксана и ФК в дозе 100 мг/кг исследовали у кроликов при различных способах введения. Динамика концентраций ФК в плазме крови кроликов при в/в введении описывается биэкспоненциальным уравнением двухчастевой модели, в табл. 17 приведены соответствующие значения параметров ФК для кроликов.

Таблица 17. Фармакокинетические параметры фепозан-кислоты у кроликов при внутривенном введении феноксана

Параметр Величина

Константа скорости элиминации, ч"' Объём распределения, л-кг"1 Клиренс общий, мл-мин"'-кг 1 Среднее время удерживания, ч 0,27 ± 0,04 6,77 ± 0,87 30,47 ± 1,70 11,9 ± 1,1

Для оценки фармакокинетики ФК при пероралыюм введении, учитывая плохую растворимость субстанции в воде, её растворяли в твине-80.

С, мкг/мл

Рис. 16. Динамика концентрации фепозан-кислоты в плазме кроликов после введения субстанции препарата внутрь.

г5 т.*

На рис. 16 представлена динамика концентраций препарата в плазме крови кроликов после пероралыюго введения в дозе 100 мг/кг, в табл. 18 приведены соответствующие значения фармакокинетических параметров, рассчитанные но уравнению одночастевой модели со всасыванием.

Таблица 18. Фармакокинетические параметры фенозан-кислоты при пероральном введении кроликам

Параметр Величина

Константа скорости абсорбции, ч"1 Константа скорости элиминации, ч"1 Объём распределения, л-кг"1 Клиренс общий, мл-мин'-кг"1 Среднее время удерживания, ч Абсолютная биодоступность, % I,42 ±0,20 0,09 ± 0,02 35,31 ±2,62 52,97 ± 8,23 II,1 ±2,3 58

Фармакокинетические параметры, характеризующие стадии распределения и выведения препарата из организма кроликов, имеют близкие значения при внутрисосудистом и внесосудистом способах его введения. Высокие значения объёма распределения ФК при различных способах её введения свидетельствуют о внутриклеточном проникновении препарата, захвате его органами и тканями. Общий клиренс ФК значительно превышает величину клубочковой фильтрации у кроликов, приближаясь к значению почечного кровотока, то есть элиминируется препарат из организма, в основном, за счёт биотрансформации.

Довольно высокое значение константы скорости абсорбции ФК при п/о введении хорошо согласуется с физико-химическими свойствами соединения. Являясь по своей природе слабой кислотой (рКа=4,5б) и обладая липофильными свойствами, ФК в неионизированном виде приникает через биологические мембраны путём простой диффузии, легко всасывается и медленно выводится из организма.

Таким образом, при в/в введении препарат быстро распределяется по кровеносному руслу; при внесосудистом (п/о) способе введения быстро всасывается и сравнительно медленно выводится из организма кроликов. Величина абсолютной биодоступности ФК при п/о введении имеет невысокое значение, что связано, как будет показано ниже, с наличием пресистемного метаболизма препарата.

Биодоступность лекарственных форм фенозан-кислоты. Изучена биодоступность в эксперименте in vivo двух лекарственных форм ФК -таблеток и свечей. Динамика концентрации действующего вещества в плазме крови кроликов после введения таблеток и ректальных свечей в дозе 100 мг/кг описывается уравнениями одночастевой модели первого порядка со всасыванием, значения фармакокинетических параметров ФК приведены в табл. 19.

Как и в случае введения таблеток, ФК из свечей быстро всасывается, максимальная концентрация в плазме крови достигается через такое же время. При этом способе введения действующее вещество также медленно элиминируется из организма кроликов.

Таблица 19. Фармакокинетические параметры фенозан-кислоты при введении

таблеток и свечей

Параметр Таблетки Свечи

Константа скорости абсорбции, ч"1 Константа скорости элиминации, ч"1 Объём распределения, л-кг"1 Клиренс общий, мл-мин'^кг"1 Среднее время удерживания, ч Абсолютная биодоступность, % 1,28 ± 0,29 0,08 ± 0,02 50,41 ±6,22 67,21 ±9,54 12,5 ±2,4 47 1,45 ± 0,33 0,07 ± 0,01 48,35 ± 3,76 56,41 ±5,97 14,3 ± 1,8 51

Высокое значение объёма распределения также соответствует интенсивному внутриклеточному распределению препарата, значение общего клиренса позволяет предполагать, что и при ректальном введении основной путь элиминации JIB из организма - выведение продуктов метаболизма. Абсолютная биодоступность свечей ФК незначительно выше, чем таблеток препарата.

Биодоступпость таблеток ФК в эксперименте in vitro определяли с помощью комплекса «Dissolutest». Установлена высокая скорость высвобождения препарата из таблеток - полное высвобождение действующего начала происходит за 45 мин, а 75% ФК - за 21 мин. Быстрое высвобождение из таблеток соответствует скорости всасывания ФК после введения таблеток кроликам в эксперименте in vivo.

Метаболизм Фенозан-кислоты. Метаболизм ФК изучали при п/о введении кроликам. Растворы остатков после упаривания органических экстрактов суточной мочи, кроликов до и после введения ФК и растворы предполагаемых метаболитов подвергали ГХ-МС анализу. Масс-спектры регистрировали в максимумах хроматографических пиков. На рис. 17 представлена типичная хроматограмма суммы метаболитов ФК после её перорального введения.

I - 2,б-ди-/п/>ет-бутил-н-бензохинон

II - метиловый эфир 4-гидрокси-3,5-ди-ет^ет-бутил-

Рис. 17. Газожидкостная хроматограмма суммы метаболитов фенозан-кислоты после перорального введения препарата кроликам.

Газожидкостная хроматограмма суммы метаболитов ФК содержит 4 основных пика, при этом масс-спектр вещества со временем удерживания 25,4 мин полностью совпадает с масс-спектром МЭФ. Масс-спектр интенсивного пика соединения I со временем удерживания 11,9 мин полностью соответствует масс-спектру 2,6-ди-от/?еот-бугил-и-бензохшюпа. Масс-спектр соединения II

идентичен масс-спектру метилового эфира 4-гидрокси-3,5-ди-от/>еяг-бутилфенилкоричной кислоты.

Масс-спектр, снятый на вершине пика соединения III принадлежит пока не идентифицированному метаболиту ФК, его структура в настоящее время устанавливается.

Таким образом, метаболизм ФК в организме кроликов при п/о введении в первом приближении может быть представлен схемой, включающей в себя два параллельно идущих процесса - образование хиноидной структуры в результате окисления бензольного кольца и гидроксилирование фрагмента пропионовой кислоты в молекуле действующего вещества с последующей дегидратацией:

¿н3

I фенозан-кислота 11

МЕТОДОЛОГИЯ И ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИМИЗАЦИИ ИЗУЧЕНИЯ ДОКЛИНИЧЕСКОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКИ И МЕТАБОЛИЗМА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ.

Основные этапы изучения экспериментальной фармакокинетики. Практика собственных системных фармакокинетических исследований, изучение и обобщение опыта, накопленного в этой области медицины, позволяют выделить универсальные методологические принципы, детерминирующие объём доклинических исследований.

■ Анализ физико-химических свойств субстанции и разработка на этой основе способа количественного определения действующего вещества.

Проводить фармакокинетические исследования возможно при наличии чувствительных, селективных методов анализа препаратов и их метаболитов в биожидкостях. Выбор метода анализа определяется физико-химическими свойствами субстанции, они измеряются и регистрируются для каждого изучаемого препарата. Необходимым этапом исследования ЛВ является изучение его спектральных и хроматографических характеристик с применением наиболее информативных современных физико-химических

методов исследования, что и было показано при изучении альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенотропила, фенозан-кислоты. - Извлечение, разделение, детектирование.

Фармакокинетическое исследование начинается с извлечения JIB из биообъекта, при этом уделяется внимание очистке лекарственных средств от эндогенных веществ. Для построения калибровочных графиков необходимо проанализировать образцы биожидкостей с различной концентрацией определяемых веществ. Наиболее надёжные данные в хроматографическом анализе получаются при использовании метода внутреннего стандарта (ВС). Так, при анализе альбикара и бикарэта в качестве ВС использовали родственные по структуре производные бициклических бисмочевин, при анализе тетрамезина ВС служил ментол, а при определении фенозан-кислоты и фенотропила — додекан и 2,4,5,7,8,10-гексаметил-2,4,8,10-тетраазабицик-ло[4.4.0]декандион-3,9 соответственно.

■ Фармакокинетика при внутрисосудистом введении.

Для проверки линейности кинетики изучение проводят при различных дозах препарата. Оценку фармакокинетики ЛВ начинают с в/в инъекций, поскольку в таком случае 100% введённой дозы ассимилировано организмом. Фармакокинетика ЛВ при его однократном в/в введении определяется и для выявления степени эффективности внесосудистых способов введения. Моделирование следует начинать с рассмотрения простейшей однокамерной линейной модели.

После получения концентрационного профиля появляется' возможность расчёта наиболее важных фармакокинетических параметров - клиренса, объёма распределения в центральной камере, периода полувыведения. Если предполагается внесосудистое применение препарата, данные по в/в введению необходимы для оценки абсолютной биодоступности способа введения. Для расчёта фармакокинетических параметров ЛВ целесообразно использовать' как камерные, так и модельно-независимые методы.

■ Фармакокинетика при внесосудистых способах введения.

При п/о введении действующее вещество проходит, по крайней мере, одну

мембрану, это влечёт за собой необходимость учёта абсорбции ЛВ из ЖКТ в сосудистое русло. Хотя при приёме твёрдой лекарственной формы перед всасыванием происходит растворение, абсорбцию обычно удаётся представить как процесс, протекающий по первому порядку. При п/о применении различают две категории параметров: 1) обусловленные дозой и путем введения (абсолютная биодоступность, константа абсорбции) и 2) вытекающие из свойств препарата и особенностей экспериментального животного (константа элиминации, стационарный объём распределения). При п/о приёме ЛВ желательно иметь представление о степени усвояемости, определяющейся всасыванием и метаболизмом первичного прохождения. " Распределение по органам.

Изучение распределения ЛВ по органам и тканям даёт возможность оценить его способность проникать через биологические барьеры и судить о

концентрации в месте его действия. Фармакокинетику препарата исследуют в основных органах и органах-мишенях, получают концентрационные профили, рассчитывают кинетические параметры, определяют скорость элиминации препарата из почек, мозга, печени, мышц, поскольку у большинства препаратов коэффициенты распределения для этих тканей являются наиболее высокими.

Близким по смыслу к коэффициенту распределения является степень тропности препарата к различным органам, данная характеристика информативна при выборе лекарственной формы ЛВ. На доклиническом этапе выявляют ткани, в которых препарат накапливается избирательно. Эта информация позволяет предвидеть развитие органотропных побочных эффектов и замедленную элиминацию вещества вследствие его депонирования, а также прогнозировать фармакокинетические профили у человека. Так, в опытах на крысах для фенотропила выявлено, что степень тропности изучаемого ЛВ убывает в последовательности: печень, почки, сердце, мозг.

Индикатором степени распределения вещества служит объём распределения ЛВ в организме. Например, для тетрамезина при в/в введении объём распределения в центральной камере, полученный в опытах на крысах, составляет около 1,3 л/кг, из чего нами сделан вывод об интенсивном захвате данного препарата тканями.

Для группы родственных между собой препаратов (альбикар, мебикар, бикарэт) значения объёма распределения также свидетельствуют в пользу выраженного, хотя и не одинакового, внутриклеточного проникновения. Количественные расхождения объёма распределения у этих препаратов связаны, очевидно, с некоторыми вполне определёнными несовпадениями в электронных конфигурациях молекул, и эта информация будет полезна при установлении более тонких соответствий «структура-активность» при проведении исследований на стадии клинических испытаний.

■ Изучение экскреции препаратов.

Преобладающими механизмами элиминации являются почечная экскреция, биотрансформация и инактивация лекарственных веществ в печени. В этой связи целесообразно изучать два пути экскреции препарата из организма - по моче и фекалиям. При оценке графиков кумулятивной экскреции, скорости выведения и содержания в крови оценивают степень метаболизма.

После разработки лекарственной формы препарата проводят фармакокинетическое исследование конкретно именно этой лекарственной формы. Получают концентрационные профили в крови, сравнивают с фармакокинетикой при введении субстанции, вычисляют относительную биодоступность препарата и оценивают влияние составляющих лекарственную форму компонентов на биодоступность препарата.

Экскреция лекарственного средства должна быть охарактеризована значениями почечного и внепочечного клиренса. Несмотря на условность такого показателя, как почечный клиренс, он позволяет судить не только о скорости, но и о механизмах выведения препаратов с мочой.

Информативно сопоставление константы скорости мочевой экскреции, характеризующей скорость выведения лекарственного средства с мочой, с

общей константой скорости элиминации изучаемого вещества из организма, которая учитывает скорость его удаления из организма и за счёт экскреции, и за счёт биотрансформации. Например, сопоставление этих констант для тетрамезина, позволило сделать вывод о том, что, всосавшись в кровь, он лишь частично выводится из организма крыс в неизменённом виде, а значительная часть действующего начала метаболизирует. Этот факт нашёл своё подтверждение при изучении биотрансформации препарата.

■ Изучение метаболизма потенциального лекарственного препарата.

Метаболизм лекарственного вещества, наряду с почечной экскрецией, является основным способом его дезактивации с последующей элиминацией. Степень метаболических превращений в организме для различных веществ неодинакова - одни вещества выводятся из организма, как это было показано для фенотропила, практически в неизменённом виде, другие могут почти полностью превращаться в метаболиты, в том числе и в фармакологически активные. В соответствии с нормативными документами, доклинические исследования метаболизма лекарственных средств являются обязательным этапом изучения их экспериментальной фармакокинетики. По своему объёму, сложности и трудоёмкости, аппаратурному обеспечению эта часть работы наиболее затратна, но и получаемая информация весьма существенна.

Несмотря на различия в структурах изучаемых препаратов, их вариабельное поведение в условиях экспериментов, возможно предложить общую последовательность работ при изучении метаболизма потенциального ЛВ:

1. Изучение физико-химических, в том числе спектральных и хроматографических свойств субстанции.

2. Определение гидролитической устойчивости вещества в различных средах при физиологических значениях рН и температуры. Установление строения продуктов превращения, выявление общих принципов фрагментации под электронным ударом.

3. Выделение продуктов биотрансформации, полученных в опытах на животных.

4. Установление структуры метаболитов, их встречный синтез, составление общей схемы и оценка количественной стороны процесса.

5. Определение фармакологической активности и токсичности метаболитов.

6. Заключение о возможности повышения эффективности и безопасности применения данного потенциального ЛВ.

■ Биофармацевтические исследования.

Для обоснования оптимальной лекарственной формы препарата необходимо выполнить комплекс исследований по изучению влияния фармацевтических факторов на терапевтическую активность ЛВ. Эти исследования проводят на стадии разработки лекарственной формы для оптимизации её состава и технологии получения. Параметром оптимизации служит максимальная биодоступностъ лекарственной формы при показателях качества препарата, обеспечивающих его необходимые технологические и

потребительские свойства. Биодоступпость изучается in vivo на животных, однако эти эксперименты обладают рядом недостатков, и поэтому оправдано определение биодоступности лекарственной формы в опытах in vitro. Понятно, что существует проблема выявления корреляции между результатами экспериментов, полученных в этих принципиально различных условиях.

Биофармацевтической характеристикой таблеток является их ( распадаемость и высвобождение действующего начала. Тест на растворимость предпочтителен, поскольку абсорбция ЛВ в кровь из быстро распадающейся таблетки может быть медленной, если будет низкой скорость высвобождения препарата из таблетки, а после её распада — из гранул или их агрегатов. Допустимо рассматривать корреляционные отношения между параметрами теста растворимости и параметрами фармакокинетики.

Собственные исследования по определению биодоступносга препаратов in vitro и in vivo указывают на реальность получения достоверной информации о кинетике процессов абсорбции вещества в организме на основании изучения кинетики высвобождения действующего начала из лекарственной формы в опытах in vitro. Например, нами получено хорошее соответствие между скоростью высвобождения активного вещества из таблеток в тестах in vitro и биодоступностью этой лекарственной формы в опытах in vivo для фенотропила и фенозан-кислоты.

Фармакокинетические подходы позволяют на доклиническом уровне разрабатывать лекарственные формы с заданными свойствами, а получаемая информация при изучении биодоступноста в опытах in vitro может быть использована при разработке проектов фармакопейных статей. ■ Обобщение доклинических исследований в рекомендациях для I стадии клинических испытаний лекарственных средств.

Развитие современной медицины связано со становлением концепции и внедрением методов доказательной медицины, главная идея которой -применение в практике только тех методов лечения, эффективность которых доказана на основе научных принципов в результате клинических исследований. Основой клинических исследований нового лекарственного средства является отчёт о его доклинических испытаниях.

Целью доклинических исследований ЛВ является получение доказательств эффективности и безопасности потенциального препарата. Поэтому требуются гарантии того, что отчёт обеспечивает точное и обоснованное представление об этих качествах изучаемого вещества. Важнейшей частью материалов исследования являются данные экспериментальной фармакокинетики потенциального лекарства. Поскольку фармакокинетические исследования проводятся в соответствии с многочисленными и разнообразными схемами, целесообразно унифицировать этот вид работы, сделав её максимально информативной при минимизации требуемых затрат.

Предлагаемые основные этапы доклинического исследования фармакокинетики оригинальных лекарственных средств основаны на

собственном опыте экспериментальной и теоретической работы и находятся в соответствии с международными стандартами, прежде всего GLP.

Результатом доклинических фармакокинетических исследовании должна являться совокупность количественных характеристик поведения ЛВ в организме животных.

На основании этих характеристик разрабатываются рекомендации по регламенту проведения фармакокинетических исследований па 1-й стадии клинических испытаний. Так, используя расчётные формулы, учитывающие соотношение между значениями периода полуэлиминации у животных и человека, определены предполагаемые периоды полуэлиминации альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенотропила, фенозан-кислоты в организме человека. При изучешш клинической фармакокинетики полученная прогностическая информация позволяет оцепить необходимую длительность наблюдений за концентрацией ЛВ в организме человека и выбрать ориентировочные временные точки забора биопр'об. Полученный материал будет полезным при разработке схем индивидуального дозирования препаратов.

Таким образом, предлагаемая методология изучения экспериментальной фармакокинетики оригинальных лекарственных средств не только не противоречит, но дополняет в основной своей части правила лабораторной практики при проведении доклинических исследований лекарственных средств, утвержденные федеральным органом контроля качества лекарственных средств. Совокупность получаемых экспериментальных данных делает возможным организацию эффективного контроля, мониторинга и аудита испытаний, что внушает уверенность в объективности, достоверности и обоснованности рекомендаций, содержащихся в материалах, направляемых в Минздравсоцразвития РФ для получения разрешения на клинические испытания лекарственного средства.

Данные по экспериментальной фармакокинетике альбикара, фенотропила вошли в материалы, на основании которых получены разрешения Фармакологического комитета на их клинические испытания.

Выводы.

1. Обоснованы принципы и на примере фенотропила, альбикара, бикарэта, фенозан-кислоты и тетрамезина реализованы пути комплексного доклинического фармакокинетического изучения новых лекарственных средств, позволяющие характеризовать их поведение в организме животных, обеспечить создание оптимальных лекарственных форм и эффективных способов введения.

2. Впервые разработаны методики количественного определения с использованием газожидкостной хроматографии и хроматомасс-спектромстрии новых оригинальных потенциальных лекарственных средств: психотропных препаратов альбикара, бикарэта и тетрамезина, ангиоксиданта фенозан-кислоты и ноотропа нового поколения - фенотропила.

3. Впервые изучен метаболизм фенотропила, альбикара, бикарэта, фенозан-кислоты и тетрамезина с применением комбинации физико-химических методов (масс- и хроматомасс-спектрометрия, тонкослойная и газожидкостная хроматография).

4. При изучении метаболизма альбикара и бикарэта установлено, что в организме их первичные превращения протекают однотипно: происходит гидроксилирование метиленового звена этильной группы, приводящее к образованию соответствующих диастереомеров. Для бикарэта выявлен второй этап биотрансформации, состоящий в М-дезэтилировании а-гидроксильных шггермедиатов, а образовавшееся триэтильное производное претерпевает гидроксилирование этильной группы в а-положении к атому азота с последующим Н-ацетилированием этого соединения.

5. На основании изучения доклинической фармакокинетики альбикара и бикарэта для быстрого достижения максимальных концентраций лекарственных веществ рекомендуется внутримышечный способ введения как наиболее эффективный. Таблетированные лекарственные формы альбикара, и в особенности бикарэта, имеют относительно невысокую биодоступность, однако и они могут быть использованы при проведении клинических испытаний данных препаратов.

6. Изучение метаболизма тетрамезина при внутримышечном и пероральном способах введения позволило однозначно установить структуру основного метаболита - 1-(Р-аминоэтил)-3,3-диметилдиазиридина.

7. Обоснована целесообразность применения таблеток тетрамезина, покрытых кишечнорастворимой оболочкой, что увеличивает биодоступность таблеток . в опытах на собаках до 50-70% вследствие предотвращения кислотного гидролиза в желудке.

8. Показано, что перспективными лекарственными формами фенотропила являются как таблетки, так и растворы для инъекций, но для достижения эффективной концентрации в крови в короткий интервал времени таблетировапная форма является предпочтительной.

9. В результате изучения распределения фенотропила по органам крыс при его пероральном применении установлено, что тропность препарата убывает в последовательности: печень, почки, сердце, мозг. Максимальная концентрация быстро достигается в крови, в печени, почках, мозге и сердце. Для препарата ноотропного действия принципиально важным является доказанный факт его способности проникать через гематоэнцефалический барьер.

10. Впервые установлено, что метаболизм фенозан-кислоты в организме кроликов при пероральном введении характеризуется двумя направлениями: а) окисляется бензольное кольцо, в результате чего образуется хиноидная структура, и б) в молекуле действующего вещества гидроксилируется фрагмент пропионовой кислоты, а последующая дегидратация интермедиата приводит к производному коричной кислоты.

11. Разработан комплексный подход к изучению экспериментальной фармакокинетики оригинальных лекарственных средств, включающий

кинетику препарата в крови животных, распределение его но органам и тканям, метаболизм и элиминацию, с использованием различных методов выделения неизменённых фармакологических средств, метаболитов из биологических сред и их идентификацию.

12. Обоснованы основные этапы и методологические аспекты изучения доклинической фармакокинетики новых лекарственных средств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Прокопов A.A., Берлянд A.C., Веселовская Н.В., Уфимцева Е.В., Белова М.В., Шукиль JI.B. Идентификация и количественное определение фенозан-кислоты в биологических объектах методом хроматомасс-спектрометрии. // Хим. - фарм. журн. — 2000. - № 5. - с. 49 — 51.

2. Прокопов A.A., Н.В.Костебелов, Берлянд A.C. Количественный анализ альбикара в биологических жидкостях. // Хим. - фарм. жури. - 2001. - № 7. - с. 50 - 52.

3. Прокопов A.A., Н.В.Костебелов, Берлянд A.C. Исследование метаболизма альбикара. // Хим. - фарм. журн. - 2001. - № 10. - с. 9 - 10.

4. Прокопов A.A., Н.В.Костебелов, Берлянд A.C. Экспериментальная фармакокинетика альбикара. // Хим. - фарм. журн. - 2002. - № 3. - с. 13-16.

5. Прокопов A.A., Н.В.Костебелов, Берлянд A.C. Изучение экскреции альбикара из организма крыс. // Хим. - фарм. журн. - 2002. - № 4. - с. 7 - 8.

6. Прокопов A.A., Берлянд A.C., Казанцева О.Н. Изучение метаболизма бикарэта. // Хим. - фарм. журн. - 2002. - № 10. - с. 5 - 6.

7. Прокопов A.A., Берлянд A.C., Казанцева О.Н. Количественный анализ бикарэта в биологических объектах методом газожидкостной хроматографии. // Хим. - фарм. журн. - 2002. - № 11. - с. 49 - 51.

8. Прокопов A.A., Берлянд A.C., Казанцева О.Н. Изучение экспериментальной фармакокинетики бикарэта. // Хим. - фарм. журн. - 2003. -№ 3.-е. 25-28.

9. Прокопов A.A., Берлянд A.C., Казанцева О.Н. Исследование биодоступности бикарэта в экспериментах in vivo и in vitroV/Хим.-фарм.журн.-2003,- №4.-с. 8-11.

10. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В.И., Берлянд A.C. Количественный анализ фенотропила в биологических объектах методом газожидкостной хроматографии. // Хим. - фарм. журн. - 2003. - № 10. - с. 46 -47.

11. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В.И., Берлянд A.C. Экспериментальная фармакокинетика фенотропила у крыс. // Хим. - фарм. журн.-2003,- № 11.-С.7 — 8.

12. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В.И., Берлянд A.C. Изучение биодоступности таблеток фенотропила в экспериментах in vitro и in vivo. // Хим. - фарм. журн. - 2004. -№ 10. - с. 10 - 12.

13. Прокопов A.A., Берлянд A.C. К вопросу о путях биотрансформации производных бициклических бисмочевин. // В сборнике «Актуальные

проблемы медицины и биологии». - Сиб. гос. мед. университет, Томск. - 2004. - т. 3, № 1. - с. 95.

14. Антонова М.И., Прокопов A.A., Берлянд A.C. Химико-фармацевтическое изучение фенотропила. // В сборнике «Актуальные проблемы медицины и биологии». - Сиб. гос. мед. университет, Томск. - 2004. - т. 3, № 2. - с. 274.

15. Берлянд A.C., Прокопов A.A. Экспериментальная фармакокинетика бикарэта и альбикара. // В сборнике «Актуальные проблемы медицины и биологии». - Сиб. гос. мед. университет, Томск. - 2004. - т. 3, № 2. - с. 274.

16. Антонова М.И., Прокопов A.A., Берлянд A.C. Исследование биодоступности таблеток фенотропила в экспериментах in vivo для разработай рациональной фармакотерапии препаратом. // Материалы XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, Фармединфо. — 2004. - с. 756.

17. Берлянд A.C., Беляк Л.И., Прокопов A.A. Доклиническая фармакокинетика тетрамезина. // Материалы Российского научного форума «СКОРАЯ ПОМОЩЬ 2004». - Москва. - с. 15-16.

18. Антонова М.И., Прокопов A.A., Ахапкина В.И., Берлянд A.C. Изучение экскреции препарата фенотропил из организма крыс. // Хим. - фарм. журн. -2004.- № 11.-с. 6-7.

19. Антонова М.И., Берлянд A.C., Прокопов A.A. Сравнительная фармакокинетика фенотропила и пирацетама. // В сборнике «Естествознание и гуманизм». — Сиб. гос. мед. университет, Томск. - 2005. - т. 2, № 2. - с. 5.

20. Антонова М.И., Берлянд A.C., Прокопов A.A. Распределение фенотропила по органам животных // В сборнике «Естествознание и гуманизм». -Сиб.. гос. мед. университет, Томск. - 2005. - т. 2, №2.-с. 5.

21. Берлянд A.C., Прокопов A.A. Метаболизм тетрамезина в организме животных. // В сборнике «Естествознание и гуманизм». - Сиб.гос.мед. университет, Томск.-2005.-т.2, № 2 -с.6.

22. Берлянд A.C., Прокопов A.A. Вопросы доклинической фармакокинетики фенозан-кислоты. // В сборнике «Естествознание и гуманизм». - Сиб. гос. мед. университет, Томск. - 2005. - т. 2, № 2. - с. 6.

23. Прокопов A.A., Котлова Л.И., Берлянд A.C. Экспериментальная фармакокинетика тетрамезина. // Хим. - фарм. журн. - 2005. - № 7. - с. 8 - 12.

24. Прокопов A.A., Берлянд A.C. Биотрансформация психотропных препаратов ряда бициклических бисмочевин. // Материалы VI международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» -2005 - Москва, РУДН - с. 394.

25. . Берлянд A.C., Прокопов A.A. Новые фармакологические средства для преодоления стресса. // Материалы IV Всероссийского симпозиума «Боевой стресс: механизмы стресса в экстремальных условиях». - 2005. — Москва, ГНИИИ ВМ МО РФ. - с. 152 - 155.

26. Прокопов A.A., Берлянд A.C. Битрансформация новых психотропных средств. // Новые лекарственные средства: успехи и перспективы. Материалы V Всероссийского научного семинара «Химия и медицина». — 2005. - Уфа, ИОХ Уфимского НЦ РАН. - «Гилем». - с. 163 - 166.

27. Берлянд A.C., Прокопов A.A. Экспериментальная фармакокинетика фенотропила. Н Материалы научно-практической конференции «Общество, государство и медицина - для пожилых и инвалидов». - 2005. - Москва. - с. 23 -25.

28. Решение от 07.11.2005 о выдаче патента на изобретение по заявке № 2004132078/15 МПК 7 G01N 33/48. Способ количественного определения бикарэта в биологических объектах. Прокопов A.A., Шукиль Л.В., Берлянд A.C. /Мое. гос. медико-стомат. ун-т.

29. Прокопов A.A., Шукиль Л.В., Берлянд A.C. Исследование биодоступности лекарственных форм фенозан-кислоты. // Хим.- фарм. журн. -2006.-№ 1.-е. 3-5.

30. Прокопов A.A., Шукиль Л.В., Берлянд A.C., Веселовская И.В. Изучение экспериментальной фармакокинетики фенозан-кислоты и феноксана у кроликов. // Хим.- фарм. журн. - 2006. - № 1. - с. 6 - 8.

31. Прокопов A.A., Шукиль Л.В., Берлянд A.C. Изучение метаболизма фенозан-кислоты в организме кроликов. // Хим.- фарм. журн. - 2006. - № 2. -с.3-4.

32. Прокопов A.A., Котлова Л.И., Берлянд A.C. Изучение экскреции тетрамезина у крыс. // Хим.- фарм. журн. - 2006. - № 3. - с. 7 - 9.

33. Прокопов A.A. Биофармацсвтичсские и доклинические фармакокинетические исследования как основа для I стадии клинических испытаний лекарственных средств. // В сб.научных трудов Пятигорской государственной фармацевтической академии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической проблематики». - Пятигорск. - 2006. - с. 379- 381.

34. Прокопов A.A., Берлянд A.C. Исследование метаболизма и экскреции тетрамезина в опытах на животных. // Материалы XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, Фармединфо. -2006.-е. 577.

35. Решение от 25.01.06 г. о выдаче патента на изобретение по заявке № 2004132079/15 МПК 7 G01N 33/62 Способ количественного определения фенозан-кислоты в биологических объектах. Прокопов A.A., Казанцева О.Н., Берлянд A.C. / Мое. гос. медико-стомат. ун-т.

36. Решение от 25.01.06 г. о выдаче патента на изобретение по заявке № 2004132080/15 МПК 7 G01N 33/62 Способ количественного определения альбикара в биологических объектах. Прокопов A.A., Костсбелов Н.В., Берлянд A.C. / Мое. гос. медико-стомат. ун-т.

Прокопов Алексей Александрович (Россия)

Методологические аспекты изучения экспериментальной фармакокинетики и метаболизма новых психотропных, ноотропных и антиоксидантных лекарственных средств

Обоснованы принципы и на примере фенотропила, альбикара, бикарэта, фенозан-кислоты и тетрамезина реализованы пути комплексного доклишгческого фармакокииетического изучения новых потенциальных лекарственных средств. Разработаны методики количественного определения этих препаратов в биологических объектах, изучен метаболизм лекарственных средств с применением комбинации современных физико-химических методов исследования. Предложен комплексный подход к изучению фармакокинетики оригинальных биологически активных соединений, включающий кинетику препаратов в крови животных, распределение их по органам и тканям, метаболизм и элиминацию, с использованием различных методов выделения неизменённых фармакологических средств, метаболитов из биологических сред и их последующую идентификацию.

Сформулированы методологические аспекты и основные этапы изучения доклинической фармакокинетики новых лекарственных средств.

Alexey A. Prokopov (Russia)

Methodological aspects of study on experimental pharmacokinetic and metabolism of new psychotropic, nootropic and antioxidant drugs

' Also principles are motivated on the example of Phenotropile, Albicare, Bikarete, Phenozan-acid and Tetramezine were realized the ways of integration pre-clinical pharmacokinetic study of new potential drugs. The methods of quantitative determination this drugs in biological object are devised, the metabolism of Phenotropile, Albicare, Bikarete, Phenozan-acid and Tetramezine were studied with application of contemporary physicochemical methods combination. The comprehensive approach to pharmacokinetic study of original biologically active substances which includes the investigation of drugs kinetics in animal's blood, its distribution on organs and tissues, metabolism and elimination, was offered. Various methods of unaltered pharmacological drugs and its metabolites isolation from biological mediums and its subsequent identifications were used.

Methodological aspects and principal stages of pre-clinical pharmacokinetic study of new potential drugs are formulated.

Прокопов Алексей Александрович

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Подписано в печать 5.04.2006 г. Формат 60x90, 1/16. Объем 3,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ Ма 295

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Краснопрудная, в л. 13. т. 264-30-73 \улу\у.Ыок0 1 centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Современные исследования и разработки в области создания новых лекарств отличаются не только количественным ростом, но и принципиально новыми методологическими подходами. Известно, что сейчас невозможно внедрить препарат с любым видом активности в лечебную практику без детального изучения его фармакокинетики: процессов абсорбции, распределения, метаболизма, экскреции действующего начала и продуктов его превращения.

В настоящее время во всём мире ведётся интенсивный поиск новых лекарств для лечения психических расстройств - психостимуляторов, антидепрессантов, анксиолитиков, ноотропов и др., - несмотря на то, что арсенал психотропных средств и сейчас уже весьма разнообразен. Актуальность проблемы связана с тем, что психические расстройства остаются одними из наиболее распространённых заболеваний человечества. Поиск стимулируется и всё ещё недостаточной эффективностью имеющихся препаратов, наличием у них побочных эффектов, снижающих безопасность их применения, особенно в амбулаторных условиях. Активно изучается и сравнительно новый вид биологической активности - антиоксидантные свойства. Эти свойства предопределяют, в частности, выраженный адаптогенный эффект в случае экстремальных воздействий на организм. Поэтому синтезируется и изучается большое количество соединений с целью создания новых лекарственных препаратов данного вида действия.

В ИОХ РАН были синтезированы два новых класса биологически активных веществ - бициклические бисмочевины и диазиридины, в этих классах соединений обнаружена анксиолитическая и антидепрессантная активность; в ЛГПИ были получены новые циклические аналоги ГАМК, обладающие психостимулирующей и ноотропной активностью; в ИХФ РАН у ряда новых производных пространственно-затруднённых фенолов выявлена значительная антиоксидантная активность.

На основании фармакологического скрининга в качестве потенциальных лекарственных средств были отобраны два представителя бициклических бисмочевин: альбикар и бикарэт, в разной степени сочетающие в себе свойства анксиолитиков и антидепрессантов. Установлено, что эти соединения имеют ряд преимуществ перед препаратами аналогичного действия (седуксен, амитриптилин, азафен и др.) - отсутствие миорелаксирующего действия, отрицательного влияния на работоспособность и координацию движений, токсичных проявлений при длительном приёме.

Среди диазиридинов наиболее перспективным является тетрамезин, обладающий антидепрессивным действием с последующим транквилизирующим эффектом. Тетрамезин, в отличие от широко известных антидепрессантов имипрамина и ниаламида, в опытах на животных проявляет значительно меньшую токсичность - соответственно в 16 и 4 раза.

В ряду циклических производных ГАМК наибольший интерес представляет фенотропил, превосходящий пирацетам по выраженности психостимулирующего эффекта и ноотропной активности. В то же время для фенотропила установлено психостимулирующее, антидепрессивное, анксиолитическое, антигипоксическое, противосудорожное, адаптогенное действие.

Таким образом, фармакологические свойства этих соединений являются обоснованием для выполнения работ с целью создания на их основе новых лекарственных препаратов.

Анализ литературных данных свидетельствует о практическом отсутствии современных методов оценки качества альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила, не разработаны методики их количественного определения в биологических объектах, не изучена их доклиническая фармакокинетика, не исследованы пути их биотрансформации, не имеется данных о биологической доступности лекарственных форм. Не существует и единого методического подхода к проведению минимально необходимого, но достаточного объёма исследований на стадии изучения доклинической фармакокинетики новых лекарственных средств. Тогда как изучение фармакокинетических свойств препаратов позволяет уже на доклиническом уровне определить оптимальные пути их введения, что в дальнейшем будет способствовать подбору рациональной дозировки для использования их в лечебной практике.

В настоящее время, несмотря на ощутимый прогресс в этой области, в нашей стране большинство доклинических фармакокинетических исследований при создании новых лекарственных средств проводятся в отрыве друг от друга. Это существенно тормозит внедрение новых препаратов в медицинскую практику. В связи с этим методический подход, основанный на выборе оптимальных методов, позволяющих наиболее полно характеризовать качество лекарственного средства с помощью комплексного доклинического фармакокинетического исследования, отвечает современной тенденции методологии решения вопросов качества лекарственных средств и их безопасного применения.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящего исследования является выработка методологического обоснования и проведение системного изучения доклинической фармакокинетики, метаболизма и биофармацевтических свойств альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила; теоретическое и экспериментальное обоснование принципов комплексного использования химических и физико-химических методов на основе единых форм испытаний для оценки качества лекарственного средства; разработка высокочувствительных и специфических методик количественного определения лекарственных средств в биологических объектах на основе изучения их физико-химических свойств; разработка на основе изучения химико-фармацевтических и доклинических фармакокинетических свойств лекарственных средств рекомендаций по наиболее эффективным способам их введения, созданию лекарственных форм и регламенту проведения фармакокинетических исследований на 1-й стадии клинических испытаний.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1. разработать высокочувствительные и специфические способы количественного определения лекарственных средств в биологических объектах (плазма крови, моча, гомогенаты органов),

2. обосновать основные этапы изучения доклинической фармакокинетики лекарственных средств,

3. изучить фармакокинетику лекарственных средств на животных при внутрисосудистом и внесосудистых способах введения и определить наиболее эффективный внесосудистый способ введения лекарственных средств,

4. исследовать биодоступность таблеток альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила,

5. установить основные пути биотрансформации лекарственных средств в организме животных и идентифицировать основные метаболиты; синтезировать возможные метаболиты и структурные аналоги лекарственных средств,

6. дать рекомендации по регламенту проведения фармакокинетических исследований на 1-й фазе клинических испытаний лекарственных средств.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые разработаны методики количественного определения субстанций альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила методом ГЖХ.

Разработаны оптимальные условия извлечения лекарственных средств из биологических объектов методом жидкостно-жидкостной экстракции.

Впервые разработаны методики определения альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила в биологических объектах, характеризующиеся высокой чувствительностью и воспроизводимостью.

С применением разработанных методик впервые изучена доклиническая фармакокинетика альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила при различных способах введения; на основании полученных данных даны рекомендации по выбору наиболее эффективного способа внесосудистого введения лекарственных средств, созданию лекарственных форм и регламенту проведения исследований на 1-й фазе клинических испытаний.

Впервые установлены основные пути биотрансформации исследованных лекарственных средств в организме животных и идентифицированы мажорные метаболиты с помощью метода хроматомасс-спектрометрии.

Обоснованы методологические аспекты изучения доклинической фармакокинетики новых лекарственных средств.

Изучена биодоступность лекарственных форм в экспериментах in vivo и определена скорость высвобождения действующих начал из лекарственных форм в экспериментах in vitro.

Научная новизна исследований подтверждена положительными решениями Федерального института промышленной собственности о выдаче трёх патентов РФ на изобретения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Данные по изучению доклинической фармакокинетики альбикара и фенотропила вошли в документацию, на основании которой получено разрешение Фармакологического комитета на проведение клинических испытаний этих лекарственных средств.

Разработанные методики количественного определения альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила в биологических жидкостях применяются в лабораторной практике, а также при проведении различных фармацевтических исследований, что подтверждено шестью актами внедрения, поступившими из Пятигорской госфармакадемии.

Предложенный методологический подход к изучению доклинической фармакокинетики лекарственных средств может быть использован в качестве рекомендации по необходимому объёму и порядку проведения исследований при изучении экспериментальной фармакокинетики новых лекарственных средств.

Методологические основы фармакокинетических исследований используются в учебном процессе, находя своё отражение в лекционном, семинарском и элективном курсах занятий по общей химии.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ.

Результаты исследований экспериментальной фармакокинетики фенотропила и альбикара включены в документацию, представленную в Фармакологический комитет, на основании чего получено разрешение на проведение клинических испытаний этих лекарственных средств.

Результаты исследований экспериментальной фармакокинетики бикарэта, фенозан-кислоты и тетрамезина включены в документацию, подготовленную для представления в Фармакологический комитет.

Методологию экспериментальных фармакокинетических исследований рекомендуется принять во внимание при разработке новой научно-технической документации по проведению качественных доклинических исследований новых фармакологически активных веществ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: III Всесоюзной конференции по фармакокинетике (Москва, 1991), XI и XIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2004, 2006), Российском научном форуме «Скорая помощь» (Москва, 2004), Научно-практической конференции «Общество, государство и медицина-для пожилых и инвалидов» (Москва, 2005), VI Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», (Москва, РУДН, 2005), IV Всероссийском симпозиуме «Механизмы стресса в экстремальных условиях» (Москва, ГНИИИ ВМ МО РФ, 2005), V Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа, ИОХ НЦ РАН, 2005), 61-й региональной Конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2006 г.).

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 35 работ, в том числе 18 статей в центральных журналах, рекомендованных ВАК, и 3 положительных решения ФИПС о выдаче патентов РФ на изобретения.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, списка литературы и приложения, изложена на 316 стр., содержит 40 рисунков, 52 таблицы, 2 схемы. Список литературы включает 263 источника, из них 144 зарубежных.

ВЫВОДЫ

Обоснованы принципы и на примере фенотропила, альбикара, бикарэта, фенозан-кислоты и тетрамезина реализованы пути комплексного доклинического фармакокинетического изучения новых лекарственных средств, позволяющие наиболее полно характеризовать их качество и безопасность, обеспечить создание оптимальных лекарственных форм и эффективных способов введения.

Впервые разработаны методики количественного определения с использованием газо-жидкостной хроматографии новых оригинальных лекарственных средств: психотропных препаратов альбикара, бикарэта и тетрамезина, антиоксиданта фенозан-кислоты и ноотропа нового поколения - фенотропила.

Впервые изучен метаболизм фенотропила, альбикара, бикарэта, фенозан-кислоты и тетрамезина с применением комбинации физико-химических методов (масс- и хроматомасс-спектрометрия, тонкослойная и газожидкостная хроматография).

При изучении метаболизма альбикара и бикарэта установлено, что в организме первичные превращения обоих препаратов протекают однотипно: происходит гидроксилирование метиленового звена этильной группы, приводящее к образованию соответствующих диастереомеров. Но для бикарэта выявлен второй этап биотрансформации, состоящий в дальнейшем Ы-дезэтилировании а-гидроксильных интермедиатов, а образовавшееся триэтильное производное претерпевает дальнейшее гидроксилирование этильной группы в а-положении к атому азота с последующим Ы-ацетилированием этого соединения.

5. На основании изучения доклинической фармакокинетики альбикара и бикарэта для быстрого достижения максимальных концентраций лекарственных веществ рекомендуется внутримышечный способ введения этих препаратов как наиболее эффективный. Таблетированные лекарственные формы альбикара и в особенности бикарэта имеют относительно невысокую биодоступность, однако и они могут быть использованы при проведении клинических испытаний данных препаратов.

6. Изучение метаболизма тетрамезина при внутримышечном и пероральном способах введения позволило однозначно установить структуру основного метаболита - 1-(Р-аминоэтил)-3,3-диметилдиазиридина. Установлено, что препарат не образует конъюгатов с глюкуроновой кислотой.

7. Обоснована целесообразность применения таблеток тетрамезина, покрытых кишечнорастворимой оболочкой, что вследствие предотвращения кислотного гидролиза в желудке увеличивает биодоступность таблеток препарата в опытах на собаках до 50-70%

8. Показано, что перспективными лекарственными формами фенотропила являются как таблетки, так и растворы для инъекций, но для достижения эффективной концентрации препарата в крови в короткий интервал времени таблетированная форма является предпочтительной.

9. В результате изучения распределения фенотропила по органам крыс при его пероральном применении установлено, что тропность препарата убывает в последовательности: печень, почки, сердце, мозг. Максимальная концентрация быстро достигается в крови, в печени, почках, мозге и сердце. Для препарата ноотропного действия принципиально важным является доказанный факт его способности проникать через гематоэнцефалический барьер.

10. Впервые установлено, что метаболизм фенозан-кислоты в организме кроликов при пероральном введении характеризуется двумя направлениями: а) окисляется бензольное кольцо, в результате чего образуется хиноидная структура, и б) в молекуле действующего вещества гидроксилируется фрагмент пропионовой кислоты, а последующая дегидратация интермедиата приводит к производному коричной кислоты.

11. Разработан комплексный подход к изучению фармакокинетики оригинальных лекарственных средств, включающий кинетику препаратов в крови животных, распределение его по органам и тканям, метаболизм и элиминацию с использованием различных методов выделения неизменённых фармакологических средств, метаболитов из биологических сред и их идентификацию.

12. Обоснованы основные этапы и методологические аспекты изучения доклинической фармакокинетики новых лекарственных средств.

13. Данные по изучению доклинической фармакокинетики альбикара и фенотропила вошли в документацию, на основании которой получено разрешение Фармакологического комитета на проведение клинических испытаний этих лекарственных средств. Разработанные методики количественного определения альбикара, бикарэта, тетрамезина, фенозан-кислоты и фенотропила в биологических жидкостях применяются в лабораторной практике, а также при проведении различных фармацевтических исследований.

14. Предложенные методологические основы фармакокинетических исследований используются в учебном процессе, находя своё отражение в лекционном, семинарском и элективном курсах занятий по общей и биоорганической химии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный методологический подход к изучению доклинической фармакокинетики лекарственных средств может быть использован в качестве рекомендации по необходимому объёму и порядку проведения исследований при изучении экспериментальной фармакокинетики новых лекарственных средств, а также может быть принят во внимание при составлении новой редакции «Правил доклинического исследования новых фармакологических веществ».

2. Рекомендуемые фармакокинетические подходы позволяют разрабатывать для новых препаратов лекарственные формы с заданными фармакодинамическими свойствами, а получаемая в рекомендуемом объёме информация при изучении биодоступности в опытах in vitro и in vivo может быть использована при разработке проектов ВФС и общих фармакопейных статей.

3. На основании полученных фармакокинетических данных для альбикара и бикарэта рекомендуется внутримышечный способ введения этих препаратов как наиболее эффективный. Таблетированные лекарственные формы альбикара и бикарэта имеют сравнительно невысокую биодоступность, однако их можно использовать при проведении клинических испытаний данных препаратов.

4. Тетрамезин рекомендуется производить в виде таблетированной лекарственной формы с кишечно-растворимым покрытием, поскольку при этом условии биодоступность лекарственного вещества максимальна.

5. Рекомендуемыми лекарственными формами для фенозан-кислоты являются таблетки и суппозитории.

6. Перспективными лекарственными формами фенотропила являются как таблетки, так и растворы для инъекций, но для достижения эффективной концентрации препарата в крови в короткий интервал времени таблетированная форма является предпочтительной.