Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.07) на тему:Зависимость суперовуляции и качества эмбрионов коров-доноров от состояния их гормонального статуса, эндометрия и показателей обмена веществ

всесоюзный шчно-исслвдовательшй инсягот незаразных болезней щвотных

На правах рукописи

АНТАНЕ Вита Витаутовна

УДК 619:591.089.843:591.147.8:636.2

ЗАВИСИМОСТЬ СУПЕРОВУЛЯЦИИ И КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ КОРОВ-ДОНОРОВ от состояния ИХ ГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА, ЭНДОМЕТРИЯ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ

16.00.07 — Акушерство и искусственное осеменение

Автореферат

диссертации на соискание ученой степенй кандидата ветеринарных наук

вороня -1990

Работа выполнена б колхозе «Тервете» Добельского района Латвийской ССР, на базе лаборатории переноса эмбрионов крупного рогатого скота, на кафедре хирургии и акушерства Латвийской СХА и в лаборатории генетики желез внутренней секреции ВНИИРГЖ.

Научный руководитель — доктор ветеринарных наук, профессор И. Н. Афанасьев.

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук Нежданов А. Г.

2. Кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Лободин А. С.

Ведущая организации: Литовская ветеринарная академия

Защита состоится « $ & » ноября 1990 г. в часов на заседа-

нии специализированного совета Д 120.78.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте незаразных болезней животных (394043, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

В. И. СЛОБОДЯНИК

I. ОБЩАН ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акууздьность темц. Проблема создания стад животных с высокими генетическими задатками давно привлекает внимание специ- ■ алистов во всех странах мира.

С развитием сельскохозяйственной науки, появлением новых гормональных и других биохимически активных препаратов, появилась возможность искусственного стимулирования системы воспроизводства коров, на основе чего р&зработан метод переноса эмбрионов. Применяя этот метод, создается возможность получения 10...30 и более телят в год от одной коровы.

Одной из ванных проблем эффективного внедрения метода переноса эмбрионов в практику является отбор высокоценных коров-доноров, способных к индуцированию множественной овуляции, выделению достаточного числа высококачественных эмбрионов для их переноса или криоконсервированкя.

Использование животных в качестве доноров осуществляется в двух направлениях: однократное или многократное использование здоровых животных после завершившегося процесса инволшии матки. Для многократного использования формируется группа из выбракованных, генетически высокоценных коров, но утративших хо- • зяйстяенно полезную ценность. Отбор доноров среди этой группы животных связан с определенным риском, так как эмбриопродук-т явность обычно бывает значительно ниже, чем у здоровых коров ( & Нож** А? 1СШ; Л. ММ Ы., 'ЧМ, 9 Гс/и/бу.

С/си-у, /983; 3 /Оч/^ at.il/.. /9¿4).

Отмечаются большие индивидуальные различия по получению эмбрионов от выбракованных высокопродуктивных коров.

Использование выбракованных высокопродуктивных коров в качестве доноров эмбрионов, а также выяснение отдельных причин, отрицательно влияющих на степень суперовуляцил, • количество и качество эмбрионов является актуальной проблемой, которая требует дальнейшего решения.

Цель ц .задачи работу. Целью .нашей работы было установить закономерности динамики некоторых гормональных, оиохимаческих и морфологических показателей крови и эндометрия и их связь с процессами суперовуляции, количеством и качеством эмбрионов у выбракованных коров, потенциальных допоров эмбрионов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить стеровдогенную функцию яичников у коров-доноров до начала обработки гонадотропинами.

2. Выяснить динамику концентрации стероидов прогестерона

и эстрад ¡юла-17/^ в сыворотке крови в период гормональной подготовки коров-доноров.

3. Изучить морфологическое состояние эндометрия у коров-доноров.

4. Изучить морфологическую картину крови и отдельные ее биохимические показатели у коров-доноров.

5. Изучить взаимосвязь медцу показателями состояния здоровья донора, суперовуляцией, количеством и качеством эмбрионов и их приживляемостыо у реципиентов.

Новизна исследований. Впервые проведен комплекс углубленных исследований коров, потенциальных доноров эморионов, перед их подготовкой к суперовуляции. Выяснена зависимость суперовуляции, получения эмбрионов и их качества от состояния эндометрия, концентрации стероидных гормонов яичников (в частности, прогестерона и эстрадиола-17^ ), а также от морфологических и некоторых биохимических показателей крови. т

Изучена динамика концентрации прогестерона и эстрадкола-17/( в сыворотке крови коров-доноров в период их подготовки к суперовуляции и извлечению эморионов.

Установлено, что при использовании выбракованных коров в качестве доноров необходима гистологическая оценка состояния их эндометрия, путам его прижезной биопсии, ■

Лрздтздеркая ценность работы. Проведенный комплекс радиоиммунологических, морфологических и биохимических исследований крови, а также гистологическое исследование эндометрия коре .а создает условия обоснованного отбора доноров эмбрионов от выбракованных животных <• целью создания постоянного донорского стада. Это позволит снизить расходы на подготовку доноров, экономя дорогостоящие гормональные препараты, труд и время.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуадены на 40-й, 41-й, 42-й и 44-й научно-практических конференциях Латвийской сельскохозяйственной акад&мии (1у85, 1986, 1У87, 1989), на научно-практической конференции ЭШШиВ в Тарту, 1У85 г. я на 5-й научной конференции молодых ученых и спедиа-

листов ВНИИЕГК Ц986).

Публикация. Основные материалы диссертации опубликованы в четырех статьях.

на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения (5 стр.), оозорэ литературы (26 стр.), материала и методов исследований (12 стр.), собственных исследований (44 стр.), обсуждения результатов работы (14 стр.), выводов и практических предложений (4 стр.), списка литературы (25 стр.). Работа иллюстрирована 25 таблицами и 14 рисунками.

Список литературы содержит 217 источников, в том' числе 127 на русском языке и 50 на иностранных языках.

Работа проведена в колхозе "Тврвете" Добельского района Латвийской ССР в течение IУ84-1985 гг., на базе лаборатории переноса эмбрионов крупного рогатого скота, на кафедре хирургии и акушерства Латвийской сельскохозяйственной академии-в 1а86-1у87 гг. и в лаборатории генетики желез внутренней секреции БНШРГЖ.

Отбор коров-доноров. В опытах использованы 33 высокопродуктивные коровы черно-пестрой породы, выбракованные ил молочного стада. Возраст коров от 4 до 10 лет, из них 22 (70$) коров были в возрасте 9-10 лет. Лучшие годовые удои коров-доноров в предыдущие лактации были не ниже 7000 кг молока, с содержанием жира не менее 4$.

, Причинами выбраковки бшш;

- патологическое состояние вымени после траш - 5 коров;

- длительное бесплодие - 28 коров. .

Анализ анамнеза и клинико-гинекологическое исследование коров показали следующие причины бесплодия:

- хронический гнойно-катаральный эндометрит ~ 5 коров;

- фолликулярная киста яечников - 8 коров, у этих животных наблюдался хронический катаральный эндометрит;

- неэффективное многократное осеменение у 14 коров, в двух из них установлена непроходимость обеих маточных труб и в дальнейшем они были из опыта исключены.

У отобранных коров устанавливали продолжительность и регу-

;. Материал диссертации изложен

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССВДОБАНИй

лярность полового цикла. Больных коров лечили. Всем коровам один раз в недела инъецировали внутримышечно 35000а ИЕ витамина А, 14000 ИЕ витамина Дд и 70мг витамина Е в масляном растворе.

Вызывание суперовуляции и ее оценка. Полиовуляцию вызывали по 2 схемам. По первой схеме (1-я группа коров-доноров) на 10-12-й день полового цикла вводили 2,5 тыс. ИЕ §оллигона, через 48 ч 600 мкг эстрофана. По второй схеме (2-я группа коров-доноров) делали 10-кратную инъекции фолликулостимулировашего гормона (ФСГ), общая доза 50 мг. После шестой инъекции ФС1' вво- , дили 500 мкг зстрофана. !

0Й эффективности полиовуляции судили до числу желтых тел й нелопнувших фолликулов в яичниках, которые определяли пальпацией на 7-Й день после искусственного осеменения.

ВЫмырание. оценка качества и перенос эмбрионов. Эмбрионы у коров вымывали на 7-8-й день после первого осеменения. Для вымывания использовали среду Дшьбекко.

Эмбрионы классифицировали по методике ВИЖа (Н.И.Сергеев, В.И.Букарова, 1983), как нормальные и дегенерированные и отдельно выделяли неоплодотворенные яйцеклетки.

В качестве реципиентов использовали 15-18-месячных телок о массой тела не менее 400 кг, у которых в одном из яичников было обнаружено выраженное желтое тело,

. Охоту синхронизировали-однократной инъекцией эстрофана по 500 мкг, которую применяли на 12 ч раньше, чем корове-донору. Телкам, пришедшим в охоту одновременно с донорами на 7«6-й день полового цикла (+ I день), в переднюю часть рога матки вводили свежеполученный полноценный эмбрион. ■ Морфологическое и бгоха.«ргеское исследование крори коров-доноров. Из морфологических показателей крови определяли количество эритроцитов, лейкоцитов (в камере Горяева) и лейкоцитарную формулу.

Биохимически исследовались кровь и сыворотка коров-доноров. Определение гемоглобина ь крови проводили по методу Сали ( в v/%), глюкозы ортоулоединовнм методом. Содержание кальция определяли комшхексонометрическим методом, неорганический фосфор ванадатмолибдатным реактивом, общий белок - рефрактометрически, рефрактометром УРЛ-1, каротин и А витамин - фотометрически, кислотную емкость - по Неводову.

Наличие кетоновых тел в моче и молоке определяли экспресс методом реагентом Розера на месте в коровнике.

Определение содержания прогестерона и эстрадиола-17/5 в сыворотке крови проводили радиоиммунологической системой, разработанной по БНШРГК (В.Б.Дмитриев, 1932).

Кровь для определения прогестерона и эстрадиола-17/2 брали на В-9-й день полового цикла, т,е. за 1-3 дня до начала гормональной обработки животных.

Для изучения динамики концентрации прогестерона и эстрадио-ла-17/$ в сыворотке крови у коров-доноров 1-й группы кровь брали в разныз дни полового цикла:

- при инъекции фоллигона (10-12-й день полового цикла);

- при инъекции эстрофана (12-14-й день полового цикла);

- во время первого и второго искусственного осеменения, т.е. 48 и 60 часов пооле инъекции эстрофана;

- во время вымывания эмбрионов (7-8-й день полового цикла). . Животные этой группы были разделены еще на 3 подгруппы:

1-ю подгруппу составляли животные с отсутствием суперовуля-ционной реакции, у которых в яичниках количество желтых тел

до двух.

2-ю - с низкой до средней суперовуляцией, количество желтых тел - 3-6.

3-ю - с выраженной реакцией, 7 и более желтых тел.

Уровень гормонов определялся в несистемных единицах (нг/мл,

пг/мл) с целью более удобного сопоставления полученных результатов с данными литературы. ■

• Гистологические исследование эндометрия. Для определения состояния эндометрия у 30 коров-доноров за 1-3 дня до введения экзогенного гонадотропина, т.е. на 8-3-Й день полового цикла, брали пробы эндометрия с нижней стенки обоих рогов матки для гистологического исследования биотомом И.Н,Афанасьева (1972). Полученные кусочки эндометрия фиксировали в жидкости Карнуа шш в 10% нейтральном растворе формалина. Затем, согласно методике Г.И.Роскина, Л.Б.Левинсона (19Ь7), после проводки через спирты материал заливали в парафин. Парафиновые срезы, яодщиной 5-6 микрон окрашивали гемотоксплином и эозином. Часть препаратов окрашивали пирошшом и мотилзоленым по методике Браше. Коллаге-

новые волокна обнаруживали по окраске по Ван-Гизон,

Подготовку гистологических препаратов проводили совместно о сотрудниками лаборатории морфологии ЛатвШШ экспериментальной и клинической медицины г.Риги.

Математическая обработка цифрового материала проведена на микрокалькуляторе Электроника-БЗ-34 с вводом программ, составленных Н.Ы.Косячекко, Н.З.Басовским (1983). Часть материала обработана с помощью ЗЯ-1 Наири-2,3.

Разницу двух сравниваемых величин считали достоверной цри • Р 0,05, то есть в тех случаях, когда лероятность результатов превышала 95$,

Во время опыта все коровы находились в отдельном коровнике и одинаковых условиях кормления и содержания. Их круглый год держали в стойле, с ежедневным активным моционом. Из рациона коров в зимний период были исключены силос и сенаж, им скармливали сено хорошего качества. Каждая короьа получала 8 кормовых единиц, 110 г переваримого протеина на 1 кормовую единицу, 600 г сахара, 78 г кальция и 56 г фоифора.

За животндаи проводился тщательный уход и наблюдение.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Динамика секреции овариальннх гормонов у коров-доноров.

3,1.1. Концентрация прогестерона и эстрадиола~17/4 в

сыворотке крови коров-доноров до начала обработки го ьадотропиками (фолгатоиои и ФСГ) и поеледуицая судоровуляция и эмбриопродуктишость.

Распределение коров в зависимости от концентрации прогестерона е.сыворотка крови 2-3 дня (8-9-й день полового цикла) перед обработкой фоллигоном и £СГ и результаты последующей супер-овуляциа к эыбриоцродуктиБности представлены в таблицах I и 2.

Из данных таблицы I видно, что у 15% коров-доноров концентрация прогестерона в сыворотке крови была до 1,0 нг/мл и следовательно получено меньше овуляций и эмбрионов по сравнению с животишз. с исходной концентрацией прогестерона выше 1,0 кг/мл. Несмотря на общую тенденцию к увеличений числа овуляций и коли-

5

Таблица I.

Эмбриопродуктивность коров-доноров с разнда уровнем активности желтого тела перед началом обработки фоллигоном. Первая группа животных (п- = 20).

Показатели =Концентрация прогестерона нг/мл

__: <1 с 1.1. ..2.0 >8

Количество коров л- {%) 3 (15) 8 (40) 9 (45) Число овуляций на донора

(М +/п) 3,3 + 1,66 9,3 + 2,29 7,9 + 1,61 Эмбрионов на I донора

(М + м) 2,3 + 1,20 5,1 + 2,06 5,3 + 1,60

в т.ч. полноценных (М+ /и.) 2,0 + 1,15 3,9 + 1,39 3,2 + 1,10

Пересажено эмбрионов I ^ ) 6 25 17 Количество беременных

животных з (50) 13 (52) 9 (53).

чества эмбрионов у коров о более высоким уровнем прогестерона в сыворотке крови 2...3 дня до инъекций фоллигона, достоверной корреляционной связи межцг этими показателями не выявлено (*ъ = 0,07; 0,03; Р>0,Сб). Также не было существенных различий приживляемости эмбрионов после их переноса телкам-реципиен- ' там.

Таблща 2.

Эмбриопродуктивность коров-доноров с разным уровнем активности желтого тела перед началом обработки ФСГ-П, Вторая группа животных (л. = 18).

Показатели : Концентрация прогестерона эт/мл

с 1,1..,'^,и > 2'

Количество коров, п- (%) 3 (16,7) II (61,2) 4 (22,2)

Овуляций на донора (М +т.) 6,7 + 2,93 9,5 + 1,91 7,8+ 1,60

Эмбрионов на донора (М+м.) 5,7 + 3,84 . 5,4 + 1,87 1,9 + 0,25

в т.ч. полноценных (М +•»$ 5,0 + 3,61 4,0 + 1,17 1,0 ± 0,40

Пересажено эмбрионов (>'") 10 36 3

Количество беременных животных, IV (%) 6 (60) 18 (50) I ^33,3)

а

У коров, подвергнутых суведовудяцик о использованием ФСГ-П (табл. 2), супсровуляционная реакция мало отличается у коров с малым и высоким уровнем прогестерона. По показателям последующей эмбриоцродуктивности коров-доноров, наблюдается тенденция увеличения среднего числа эмбрионов у коров о низким исходным содержанием прогестерона, что подтверждает отрицательный коэффициент корреляции (^ = -0,15 + 0,25 Р>0,05).

Результаты изучения концентрации эстрадиола-17/5 в сыворотке крова у коров-доноров перед их гормональной обработкой (фол-лнгоном и ФСГ-П) и их связи о данными последующей полиовуляции и выходом эмбрионов представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3.

Эффективность суперовуляции у коров-доноров о различным уровнем эстрвдиола-17/# перед началом обработки гонадо-тропином фоллигоном. • •

;Концентрация эстрадиола-1'М ' пг/мд

Количество коров, и {%) 6 (30) 10 (50) 4 (20)

Число овуляций на донора И,7 + 1,98 7,9 + 1,97 6,5 ± 2,72

Ш

^брир^ов на донора 5,3 ±1,86 5,0 + 1,82 3,5 + 2,25

в тГч. полноценных

(И +/н)' 4,3 ± 1,38 • 3,1 £ 1,32 2,3 + 1,31

Пересажено эмбрионов () 20 23 5

Количество беременных

животных, л- {%) 7 (35) 16 (65,2) 2 (40)

В данных таблицы 3 отмечается определенная закономерность: по мере увеличения уровня эстрадиола-17/5 у коров перед введением фоллигона, появляется тенденция уменьшения как количества овуляций, так-и общего числа эмбрионов (в том числе и полноценных), что подтверадается отрицательной корреляцией этих показателей ОТ = -0,25; -О,Ж; -0,33), однако корреляционная связь недостоверна - Р У 0,05.

3

Таблица 4.

Эффективность суперовуляции у коров-доноров с различной концентрацией эстрадиола-17/Ь в сыворотке крови за 2...3 дня до инъекции ФСГ-Л (>* = 18)

:Концег-рация эстрадиола-17/5 пг/мл

с 20,0...30,0 | >30,0

Количество коров (%) 9 (50) 9 (50)

Овуляций на донора (М ¿т) 9,3 ± 2,43 8,0 + 1,05

Эмбрионов на донора (М + ж) 5,7 ± 2,30 3,4 + 1,30

в т.ч. полноценных (М +»$ (%) 4,1 + 1,47(72) 3,0 + 1,21(88)

Пересажено эмбрионов 30 19

Количество беременных

животных /V, \%) 14 (43,7) II (57,9).

Как ввдно из таблицы 4, полученные различия по количеству, желтых тел, эмбрионов и полноценных эмбрионов у коров с разным уровнем эстрадиола-17Д незначительные и недостоверные (Р>0,05).' У этих животных, так же как и в первой группе коров (где применялся фоллигон) достоверной корреляционной связи между выше указанными показателями не обнаружено (^ = -0,13; -0,32; -0,08; Р>0,05).

Таким образом, из приведенных данных следует, что уровень прогестерона й эстрадиола-17^. в сыворотке крови'коров-доноров яа 8-9-й день полового цикла носит различный характер и не имеет. существенной связи с количеством последувдих овуляций и эм-бриоцродуктивностью.

3.1.2. Динамика концентрации овариальных гормонов в

сыворотке крови коров-доноров на фоне обработки гонадотропином (фоллигоном) и эстрофаном.

Полученные данные концентрации прогестерона и эстраддала-17/3 в сыворотке крови у коров-доноров с различной реакцией суперовуляции представлены в таблицах 5 и 6, а их графическое изображение показано на рисунке 2.

Как видно из таблиц, у 4(2ОД короа суперовуляция отсутствовала, у 7(35%) - она была низкая до средней (ж.т. 3.«), у коров-доноров * ярко выражена (ж.т. >7).

' Э

Таблица 5.

Изменение концентрации прогестерона-в сыворотке крови у коров-доноров с различной реакцией сулеровуляции (п- = 20)

День полового цикла '.Концентрация

(манипуляция) :без супер- :низкая до ¡овуляции .-средней __: 4) : (>у= 7)

прогестерона нг/мл (М

выраженная

8...9-й 10...12-й (ГО 12...14-Й (ПГ) 0-Й (ИО) ' 1-й (ИО) 7...8-й (Ю)

2.3 ± 0,76 2,1 ± 0,60 2,5 ± 0,52 1,3. ± 0,39 0,7 ± 0,33 2,0 ± 0,93

1,6 ± 0,49 2,7± 0,49 3,2 ^ 0,63 0,5 ± 0,14 0,4 ± 0,02 4,0 ± 0,71

2.2 ± 0,25 3,0 ± 0,31

4.3 0,63 0,4 ± 0,04 0,4 ± 0,03 9,5 ¿ь 0,59

Таблица 6

Изменение концентрации эстрадиола-17/$ в сыворотке крова у коров-доноров с различной реакцией суперовуляции (л, =20)

День полового цикла | Концентрация эстрадиола-ГУ^лг/ш (М (манипуляции)

:без супер-:овуляции : V« 4)

низкая до средней <»■« 7)

выраженная (/" = 9)

8. 25,6 ± 4,07 24,2 ± 3,41 23,1 + 2,87

10. ...12-й (ГТ) 21,6 ± 4,57 24,5 ± а,00 25,7 ± 3,15

12. ...14-й (ПГ) 20,8 ± 5,46 25,7 ± 1,55 30,3 ± 1,46

0-й (ИО) 23,2 ± 4,59 27,6 ± 2,77 28,0 х 3.69

1-й (ИО) 30,5 ± 5,85 21,7 ± 3,43 26,0 ± 3,13

7. ...8-й (НЭ) 25,0 ± 1,53 21,7 ± 2,21 27,6 * 2,57

На 10...12-й день полевого цикла происходит некоторое повышение концентрации прогестерона и эстрадиола-17у коров с реагиреп суперовуляняя, причем у животных с более выраженной реакцией оно визе, что свидетельствует о более активной стеро-идогекной функции яичников этих животных.

Под воздействием фоллигона (12...14-й день полового цикла) Еылвлепо значительное увеличение секрести прогестерона и эст-10

радиола-Г?/^ (Р^.0,05) в сыворотке крови у живот них со средней и выраженной полиовуляцией по сравнению с начальным ее уровнем (8...3-й день полового цикла), очевидно это связано с ростом большего количества фолликулов и следовательно повышена-, ем выделения гормонов. У коров без суперовуляции, увеличение данных гормонов в этот период было незначительным.

Спустя 48 и 63 часов после инъекции эстрофана, когда проводили первое и второе искусственное осеменение, меэду животными наблюдалось различие по ,уровни концентрации прогестерона в сыворотке крови в зависимости от степени полиовуляции. Резкое падение содержания прогестерона до минимальных уровней во вре-ш искусственного осеменения сопровождалось хорошей суперовуляцией. Б это же время концентрация эстрадиола-17^ понижается, что указывает о происходящей овуляции.

Уровень концентрации прогестерона в сыворотке крови у доноров через 7...8 суток после осеменения, т.е. в день вымывания эмбрионов, был различным между сравниваемыми подгруппами. У коров с более высокой полиовуляцией он выше, соответственно 9,5 ± 0,59 нг/шг против 4,0 ± 0,71 нг/шг у короз со средней полиовуляцией и 2,0 ± 0,93 нг/мл у короз без суперовуляцип. Установлена тесная корреляционная связь между уровнем прогестерона в это время и числом желтых тел = 0,9; Р ¿1 0,001).

На основании подученных данных по отношению содержания прогестерона в сыворотке крови коров-доноров во время их подготовки к суперовуляции и вымыванию эмбрионов следует, что концентрация гормона изменяется в строгой закономерности (рис.2). Она характеризуется риилической сменой периодов повышения концентрации прогестерона в лютеиповую фазу цикла (особенно после, инъекции фоллигопа) и резким снижением концентрации во время - стадии возбуждения, т.е. 48 и 60 часов после инъекции эстрофана. Вновь повышенный уровень гормона наблюдается на 7-й день цикла, причем он тесно коррелирует о числом желтых тел в яичниках.

Концентрация эстрадпола-1?^ у коров о выражегсгай реакцией суперовуляции и коров с низкой до средней реакции и без суперовуляции, в большинстве рлучаез различалась незначительно, кроме после инъекции £оллигона (через 48 часов), когда корреляционная связь между концентрацией зстрадиола-17/5 к степенью суперовуляцпи бнла достоверно положительной (Р^. 0,001).

и

а ©

а

9 8 7

6 5

1

4 14 л ;, 1 § 40

3 ■ 1 . ' -л . 1 1 оз 30

2 20

I V ^^ч» 1-- 10

Й-9 ' 12-14 ' 1-й 1 10-12 0-Й 7-6 ■

В

с--

Ч

I А

гг

8-9' , ' 1-й

10-12

0-й 7-8

(День полового цикла)

Рис. 2. Концентрация прогестерона и э страда ола-17/3 в сыворотке крови у коров-доноров с различной . реакцией суперовуляции.

_реакция отсутствует, -. - - - с низкой

до средней реакции, .... высокая реакция.

Динамика конгентрации прогестерона и эстрадиола-17^ у отдельных коров-доноров имела свои особенности, которые отличались от общих закономерностей. У этих коров выявлен низкий су-перовуляторный ответ и плохое качество полученных эмбрионов.

Анализ соотношения концентрации прогестерона к эстрадио-.лу-17^ в сыворотке крови у коров-доноров показал, что на 8...9-й день полового цикла оно соответствует I : 12 у коров с выраженной суперовуляцией; I 27 у коров со средней и I : 15 у коров без суперовуляции, однако различия не достоверны..При- . близитольно в таком же соотношения концентрация этих гормонов остается в 10...12-й и 12...14-й день полового цикла у всех групп коров. Достоверные различия соотношения концентрации про-12 _

гестерола й эстрадиола-17$ у коров с различной сулеровуляцией выявлены через 48 часов после инъекции эстрофана, причем у коров с выраженной реакцией суперовуляции данное соотношение о кат-зало сь значительно выше, составляя I : 81 против I : 27 у коров без еуперовуляцша. Это подтверждается и положительной достоверной корреляцией между показателями соотношения концентрации прогестерона и эстрадиола-17/3 и количеством желтых тел (4- = 0,6 ± 0,2; Р 4.0,05). Во время вымывания эмбрионов их соотношение резко падает вследствие высокой концентрации прогестерона и составляет I : 3 у коров с выраженной суперовулинией; 1:8-о низкой до средней суперовуляцией и I : 21 у коров без супер-о:' ляяпи.

С практической точки зрения очень важно знать число эморио-нов, пригодных для пересадки. Поэтому мы сравнивали количество и качество полученных эмбрионов с изменением концентрации прогестерона и зстрадаола-17/5 в сыворотке крови.

Анализ полученных результатов доказал, что изменение концентрации црогестерона и эстрада ола-Г7Д происходило по таким же закономерностям, как и изменения концентрации гормонов в зависимости от степени полиовуляции. Это связано с тем, что между степенью долиовудящи и общим числом эмбрионов выявлена высокая корреляционная связь (4 = 0,8; Р 4. 0,001), а также мед-ду оощим числом эмбрионов и эмбрионов, пригодных для пересадки (/&« 0,9; Р< 0,001),

3.2. Гистологическая оценка эндометрия у коров-доноров.

Гистологическая оценка эндометрия 30 коров-доноров позволила установить у 4055 из них различные морфологические изменения, которые могли бы быть одной из причин бесплодия. Патологические изменения эндометрия оонаруженн в основном в виде умеренной и сильной лимфоидно-'гистоцитарной инфильтрации, которая у 32? коров сочеталась с выраженной гиперемией и у 58$ отеком эндометрия. Кроме того, у 42? коров нами была выявлена коллагени-задия и фиброз строын эндометрия, у 33$ - гзалиноз сосудов, у . 42$ - атрофические и деструктивные изменения тточкых желез, а'в отдельных, случаях в просвете маточных желез обнаружены фоциты. Плазматические клетка выявлены в эвдомотрил трех коров, ' тучные клетки четырех (33$) коров. Ыезду вштленЕшт пат-логп-

ческиш изменениями в эндометрии и полиовуляторной реакцией, количеством и качеством эмбрионов нами установлена отрицательная корреляционная зависимость. Такие изменения, как гиперемия и кровоизлияния в эндометрии, гиалиноз кровеносных сосудов, инфильтрация плазматическими .летками достоверно (Р4.0.05) отрицательно коррелируют с суперовуляторной реакцией яичников, а кровоизлияния в субэпителиальном слое эндометрия отрицательно (Р < 0,05) с количеством полноценных эмбрионов.

Необх' -u.:o отметить, что такие структурные изменения, как диффузное разрастание соединительной ткани эндометрия с атрофией маточных желез, гиалиноз кровеносных сосудов указывал на хрони-. ческий, скорее всего необратимый процесс. У коров с подобными изменениями нам не удалось получить эмбрионов.

У двух коров, с кистозным перерождением яичников, после соответствушего лечения обнаружена железисто-кистозная гиперплазия эндометрия, изыеишшые железы имели различную величину и форму, наблюдалась лимфоцитарная инфильтрация субэпителиального слоя эндометрия. В сыворотке крови этих животных установлен высокий уровень эстрадиола-17/Ь (выше 30 нг/мл) и низкий уровень прогестерона (меньше I нг/мл). Попытка индуцирования полаовулящш была неэффективном. Считаем, что структурные изменения эндометрия и изменение фона овариальных гормонов являются характерными для кистозного перерождения яичников.

Пригодные для переноса эмбрионы'были получены от 88,9$ коров, у которых ь , слизистой оболочке матки не выявлено видимых структурных изменений, и лишь от 41,7$ коров, у которых гисто-структура эндометрия была изменена (табл. 7).

Таблица 7.

Гистологическая картина эндометрия коров-доноров, количество и качество полученных эмбрионов

Состояние эндометрия iiOHODH ЗМОРИОИЫ

Все-:^ДЕШие :го :эмбри-: оны % üce-:tí среднем:В сред-:Пе- :Прижило го :от донора:нем при+ре- :число -: :годные :са- : % :от до- :жеш: :нопа : :

Здоровий 18 16 88,88 81 4,5¿0,96 3,5¿0,66 46 22-47

С признаками гистологических 12 5 41,66 14 J.,2iP,59 0,9j0,45 II 3-27 >18А'ОНС1ШЙ

J.4

Выявленная разница по количеству суперовуляций между обеими группами животных недостоверна (Р> 0,05), а по количеству а качеству эмбрионов внсокодостоверна (Р< 0,001). Выявлена достоверная разница (Р<0,05) между адшживдяемоотью эмбрионов, полученных от коров о патологическими изменениями слизистой оболочки матки (соответственно 47,82 и 21,21%),

3.3. Морфологические я биохимические показатели крови у коров-доноров.

При морфологическом исследовании крови коров-доноров о хорошей полиозуляцией и коров не ответивших полиовуляторной реакцией на гормональные препараты, выявлены существенные различия.

Таблица 8

Морфологические показатели крови коров-доноров эмбрионов и у коров, не давших эмбрионов (М + «О

Показатели : К о р о в ы

доноры эмбрионов : без эмбрионов

Количество коров, /V 9 7

Эритроциты, млн/мкл 5,8 + 0,34 5,8 + 0,31

Лейкоциты, тыс/мкл 8,1 + 0,88 6,3 + 0,83

Лейкоцитарная формула, (%)

- базофилы 0 - I 0-1

- эозинофилы 12,6 + 2,12 7,8 + 1,40

- палочхоядерные

нейтрофилы 2,3 + 0,78 2,9 + 0,44

- сегментоадерные

нейтрофилы 36,0 + 4,00 23,9 + 3,60

- лимфоциты 48,0 + 3,6.1 64,0 + 3,75

- моноциты 0-3 0-3

- юные формы 0-1 -

Как видно из таблицы 8, у коров, от которых получены эмбрионы, выявлено существенно больше сешентоядерннх нейтрофилов и меньше лимфоцитов (Р 0,05). Между количеством лимфоцитов, с одной стороны, и количеством овуляциь, количеством эмбрионов

(в т.ч. пригодных/, а также беременностью реципиентов. - с другой, установлена отрицательная достоверная корреляционная связь (Р< 0,05).

Однако оледует отметить, что в целом морфологические показатели крови (кроме количества эозинофилов) находились в пределах физиологической нормы, и установленные различия между обеими группами коров, видимо, можно особенно не учитывать.

При сопоставлении оиохгмлчеиких показателей сыворотки крови коров-доноров оказалось, что различия таких показателей, как содержание гемоглобина, общего белка, кальция и неорганического фосфора весьма несущественны, и она обнаружены в пределах физиологической нормы. Б то же время содержание глюкозы крови у коров-доноров несколько понижено ?дри норме 40-60 мгД)у Особенно это отмечается у коров с кистой яичников -31,0 + 2,53 мг/$, у них же понижен уровень каротина (0,3+0,06 глг/%), вмамика А (22,6 + 3,94 жг/%) и показатели кислотной емкости (391,2 + 5,99 ьхг/%).

Следует отметить, что у коров переболевших кистозным перерождением яичников, степень суперовуляции и количество эмбрионов было самое низкое, соответственно 5,5 овуляций и.1,5 эмбриона на донора (табл. 9).

Снижение содержания каротина и витамина А наблюдалось также у коров, переболевших хроническим гнойно-катаральным эндометритом. Полиовуляторный эффект у таких животных ооставил 8,1 +1,27 желтых тел и 4,7 + 1,10 эмбриона на донора, из которых 3,4 + 0,8 были пригодны для переноса. В группах корон-доноров, сформированных из животных с перенесенными заболеваниями вымени и с многократными неэффективными осеменениями, отклонений в биохимических показателях не установлено. 7 этих животных выявлено достоверное различие (Р< и,05) по количеству, качеству и приживляемости эмбрионов, однако следует, что у коров, перенесших заболевания вымени, этот показатель несколько выше.

Таблица 9

Количество овуляций и со сладу стоя эмбряопродуктиЕШсть у коров-доноров в зависимости от их причин, выбраковки из основного стада (п-= 31 )

Показатели Пркчляы выбраковкл

: Болезни . : ЕШ9НП :Хродаческпй гя.-: Киста яични-:кат. эндометрит : ков :;Лногократное безуспешное 0се:.:ен(?нке

Число животных з группе, (и-)

КороЕК-донорц эмбрионов, ( Л- )

ОвуляшШ на донора (М + «г).

Число проеодэших змбрволз-кэченш:, (М

Всего э;л6оиопов на докопа

в т.ч. полноценных ('.1 ± >*•) в процентах, %

Порзсаюпо эмбрионов, ( М

Бшалэка боремепность (п- -£)

5 5

10,5 ± 1,4х 12

7,2 ± 1,4х 5,8 ± 1,2х 80,55 55 29-52,7

5 3

8,1 ± 1,27 II

4,7 ± 1,10 3,4 * 0,8 72,35 33

20-60,51-

9 5

5,5 ± 0,94. 15

1,5 ± 0,43х 1,2 * 0,35х 80,00 14 8-57,14

12 . II

7,3 ± 0,78 21

3.8 ± 0,81х

2.9 ± 0,56х 76,00.

45

15-33,33

Прг^шчанне: х - разли'Я1Я достоверны (Р 0,05).

У них получено всего по 7,2 эмбриона, из которых 5,8 качественных, против 3,8 и 2,9 эмбриона в группе с многократными неэффективными осеменениями при приживляемости 52 и 33%.

Таблица Ю

Некоторые биохимические показатели крови коров-доноров о положительным и отрицательным эффектом эмбриопродуктивности

Показатели : К о р о : доноры эмбри— : онов : в ы без эмбрионов

Количество коров, п- 9 7

Гемоглобин, г% Ю,6 + 0,45 11,2 £ 0,33

Общий белок, г$б 8,4 + 0,25 8,1 £ 0,25

Кальций общий, 1лг% 9,9 + 0,29 9,9 + 0,17

Фосфор неорганический, мг$ 5,4 + 0,63 5,6 £ 0,44

Отношение Са:Р 2,0 ± 0,27:1 1,8 £ 0,16:1

Глюкоза, 36,2 + 2,22 35,0 £ 2,72

Каротин, мг# 0.8 + 0,16 0,5 + 0,18

Витамин А, шт% 35,0 + 2,39 29,4 + 5,81

Кислотная емкость, мг% 412,0 + 6,27 411,0 £ 11,57

Показатели биохимических исследований у коров-доноров не коррелируют с числом полученных эмбрионов. Различия между этими показателями недостоверны (Р> 0,05) (табл. 10). Из чего следует, что с помощью биохимического анализа крови невозможно прогнозировать полиовуляторнув реакцию коров-доноров, количество и качество получаемых эморионов.

5. ВООДЦ

1. Уровень прогестерона и эстрадиола-17/? в сыворотке крови коров-доноров на 8-9-й день полового цикла, т.е. за 1-3 дня перед инъекцией гонадотропинов (фоллигона, ФСГ-П) не имеет существенной связи с количеством последующих овуляций и эмбрио-продуктивностью, и поэтому данный показатель не может служить прямым критерием для выбора коров-доноров.

2. Динамика концентрации прогестерона в крови коров, во время их подготовки к суперовуляции, находится в прямой зависимости от функциональной активности яичникое. После инъекции го-18

надотропина фоллигока (12...14-й день полового цикла) наолвда-ется повышение кодцентрации прогестерона по сравнению с начальным уровнем (8...9-й день полового цикла) соответственно с 1,6 + 0,49 кг/мл до 3,2 + 0,63 нг/мл у коров со средней полчову-ляцией (ж.т. 3-6) и с 2,3 + 0,25 нг/мл до 4,3 + 0,63 нг/мл у животных, о выраженной полиовуляцией (ж.т. >7). У короз без суперовуляции (ж.т.< 3) в то же время концентрация прогестерона повышается незначительно о 2,3 + 0,76 нг/мл до 2,5 + 0,52 нг/мл.

Через 48 часов после инъекции простагландина (т.е. во время стадии возбуядения) наблвдается снижение уровня прогестерона до 0,4 + 0,0а нг/мл у коров с суперовуляцией и до 1,4 + 0,39 нг/мл у животных без таковой.

На 7-й день полового цикла концентрация прогестерона вновь повышается пропорционально степени полиовуляции.

3. Концентрация эстрадиола-17/3 в сыворотке крови коров-доноров зависит от числа растущих фолликулов в яичниках. Установлена положительная достоверная ( р < 0,001) корреляционная связь между концентрацией эстрадиола-17/5 и степенью последующей полиовуляции через 48 часов посла инъекции гонадотропина.

4. У коров о хорошей суперовуляцией соотношение концентрации прогестерона и эстрадиола-17/5 в сыворотке крови на 8...3-2 день полового цикла соответствует 1:12, а у коров без суперовуляции 1:15. Примерно такое же соотношение концентрации этих гормонов

в сыворотке крови коров-доноров остается и на 10...12-й а 12...14-й день полового цикла.

Через 48 часов после инъеэдии простагландина выявлено повышение соотношения концентрации прогестерона и эстрадиола-17/3 до 1:81 у коров с выраженной полнонуляцией, 1:60 у коров со средней и 1:27 у коров без суперовуляции.

Во время вымывания эмбрионов их соотношение резко снижено, вследствие высокой концентрации прогестерона, и составляет соответственно х:3; 1:8 и 1:21.

5. Выявлена высокая корреляционная связь мезду степенью полиовуляции и общим чистом эмбрионов {'г = 0,8; Р< 0,001), а также между общим числом эмбрионов и эмбрионов пригодных к пересадке

= 0,8; ?<0,001).

6; Характер динамики концентрация прогестерона и зстрздЕола-17^

позволяет судить о функциональном состоянии яичников, об эффективности и механизме действия гормональных препаратов во время подготовки животных к суперовуляции, а также о степени ожидаемой полиовуляции и количества эмбрионов, в том числе а качественных.

7. При нарушенном гормональном профиле прогестерона и эстра-диола-17,4 в сиворотко крови коров-доноров выявлен низкий супер-овуляториыл ответ и полученные эмбрионы условно пригодны для трансплантации.

8. У 40" выбракованных коров, в результате, гистолого-морфоло-гичесяих исследований эндометрия установлены различные патологические изменения. Осноенши изменениями, влияющими на эмбриопро-дуктишостъ, являются лимфоидно-гисгоцитарная инфильтрация, инфильтрация плазмоцитами и тучными клетками, а также полнокровие капилляров и кровоизлияние в эндометрий, гиалиноз сосудов и фиброз строки.

9. У животных с выявленной патологией эндометрия овуляция составила 6,3 + 1,42 на донопа, извлечено 1,2 + 0,59 эмбриона, их приживляемость у телок-реципиентов - 27,3$. У коров без патологических изменений в эндометрии эти показатели соответствуют

И,6 + 0,; 4,5 + 0,96; 47,8.

10. Единственным показателем морфологической картины крови, который коррелирует с данными «.уперовуляции (Р<0,и5), а также с количеством и качеством полученных эмбрионов является число лимфоцитов. Тенденция к увеличению количества лимфоцитов коров, не давших эмбрионов, может свидетельствовать о возможном снижении реакции супзровуляцш.

11. Содержание общего кальция, неорганического фосфора, общего белка, каротина, витамина А и глюкозы в крови коров-доноров достоверно не отличается от таковых у животных не даших эмбрионов. Поэтому эти показатели не могут быть использованы для прогнозирования супероВ7лиции и получения эмбрионов. Они имеют важное значение для контроля полноценности кормления и оценки уровня оомона веществ коров-доноров.

6. фактические прдаоншш

I. При выбраковке высокопродуктивных, генетически ценных коров целесообразно определять их пригодность для использования 3 качестве доноров-эмбрионов.

л. Потенциальных доноров эмбрионов, из числа выбракованных хоров, необходимо тщательно исследовать гинекологически о гистологической оценкой соотояния их эндометрия, путем его прижизненной биопсии.

Оововные положения диссертации изложены в следующих раоотах:

1. Антане В. Количество и качеотво эмбрионов в зависимости от гистологической картины эндометрия // Тезисы докладов научно-практической конференции. Тарту, 18-19 сентября 1985 г. - Таллин, 1985. - С.55.

2. Антане В., Николаева Н.В. Взаимосвязь между эндокринной функцией яичников и получением эмбрионов // Труды конференции молодых ученых ЛСХИ 3-5 июня 1986 года / ЛИИ. - 1986. - Деп. в ВНИИТЭИ Агропром.

3. Афанасьев И.Н., Антане В.В. Полиовуляция и результаты оплодотворения высокопродуктивных коров-доноров // Труди JJCXA / Датв. с.-х. акад. - 1987. - Вып. 235. - С.70-76. .

4. Афанасьев И.Н., Антане В.В. Эффективность полиовуляции я получения эмбрионов в зависимости от содержания прогестерона я эстрадиола-17^ в сыворотке крови коров-доноров // 'Груды ЛСХА / Латв. о.-х. акад. - 1988. - Вып. 247. - С.3-7.

Автореферат

Подписано « naw, 5.00. 00г. Формат 60x8-1/16. Тираж ЮОэка,

Отпечатало на ротапринте в яЛо'Погшграфистс' 22в177,Риг« ул. кр. Валдвмара,в.