Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Цитокины в вакцинах и их адъювантные свойства

Г Г В ОД

На правах рукописи

П 3 ФЕЗ 1П97

АКОЛЬЗИНА Светлана Евгеньевна

ЦИТОКИНЫ В ВАКЦИНАХ И ИХ АДЪЮВАНТНЫЕ СВОЙСТВА

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1996 г.

Работа выполнена в ГИСК им.Л.А. Тарасевича Минздрава России

Научные руководители:

академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Н. В. Медуницын

кандидат медицинских наук Ж. И. Авдеева Официальные оппоненты:

академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А.Н. Чередеев

доктор биологических наук, профессор А.А. Михайлова

Ведущая организация - НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится срс-брал*. 1997 г. в 14

часов на заседании диссертационного совета Д 074.09.01. при Институте иммунологии Минздрава России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава России

Автореферат разослан "_" _1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.С. Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Проблема регуляции иммунного ответа является главенствующей в современной иммунологии. Большие надежды в этом плане возлагают на цитокины, которые являются низкомолекулярными гликопротеинами, продуцируемыми различными клетками организма и выполняющими иммунорегуляторную функцию (Медуницын Н.В. и др., 1980; Кетлинский С.А. и др., 1992; Abbas А.К. et al.. 1991).

Экспериментальные исследования показали, что фибробластные, эпителиальные и лимфобластоидные клеточные культуры, используемые для производства противовирусных вакцин, способны секретировать цитокины при нормальных условиях культивирования, либо приобретают эту способность при антигенной стимуляции (Cayphas S. et al., 1987; Sehgal P.В. et al., 1988; Van Damme J. et al., 1989). Имеются единичные публикации о содержании цитокинов в противовирусных вакцинах (Gearing A.J.H. et al., 1989). Учитывая, что цитокины обладают широким спектром иммунобиологического действия, можно ожидать возможность влияния примеси цитокинов на развитие локальных воспалительных реакций или системных эффектов, таких как продукция белков острой фазы, индукция лихорадки. Цитокины, находясь в вакцинах, по-видимому, могут стимулировать развитие иммунного ответа на вакцины, выполняя роль иммунологических адьювантов, либо оказывать иммуносупрессивное действие.

Проблема использования цитокинов в качестве адьювантов при введении вакцин только начинает развиваться. Имеются отдельные публикации по олтимицации вакцинального процесса с помощью ИЛ-1, ИЛ-2 и ИФ-Y. В экспериментах на лабораторных животных отмечена эффективность ИЛ-1 при вакцинации против гепатита В, ИЛ-2 - против бешенства и герпеса, ИФ-Y - против малярии (Playfair J.H. L., DeSouza J.В., 1987; Weinberg A., Merigan T.C., 1988; Tagliabue A. et al., 1989; Nunberg J. etal., 1989). При иммунизации людей вакциной против гепатита В выявлен адьювантный эффект ИЛ-2 и ИФ-Y (Meuer S.C. etal., 1989; QuirogaJ.A. etal., 1990). Однако,

многие вопросы, касающиеся использования цитокинов в качестве адьювантов и их роли в развитии поствакцинального иммунитета, остаются неизученными.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является определение уровня цитокинов (ШЫЬ, ИЛ-6, ФНО-а) в противовирусных вакцинах, изготовленных на основе клеток эукариотов, а также изучение адьювантных свойств цитокинов (рч ИЛ-1Ь, рч ИЛ-2, рч ФНО-а, рч ИФ-а, рч ИФ-У, тимозин а1, гибридный белок "неотим", иммуно-фан) в формировании поствакцинального иммунитета.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить содержание ШЫЬ, ИЛ-6, ФНО-а в живых и инактиви-рованных противовирусных вакцинах (антирабической, полиомиелит-ной, коревой, против гепатита А) и в субстратах, на основе которых изготовлены эти вакцины.

2. Изучить спонтанную и индуцированную вирусом полиомиелита 1. 2, 3 типов выработку цитокинов (ШЫЬ, ИЛ-6, ФНО-а) различными клеточными культурами: первичной (ПЗМ), перевиваемой (4647), диплоидной (М-22), используемыми для изготовления противовирусных вакцин.

3. Изучить на моделях экспериментальных животных (мыши, морские свинки) возможность использования цитокинов (рч ШЫЬ, рч ИЛ-2, рч ФНО-а, рч ИФ-а, рч ИФ-У, тимозин а1, гибридный белок "неотим". иммунофан) в качестве адьювантов при иммунизации против клещевого энцефалита, гепатита А и бешенства.

4. Оценить влияние цитокинов (рч ШЫЬ, рч ИЛ-2, рч ФНО-а, рч ИФ-а, рч ИФ-У, тимозин а1, гибридный белок "неотим", иммуно-.фан) на показатели клеточного и гуморального иммунитета экспериментальных животных при вакцинации против клещевого энцефалита, гепатита А и бешенства.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Обнаружено присутствие высокоактивных цитокинов (ИЛ-1Ь. ИЛ-6, ФНО-а) в экспериментальных и коммерческих противовирусных вакцинах (антирабической, полиомиелитной, коре-

вой, против гепатита А), изготовленных на основе клеток млекопитающих.

Впервые изучена спонтанная и индуцированная вирусом полиомиелита 1, 2, 3 типов выработка цитокинов (ИЛ-1Ь, ИЛ-6, ФНО-а) клеточными культурами (ПЗМ, 4647, М-22), используемыми для производства противовирусных вакцин.

Впервые на экспериментальных моделях показана способность цитокинов (рч ШЫЬ, рч ИЛ-2, рч ФНО-а, рч ИФ-У, тимозин а1, гибридный белок "неотим", иммунофан) усиливать иммунный ответ животных на введение вакцин против клещевого энцефалита, гепатита А и бешенства.

Впервые на экспериментальных моделях показана способность цитокинов (рч ШЫЬ, рч ИЛ-2, рч ФНО-а, тимозин а1, гибридный белок "неотим", иммунофан) стимулировать показатели клеточного иммунного ответа при введении мышам вакцины против клещевого энцефалита и антирабической вакцины, а также повышать уровень вирус-нейтрализущих антител (рч Ш-1Ь, рч ФНО-а, тимозин а1, гибридный белок "неотим") при введении мышам вакцины против бешенства одновременно с указанными выше цитокинами.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Определение в противовирусных вакцинах высокоактивных цитокинов и выявление различий по их содержанию между сериями препаратов предопределяют целесообразность стандартизации и контроля этих препаратов по содержанию в них цитокинов. Изучение спонтанной и антигениндуцированной продукции цитокинов клеточными культурами может быть одним из критериев выбора клеточного субстрата при разработке новых противовирусных вакцин.

Полученные в работе данные свидетельствуют о возможности применения цитокинов в качестве адьювантов при вакцинации. Направленная стимуляция клеточного или гуморального поствакцинального иммунитета может быть достигнута подбором необходимых цитокинов.

- 4 -

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Вакцины, изготовленные на основе клеток млекопитающих, содержат ряд цитокинов, набор и концентрация которых зависят от вида вакцины. Отдельные серии вакцин отличаются по содержанию в них цитокинов.

2. Спонтанная продукция цитокинов выявлена у диплоидных клеточных штаммов, исследованные первичные клеточные культуры и перевиваемые линии клеток не обладают такой способностью. Синтез цитокинов во всех клеточных субстратах наблюдается при антигенной стимуляции вирусом. Продукция цитокинов зависит от вида клеточной культуры и типа вируса.

3. На экспериментальных моделях показана эффективность использования цитокинов в качестве адьювантов. Выявлена их способность усиливать иммунный ответ животных на введение вакцин против клещевого энцефалита, гепатита А и бешенства, оцениваемый по резистентности экспериментальных животных к последующему их заражению тест-штаммом вируса и по уровню показателей клеточного и гуморального иммунного ответа.

4. с целью достижения желаемого адьювантного эффекта для каждого вида вакцин необходим свой набор цитокинов, стимулирующих клеточные и/или гуморальные механизмы иммунитета.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Материалы диссертации доложены на II Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (г.Москва, 1995 г.), на Международном симпозиуме, посвященном 150-летию со дня рождения И.И. Мечникова и 90-летию Уфимского НШВС им. И.И. Мечникова НПО "Им-мунопрепарат" (г.Уфа, 1995 г.), на II Международном конгрессе "йммунореабилитация и реабилитация в медицине" (Турция, 1996 г.), на I Всероссийском конгрессе по патофизиологии (г.Москва, 1996 г.).

ОБЬЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы. главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения и выводов. Указатель литературы включает 272 источника, в том числе 39 отечественных авторов и 233 зарубежных. Диссертация иллюстрировала 15 рисунками и 21 таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В противовирусных вакцинах и субстратах, на основе которых они изготовлены, исследовано содержание ряда цитокинов (ИЛ-1Ь, ИЛ-6, ФНО-а). Использованы следующие культуральные вакцины:

- инактивированная айтирабическая из штамма "Внуково-32" -на первичной культуре клеток почек сирийских хомяков (ПСХ),

- инактивированная вакцина гепатита А из штамма "ЛВА-86" -на перевиваемой линии клеток почек зеленых мартышек (4647),

- живая полиомиелитная вакцина типов 1, 2, 3 из штаммов Се-бина - на первичной культуре клеток почек зеленых мартышек (ПЗМ).

- живая полиомиелитная моновакцина 1 типа - на клеточной культуре ПЗМ,

- живая полиомиелитная моновакцина 2 типа - на клеточной культуре ПЗМ,

- живая полиомиелитная моновакцина 3 типа - на клеточной культуре ПЗМ,

- живая полиомиелитная вакцина типов 1, 2. з из штаммов Се-бина - на перевиваемой линии клеток почек зеленых мартышек (VERO),

- живая коревая вакцина из штамма "Ленинград-16" - на диплоидной культуре клеток фибробластов легкого человека (Л-68).

Исследована спонтанная и индуцированная вирусом полиомиелита 1, 2, 3 типов выработка цитокинов (ШЫЬ, ИЛ-6, ФНО-а) клеточными субстратами, используемыми для производства вирусных вакцин:

- первичной клеточной культурой почек зеленых мартышек (ПЗМ),

- перевиваемой линией клеток почек зеленых мартышек (4647),

- диплоидным клеточным штаммом фибробластов кожи и мышцы эмбриона человека (М-22).

Определение уровня ШЫЬ в исследуемых препаратах проводили, используя иммуноферментную тест-систему в "сэндвич" варианте с применением аффинно-очищенных ноликлональных антител к рч ШЫЬ, моноклональных антител к рч ШЫЬ, меченных биотином, и стрепта-видина, коньюгированного с пероксидазой. Чувствительность тест-системы 20-50 пг/мл (НИИ ОЧБ г.Санкт-Петербург).

Уровень ИЛ-6 оценивали в биотесте (Аагйеп Ь.А. еЪ а!.. 1987), используя клетки ИЛ-6 зависимой мышиной гибридомы В.9.9. Величину пролиферативного ответа клеток В.9.9. оценивали радиометрическим методом. Активность ИЛ-6 рассчитывали по отношению к стандартному образцу (88/514, Национальный институт биологических стандартов и контроля. Англия) методом пробит-анализа с использованием компьютерных программ.

Уровни ФНО-а в исследуемых образцах определяли с помощью иммуноферментного анализа в авидин-биотиновой системе. Чувствительность тест-системы 15-30 пг/мл (НИИ гематологии и переливания крови МЗ РБ г.Минск). Кроме того, для оценки активности ФНО-а использовали биологический тест на культуре клеток Ь-929 (МаПЬеюэ N. еЪ а1., 1987). Для определения подлинности ФНО-а в исследуемых препаратах проводили реакцию специфической нейтрализации с ан-ти-ФНО-а сывороткой (институт иммунологии ГК "Биопрепарат", п.Лю-бучаны).

В экспериментах по изучению адьювантных свойств цитокинов использованы: 1430 беспородных белых мышей массой 7-8 г и 12-14

г, 1320 мышей линии Balb/c массой 14-16 г, 90 мышей линии СВА массой 12-14 г. 148 морских свинок весом 250-300 г.

В работе использованы препараты цитокинов:

- интерлейкин-1 бета человека рекомбинантный (рч ИЛ-lb) -НИИ ОЧБ, г.Санкт-Петербург,

- интерлейкин-2 человека рекомбинантный (рч ИЛ-2) - МНТК "Биоген" Институт органического синтеза АН Латвии, г.Рига; БиНИИ СПбГУ, г.Санкт-Петербург,

- фактор некроза опухоли альфа человека рекомбинантный (рч ФНО-а) - НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", г.Новосибирск; НИИ прикладной микробиологии, г.Оболенск,

- гаммаферон (рч ИФ-Y) - НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", г.Новосибирск,

- реаферон (рч ИФ-а) - НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", г.Новосибирск,

- тимозин al человека рекомбинантный (Та) - НИИ прикладной микробиологии, г. Оболенск,

- гибридный белок "неотим", состоящий из фактора некроза опухоли альфа и тимозина al (Т-ФНО-Т), продуцируемый плазмидой pThy 325, встроенной в E.coli, - НИИ прикладной микробиологии, г. Оболенск,

- иммунофан или тимогексин, представляющий собой гексапеп-гид. полученный путем модификации химической структуры активного центра гормона тимопоэтина-П, - ЦНИИ Эпидемиологии России, г. Москва.

Дозы цитокинов, использованные на различных экспериментальных моделях, были выбраны на основании данных литературы и результатов собственных предварительных исследований. Для рч ИЛ-1Ь, Га, Т-ФНО-Т, иммунофана использованы дозы от 10 до 1500 нг, для оч ИЛ-2, рч ФНО-а - от 10 до 10000 Е, для рч ИФ-а, рч ИФ-Y - от 2000 до 50000 Е на 1 животное.

Работа выполнена с использованием стандартных моделей и схем

введения препаратов, применяемых для контроля противовирусных вакцин (против клещевого энцефалита, гепатита А, антирабической).

Влияние цитокинов на иммуногенность инактивированной культу-ральной вакцины клещевого энцефалита (ВКЭ) оценивали в экспериментах на мышах линии Balb/c в тесте определения минимальной иммунизирующей дозы вакцины (МИД50), защищающей 50% животных против 2,0-3,0 lg LD50 вируса клещевого энцефалита. Цитокины вводили мышам одновременно с ВКЭ - трехкратно с интервалом в одни сутки. Вирус клещевого энцефалита тесг-штамм "Абсетгаров" вводили животным на девятый день после окончания введения препаратов. Титр вируса при внутрибрюшном заражении мышей линии Balb/c был в пределах 8,5-9,2 lg LD50/0,25 мл.

Влияние цитокинов на иммуногенность инактивированной культу-ральной вакцины против гепатита А (Геп-А-ин-ВАК) оценивали в экспериментах на морских свинках по уровню титров специфических сывороточных антител к вирусу гепатита А и по числу сероположитель-ных животных. Цитокины морским свинкам вводили одновременно с Геп-А-ин-ВАК - трехкратно с интервалом в две недели. Эффективность вакцинации оценивали в динамике на четырнадцатые сутки после 2-го и 3-го введения препаратов.

Влияние цитокинов на протективный эффект инактивированной культуральной антирабической вакцины (КОКАВ, КАВ) определяли в экспериментах на беспородных белых мышах в тесте защиты от заражения фиксированным вирусом бешенства, штамм CVS. В экспериментах использовали две схемы вакцинации и заражения беспородных белых мышей. В первой серии экспериментов использовали профилактическую схему вакцинации, при которой цитокины и вакцину вводили мышам до их заражения фиксированным вирусом бешенства. Цитокины и вакцину вводили животным двукратно с интервалом в одну неделю, а вирус бешенства - на восьмой день после окончания введения препаратов. Во второй серии экспериментов проводили лечебную вакцинацию животных, при которой опыт начинали с заражения мышей путем интра-

церебрального введения фиксированного вируса бешенства. Лечение мышей вакциной и цитокинами начинали сразу после заражения и инь-екции проводили в течение пяти дней с интервалом в 24 часа. Титр вируса при внутримозговом заражении беспородных белых мышей был в пределах 3,6-8,4 lg LD50/0,03 мл.

Изучая влияние цитокинов на поствакцинальный иммунитет, оценивали состояние клеточного и гуморального иммунитета у экспериментальных животных. О клеточной форме иммунного реагирования судили по численности и функциональной активности лимфоцитов, изученных в цитотоксическом тесте (ЦТТ) и реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

В ЦТТ использовали кроличьи иммуноглобулины, специфичные к Т-(АТГ) и В-(АВГ) лимфоцитам мыши, и комплемент кролика (НИИЭМ им.Г.Н.Габричевского г.Москва). Реакцию проводили в круглодонных микропланшетах ("Ленмедполимер"), в лунки которых вносили АТГ или АВГ, исследуемую взвесь лимфоцитов (концентрация ШО"? кл/мл) и комплемент кролика. Клетки инкубировали при 37°С в течение 25-30 минут. Определяли число погибших клеток, вычисляли их процентное содержание от общего количества клеток в препарате, подсчитывали цитотоксический индекс.

Постановку РБТЛ проводили с использованием оптимальных концентраций митогенов (10 мкг/мл для ФГА и Кон А, 50 мкг/мл для ЛПС, "Sigma", США) или специфических антигенов (вакцина против клещевого энцефалита, антирабическая вакцина). Клетки культивировали в микропланшетах ("Becton Dickinson", США) в конечной концентрации 1x10^6 кл/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% ЗТС, 2тМ-Ь-глутамина, 5x10Л5 М2-меркаптоэтанола, 1мМ HEPES-буфера и антибиотики. Лимфоциты мышей инкубировали в течение 72 часов при 37°С в атмосфере 5% С02. Пролиферативный ответ оценивали по интенсивности синтеза ДНК клетками. Для этого за 16 часов до окончания культивирования в культуры клеток вносили метил~3-"Н-тимидин (74 кБк/мл). Счет радиактивности проводили b-счетчиком "BetaT-

гак", уровень пролиферации спленоцитов оценивали по числу импульсов в одну минуту.

Численность Т-хелперов и Т-супрессоров, а также экспрессию антигенов ГКГ класса II (IA-, IE-субрайонов) на спленоцитарных лимфоцитах и макрофагах мышей линии СБА определяли в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием соответствующих специфических моноклональных антител: анти-ЬЗТ4- и анти-Thyl,2-антите-ла ("Becton Dickinson", США), анти-IA- и анти-1Е-антитела (супер-натанты гибридом 10-2-16 и 13/4, соответственно). Взвесь клеток (концентрация 1x10~6 кл/мл в среде 199 с 5% ЭТС) инкубировали с препаратами моноклональных антител в 96-луночных планшетах ("Becton Dickinson", США) в течение 30 минут при 4°С. После отмывания клетки вновь инкубировали в течение 30 минут при 4°С с препаратом FITC-меченных Г(аЬ)2-фрагментов кроличьих антител, специфичных к иммуноглобулинам мыши ("Becton Dickinson", США). Затем клетки фиксировали 1% раствором параформальдегида ("Merck", Германия) в течение 15 минут при комнатной температуре и хранили при 4° С не более 2-х суток. Результаты опытов учитывали с помощью проточной цитометрии на приборе "Epics С", определяя количество клеток, несущих указанные маркеры.

О влиянии цитокинов на гуморальную форму иммунного реагирования экспериментальных животных судили по содержанию в сыворотке крови гемагглютинирующих антител при клещевом энцефалите, ви-руснейтрализующих антител при бешенстве и специфических антител при гепатите А.

Титр гемагглютинирующих антител определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с 0,4% суспензией гусиных эритроцитов. Использовали микрометод РТГА с 2-кратными разведениями сывороток и одной дозой антигена - 8 АЕ. В качестве антигена применяли коммерческий диагностикам вируса клещевого энцефалита из штамма 139 (НИИВС, г.Томск). Реакцию учитывали через 18-20 часов контакта антигена с антителами при +4°С.

Титр вируснейтрализующих антител определяли в реакции биологической нейтрализации на мышах. Постановку реакции осуществляли с использованием постоянной дозы вируса бешенства, штамм CVS (38 LD50) и 5-кратных разведений сывороток. Равные обьемы вируссодер-жащей жидкости и сыворотки смешивали и выдерживали в течение 1,5 часов при 37°С. После инкубации смесь вводили в мозг беспородным бельм мышам массой 7-8 г в обьеме 0,03 мл. За мышами наблюдали 14 дней, учитывая гибель животных, начиная с 6 дня после заражения.

Титр специфических антител к вирусу гепатита А (ВГА) определяли с помощью иммуноферментного анализа, используя отечественные коммерческие гест-системы ("ИФА-анти-ВГА" НПО "Диагностические системы" г.Нижний Новгород и "Вектогеп A-антитела" НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ НПО "Вектор" г.Новосибирск). Обе тест-системы обладают практически одинаковой чувствительностью, составляющей 10-20 мМЕ/мл по отношению к международному стандарту IgG к ВГА. Результаты исследований оценивали по титру специфических антител к ВГА и по числу сероположительных животных. Сероположительными считались сыворотки животных, титр антител к ВГА в которых был больше 1:10.

Статистическая обработка данных проводилась на компьютере типа IBM PC/XT с использованием программы "STATGRAPH" фирмы Microsoft v. 2.1. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью t - критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Определение содержания цитокинов в противовирусных вакцинах.

При анализе результатов проведенных исследований установлено, что все изученные противовирусные вакцины, полученные на основе клеток млекопитающих, содержат ряд цитокинов (Табл.1).

Наибольший уровень ИЛ-1Ь выявлен в вакцине против гепатита

Таблица 1.

Содержание цитокинов в вакцинах и субстратах

Название препаратов

ШЫЬ (пг/мл)

ИЛ-6 (МЕ/мл)

ФНО-а (пг/мл)

1. Антирабическая вакцина на клеточной культуре ПСХ н/о

2. Полиомиелигная вакцина

типов 1,2,3 на 26,0±4,0

клеточной культуре ПЗМ (19^55)

833, 3±211, 8 О (4.10-5-1060)

62,0±13,3 779,Oi96,О

(44-5-88) (380-1280)

Полиомиелитные моновакцины на

клеточной культуре ПЗМ

3. 1 типа

4. 2 типа

5.

3 типа

клетки ПЗМ

6. Полиомиелитная вакцина

типов 1,2,3 на клеточной линии VERO клетки VERO

7. Коревая вакцина на клеточной культуре Л-68

24,0 35,5±4, 5 (31+40) 20,0

О О

О

27, 0±8,О (19-35) О

клетки Л-68 8. Вакцина против гепатита А

на клеточной линии 4647 130,8+12,8

(1084-165) клетки 4647 О

44,0 48,0

2,4

н/о 15, 0±4, О (11-19)

О

71, 5±32, 1 (ЗЭИОЗ) 0.8

О, 9±0,3 (0,4-1,5) н/о

30,0 40,0±10,О

(30-60) 45, 0±15, О (30-60) О

2830,0±30, О (2800-2860)

О

600, 0+79,О (520-680) О

575,0±39,О (500-680) О

Примечание: - н/о - не определяли;

- в скобках указаны пределы колебаний соответствующих показателей.

А, изготовленной на основе клеточной линии 4647 (130,8+12,8 пг/мл). Отсутствие ИЛ-lb установлено в полиомиелитной вакцине, изготовленной на клеточной линии VERO. В остальных вакцинах концентрация ИЛ-Ib была на уровне 20,0-35,0 пг/мл.

Наибольшее количество ИЛ-6 выявлено в антирабической вакцине, изготовленной на культуре клеток ПСХ (833,3±211,8 МЕ/мл), наименьшее содержание ИЛ-6 установлено в вакцине против гепатита А и в полиомиелитной моновакцине 3 типа, изготовленной на культуре клеток ПЗМ (0, 9 и 2,4 МЕ/мл, соответственно). В остальных вакцинах концентрация ИЛ-6 была в пределах 15, 0-72, 0 МЕ/мл.

Наибольшее количество ФНО-а выявлено в полиомиелитной вакцине, изготовленной на клеточной линии VERO (2830,0+30,0 пг/мл). В полиомиелитной вакцине, изготовленной на культуре клеток ПЗМ, а также в коревой вакцине и вакцине против гепатита А содержание ФНО-а было в пределах 575,0-779,0 пг/мл. В полиомиелитных моновакцинах, изготовленных на культуре клеток ПЗМ, концентрация ФНО-а была на уровне 30,0-45,0 пг/мл, в антирабической вакцине ФНО-а отсутствовал.

Субстраты, используемые для производства исследуемых вакцин, не содержали указанных цитокинов. Исключение составляет диплоидный клеточный штамм Л-68, который спонтанно продуцировал небольшое количество ИЛ-6.

Таким образом, набор и концентрация цитокинов зависят от вида вакцины. Наибольший уровень ИЛ-lb из всех изученных вакцин содержится в вакцине против гепатита А, ИЛ-6 - в антирабической вакцине, ФНО-а - в полиомиелитной вакцине, изготовленной на клеточной линии VERO. Концентрация цитокинов в различных вакцинах варьирует от серии к серии.

С целью выяснения источника появления цитокинов в противовирусных вакцинах была изучена спонтанная и индуцированная вирусом полиомиелита 1, 2, 3 типов выработка цитокинов (ИЛ-lb, ИЛ-6. ФНО-а) различными клеточными субстратами (ПЗМ, 4647, М-22), ис-

- 14 -

пользуемыми для изготовления вакцин (Табл.2).

Таблица 2.

Спонтанный и индуцированный вирусом полиомиелита 1, 2, 3 типов синтез цитокинов клетками млекопитающих

Клеточные Тип ШМЬ ЙЛ-6 ФНО-а

культуры вируса (пг/мл) (МЕ/МЛ) (пг/мл)

Первичная культура

клеток (ПЗМ) - 0 Н/О 0

1 34,3±6,3 12,0 501,7±208,0

3 0 2,3 95,0+65.0

Перевиваемая клеточная

линия (4647) - О Н/О 0

1 36,0 Н/О 140,0

2 102,0 Н/О 135,0±5, 0

3 0 Н/О 40,0

Диплоидный клеточный

штамм (М-22) - 0 0.3 190,0

1 0 66,1 810,0±266,6

2 0 156,4 622, 5±126,9

3 0 1,8 618,0±190,9

Примечание: - н/о - не определяли.

Спонтанная продукция цитокинов обнаружена у диплоидного клеточного штамма М-22. Культуры клеток ПЗМ и 4647 спонтанно не продуцировали не один из указанных цитокинов.

Под воздействием вируса полиомиелита все исследуемые виды клеточных культур приобретали способность продуцировать цитокины. Выявлена зависимость выработки цитокинов от типа вируса.

Под влиянием вируса полиомиелита 1 типа наблюдается наибольшая выработка ФНО-а всеми исследуемыми клеточными культурами. Под

влиянием вируса полиомиелита 2 типа установлена наибольшая продукция ИЛ-Ib клеточной линией 4647 и ИЛ-6 культурой клеток М-22. Вирус полиомиелита 3 типа индуцирует культуры клеток к выработке значительно меньшего количества ИЛ-6 и ФНО-а по сравнению с вирусом полиомиелита 1 и 2 типа и не стимулирует выработку ИЛ-lb.

Таким образом, диплоидные клеточные штаммы (М-22, Л-68) сек-ретируют цитокины спонтанно, первичная культура клеток (ПЗМ) и перевиваемые клеточные линии (VERO, .4647) не обладают такой способностью. Синтез цитокинов во всех клеточных субстратах наблюдается при антигенной стимуляции вирусом полиомиелита. Набор и концентрация цитокинов зависят от клеточной культуры и типа вируса. Наибольшая продукция цитокинов наблюдается под воздействием вируса полиомиелита 1 и 2 типов по сравнению с вирусом 3 типа.

2. Изучение адьювантных свойств цитокинов (на моделях клещевого энцефалита, гепатита А, бешенства).

На экспериментальных моделях было изучено влияние цитокинов на иммунный ответ животных при введении вакцин против клещевого энцефалита, гепатита А и бешенства.

При вакцинации мышей линии Balb/c против клещевого энцефалита статистически достоверное (р<0.05) увеличение иммуногенности ВКЭ наблюдается при введении животным рч ИЛ-lb, рч ФНО-а, гибридного белка "неотим" и иммунофана одновременно с вакциной; уменьшение - при использовании тимозина al или комбинации цитокинов из рч ИФ-Y и рч ФНО-а. Отсутствие эффекта отмечено при введении вместе с вакциной рч ИФ-а или рч ИФ-Y. Комбинированное использование рч ИЛ-lb. рч ИЛ-2, рч ФНО-а и иммунофана было способно повысить иммуногенность вакцины, усиления иммунопотенциирующего действия по сравнению с индивидуальным введением указанных цитокинов не наблюдали (Рис.1).

Puai. Иммуногенность вакцины против клещевого энцефалита на фоне цитокинов

* *

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13

Группы животных

1 - ВКЭ

2 - ВКЭ + рч ИЛ-1Ь

3 - ВКЭ + рч ИЛ-2

4 - ВКЭ + рч ЗНО-а

5 - ВКЭ рч ИФ-а

6 - ВКЭ ■1- рч Ш-Y

7 - ВКЗ +■ Та

8 - вкв Т-ЙЮ-Т

9 - ВКЭ ■h иммунофан

10 - ВКЗ +■ рч ИФ-Y

рч Ш0-а

11 - ВКЭ рч ИЛ-2

рч ФНО-а

12 - ВКЭ + рч ИЛ-1Ь

рч ИЛ-2 рч ШО-а

13 - ВКЭ + рч ИЛ-1Ь

рч ИЛ-2 рч ФНО-а иммунофан

При изучении количественного содержания Т- и В-лимфоцитов в селезенках иммунизированных животных установлено, что все используемые цитокины оказали стимулирующее действие на процессы пролиферации и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов. При введении мышам ВКЭ в сочетании с рч ИЛ-2, гибридным белком "неотим" или иммуно-фаном наблюдается статистически достоверное (р<0,05) увеличение количества Т- и В-лимфоцитов по сравнению как с группой интактных мышей, так и с группой животных, получившей ВКЭ без цитокинов (Табл.3).

При оценке функциональной активности лимфоцитов выявлено статистически достоверное (р<0,05) усиление антигенспецифической пролиферации лимфоцитов в группах животных, иммунизированных ВКЭ в сочетании с рч ШЫЬ или рч ИЛ-2 (Рис.2).

Таким образом, использование цитокинов в качестве адыовантов способно повысить эффективность иммунизации экспериментальных животных против клещевого энцефалита. Наибольшую активность в этой модельной системе проявили иммунофан и гибридный белок "неотим", которые усиливали иммуногенность ВКЭ в 1,5 раза. Более выраженный протективный эффект, наблюдаемый в ряде случаев при использовании ВКЭ с цитокинами, по-видимому, обусловлен активацией специфического клеточного иммунного ответа под влиянием цитокинов.

При вакцинации морских свинок против гепатита А выявлено стимулирующее действие изученных цитокинов на продукцию антител к вирусу гепатита А (Рис.3).

После 2-х кратного введения препаратов (I срок обследования) статистически достоверное различие (р<0,05) титров АТ по сравнению с показателями в контроле выявлено в группах морских свинок, получивших вместе с вакциной рч ФНО-а, рч ИЛ-1Ь, иммунофан или комбинацию рч ФНО-а и рч ИФ-У. Титры АТ в группе с рч ФНО-а превышали в 13,4, рч ШЫЬ - 11,9, комбинацией из рч ФНО-а и рч ИФ-У - 4,6. иммунофаном - 4,4 раза уровень контрольной группы. В группах с рч ИЛ-2, рч ИФ-У или комбинацией из рч ШЫЬ. рч ИЛ-2, рч

Таблица 3.

Количественное содержание Т- и В-лимфоцитов (в %) в селезенках мышей линии Ва1Ь/с, иммунизированных ВКЭ на фоне цитокинов

NN Групш животных .Т-лимфоциты В-лимфоциты

1., . Интактные мыши 26,2 + 1,9 41,1 ± 0,9

2. ВКЭ 29,2 ± 3,0 46,1 ± 1,5

3. рч ИЛ-1Ь + ВКЭ 40,6 ± 4, 1 * 56,2 ± 4,6 *

4. рч ИЛ-2 + ВКЭ 41,7 ± 2,2 *, ** 54,1 ± 2,2 **

5. рч ФИО-а + ВКЭ 38,9 ± 2,2 * 56,4 ± 1,5 *#

6. рч ИФ-а + ВКЭ 37,5 + 2,8 * 52,8 ± 5,3

7. рч ИФ-У + ВКЭ 39.2 ± 4,1 * 54,7 ± 3.4 *

8. рч Та + ВКЭ 38,6 ± 1,5 * 52,6 ± 2.6 *

9. Т-ФНО-Т + ВКЭ 49,2 ± 1,5 ** 60,7 + 1,5 **

10. Иммунофан+ ВКЭ 42,7 ± 2,7 ** 58,6 ± 2,1 **

11. рч ФНО-а + ВКЭ 38,5 £ 1,8 * 53,1 ± 4.9

рч ИФ-У

12. рч ИЛ-2 + ВКЭ 42,3 ± 5,4 * 56,1 ± 3,7 *

рч ФНО-а

13. рч ИЛ-1Ь + ВКЭ 40,6 ± 2,7 *, ** 54,5 ± 2,9 *

рч ИЛ-2

рч ФНО-а

14. рч ИЛ-1Ь + ВКЭ 38,6 ± 2,9 * 53,3 ± 3,9 *

рч ИЛ-2

рч ФНО-а

иммунофан

Примечание: * - различие достоверно (р < 0,05) по отношению к группе интактных мшей;

** - различие достоверно (р < 0,05) по отношению к группе мышей, получившей вакцину без цитокинов.

Puc.2. Показатели аитшгенспеищфической РБТЛ при введении ВКЭ и цитокинов

3 4 5 6 Группы животных

1 -2 -

3 -

4 -

5 -

ВКЭ ВКЭ + ВКЭ + ВКЭ + ВКЭ +■

рч ИЛ-1Ь рч ИЛ-2 рч fflO-a Т-ФНО-Т

6 - ВКЭ + иммунофан

7 - ВКЭ + рч ИЛ-lb

рч ИЛ-2 рч ФНО-а

Рис,3. Уровень АГ к ВГА при вакцинации против гепатита А на фоне цитокинов

4 5 6 Группы животных

I - 14-сутки после 2-кратного введения препаратов II- 14-сутки после 3-кратного введения препаратов

1 2

3

4

5

6

Геп-А-ин-ВАК Геп-А-ин-ВАК Геп-А-ин-ВАК Геп-А-ин-ВАК Геп-А-ин-ВАК Геп-А-ин-ВАК

+■ рч ИЛ- 1Ь 7 - Геп-А-ин-ВАК + рч ИЛ-1Ь

+ рч ИЛ-2 рч ИЛ-2

+ рч ФНО-а рч ЙЮ-а

рч Ш-Х 8 - Геп-А-ин-ВАК + рч ФНО-а

+ иммунофан рч ИФ-У

ФНО-а титры АТ были в 2,5-4,3 раза выше по сравнению с контрольной группой, однако различие статистически недостоверно (р>0,05).

Частота сероположительных животных после 2-х кратного введения препаратов в группах с рч ИЛ-1Ь, рч ИЛ-2 или рч ФНО-а, используемых индивидуально, достигла 100% и достоверно (р<0,05) отличалась от аналогичного показателя в контроле, равного 73, 7%. В группах животных, получивших вместе с Геп-А-ин-ВАК комбинацию из рч ШЫЬ. рч ИЛ-2 и рч ФНО-а или из рч ФНО-а и рч ИФ-У, а также в группах с рч ИФ-У или иммунофаном эффективность вакцинации была менее выраженой.

После 3-х кратного введения препаратов (II срок обследования) достоверное различие. (р<0,05) титров АТ по сравнению с показателями в контроле выявлено в тех же группах морских свинок, что и после 2-х кратного введения препаратов. Средние геометрические титры АТ в груше с рч ФНО-а превышали в 13,6, рч ИЛ-1Ь - 11.3, иммунофаном - 8,4, комбинацией из рч ФНО-а и рч ИФ-У -6,8 раза уровень контрольной группы. Титры АТ в других группах животных превышали з 4.4-4, 9 раза аналогичный показатель в контроле, однако различие по сравнению с контрольной группой статистически недостоверно (р>0.05).

Частота сероположительных животных после 3-х кратного введения препаратов в контрольной группе морских свинок, иммунизированной Геп-А-ин-ВАК без цитокинов, составила 89,5%, во всех группах с цитокинами - 100%.

Таким образом, в экспериментах на морских свинках выявлено стимулирующее влияние цитокинов на иммуногенную активность вакцины против гепатита А. Введение цитокинов в качестве адьювантов способствовало увеличению титров антител к вирусу гепатита А в 2,5-13,6 раза по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированной одной вакциной, и обеспечивало 100% сероконверсию животных после окончания введения препаратов.

При вакцинации беспородных белых мышей против бешенства в

первой серии экспериментов изучали профилактическое использование цитокинов в сочетании с КОКАВ, при котором указанные препараты вводили мышам до их заражения фиксированным вирусом бешенства, штамм СУБ.

При введении КОКАВ в сочетании с отдельно взятыми цитокинами (рч ИЛ-1Ь. рч ФНО-а, Та, Т-ФНО-Т) установлено, что рч ФНО-а или рч ИЛ-1Ь способствуют повышению выживаемости животных в 1,2-1,8 раза, а использование Та или Т-ФНО-Т не оказывает влияния на эффективность иммунизации.

При изучении титров вируснейтрализующих антител в сыворотках крови экспериментальных животных установлено, что при введении вакцины в разведении 1:25 все указанные цитокины оказали стимулирующее влияние на процесс антигелообразования, способствуя увеличению титров АТ в 1,2-7,0 раз. При использовании вакцины в разведении 1:125 в группах с рч ФНО-а и рч ИЛ-1Ь титры АТ были в 2,5-3,0 раза выше уровня контрольной группы, а в группах с Т-ФНО-Т и Та - на уровне контроля. При большем разведении вакцины стимулирующее влияние цитокинов на антителообразование выявлено не было (Рис.4).

При изучении показателей клеточного иммунитета в РБТЛ установлено статистически достоверное (р<0,05) увеличение спонтанной и митогениндуцированной пролиферации лимфоцитов в группе мышей, иммунизированной КОКАВ в сочетании с рч ИЛ-1Ь.

При введении КОКАВ в сочетании с комбинацией цитокинов (рч ИЛ-1Ь, рч ИЛ-2, рч ФНО-а) установлено, что указанные цитокины способствуют увеличению выживаемости животных в 7,3 раза. Процент выживших животных при использовании вакцины в разведении 1:50 и 1:500 в опытной группе статистически достоверно (р<0,05) отличался от показателей контрольной группы (Рис.5).

При указанной схеме введения цитокинов у экспериментальных животных исследовали показатели клеточного иммунитета в реакции бласттрансформации, а также определяли уровень Т-хелперов, Т-суп-

Рис.4. Уровень титров АТ при вакцинации против бешенства на фоне цитокинов

з 4

Группы животных

—71:25

_/1:125

/1:625

1 - КОКАВ

2 - КОКАВ рч ИЛ-1Ь

3 - КОКАВ + рч ®0-а

4 - КОКАВ 4- Та

5 - КОКАВ + Т-ФНО-Т

Рис.5. Влияние идтокинов на протективный эффект КОКАВ

1:50 _/1:500 71:5000

Группы животных

1 - КОШ

2 - КОКАВ рч ИЛ-1Ь

рч ИЛ-2 рч ФИО-а

рессоров и уровень экспрессии антигенов класса II ГКГ в реакции иммунофлюоресценции.

В группе животных, иммунизированной КОКАВ в сочетании с комбинацией цитокинов, установлено статистически достоверное (р<0,05) усиление антигенспецифической пролиферации лимфоцитов (Рис.6). увеличение процентного содержания Т-хелперов и уменьшение Т-супрессоров, а также увеличение числа клеток, несущих IA- и IE-антигены, по сравнению с контрольной группой мышей.

Таким образом, в опытах профилактической иммунизации использование цитокинов в качестве адьювантов способно усилить защитный эффект КОКАВ. Наиболее выраженный стимулирующий эффект был отмечен при использовании вместе с КОКАВ комбинации цитокинов (рч ИЛ-lb, рч ИЛ-2, рч ФНО-а), введение которой способствовало увеличению выживаемости животных в 7,3 раза. Лучший протективный эффект, наблюдаемый в этой группе животных, сопровождался повышением показателей клеточного иммунитета.

Во второй серии экспериментов изучали лечебное введение цитокинов (рч ИЛ-lb, иммунофан) в сочетании с КАВ, при котором указанные препараты вводили мышам после их заражения фиксированным вирусом бешенства, штамм CVS. Проведенные исследования показали, что введение рч ИЛ-lb или иммунофана в сочетании с КАВ практически не оказывает влияния на протективный эффект вакцины. Одной из причин отсутствия усиления специфического иммунитета при использовании цитокинов в сочетании с антирабической вакциной может быть интрацеребральный путь введения вируса бешенства и подкожное введение антирабической вакцины и цитокинов.

Таким образом, в вакцинах, изготовленных на основе клеток млекопитающих, обнаружено присутствие ряда цитокинов (ИЛ-lb, ИЛ-6, ФНО-а). Наличие высокоактивных цитокинов в противовирусных вакцинах свидетельствует о необходимости изучения биологической значимости их присутствия. Выявленные различия по содержанию цитокинов между отдельными сериями вакцин предопределяют целесооб-

Puc.6. Покаэаше/ш РБТЛ при введении КОКАВ и комбинации и,ишокинов

I - Интактнне мыши III - КОШ

II- рч ИЛ-lb IV - КОКАВ +■ рч ИЛ-1Ь

рч ИЛ-2 рч ИЛ-2

рч ФНО-а рч ФНО-а

1 - Спонтанная пролиферация лимфоцитов

2 - ФГА-индуцированная — " —

3 - КОКАВ-индуцированная — " —

разность стандартизации и контроля этих препаратов по содержанию в них цитокинов. Установлена спонтанная и индуцированная вирусом полиомиелита способность клеточных культур вырабатывать цитокины. Оценка указанных свойств клеточных культур может быть использована при подборе клеточного субстрата для новых противовирусных вакцин. В экспериментах установлено, что цитокины являются эффективными иммунологическими адьювантами, неспецифически усиливающими иммунный ответ. Для достижения желаемого адъювантного эффекта для каждого вида вакцин необходим свой набор цитокинов, стимулирующих клеточное и/или гуморальное звено иммунитета. Использование цитокинов в качестве адыовантов открывает новые подходы к изучению и управлению вакцинальным процессом.

ВЫВОДЫ.

1. Вакцины, изготовленные на основе клеток млекопитающих, содержат ряд цитокинов, набор и концентрация которых зависят от вида вакцины. Наибольший уровень ИЛ-lb из всех изученных вакцин содержится в инактивированной вакцине против гепатита А (на клеточной линии 4647), ИЛ-6 - в инактивированной антирабической вакцине (на клеточной культуре ПСХ), ФНО-а - в живой полиомиелитной вакцине (на клеточной линии VERO).

2. Диплоидные клеточные штаммы (М-22, Л-68) секретируют цитокины спонтанно, первичная клеточная культура (ПЗМ) и перевиваемые клеточные линии (VERO. 4647) не обладают такой способностью. Синтез цитокинов во всех клеточных субстратах наблюдается при антигенной стимуляции вирусом полиомиелита (1, 2, 3 типы). Продукция цитокинов зависит от вида клеточной культуры и типа вируса, более выраженный эффект наблюдается под воздействием вируса полиомиелита 1 и 2 типов по сравнению с вирусом 3 типа.

3. Отдельные серии вакцин отличаются по содержанию в них ци-

токинов, что предопределяет целесообразность стандартизации и контроля этих препаратов по содержанию в них цитокинов, а также необходимость изучения биологической значимости присутствия цитокинов в вакцинах.

. 4. Цитокины повышают иммуногенную активность вакцины против клещевого энцефалита, оцениваемую по уровню резистентности мышей линии Balb/c к заражению вирулентным штаммом "Абсеттаров" вируса клещевого энцефалита. Более выраженный эффект наблюдается при использовании вместе с вакциной иммунофана или гибридного белка "неотим", которые усиливают иммуногенность вакцины в 1,5 раза.

5. Протективный эффект, возникающий при использовании вакцины против клещевого энцефалита с цитокинами, сопровождается более высокими показателями специфического клеточного иммунного ответа без повышения уровня циркулирующих антител.

6. Изученные цитокины (рч ИЛ-lb, рч ФНО-а, тимозин al, гибридный белок "неотим", иммунофан) усиливают иммуногенную активность вакцины против гепатита А у морских свинок, увеличивая титры антител к вирусу гепатита А в 2,5-13,6 раза по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированной одной вакциной, и обеспечивая 100% сероконверсию у животных после введения препаратов.

7. Цитокины повышают протективный эффект культуральной анти-рабической вакцины, оцениваемый по уровню резистентности беспородных белых мышей к заражению тест-штаммом CVS фиксированного вируса бешенства. Наиболее выраженная защита наблюдается при использовании вместе с антирабической вакциной комбинации цитокинов (рч ИЛ-lb, рч ИЛ-2, рч ФНО-а), которая усиливает выживаемость животных в 7,3 раза.

8. Развитие иммунитета у животных, наблюдаемое при использовании антирабической вакцины с отдельными цитокинами (рч ИЛ-lb, рч ФНО-а) или смесью цитокинов (рч ИЛ-lb, рч ИЛ-2 и рч ФНО-а). сопровождается усилением специфического и неспецифического кле-

точного иммунитета и высоким уровнем вируснейтрализуюпщх антител в сыворотке крови экспериментальных животных.

9. С целью достижения желаемого адьювантного эффекта для каждого вида вакцин необходим свой набор цитокинов, стимулирующих клеточные и/или гуморальные механизмы иммунитета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Cytokines as vaccine adjuvants. Abstract of the 12th European Immunology Meeting. Barselona, Spain, 1994, 14-17 June, (соавт. Medunitsin N. V., Bukovskaya S.N.).

2. Cytokines and vaccination. Abstract of the I International Congress on Immunorehabilitation, Sochi-Dagomys, 1994, 5-9 July, p.231. (соавт. Medunitsin N. V., Nevskaya L.V.).

3. Содержание цитокинов в полиомиелитной вакцине. Материалы междунородного симпозиума, посвященного 150-летию со дня рождения И.И. Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова НПО "Иммунопрепарат", "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине", г.Уфа, 12-15 июня 1995 г., часть I, с.201-204. (соавт. Невская Л.В., Авдеева Ж.И., Потапнев М.П., Вознюк A.B., Медуницын Н.В.).

4. Оптимизация цитокинами вакцинального процесса. В сб. "Актуальные проблемы инфекционной патологии", г. Санкт-Петербург, 1993 г., часть III, с.17. (соавт. Буковская С.Н., Невская Л.В., Симбирцев А.С., Храпова И.С., Романова Л. Н., Медуницын Н.В.)

5. Цитокины как стимуляторы поствакцинального иммунитета. Тезисы II Российского национального конгресса "Человек и лекарство". г.Москва, 10-15 апреля 1995 г., с.39. (соавт. Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Шмелев В.А., Лебедев В.В., Степанов О.Г.).

6. Цитокины в иммунобиологических препаратах. Тезисы II Российского национального конгресса "Человек и лекарство", г.Москва,

10-15 апреля 1995 г., с.39. (соавт. Медуницын Н.В., Невская Л.В., Алпатова Н. А., Тер-Габриэльянц Г.Г., Авдеева Ж. И.).

7. Разработка новых лекарственных средств - цитокинов. Тезисы III Российского национального конгресса "Человек и лекарство", г.Москва, 16-20 апреля 1996 г., с.36. (соавт. Медуницын Н. В., Авдеева Ж. И., Алпатова H.A., Тер-Габриэльянц Г.Г., Пустошилова Н. М,, Масычева В. И.).

8. Цитокины и вакцины. Тезисы II Международного конгресса "Иммунореабшштация и реабилитация в медицине", Турция, 4-7 мая 1996г., с.66. (соавт. Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И., Алпатова Н. А., Невская Л. В.).

9. Цитокины в вакцинальном процессе. Тезисы I Всероссийского конгресса по патофизиологии, г.Москва, 17-19 октября 1996 г., с.153. (соавт. Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И., Воробьева М.С., Рас-щепкина М.Н., Тер-Габриэльянц Г.Г.).

10. Цитокины в вакцинах и препаратах интерферона. "Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии", в печати, (соавт. Авдеева Ж.И., Потапнев М.П., Возник A.B., Невская Л.В., Алпатова H.A., Тер-Габриэльянц Г.Г., Медуницын Н.В.).

11. Содержание цитокинов в иммунобиологических препаратах. "Иммунология", в печати, (соавт. Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И., Потапнев М.П., Возник А. В., Невская Л.В., Алпатова H.A., Тер-Габриэльянц Г.Г., Варданян Н.В., Миронова Л.Л., Попова В.Д.).