Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Значение цитокинов (альфа-интерферона, альфа-ФНО) при трипаносомозе животных, изучение их лечебной эффективности

АВТОРЕФЕРАТ
Значение цитокинов (альфа-интерферона, альфа-ФНО) при трипаносомозе животных, изучение их лечебной эффективности - тема автореферата по ветеринарии
Зайченко, Ирина Юрьевна Санкт-Петербург 1998 г.
Ученая степень
кандидата ветеринарных наук
ВАК РФ
16.00.04
 
 

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Значение цитокинов (альфа-интерферона, альфа-ФНО) при трипаносомозе животных, изучение их лечебной эффективности

РГо ОД

На правах рукописи

ЗАЙЧЕНКО ИРИНА ЮРЬЕВНА

ЗНАЧЕНИЕ ЦИТОКИНОВ (АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОНА, АЛЬФА-ФНО) ПРИ ТРИПАНОСОМОЗЕ ЖИВОТНЫХ, ИЗУЧЕНИЕ ИХ ЛЕЧЕБНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ

Специальность 16.00.04 - ветеринарная фармакология

с токсикологией

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург -1998

Работа выполнена в отделе хнмиотерапевтических препаратов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации

Научный руководитель - доктор биологических наук К.Н.Груздев

Научный консультант - заслуженный деятель науки РФ, доктор,ветергагарных наук, профессор Б.А.Тимофеев Официальные оппоненты:

Е доктор биологических наук, профессор Н.Л.Андреева ® доктор ветеринарных наук, профессор Э.Х. Даугалиева

Ведущая организация - Московская государственная академия ветеринарной медицины и прикладной биотехнологии им. К.И.Скрябина

Защита диссертации состоится " ^ " 1998

года на заседании диссертационного совета Д 120.20.02 при Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке СПГАВМ.

Автореферат разослан " 3 " 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор

ветеринарных наук М.В.Шустрова

1. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы. В последние годы имеет место увеличение числа пунктов, неблагополучных по случной болезни, что связано с ослаблением внимания к этой болезни и появлением штаммов трипаносом, устойчивых к используемым препаратам. Это вызывает необходимость поиска и применения новых средств. В последнее десятилетне внимание паразитологов в качестве этих новых средств привлекают иммунные препараты, и цитокины в частности. Наиболее изучены из них тштерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухолей аир, некоторые ростовые и другие клеточные факторы.

ИФН обнаружен в 1957 г Айзеком и Линденманом. ИФН является иммунорегуляторным белком и, кроме антивирусного действия, проявляет анггипролиферативную активность к нормальным и опухолевым клеткам, вызывает дифференцировку лейкозных клеток, активирует макрофаги и естественные киллеры.

аФНО получил свое название как медиатор, выделяющийся в кровь при бактериальных инфекциях и вызывающий некроз некоторых опухолей. Однако он был описан независимо и как медиатор истощения при паразитарной инвазии. ФИО усиливает пролиферацию Т-лимфоцитов, стимулирует свертываемость крови, активирует генерацию суперок-сидного радикала моноцитами и гранулоцотами, вызывает локальную адгезию лейкоцитов к сосудистой стенке, стимулирует метаболизм арахидоновой кислоты, усиливает рост и активность фибробластов. Кроме того, он усиливает

токсичность эозинофилов, что ингибирует рост инфекционных паразитов,

аФНО, аИФН вместе с ИЛ-1 являются центральными регуляторами естественного иммунитета и представляют собой цитокины "первого поколения" в "каскаде цитокннов" (Вотяков В.И., Грибков Н.В., 1990; Кетлинский С.А.и др., 1989; Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Воробьев A.A., 1992; Недоспасов С.А. и др., 1988; Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А., 1988; Иванов В.Т., 1997).

Изучение цитокинов с противопатогенной активностью находится лингь в самом начале своего пути. Неоднозначность сведений о их значении при протозойных болезнях и ралрозненность этих данных вызывает необходимость изучения роли цитокинов при трипаносомозе животных и наличии у них лечебной эффективности при этом заболевши«.

В задачу исследований входило:

1. Определить уровень фактора некроза-альфа (ФНОа) и интерферона-альфа (ИФНа) при экспериментальном трипаносомозе лабораторных животных в динамике.

2. Изучить корреляцию между клиническим течением трипаносомоза и уровнем указанных цитокинов.

3. Изучить иммуностимулирующее действие и лечебную эффективность ФНОа при экспериментальном трипаносомозе лабораторных животных.

4. Изучить иммуностимулирующее действие и лечебную эффективность ИНФа при экспериментальном трипаносомозе лабораторных животных.

Научная новизна. 1. Изучены токсические свойства аФНО: ЬО50 препарата для белых мышей при втгутрибрюшинном введении составляет 860 мг/кг, для белых крыс - 615 мг/кг. ЬО50 при алиментарной даче установить не удалось. В соответствии с ГОСТ 12.) .007-76 препарат относится к соединениям IV класса опасности.

2. Установлено отсутствие у аФНО аллергнзируклцих свойств, мутагенной активности и влияния на функциональное состояние печени.

3. В процессе переболевания собак трипаносомозом отмечено появление в крови фактора некроза опухолей, что связано с патогенезом этой болезни.

4. аФНО экзогенного происхождения в терапевтической дозе при подкожном введении не влияет на клиническое состояние собак, их гематологические и биохимические показатели.

5. аФНО экзогенного происхождения обладает имдунокорреги-рующим действием при трипаносомозе собак.

Практическая ценность. На основе фармакологических и токсикологических исследований разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ "Временное наставление по применению аФНО при протозойных болезнях с/х животных" № 13-4-2/514 от 26.01.96 и тех}шческие условия на препарат "Фактор некроза опухолей альфа" № 9381-001-96 от 26.01.96.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Токсические свойства аФНО.

2. Роль аФНО и аИФН в патогенезе трипаносомоза животных.

Результаты реализации. Результаты исследований могут быть использованы в ветеринарной практике при осуществлении иммунокоррсгирузощей терапии трипаносомоза и расшифровке закономерностей функционирования системы цитокинов при указанной болезтш.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были доложены:

1. га научно-производственной конференции: «Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных животных и птиц», посвященной 50-летию Краснодарской НИВС (Краснодар, 1996),

2. на Всероссийском совещании по протозоологии (Москва, ноябрь 1997);

3. на межлабораторном совещании научных сотрудников ВГНКИ ветпрепаратов (Москва, июнь 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, которые отражают основное содержание данной работы.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 4 рисунка.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы исследовагоШ.

Исследования физико-химических свойств аФНО и аИФН проводили согласно ТУ: внешний вид, цвет, наличие посторонних примесей, плесени, трещин в ампулах, запах,

растворимость, наличие вакуума, стерильность, рН раствора, содержание белков - мг/мл, пирогенность, безвредность при тест-дозе на одно животное (белые мыши), активность МЕ/мл.

массы белков аФНО проводили с помощью электрофореза в полиакриламвдном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Подопытные животные и клинические исследования. Объектом исследований были собаки разных пород в возрасте сп 1 года до 5 лот, белые беспородные мыпш, крысы и морские свинки.

Гемоглобин определяли по методу Сали, лейкоциты подсчитывали в хамере Горяева, аналогично определяли зритрощгш. Содержаше общего бежа в сыворотке крови определялось рефрактометрическим методом, щелочную фосфатазу - по методу Боданского (А.АЛокровский, 1969).

Заражение животных.. В своей работе мы использовали штамм трипаносом, выделенный от лошадей в 1946 году на северном Кавказе И.И.Казанским и И.В.Абрамовым (видовое название - Trypanosoma equiperduni, Doflein, 1901), а также два штамма, привезенные из Бельгии и Германки В.Т.Заблоцкпм.

Токсичность. Определение средней смертельной дозы LDW аФНО изучали на белых беспородных мышах (самцах и самках) массой тела 18-20 г и на белых крысах массой тела 250300 г. Параметры острой токсичности (величитгу I,D50) рассчитывали по методу Литчфилда и Уилкоксона (А.Н.Кудрин, Г.Т.Пономарева, 1967).

Влияние аФНО на антитоксическую функцию печени изучали по методу Д.Р.Разина (1964). Опыт проводили на 80 белых мышах.

Изучение аллергизирующих свойств аФНО проводили на морских свинках согласно методическим рекомендациям, разработанным в НИИ медицины труда АМН РФ О.Г.Алексеевой, Л.А.Дуевой и др. (1980) по единой схеме постановки токсикоаллергологических экспериментов. Первичную оценку рефнолина проводили путём однократной внутрикожной сенсибилизации. На 12-е сутки после однократного введения морским свинкам рефнолина в кожу уха дополнительно проводили в течение недели 7 эпикутанных аппликаций. Через 24 часа после учёта реакции кожи брали кровь для выполнишя лабораторных иммунологических тестов:

1. Реакция специфической агломерации лейкоцитов

(РСАЛ).

2. Реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).

Аллсргоопасность рефнолина оцстгивали по результатам

всех проведённых токсикоаллергологических тестов.

Определение биологической активности аФНО проводили на базе Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных.

Принцип метода основан на цитотокскческом действии аФНО на опухолевые клетки мыши. Для этого использовали перевиваемую культуру мышиных клеток Ь929. За титр аФНО принимали величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура на 50% оказывалась повреждена цитотоксическим действием аФНО.

Изучение мутагенного действия аФНО проводили во Всесоюзном научно-исследовательском институте санитарии, гнгаены и экологии (ВНИИВСГЭ) с помощью метода цитогенетического анализа клеток костного мозга белых

беспородных мышей. В основе метода лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом на стадиях ранней телофазы или поздней енафазы.

Изучение влияния аФНО на клинические, гематологические и биохимические показатели собак. Для этой цели были созданы 4 группы собак по 4 головы в каждой. Собак подбирали беспородных, массой тела 12-15 кг, в возрасте 3-5 лет. ФНО вводили однократно, подкожно и внутривенно, в дозе 103 и 106 МЕ/кг. У животных брали кровь до введения препарата (контроль), через 1, 3, 6, 24 часа и через 3, 10 и 21 сутки после введения. В качестве тестов, характеризующих состояние животных, определяли следующие показатели: температуру тела, частоту дыхания, количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобин, активность щелочной фосфатазы и концентрацию общего белка.

Для определения антивирусной активности альфа-интерферона (аИФЩ в сыворотке крови больных трипаносомозом животных_ предварительно проводили определение инфекционного титра вируса везикулярного стоматита (ВВС). За инфекционный титр ВВС принимали максимальное его разведение, которое оказывало ТЦД не менее, чем (■< '•) в 50% лунок с культурой клеток М-1° ГП(Д-,Р,) В дальнейшем использовали вирус с титром от 105 до 10б ТЦД50 в 1 см3. Для контроля антивирусной активности исследуемых сывороток использовали культуру первично трипсинизированных кожно-мышечных фибробластов 10-25 пассажей и ВВС человека - штамм Индиана. Для каждой тестируемой сыворотки , а также для стандартного аИФН определяли максимальное разведение, которое обеспечивает

защиту 50% монослоя клеток от ТЦД вируса. Пересчет активности исследуемой сыворотки в международные единицы (МБ) стандарта В 69/19 на 1см3 проводили по формуле:

Асв = Эасв х Act , где ЭАст

Асв и Act - антивирусные активности сыворотки крови и стандарта аИФН в МЕ/см3.

ЭАсв и ЭАст - антивирусные активности сыворотки и стандарта, полученные в эксперименте.

Изучение лечебной эффективности аФНО и аИФН при экспериментальном трипаносомозе проводили на белых беспородных мышах, подобранных но принципу аналогов, массой тела 18-20 г. Были созданы 10 групп животных по 10 голов в каждой, которых заражали подкожно в дозе 0,2 мл инвазированной кровью (3-5 паразитов в поле зрения). Изучаемые и коотролыгые препараты вводили мышам через 1 сутки после заражения трипаносомозом. Все препараты, кроме наганина, вводили внутрибрюшинно. Нагадан - внутривенно. 1-ой группе мышей вводили физиологический раствор в объеме 0,5 мл, 2-й группе - наганин в дозе 15 мг/кг массы тела. Эти группы служили контролем. 3-й группе вводили юггерферон (ИФН) в дозе 5 МЕ/кг, 4-й группе - ИФН в дозе 0,5 МЕ/кг, 5-й -ИФН в дозе 5 х 10"5 МЕ/кг, 6-й - ИФН в дозе 5 х Ю"10 МЕ/кг, 7-й - ФНО в дозе 10 МЕ/кг, 8-й - ФНО в дозе 1000 МЕ/кг, 9-й - ФНО в дозе 25000 МЕ/кг, 10-й - ИФН в дозе 0,5 МЕ/кг и ФНО в дозе 1000 МЕ/кг. Результат учитывали по выживаемости мышей.

Иммунокоррегирующую терапию при трипаносомозе проводили на 4 - х собаках разных пород, в возрасте 10-12 месяцев, массой тела 12-15 кг. Все собаки были заражены

внутримышечно кровью от белых мышей, больных трипаносомозом (отечественный штамм), в объеме 10-15 мл с содержанием 5-7 паразитов в поле зрения микроскопа. Животные были разделены на 2 группы по 2 головы в каждой. Собакам 1-й группы на пике паразтемии (14-н и 17-й дни) вводили .внутривенно наганин в дозе 15 мг/кг. Собакам 2-й группы на пике паразитемии (12-й и 15-й дни) вводили внутривенно наганил в дозе 15 мг/кг и подкожно рефнолин (ФНО) в дозе 1000 МЕ/кг массы тала. У животных ежедневно учитывали общее состояние, измеряли температуру тела, каждые 2 дня определяли уровень гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов и выводили лейкоцитарную формулу по общепринятым методикам.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1. Изучение физико-химических свойств аФНО (рефлолтпга, алыюрина) и схИФН.

Имеющиеся в нашем распоряжении рефнолин, альнорин и интерферон соответствуют нормативно-технической документации на указанные препараты.

2.2.2. Острая токсичность аФНО.

Итога изучения острой токсичности при внутрибрюшинном введении следующие - ГЛЭ^ для белых мышей составила - 860 мг/кг, ЬОм для белых крыс - 615 мг/кг. Полученные данные позволяют отнести рефнолин к IV классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76. При введении рефнолина в желудок указанным животным выявить его токсическое действие не удалось. Что касается лейкоцитарного интерферона, то его токсичность уже хорошо изучена и по литературным

данным этот препарат безвреден (Ершов Ф.И., 1985; Груздев К.Н., 1993).

2.2.3. Влияния аФНО на функциональное состояние

печени!

Полученные результаты свидетельствуют о том, что аФНО в терапевтической дозе не влияет на время разрушения гексенала в печени и, следовательно, не влияет на ее антитоксическую функцию, что делает возможным его применение в ветеринарной практике.

Таблица № 1.

Результаты изучения влияния аФНО на функциональное

состояние печени.

№ № гр Группа жив- X Доза препарата, МЕ/кг Кол -во жив-X в груп пе, гол. Время сна мышей (в мин.) после введения аФНО через, М + гп

1 час Зчаса 6 часов

1. Ковтр. 20 28,8 ±9,1

2. Опьпн. 1000 20 37,2 ± 8,1 44,8 ± 8,6 34,6 ±7,8

3. Опыт и. 100.000 20 34,7 ±9,3 39,6 ±9,9 47,3 ± 10,4

4. Опытн. 1.000.000 20 57, 61 10,8 74,8 ± 11,6 81,3 ± 13,4

2.2.4. Изучение мутагенной активности аФНО.

Таблица № 2.

Цитогенетический анализ клеток костного мозга белых мышей, подвергавшихся воздействию аФНО в дозе 430 мг/кг (в/бр.).

Показатели в % через 24 чяса через 48 часов

опыт котггроль опыт контроль

Истинные хромосомные аберрации 1,3 ±0,2 1,6 + 0,3 1,4 ±0,2 6 1,5 + 0,2

Кол-во клеток с отставаниями 0,3 ±0,1 0,7 ±0,2 0,6 ±0,17 0,4 + 0,1

Кол-бо клеток со слипаниями 0,9 ±0,3 1,2 + 0,3 1,1 ±0,26 0,7 ±0,2

Мтгготическин индекс 1,8 + 0,1 1.9 + 0,1 1,9+0.12 1,9+0,1

Как следует га представленных данных, при действии аФНО в дозе 430 мг/кг количество хромосомных аберраций по всех опытных группах (т.е. через 24 и 48 часов) статистически недостоверно по сравнению с ючггролем и не выходит за границу физиологической нормы для данного показателя ( 1,81 -7,70 % ) (Трахтеиберг И.М., Сова Р.Е, Шефтель D.O., 1991).

Таким образом, препарат аФНО даже на уровне высоких доз (1/2 LD50) не вызывает увеличения повреждений хромосом и, как можно предположить, генетически безопасен при применении в ветеринарной практике.

2.2.5. Изучение аллергизнрующих свойств аФНО.

Псрвшшая оценка аФНО показала, что через 10-15 минут послс внутрлкожного введения 0,02 мл (50 мкг) аФНО 8 опыпшм морским свинкам (6 контрольным - 0,02 мл физиологического раствора ) препарат не вызывал видимых измеиетгий со стороны уппгах раковин.

Через 12 дней у всех животных были выстрижены участки на одном го боков. При нанесении на эти участки разрешающей дозы рефнолина видимая реакция (гиперемия, зуд, отек) отсутствовала. Затем в течение 7 дней ежедневно на открытые участки кожи наносили и втирали по 0,5 мл 0,75% раствора рефнолина. Этот эксперимент одновременно позволяет выявить опасность развтия неаллергического дерматита - аФНО не оказывал раздражающего действия и не вызывал у контрольных животных при многократных аппликациях контактног о дерматита.

Через 24 часа после учёта эпикутэнных аппликаций были поставлены иммунологические тесты для выявления реакции клеток 'крови на аллерген in vitro : реакция специфической агломерации лейкоцитов (PCАЛ) и реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). РСАЛ основана на специфическом склеивании (агломерации) лейкоцитов при добавлении аллергена, вызывающего сенсибилизацию, in vitro к крови сенсибилизированного животного. Данная реакция учитывается по величине отношения процента агломерации лейкоцитов в опытном мазке (АО) к проценту агломерации лейкоцитов в контрольном мазке (АК), при этом реакция считается положительной, если процент агломерированных лейкоцитов в опытной пробе выше или ниже показателя агломерации контрольной пробы в 1,5 раза (например, в 2,3 или 5 раз). Результаты РСАЛ у морских свинок, сенсибилизированных рефнолином, представлены в таблице № 3.

Таблица № 3.

Показатель агломерации АО% : АК%

опыт с аФНО контроль

3,55 1,3

0,6 1,64

0,4 1,29

0,95 1,57

0,87 1,46

2,06 1,18

0,84

0,9

Среда. 1,721 Средн. 1,406

В приведённой таблице соотношение процентов агломерированных лейкоцитов в опытной группе несущественно отличается от значения в 1,5 раза за счёт повышенного показателя у 2-х животных (3,55 и 2,06). Аналогичные результаты получены и в контроле.

Реакция специфического лизиса лейкоцитов расценивается как положительная при показателе 10% и выше. Показатель РСЛЛ для опытной группы составил 4,31%, а для контрольной - 3,3%, то есть результат в опыте и в контроле отрицательный (табл. № 4).

Таблица № 4.

Показатель РСЛЛ (%), Лк-Ло .100

Лк

опыт с аФИО контроль

0 0

0 4,6

11,7 0

4,87 3,75

0 11,45

0,59 0

0

17,36

Среди. 4,31 Средн. 3,3

Таким образом, исследование сенсибилизирующего действия аФНО не выявило выраженной реакции иммунной системы подопытных животных на данный препарат. Водный раствор аФНО не раздражал слизистую оболочку глаз, не вызывал контактного дерматита после многократных накожных аппликаций, реакция специфического лизиса лейкоцитов -отрицательная. Но показатель реакции специфической агломерации позволяет сделать вывод о возможности слабовыраженного сенсибилизирующего действия аФНО та отдельных животных, обусловленное, вероятно, их индивидуальной чувствительностью к данному препарату.

2.2.6. Экспериментальный трипаносомоз собак.

Целью работы было изучить семиотику экспериментального трипаносомоза собак и возможность использования собак как лабораторной модели трипаносомоза. Под опытом находилось 28 собак различных пород в возрасте 2-6 лет. Для их заражения использовали 2 штамма трипаносом: 1-й - эталонный штамм Т.ечшрег<1шп, полученный во Франции (институт им. Пастера), 2-й - отечественный, именуемый как Т^шрейит, Итоги исследования приведены в таблице.

Таблица № 5.

Сравнительная семиотика экспериментального _трипаносомоза.___

№ Кол-во Штамм Инкуб. Продол-ть Налнч-е Развитие

№ жнв-хв парази- период болезни параз-в отеков

пи гр. та (в днях) (в днях) в 1

П.зр.

1. 15 Франц. 5-8 25-30 5-10 Имеются

2. 13 Отеч. 4-6 10-12 10-20 Имеются

Наблюдет™ свидетельствуют, что клиническое течение трипаносомоза у собак, вызванного отечественным штаммом, более выраженное и тяжелое. Кроме того, в опытах установлено, что собаки могут быть использованы как лабораторная модель в изучении патологии трипаносомоза.

2.2.7. Изучс?{ие лечебной эффективности аФНО и аИФН при экспериментальном трипаносомозе..

С целью расширения арсенала лекарственных средств, используемых в ветеринарии при данном заболевании, мы решили испытать аФНО (рефнолин) и аИФН (лейкоцитарный интерферон). Для этого было создано 10 групп белых мышей по 10 голов в каждой массой тела 18-20 г, которые были заражены трипаносомозом. Испытуемые препараты им вводили через 1 сулск после заражения. 1-й группе - изотонический раствор натрия хлорида 0,9%, 2-й группе - наганнн. Эти две группы служили контролем. Остальным группам подопытных животных вводили рефнолин и интерферон в различных дозах, Все мыгаи, за исключением обработанных наганшюм, погибали через 6-9 дней после заражения. Таким образом, аФНО и а ИФН не обладали трипаноцидным действием.

2.2.8. Влияние аФНО на клинические, гематологические и биохимические показатели собак.

В опыте учитывали общее состояние животных, температуру тела, пульс, частоту дыхания, аппетит, отправление физиологических функции, состояние шерстного покрова. В качестве дополнительных тестов, характеризующих состояние животных, использовали уровень гемоглобина, количество эритроцитов, лейцкоцитов, концентрацию общего белка и активность щелочной фосфатаз.

Достоверные изменения в эксперименте отмечали в динамике уровня общего белка и активности щелочной фосфатазы у собак 2-ой, 3-ей и 4-ой группы, причем во 2-ой и 4-ой группе эти показатели выходили за пределы физиологической нормы. Максимальные изменения дашгых регистрировали в первые сутки наблюдения (рис. 2,3,4).

Рис.1.

КРМЕАт.пк

Рис.2.

ЯРМЕ/кг, п^

I и 5 П II

Рис.3.

рпнп

Рис.4.

Ю'МРкг.^»

ы

I * I 1 I * * *

Как показали наши исследования, у животных 1-ой группы, которым вводили аФНО подкожно в терапевтической

дозе, колебания гематологических показателей, общего белка и щелочной фосфатазы в период наблюдения изменились в пределах статистической ошибки (рис.1). Что касается животных, которым вводили аФНО подкожно в стократной терапевтической дозе и внутривенно в терапевтической и стократной терапевтической дозах, то у них наблюдали статистически достоверное снижение активности щелочной фосфатазы и повышение содержания общего белка (рис. 2, 3, 4). Прицеленные мaтqж.^лы свидетельствуют о дочтгтипшом характере действия аФНО.

7.2.9. Роль аФНО и а.ИФН при трипаносомозе животных.

Так как сами по себе цитотоксические реакции не позволяют однозначно разделять аФНО и рФНО, особенно в сыворотке крови, представлялось правомерным объединить оба медиатора в экспериментах

по определению их функциональной активности под названием "цитотоксические факторы". Уровень активности цнт ©токсических факторов в сыворотке крови собак, зараженных трипаносомозом, приведен в таблице № 6. Как видно из таблицы, титр цитотоксических факторов был более высокий у подопытных животных через 28 дней после заражения. Как, впрочем, н индексы цитотоксичности, причем их величины достоверно выше, чем в контроле в разведении сывороток 1:8 и 1:64.

Необходимо отметить наличие корреляции между титром цитотоксических факторов и титром комплемеитсвязывающих антител. Уроветсь антител был

небольшим и составлял через 7 и 14 дней 1:10 ++, через 21 день -1:10 +++, через 28 дней -1:10 ++++.

Таблица №7. Титр интерферона в сыворотке крови собак, зараженных трипаносомозом.

Дии после заражения Через 30 часов Через 48 часов

опыт контроль опыт контроль

2 0-1:2 0-1:32 0-1:2 0-1:1

7 0-1:4 0 -1:4 0 0

14 0-1:2 0-1:32 0-1:2 0 - 1:8

21 0-1:32 1:4-1:32 0-1:4 1:4-1:32

28 0-1:16 1:8 1:8-1:16 0-1:4

35 0-1:16 1:8-1:32 0-1:16 0-1:4

Таблица № 6.

Активность цитотоксических факторов в сыворотке крови собак, зараженных трипаносомозом.

№ группы собак Время взятая крови после заражения Титр цитогокса - ческах факторов Индексы цитотоксячноста сыворотки в конечном развед.

1:8 1:16 1:32 1:64

Опытная через 2 дня 0-1:2 2,04+ 0,25* 1,73 ±0,95 136 ±0,12 1,14 ±0,04

-"- 7 дней 0 -1:4 1,89 + 0,21 1,89+0,10* 1,35 ±0,02 1,07 ±0,07

14 дней 0 -1:2 2,32 + 0,3* 2,04 + 0,37* 1,19 ±0,39 1,38 ±0,15*

21 день 0 -1:32 1,93 + 0,09* 1,66 + 0.07* 1,29 ±0,05 1,17 ±0,05

28 дней 1:8 -1:64 2,31 + 0,29* 1,81 + 0,25* 1,47 + 0,25* 1,13 ±0,10*

35 дней 0-1:16 2,96 + 0,06* 2,86 + 0,13* 2,18 ±0,71* 1,65 ±0,41*

Контр. через 2 дня 0-1:31 1,61 + 0,03 1,41 +0,12 1,25 +0,07 1,06 ±0,05

7 дней 0-1:4 1,57+0,21 1,42 + 0,18 1,31 ±0,13 1,11 ± 0,15

-"-14 дней 0-1:32 1,42 + 0,01 1,21 +0,01 1,12 ±0,06 1,06 ±0,01

-"-21 день 1:4 -1:32 1,42 + 0,19 1,43 + 0,06 1,27 ±0,06 1,12 ±0,06

-"-28 дней 0 -1:8 1,24 + 0,07 1,15 + 0,05 0,95 + 0,15 0,79 ±0,09

-"-35 дней 1:32 1,47 + 0,01 1,25 + 0,04 1,12 ±0,09 1,02 ±0,08

* - достоверное отличие от контрольных результатов.

Анализ приведенных данных свидетельствует, по нашему мнению, об отсутствии различий в тигре интерферона между опытными сыворотками и контролем. :'

2.2.10. Иммунокоррсттфующая терапия____при

трипаносомозе собак.

Сопоставляя данные исследований собак, которым вводили один наганин, с аналогичными данными собак, которым вводили наганин и рефнолин, необходимо отметить следующее. Если через 5 дней после лечения различие данных между группами было небольшим (повышение гемоглобина составляло в 1-й группе соответственно 31-35 % против 39,2 -38,6 % во 2-й 1руппе, эритроцитов на 2 - 24 % против 35,7 - 38,6 %, уменьшите лейкощпов составляло 39 - 41,1 % против 26,9 -34,5 %), то через 7 дней во 2-й группе (вводили наганин и рефнолин) увеличение количества эритроцитов было более выражено (52,3 - 59 % против 47 % у одного животного и уменьшения на 5,6 % у второго). В лейкоцитарной формуле у животных, обработанных наганином и рефнолином, юные нейтрофилы не обнаруживаются на 29 - 34-й дни, в то время как у животных 1 -й группы их наличие устанавливалось вплоть до 45-го дня (срок наблюдения).

Таким образом, можно сделать вывод, что у животных, которым вводили наганин и рефнолин, отмечается тенденция к более быстрому выздоровлениго, чем у собак, обработанных одним наганином.

3. ВЫВОДЫ.

1. Лейкоцитарный интерферон является низкомолекулярным белком и имеет следующие показатели: однородный порошок светло-коричневого цвета, массовая доля

плати - 3%, растворимость в дистиллированной воде - 1,5 мин., стерилен, противовирусная активность - 1 х 107 МЕ/см3, содержание белка - 68 мг/см3, не токсичен, безвреден, рН раствора - 7,4, титр индуктора -105 ТЦД5()/см3.

2. Рефнолин является низкомолекулярным белком и имеет следующие показатели: сухая белая мелкопористая масса с отсутствием посторонних примесей, плесени, трещин ампул, запаха; вакуум присутствует, стерилен, рН раствора 7,8; содержание белка - 4,8 мг/мл, пирогенность отсутствует, безвреден, активность - 10' МЕ/мл.

3. При изучении токсических свойств ФНО (рефнолина) установлено следующее: ЬО50 при агашентарном введегпш определить не удалось, при внутрибргошигагом введении составила для белых мышей 860 мг/кг, для бельтх крыс - 615 мг/кг, что дает основание отнести этот препарат к IV классу опасности (ГОСТ 12.1.007-76).

4. ФНО не обладает аллергизирующими и мутагенными свойствами, не ушетает антитоксическую функшпо печени.

5. ФНО экзогенного происхождения в терапевтической дозе при подкожном введении не влияет на клиническое состояние собак, их гематологические и биохимические показатели (общий белок, щелочную фосфатазу), колебание их значений было статистически недостоверным. При внутривешюм и подкожном введении ФНО в 100-кратной терапевтической дозе и внутривенном введении в терапевтической дозе наблюдали первоначальное угнетение активности щелочной фосфатазы, повышение концентрации общего белка с последующими их нерезкими колебаниями.

6. Переболсвание собак трипаносомозом сопровождается незначительным по сравнению с нормой повышением активности цитотоксических факторов, выражающееся либо в увеличении их тигров на одно- или двукратное разведение, либо в увеличении индексов цитотоксичности для всех соответствующих разведении сывороток через 14-28-35 дней после заражения животных.

7. Титры ИФН у подопытных и контрольных животных являются невысокими и нерезко отличаются друг от друга, что дает основание утверждать о патогенетической неопределенности ИФН как медиатора иммунных процессов при трипаносомозе животных.

8. Индивидуальный анализ уровня ФНО у больных и здоровых животных выявил значительную гетерогенность этого показателя, что может объяснятся, по • нашему мнению, индукцией аномальной диффереренцировки цитотоксических факторов за счет перемежающейся паразитемии при трипаносомозе собак.

9. Лечение лабораторных животных и собак, больных трипаносомозом, одним лейкоцитарным интерфероном и фактором некроза опухолей-альфа не сопровождалось их выздоровлением.

10. Совместное применение наганина с фактором некроза опухолей-альфа собакам, больным трипаносомозом, обеспечивает их более быстрое выздоровление и улучшение клинического состояния, что дает основание проводить иммунокоррегирующую терапию животных с помощью этого цитокина.

4. ПРАКТИЧЕСКИЙ ВЫХОД.

На основе фармакологических и токсикологических исследований, изложенных в диссертации, разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ "Временное наставление по применению аФНО при протозойных болезнях с/х животных" и Технические условия на препарат "Фактор некроза опухолей альфа".

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Тимофеев Б.А., Марченко В.И., Павлов Г.В., Зайченко И.Ю., Гусев В.В. Применение цигокинов при тейлериозе крупного рогатого скота/ Вестник Российской академии с/х наук. - 1996. - № 4. - с.59-62.

2. Зайченко И.Ю., Янышевская О.Д. Изучение аллерггаирующих свойств рефнолина / Сборник научных трудов ВГНКИ. - 1996. - т.60. - с.7-12.

3. Тимофеев Б.А., Зайченко И.Ю. Материалы по изучению цитокинов при трипаносомозе животных / Вестник ветеринарии. - 1998. -№7. - с.36-39.

4. Зайченко И.Ю. Интерферон и трипаносомоз животных / Материалы научной конференции, посвященной 50-летию Краснодарской НИВС. - Краснодар, 1996. - ч.1. - с.194-195.