Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.07) на тему:Иммунологическая характеристика коров-доноров при эмбриотрансферзе

, V

правах рукописи

Л

Попов Владимир Германович

Иммунологическая характеристика коров-доноров при эмбрпотрансфсрзе

16.00.07-Акушерство и искусственное осеменение

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Саратов, 1998

Работа выполнена на кафедре акушерства >Ч> гинекологии и биотехники размножения животных Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии и в лаборатории трансплантации эмбрионов Поволжского научно-исследовательского института животноводства и биотехнологии.

Научные руководители:

Заслуженный ветеринарный врач РФ, доктор ветеринарных наук, профессор В.С.Авдеенко;

Доктор биологических наук С.В.Советкин.

Официальные оппоненты:

Заслуженный ветеринарный врач РФ,

доктор ветеринарных наук В.Г.Гаврит;

Доктор биологических наук А.А.Щербаков.

Ведущая организация -Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция.

Защита состоится « ЯР » и^СЫ- 19 98 года в 1300 часов на заседании диссертационного совета К-120.97.02 при Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии (410005, г.Саратов, ул. Соколовая, 335).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии.

Автореферат разослан « 19 90

года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, ддцеГрг^^ В.В.Салаутин

1. Обдая характеристика работы.

1. 1,Актуальность темы. Обеспечение населения Российской Федерации высококачественными продуктами питания невозможно без создания высокопродуктивных стад, ' типов, пород животных устойчивых к различным заболеваниям и стрессам, хорошо приспособленных к местным природно-климат ическим условиям. Решение этой проблемы можно ускорить путем широкого использования метода трансплантации эмбрионов (Л.К.Эрнст,

Н.И.Сергеев, 1989; С.В.СоЕеткин, 1993). Применение указанного метода в скотоводстве будет способствовать использованию генетически выдающихся самок мировых генетических ресурсов. Метод змбриотрансферза позволяет вести эффективную борьбу с бесплодием маточного стада и обеспечивает оздоровление стада от инфекционных болезней (Б Л"1. Завертяэв, 1987; А.М.Петров, 1996).

В настоящее время, в сложившейся экономической ситуации, метод пересадки эмбрионов стал наиболее актуален, так как благодаря криоконсервированию можно сохранить генетический потенциал высокоценный коров (В.А.Мадисон, 1987; А.К.Голубев, 1990).

Одним из самых ответственных этапов в биотехнологическом цикле эмбристрансферза, является индукция и синхронизация полиовуляции, оплодотворение, формирование и развитие эмбрионов.

Вместе с тем, в технологии трансплантации эмбрионов. имеют место проблемы, которые носят скорее биологический, чем технологический характер

(М.И.Прокофьев, 1989, Rifoot, 19 84; Sauraande, 1990; В.Ф.Карташов, 1990)

При трансплантации эмбрион, полугенный от донора, является для реципиента аллотрансплантантом и действует так -ке, как антиген (В. И. Говалло, 1987; Р . X. Кармолиев, 1991; А.М.Петров, 1995).

Ретроспективный анализ литературы ( Л.К.Эрнст, Н.И.Сергеев, 1989; В.В.Мадисбн, 1990; В.М.Шириев, 1991; J.Hahn, 1990 ;J.Donaldson, 1990; В.В.Горин, 1992; З.М.Жилнерович, 1994) свидетельствует о большом количестве исследований, направленных на нахождение надежных методов прогноза суперовуляторной реакции.

Однако, эффективность предлагаемых методически прогнозируемых подходов полиовуляции не может быть общепризнанным критерием.

Вместе с тем, клиника-иммунологическая характеристика эмбриогенеза у коров-доноров не всегда соответствует полноценности полученных эмбрионов в биологическом смысле слова.

Ознакомление с доступной научной литературой, а также патентная проработка материала по данной проблеме по 13 ведущим государствам мира показывает, чтс изученность данного вопроса противоречива и дискуссионна .

В связи с вышеупомянутым, нам представляется целесообразным проведение клинических и иммунологический исследований состояния коров-докоров при подготовке их к получению эмбрионов. Это позволит получить качественно новые данные, раскрывающие механизм реализации воздействия экзогенных гонадолиберинов на организм коров-доноров и качество полученных эмбрионов.

1.2.Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось - изучить иммунологическое состояние коров-доноров и дать характеристику эмбриогенеза в период специфической гормональной индукции полиовуляции■

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

- разработать схемы гормональной стимуляции .множественной овуляции у коров-донороз и оценить диагностическую информативность критериев отбора доноров в биотехнологии трансплантации зародышей;■

- определить особенности динамики гуморальной реактивности коров-доноров при индукции полиовуляции ;

- изучить состояние специфической и неспецифической естественной резистентности организма коров-доноров ;

- разработать иммуноби©химический тест прогнозирования суперовуляции у коров-доноров и качества полученных эмбрионов.

1.3. Научная новизна. Впервые проведено комплексное клинико-иммунологическо-е исследование состояния коров-доноров на различных этапах цикла биотехнологии эмбриотрансферза. Получены новые данные морфологической

реакции яичников на полиовуляцию у коров-доноров, способствующие повышению эффективности суперовуляции и качества полученных эмбрионов. Определены значения специфической и неспецифической иммунологической реактивности коров-доноров, соответствия качеству полученных эмбрионов, при их многократном использовании .

Выявлена взаимосвязь состояния иммунного статуса коров- донора с реакцией на суперовуляцию, число и качество полученных эмбрионов.

1.4.Практическая значимость работы и реализация результатов исследования. Полученные данные о клинике— иммуч юлогичес к ом с т а т у с е к о ров-д о н о р о в р е к ом е иду е т с я использовать в качестве методическим указаний при отборе доноров, что позволяет повысить эффективность мнсже с т б е нной лолиовуляции.

Разработан иммунологический тест прогнозирования суперовуляции у коров-доноров и качества полученный эмбрионов.

Для увеличения выхода качества эмбрионов следует учитывать и корректировать иммуньшй статус в период индукции пелиовуляпии у коров-доноров -

Материалы исследований реализованы в научно-практической деятельности .лаборатории транспла нтации эмбрионов Поволжского научно-исследовательского

института животноводства и биотехнологии (г.Саратов, 1987-1997 гг).

Теоретические положения работы используются в учебном процессе Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии, Воронежского государственного аграрного университета, Волгоградской государственной сельскохозяйственной академии. 1.5. Апробация и реализация результатов исследований. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных конференциях Саратовской госакадемии ветмедицины и биотехнологии (1987-1997 гг) . Предложения, вытекающие из материалов диссертации, включены в «Методические рекомендации по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота» утвержденные департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ (М, 1997г.).

1.6. Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 11 научных статьях.

1.7. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, обсуждений, выводов и практических предложений, списка литературы, включающего 189 наименований, в том. числе 98 иностранных авторов. Работа содержит 16 таблиц и 14 рисунков.

1.8. Основные положения, выносимые на защиту.

-оценка клинического состояния половых органов в качестве диагностического критерия при отборе коров-доноров ;

взаимосвязь иммунологического статуса коров-доноров с полиовуляторной реакцией, количеством и к а ч е с т в ом п олуч е нных эмбрион о в;

-иммунологический тест прогнозирования суперовуляции у коров-доноров и качества полученных эмбрионов.

Научные исследования и их внедрение выполнено лично автором диссертации, а также совместно с сотрудниками Поволжского НИИ животноводства и биотехнологии. Автором проводился научный поиск, разработка методик, практическое выполнение работы на животных хозяйств Саратовской и Астраханской областей, биометрическая отработка данных, реализация практических предложений. Автор выражает искреннюю признательность и благодарность за содействие в выполнении научных исследований коллективу лаборатории трансплантации эмбрионов ПНИИ ЖиБ и кафедры акушерства, гинекологии и биотехники размножения СГАВНиВТ.

2.Материал и методы исследований

Работа выполнена в 1987-1997 г.г. Экспериментальные исследования проводились в хозяйствах Саратовской области (ГППЗ Красный Кут», конезавод «Еланский», племенной совхоз «Комбайн») и Ас трах а не?: ой области (совхоз «Марфинский»)-

В качестве доноров в ГППЗ "Красный Кут" использовали '50 коров с продуктивностью 6,5 — 10.5 тыс. кг молока класса элита-рекорд черно-пестрой породы с кроЕностыо 1/2 и 3/4 по голштино-фризской породе линии Уэс Идеал и 1/2-линии Рефлекшин Соверинг. Возраст коров 4-3 лет, масса тела 550-600 кг. Коров-доноров осеменяли семенем чистопородных быков аналогичной породы "Роджерс" линии Рефлекшин Соверинг и 3/4 кровности по породе "Юан" линии Рефлекшин Соверинг, "Эхо" линии Уэс Идеал и 7/8 '¿срочности "Манфред" линии Монтвик Чифтейн. Продуктивность матерей быков была ст 8,0 до 11,0 тыс.кг молока. Быки проверены по качеству потомства и признаны улучшателями. Подбор» доноров и быков-производителей вели согласно плану селекционно-племенной работы. При этом учитывали показатели молочной продуктивности коров. Отдавали предпочтение коровам с более высоким содержанием жира в молоке. Учитывали состояние здоровья животных, уровень обмена веществ, способность к легким ролам, сохранившим высокие репродуктивные показатели и устойчивость к технологическим стрессам.

Реципиентами подбирали телок (101 голова), полученных от малопродуктивных коров с массой тела 400-420 кг возраста 18-20 месяцев, клинически здоровых, без анатсмо-фушшиональных нарушений в развитии половы;-: органов.

В Еланском конезаводе в качестве доноров исполе. -зевали 16 коров айрширсксй породы с продуктивностью 6,0-7,0 тыс.кг молока в возрасте от 5 до В лет. Искусственное осеменение доноров производили быками айрширсксй породы. Продуктивность матерей 6ыкое была 7,0-В,0 тыс. кг молока за лактацию. Реципиентами были 60 телок симментальской породы в возрасте 16-18 месяцев с массой тела 3 80-4 00 кг.

.В племенном совхозе "Комбайн" в качестве доноров использовали 27 коров селекционного ядра с продуктивностью 6,0-10,0 тыс.кг молока симментальской породы возраста 4-8 лет.

Коров-доноров осеменяли семенем чистопородных голштино-фризских быков "Кин" и "Кирка" линии Монтвих Чифтейн. Продуктивность матерей быкоь была от 8,0 до 11,0 тыс.кг молока за лактацию. Реципиентами подобрали 99 телок, полученных от малопродуктивных коров, массой

тепа 4 00-420 кг возраста 18-20 месяцев.

В совхозе "Марфинский" в качестве доноров отобрали 14 телок голштино-фризской породы в возрасте 16-18 месяцев с продуктивностью матерей 4-5 тыс.кг молока. Для их искусственного осеменения использовали семя быков-производителей "Бридон" N 256 линии Уэс Идеал и "Скиф" Н! 32 линии Силинг Трайджун Рокат. Продуктивность матерей быков-производителей колебалась от 9 до 10 тыс.кг молока. Реципиентами были 4 9 телок, 16-18 месячного возраста с массой тела 380-400 кг симментальской породы.

Ьо Есех опытах коровы-доноры и телки-доноры были отобраны с учетом анамнестических данных, (продолжительность и регулярность половых циклов, отсутствие акушерских и гинекологических заболеваний). Дна томо-т опографическую диагностику состояния половых органов осуществляли ректальным способом по общепризнанной методике в ветеринарном акушерстве. Полиовуляцию вызывали на 9-10-11 день г-шдуцирова иного или спонтанного полового цикла. Для индукции лолиовулядии использовали гонадотропные препараты гипофизарного происхождения (ФСГ-п — производства США в общей дозе 5 0 мг: фоллитропин — производства Литвы, в общей дозе 1200 ЕД: фолликотрощ-ш — производства Чехии, в обидой дозе 4ВО МБ). Препараты вводили 2 раза в сутки в течение 4-5 суток. Простогладин Е'2 (эстрофан) инъецировали в дозе 500 мкг на ¿-4 сутки после введения гонадотропных препаратов:

- ФСГ-п в дозе 3 7,5 мг шести донорам:,

- фоллитропин шести донорам в дозе 1200 БД;

- фолликотропин трем донорам в дозе 24 м;

- фоллитропин семнадцати донорам в дозе 1200

ЕД;

- ФСГ-п в дозе 4 2 мг двадцати пяти донорам.

Для изучения влияния полноценности реакции яичников на введение гонадотропннх препаратов провели два опыта: первый - на 10 сутки расчетного полового цикла ввели девяти животным - фоллитропин, семи - ФСГ и второй — на 11 сутки полового цикла восьми животным ввели фоллитропин и шести ФСГ по 4-х дневной схеме. Стимуляцию и синхронизацию половой схемы у доноров

проводили эстрофаном путем однократного введения (в случае применения фоллитропина — 9 голов, ФСГ - 7 голов) и двукратной инъекции (при использовании фоллитропина 8 — голов. ФСГ — 6 голов).

Для вызывания полиозуляции у телок-доноров применяли гонадотропные препараты на 10 сутки полового цикла ФСГ в дозе 3 7,5 мг (9 донора), фоллитропин в дозе 120 0 ЕД (5 доноров) и фолликотропин в дозе 2 4 мг (5 доноров) .

Половой цикл у телок-реципиентов вызывали путем двукратной инъекции эстрофана с интервалом 10 суток. При этом введение препарата рассчитывали так, чтобы половая охота у телок-реципиентов наступала на 12 чассв раньше, чем у коров-лоноров.

Искусственное осеменение проводили через 12-24 часа после начала течки. Эмбрионы отбирали на седьмые сутки после первого осеменения нехирургичзским методом. При вымывании эмбрионов для обеспечения стерильности использовали, предложенную нами, замкнутую систему, состоящую из стеклянных флаконов и резиновых трубок с зажимами. Промывная яидкость (среда Дюльбенко) поступала в рога матки и вытекала из них самотеком, не имея контакта с воздухом. Эмбрионы классифицировали по методике ВИЖа (Н.И.Сергеев и Др., 1983), кате полноценные, условно-полноценные, дегеьерированные и отдельно выделяли неоплодотвореиные яйцеклетки.

Для морфологического исследования у коров-доноров убитых в период индукции полиовуляции и при спонтанной слоте извлекали яичники и изучали объем, массу, толщину, ширину, длину гонад, желтых тел и фолликулов.

Гематологические исследования гемоглобина, эритроцитов производилось при помощи эритрогемометра. Лейкоцитарную формулу - методом подсчета клеток по общепринятой методике. Иммунологические исследования проводили до индукции полиовуляции, во время и после осеменения доноров. Количество Т-лимфоцитов определяли в реакции спонтанного розеткоюбразования по методу Жондаля и Зуева: В-лимфоцитсв — реакцией комплементарного розеткообразования с эритрсиитарной взвесью барана, образующим иммунные пртизоэритроцитарные антитела и комплемент. Комплемент-зависимые лимфоциты

выявляли при помощи гемолизина в субагглютинирующем титре.

Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по B.C. Гостеву. Фагоцитарную способность лейкоцитов при помощи фагоцитарной реакции с вычислением фагоцитарной активности, фагоцитарного индекса, числа и емкости.

Бактерицидную активность сыворотки крови определяли по методу О. В. Смирновой, комплементарную — по М.Н. Лебедевой, а аллергическую реакцию по методу Д.Д. Новак. Показатель содержания клеточных антигенов плода в крови коров проводили по методу L. Singer. Количество гликозаминагликана в сыворотке крови определяли методом Н.М. Фильчагина в модификации Д. Б. Стapoceль скоро, а степень связывания гликозаминагликана с эритроцитами по методике Доссе. Определение среднего геометрического титра антител проводили по методу П.П. Косякова. Количество фибриногена в плазме крови по II.А. Рутбергу, а сиаловые кислоты по Gessy. Активность сывороточной гиалуронида зы по методу Ю.В. Наточила, а активность ферментов сульфгидрильных групп определяли в 1 мл сыворотки крови — методом амперметрического титрования раствором сулемы (0,001 N) на аппарате ПАТ-1.

Полученные результаты анализировали биометрически на ЭВМ ЕС-1002 с вычислением коэффициента достоверности .

3. Результаты собственных исследований

3.1. Фуни ци он а л ь ные а с пе к ты__становления_ответной

pea к ц и и я и ч ни ков___у__коров-доноров на _гормональную

индукцию суперовуляция

Проведенными исследова ниями установили, что по-лиовуляторный эффект зависит не только от типа применяемых препаратов, но и их дозы. Так, процент доноров, реагирующих полиовуляцией при введении ФСГ-п составляет в пределах 63.3 ±"',234, тогда как фоллитро-пина и фолликотропина, соответственно, 100 %.

Полиовулятор'ная реакция яичников имеет достоверное различие при введении ФСГ-п в разных дозах. Так, при введении 37 мг .эффект полиовуляции отмечается у 8 8 . Ь ± 9, 3 2 % коров-доноров, а 37,5 мг у 60, 03:4 , 38 I, тогда как при введении 42 мг ~42.3±7.31 'i коров.

Суперовуляция проявилась образованием фолликулов в количестве от 3 до 16 у всех доноров. Б процессе вымывания получено 129 эмбрионов, в т.ч. 28 полноценных, 57 условно-полноценных, 26 дегенерированных и 24 неоплс'дотвсренных яйцеклетки.

От 7 доноров получено 23 жизнеспособных эмбриона (от 2 до б на донора) , в среднем по 3,3 зародыша на одного донора. При трансплантации эмбрионов приживляе-мость зародышей у телок-реципиентов составила 60,9%. Ст данных животных в процессе транс плантации 79 эмбрионов было получено 3 0 живых телят-трансплантатов.

В связи с этим нами была проведена серия опытов по разработке оптимального времени введения гонадотро-пиноб от начала полового цикла.

С этой целью 17 донорам вводили фоллитропин з дозе 1200 ЕД по 4-х дневной схеме. Из них 9 коровам-донорам препараты в водили на 10 день, а 8 доз юрам на 11 день полове го цикла. После введения фоллитропина на 10 .день полового цикла суперовуляция наблюдалась у всех коров-доноров в количестве от б до 16 фолликулов. В процессе вымывания получено 45 эмбрионов, в том числе, 16 полноценных. 19 условно-полноценных, 10 д©генерированных и 8 неоплодстворенных яйцеклеток.

Трансплантацию осуществили 35 телкам-реципиентам. Приаттляемссть составила 27,5%. От данных реципиентов получено шесть живых телят-трансплантатов.

Лссле введения фоллитропина на 11 день полового цикла супер-овуляцию наблюдали у всех 8 доноров от 5 до 12 фолликулов. Получен был 21 эмбрион — 8 полноценных, 9 условно-полноценных,4 дегенерированных и 3 неоплодо-тзоренных яйцеклетки.

Из представленных данных результатов опыта следует, что введение фоллитропина на 11 день полового цикла более целесообразно, так как приживляемость эмбрионов оказалась выше, чем при индукции полиовул.чции на 10 день полового цикла. Из этого следует, что эмбрионы, полученные после стимуляции овуляции на 11 день полового цикла обладают большей жизнеспособностью. После индукции полиовуляции ФСГ-п на 10 день у всех 7 доноров наблюдалась суперовуляция в количестве от 7 до

10 фолликулов. После вымывания было получено 6 эмбрионов, в том числе 1 полноценный, 3 условно-полноценных, 2 дегенерированных и 11 неоплодотворенных яйцеклеток.

После трансплантации четырем телкам-реципиентам был получен один живой трансплантат.

При введении ФСГ-п на 11 день полового цикла суперовуляцию отмечали у всех шести доноров от 3 до 11 фолликулов. Обнаружили 33 эмбриона, из них 3 полноценных, 20 условно-полноценны:-;, 10 дегенерированных и 2 неоплодотворенные яйцеклетки. Трансплантацию осуществили 21 телке-реципиенту. Однако, приживаемость составила 4.8%.

В связи с полученными результатами исследований мы поставили задачу изучить эффективность различных гонадотрспинов в сочетании с однократным и двукратным введением эстрофана.

Стимуляцию и синхронизацию половой охоты у доноров осуществляли путем однократного (9 доноров) и двукратного (8 доноров) введения эстрофана на 3 день от качала инъекций гснадотропинов.

В случае использования фоллитропина для индукции полиовуляции при однократной инъекции острофана у 1001 доноров наблюдали хорошо выраженную схоту и эффект суперовуляции от 5 до 12 фолликулов. При вымывании обнаружили 21 эмбрион, из них 7 полноценных, б условно-полноценных, 8 дегенерированных и 3 меоплодо-твореыных яйцеклетки. Пересадку осуществили 13 реципиентам, приживляемость составила 57.1 %

При двукратном введении эстрофана на фоне фоллитропина у 1001 доноров отмечали хорошо выраженну» охоту и суперовуляцию от 5 до 16 фолликулов. При вымывании обнаружили 4 5 эмбрионов, в том числе 17 полноценных, 12 условно-полноценных, 16 дегенерированных и 8 неоплодо-творенных яйцеклеток. Трансплантацию осуществили 37 реципиентам, приживляемость составила 531.

Таким образом, двукратное введение донорам эстрофана, по сравнению с сднократным, способствовало формированию и получению большего числа полноценных эмбрионов. При однократной инъекции эстрофана полноценные эмбрионы получены от 30% доноров, а при двукратном от 75 S.

При использовании ФСГ-п для индукции полиовуляции при однократном введении эстрофана (7 доноров) отмечается хорошо выраженная окота и суперовуляция от 3 до 6 фолликулов. При вымывании обнаружили 8 эмбрионов (2 полноценных, 2 условно-полноценных и 4 дегенериро-ванных). При пересадке реципиентам 4-х эмбрионов приживляемость составила 25? .

Двукратное введение эстрофана !б доноров) на фоне ФСГ-п сопровождалось проявлением хорошо выраженной охоты и еуперовуллцией от 4 до 14 фолликулов. При вымывании обнаружили 31 эмбрион (2 полноценных,, 21 условно-полноценный 3 дегенерированных и 13 неоплодо-творенных яйцеклеток). Трансплантировали 21 эмбрион, приживляемость составила 12,5".

Таким образом, способность коров-доноров к суперовуляции и продуцироп анию асизнесг.оссбных эмбрионов является индивидуальной реакцией доноров на вводимые гонадотропины. Из 101 коровы, используемых в качестве доноров, только у 29,"' % получено от 2 до б жизнеспособных эмбрионов по 3,3 зародыша на одного донора. При трансплантации полученных эмбрионов приживаемость составила 53,5%.

Яри введении донорам фоллитропина в дозе 1200 ЕД на 10 день полового цикла приживлземость эмбрионов была в два раза выше, чем при индукции полиовулчции на 11 день полового цикла ',75% против 3'?, 5%) .

Двукратная инъекция донорам эетрсфана на третий день от начала индукции полиозуляции фоллитропинсм способствовала получению большего числа полноценных эмбрионов, чем при однократном введении эстрофана.

Однако, введение эстрофана как однократно, тар: и двукратно' на фоне ФСГ-п не способствовало увеличению количества полно-ценных эмбрионов и не сказало существенного влияния на при;еивля61юсть эмбрионов.

Влияние размеров яичников у коров-доноров в лютей-новую фазу полового цикла на особенности полиовулятср-ной реакции, количество и качество извлеченных эмбрионов изучал!! на 24 донорах, которых разделил:! на 2 группы по исходному состоянию яичников на 8-й день полового цикла, предшествующего индукции полиовуляции.

Состояние яичников оценивали по длине, ширине и толщине. В первую группу вошли животные, у которых произведение вышеуказанных параметров не превышало 10 см3. Во вторую группу вошли коровы-доноры, у которых объем гонад превышал 10 см"'. Анатомическую диагностику яичников осуществляли ежедневно до введения гонадотро-пинов, во время индукции полиозуляции и до момента извлечения эмбрионов. У коров-доноров 1 группы после индукции полиовуляции отмечалось увеличение яичников более чем вЗ раза. Динамика изменений параметров гонад во второй группе животныя носила аналогичный характер животным первой группы. Однако во всех случаях увеличение яичников всегда было более выражено в правом, чем в левом.

Анализ эффективности суперовуляции у коров-доноров показывает увеличение числа овуляций в среднем до 12,34+0,83 у коров второй группы против 9,25+0,67 первой группы и количество извлеченных эмбрионов, соответственно, 9,75+0,82 - 6,00+1,105 (р<0,05). Для выяснения выявленной тенденции реакции гонад на индукцию полиооуляции провели изучение местонахождения желтого' тела в лютеиновую фазу полового цикла, предшествующего суперовуляцки-

Учитывая, что технология вымывания эмбрионов была стандартна для всех доноров обеих групп, а разница в эффективности извлеченных эмбрионов очевидна, можно с: определенной долей объекта вности рекомендовать использование в качестве доноров коров, у которых желтое тело в лютеиновую фазу полового цикла, предшествующего индукции полиозуляции, располагается на правом яичнике.

На основании вышеизложенного нами проведены морфологические исследования яичников во время стимуляции овуляции на 10 день полового цикла. Исследования показали, что яичники имели неровную, преимущественно мелкобугристую поверхность, из-за многочисленных фолликулов различных размеров. В гистологических срезах насчитывали 91,4 фолликула, 76,8% из которых составляли

ная часть примод! сальных и растущих фолликулов находились в хорошем функциональном состоянии. Иногда встречались графоаы пузырьки с двумя яйцеклетками, одна из которых всегда была несколько больше другой по своим размерам. Третичные фолликулы более крупных размеров (диаметр? 3735,0 мкм), имели кистозные изменения. Всего в состоянии атрезии находилось 65,21 графокых пузырьков, средний диаметр которых 2132,0 мкм, что больше диаметра всех имеющихся в гистологических срезах третичных фолликулов на 274 мкм. Объясняется это наличием в яичниках графовых пузырькоз небольших размеров без признаков атрезии.

Характерно, что в срезах яичников с желтым телом предыдущего полового цикла насчитьгазлось 76-80 п римордяаль ных фолликулов, 13-18 вторичных и 12-15 третичных.

Таким образом, морфологическое состояние яичников свидетельствует о существенной эффективности гормональной индукции пслиовуляции.

3 __Харахсгэр'истика иммунологической реактивности

коров-доноров при суперовуляции

Изучение гумораль ной иммунологической реакции проводили: во-первых, определением суммарного показателя отражающего количества несвязанных антигенов в крови коров-доноров при суперовуляции, в процессе оплодотворения и бластогенеза (фатальный гемоглобин, гликозами-нагликан и реологическая активность эритроцитов); во-вторых — определением показателя, характеризующего количество связанных антигенов с сывороточным белком крови кор'ов, где определили содержанке среднего геометрического титра антител фибриногена, глккозами-нагликана в элюатах с эритроцитов и степень связывания антигенов в тканях организма коров-донороз.

В результате проведенных исследований установлено, что в крови отмечаются значительные колебания содержания фетального гемоглобина. Так. при получении 2-4 эмбрионов Нг было 3,1710.771. при 4-6 -3.3+0.80! ;?>0.05). а при '6-8 - 3.4±0,351.

Сравнивая данные количества Нр в крови коров-доноров при суперовуляции с различным количеством полученных эмбрионов следует отметить их статистическую недостоверность как. между собой, так и с аналогичными периодами не обработанных гормональными препаратами животных. Кроме того, содержание Нг в крови корсв-дС1 норов взаимосвязано с качеством полученных эмбрионов. Так, при содержании НР в пределах 1,й±0,8% отмечается повышенный процент непригодных для трансплантации эмбрионов. В то время как содержании Нг в пределах 3,6+1.2% свидетельствует с пригодности эмбрионов по морфологическим критериям для трансплантации.

В результате исследований установлено, что количество глшсозаминагпикана в сосудак матки коров-доноров как при индукции полиовуляцки, так и у телок-реципиентов, не подвергнутых гормональной стимуляции, тлеет значительную вариабельность. Так, у телок-реципиентов различия в артериальной (а - 0,155±0,С62) и венозной (в - 0, 150±0,071 ед.опт.пл.) кроьи незначительна и не достоверны. (Р>0,05). В тс же время при суперовуляции происходит резкое возрастание почти в два раза содержания г ликозаминагликан а как в артериальной (а - 0,352±0,021), так и в венозной крови (в 0,430±0,019 ед.опт.пл.) сосудов матки коров-доноров. (Р<0,001). Причем в венозной крови содержание глшсоза-минагликана возрастает в 1,23 раза по сравнению с артериальной (Р<0,0.1), что свидетельствует об интенсивном поступлении в организм матери полисах,аридных антигенных субстанций-

После прекращения действия гормональных препаратов уровень содержания гликозамикагликана возвращается к. показателю; небеременных клинически здоровых телок-реципиентов .

Очевидно, после выхода блас-гомеров из яйцепрово-дов происходит элиминация антигенных субстанций. Однако уровень накопления гликозаминагяикана продолжается при увеличении (8-10) количества эмбрионов и снижении их качества.

Таким образом, не связанные антигены могут вызвать динамические изменения структуры плазматической мембраны эритроцитов и являются физико-химической

основой изменения функции ферментов в эритроцитах.

Для определения активности На, К, ЛТФазы эритроцитов в зависимости от концентрации АТФ и температуры мы проводили измерение коэффициента преломления (Ат).) от концентрации АГФазы Дт| (с) в диапазоне 35-42°С.

V клинически здоровых животных на седьмой день после оплодотворения температурный оптимум активности фермента составил 3 0-4 О"С. при этом зависимость К(Тс) и шах(V) имела колоколообразныЛ вид.

Определение о гносительной скорости утилизации глюкозы проводили измерением коэффициента преломления сильно разбавленной взвеси эритроцитов при определенней температуре.

Капиллярную вискозиметрию взвесей эритроцитов и их «теней» в зависимости от температуры проводили с целью обнаружения термотролного фазового перехода (б) в интервале 34 -4 2 ° С.

Представленные материалы свидетельствуют о том, структурная вязкость эритроцитов с увеличением количества эмбрионов до 4-6 повышается на статистически достоверную величину. Однако коэффициент агрегации эритроцитов при этом остается практически неизменным.

При изучении зависимости взвесей эритроцитов от температуры Аг|(Т) у короа-доноров при суперовуляции нами было установлено, что при продукции эмбрионов в количестве 4-6 и 3-10 соответствуют весьма своеобразные изменения структуры эритроцитарных мембран, проявляющиеся каьс сдвиг точки фазового перехода Тс-30°С, т.е. фазовый переход смещен п низкотемпературную область.

Для условно-полноценных и дегенерирозанных эмбрионов оказалась характерна «размытость» фазового перехода. при Тс—37-39°С.

Таким образом, полученные кривые Ат) (т} существенно отличаются как от нормы, так и между собой по важнейшим признакам: критической температуре (Тс), ферме и даже числу термотропных фазовых переходов.

Результаты изучения активности На, К, АТФазы эритроцитов показали, что при суперовуляции выявляются три возможных варианта расположения (Тс) точек температурного оптимума активности фермента..

При индукции 4-6 эмбрионов Тс—39 °С/КМ 39=7, 266-10"5 М АТФ; Утах=1.000 10 + 8,750-Ю"6 АТФ/3 10 клеток, -а при 8-10 эмбрионов Тс-4 ОС/КМ 4 0=6, 666-10"5 +1,2777.10"® М АТФ; \/[па к=1, 0 б б • 10"5 + 7, 995-10"® К АТФ/3 10 клеток, условно-годные и непригодные характеризовались Тс=37 и 3.9°С/КМ 37=7, 000-Ю"5 + '9.880-10"6 МВ АТФ; \'гсах=', 120-Ю"5 + 8. 34 8-Ю"6 М АТФ/3 10 клеток; КМ 33=7,128-Ю"5 + 1, 069-Ю"5 М АТФ; Утах=1.389-Ю"5 + 1, 250-Ю"6 М АТФ/3 10 клеток

Как видно из приведенных значений, КМ в точках температурного оптимума при любой из изученных форм индукции полиовуляции существенно снижалась по сравнению с продукцией 2-4-6-8 эмбрионов и пригодных в 1,5-1.8 раза меньше по сравнению с контролем б области 39-40"С. где обнаруживается дополнительный максимум по данным капиллярной• вискозиметрии и температурном оптимуме активности На, К, АТФазы.

Титры антиэритроцитарных антител имеют незначительные колебания клинически здоровых тетюк-реципиентов вне гормональной индукции суперовуляции. Так, ь течение полового цикла наблюдаются колебания, связанные в основном с гормональной деятельностью яичников, что выражается в значительном повышении титра а и [3 антиэритроцитарных антител в период формирования фолликулов в предовуляционный период. Наиболее низкое его содержание отмечается незадолго до овуляции и в период регрессия желтого тела.

Серия исследований по изучению содержания фибриногена в плазме крови кор эв-доноров при суперовуляции после добавления к ней полис ахаридных антигенов. (высокополимерный гиалуроновой кислоты) показала, что происходит достоверной увеличение фибриногена, во время суперовуляции у коров-доноров обнаружено значительное увеличение содержания фибриногена в крови, оттекающей от мачки. В артериальной же крови количество фибриногена. оказалось даже меньшим, чем в плазме крови телок-реципиентов . Исследование среднего геометрического титра антиэритроцитарных антител и фибриногена• в крови коров-доноров в зависимости от количества и качества эмбрионов показало, что средний геометрический титр резко снижается при индукции 2-4 и 6-8 эмбрионов (7,1 —

7,6 ед. титра).

Результаты исследований крови у коров-доноров после гормональной индукции суперовуляции и получении 4-6 и 8-10 эмбрионов свидетельствуют о значительном возрастании фибриногена в крови животный. Так, при вымывании 2-4 эмбрионов содержание фибриногена в крови коров-доноров составляет 3,7 + 0,50 ед. титра, тогда как при большем проценте непригодных эмбрионов-5,3 + 0.62 ед. титра. Значительная достоверная разница в концентрации фибриногена отмечается и в плазме крови в ед. титрах при 4-6 и 8-10 эмбрионов.

У коров-донорое при получении 2-4 эмбрионов Содержание гликозаминагликан в элюатах эритроцитов составило 0,083 + 0,026 ед. опт. пл., при 8-6 - 0,152 Ь 0.116: при 6-8 — 0,0 62 + 0,2 8 ед. опт. пл. Вымывание 810 эмбрионов у коров-доноров характеризуется наивысшим накоплением КМПС на эритроцитах (0.169 + 0.025 ед. опт. пл. ) . У коров-доноров, имевших большой процент непригодных эмбрионов, полисахаридные субстанции вообще не элиминируют с эритроцитов, а у условно полноценных накопление гликозаминагликан в элюатах достигает до 0,1 13 + 0,019 ед.опт.пл.. а полноиенкых до 0,096 - 0,029 ед.опт.пл.

Исследование эозш-юфюпии носового зеркала у коров-доноров показало значительное возрастание эозицофи-лов в поле зрения исследуемого пунктата.

При вымывании 2-4 эмбрионов тип риноцитограммы оказался равным 1.5 - 0,05; 4-5 - 2,4 + 0,03; 6-8 - 1,7 + 0,09; 3-10 — 2,8 + 0,26; дегенерированных эмбрионов — 3,2 + 0,21, условно-полноценный 2,5 + 0.71 и полноценных 1,6 + 0,16, т.е. все показатели оказались статистически достоверно выше у коров-доноров, подвергнутых гормональной обработке. Причем, чем. выше эффект реакции яичников на гормональную индукцию, тем некачественнее получаютс. з эмбрионы, со с войственным иммунологическим состоянием организма коров-доноров.

Таким образом, оОсуждаемые показатели гуморальной иммунологической реактивности организма объективно отражают (функциональное состояние животных и могут применяться для прогнозирования суперовуляции у коров-доноров и эффективности трансплантации эмбрионов.

Изучение специфической иммунологической реакции

проводили путем определения изменений, происходящих в организме животных, на антигенное воздействие. Для ■этого исследовались показатели: во-первых, содержание специализированных образований лимфоцитов и их субпопуляций (венозно-капиллярнач разница в содержании лимфоцитов, Т-лимфоциты. Т-хелперы, Т-супрессоры, В-лимфоциты и функциональные свойства лимфоцитов in vitro) ; во-вторых, активностью ферментов, характеризующих иммунологическую реактивность организма коров (активность сывороточной гиалуронидазы и сульфгидриль--ных групп ).

С целью анализа хшмунореагирования и выявления отдельных его звеньев в процессе суперовуляции, оплодотворении и бластогенеза нами изучена динамика лимфоцитов б периферической крови коров-доноров и телок-р-еципиентов.

Результаты изучения венозно-капиллярной разницы (ВКр-лимфоцитов) у телок-реципиентов в течение полового цикла показывают, что выявлена закономерная динамика показателя ВКр лимфоцитов, которая была практически во всех случаях положительна и колебалась от - 0,2 до + 2,4 °„.

Отрицательная векознс—капиллярная разница в содержании лимфоцитов отмечена в феномен овуляции. Следует отметить, что стадия возбуждения полового цикла ха растеризовалась небольшой венозко-капиллярной разницей лимфоцитов.

Однако, на 6-3 сутки после оплодотворения происходит возрастание положительной ВКр лимфоцитов.

Ка основании изложенного следует считать, что показатель ВКр чимфоцитов может использоваться в качестве теста, отражающего реакцию организма на антигенное воздействие, что подтверждается исследованиями ВКр у коров-доноров при супер-овуляции.

Так как у коров-доноров в зависимости от количества и качества эмбрионов наблюдается колебание количества лимфоцитов е венозной крови.

Особенно это достоверно отмечено при вымывании 46 эмбрионов (2,8 -1- 0,4) и 8-10-3,1 + 0,24: а также непригодных для трансплантации эмбрионов — 3,3 + 0,47.

Проведенные исследования показали, что у телок-реципиентов в течение полового цикла отмечены существенные колебания Т-лимфоцитов и их субпопуляций. 'Гак, относительное минима л ь н ое с од е ржа ни е Т-лимфоцитов зарегистрировано в период активной функции желтого тела (36,75 + 1,27 %) , а максимальное в предозуляционный период.

Проведенной серией исследований установлено, что у коров-доноров при суперовуляцки установлен достоверный Т-дефииит, который является физиологическим, особенно при реакции яичников на гормональную стимуляцию 4-6 эмбрионами, при этом количества Т- розеткообра-зующих лимфоцитов в крови возрастает почти вдвое при суперовуляции и вымывании 8-10 эмбрионов.

Т-иммунодефицит, очевидно, связан с перестройкой в иммунной системе, направленный на развитие ауто (изо) иммунных реакций, в связи со значительной :«мбриопродук-тивностью (58,75 + 2,31 ®), разница статистически достоверна (Р < 0,001).

Содержание Т ;з-хелпоров аналогично содержанию Т-лимфоцитов, тогда как содержание субпопуляций супрессоров прямо пропорционально показателям Т-ллкфоцитоз и Т-хелперов. Наименьшее содержание супрессоров отмечено в период овуляции, а наивысшие в период функционирования желтого тела.

Изучение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов позволило установить повышение Т;-супрессоров У коров-доноров при суперовуляции и вымывании 4-6 и 8-10 эмбрионов в среднем на 20,9*-0,"?Ъ по сравнению с эмСриопродуктиеностью 2-4 и 6-3 (р<0,0У1) . В то же время у коров-доноров с такой же омбриспродуктивностьк> происходит снижение Т-хелпероч в среднем до 21,4+0,91 (?<0,001.1 .

Повышение Тз-супрессоров у коров-доноров при су-перовупяпии связано с созданием толерантности, направленно« на подавление изоиммунных реакций матери против экзогенных гормональных индукторов -

Тогда как снижение Т;]-хелперов, возможно, связано с перераспределением их в лимфоидных органах, где они непО'средственно участвуют в межклеточных взаимодействиях.

Исследование количества В-клеточных розеткообра-зующих лимфоцитов позволило установить значительное увеличение до 4 7,38+2,07% у коров-доноров после индукции суперовуляции с постепенным снижением их содержания после оплодотворения к выхода бластоциетов из 'яйцеводов и полость рогов матки (26,34 + 1,731).

Активность розеткообразных В- клеток варьирует у коров-доноров при суперовуляции вымыванием 2-4 эмбрионов незначительно и достигает средних физиологических показателей (19,30 + 1,96%) . При вымывании 6-8 эмбрионов специфическая клеточная реакция организма коров-доноров характеризовалась достоверным Т-дафицитом, содержание которых достигало 50,9+2,8% (Р<0,05). Причем Т-иммунодефицит заметно углублялся при вымывании 4-6 и 8-10 эмбрионов, достигая 43,6+3,7« (Р<0,001;, и 44,9+1,7 (Р<0,001) соответственно.

При исследовании относительного содержания Tj-супрессоров уже на стадии суперовуляции происходит достоверное снижение этого показателя до 16,8+1,0% (Р<0,001). При вымывании 4-6 и 8-10 эмбрионов регистрировалось заметное снижение содержания Тj-супрессоров по сравнению с вымыванием 2-4 и 6-3 эмбрионов (Р<0,05 и РС0.001 соответственно). Изучение Тj-хелперов показало, что .наибольшую чувствительность проявляет показатель Tj-хелпер, рассчитанный относительно Т-лимфоцктов.

Исследование В-клеточного иммунитета позволило установить, что только при супер :>вуляции происходит достоверное увеличение числа В--лимфоцитов в среднем до 22,9+0,9% (Р<0,005). При вымывании 4-6 эмбрионов абсолютное количество В-лимфоцитов у коров-доноров заметно повышается до 38, 2— 30, 7 в 1 мкл крови (Р<0,001). Вымывание 2-4 и 6-8 эмбрионов характеризуется у коров-доноров нормальным относительным содержанием В-лимфоцитов.

Включение Н3-тимидина в ядра лимфоцитов свидетельствует о т-ом, что в культурах клеток без добавления митогена - (фитогемагглютинина) процент включения меченного тимидина находится в пределах 5,63+0,34% — 6,27+0,98% (Р<0,05) от общей введенной активности и на всем протяжении исследований варьирует незначительно. Бласттрансформация лимфоцитов в культуре клетки,

первичные, 10,9?, вторичные, 12,3'й третичные. Значитель стимулированных ФРА у коров-доноров при суперовучяции, показывает высокий процент 29,3 + 0,34% включения Н"*-тимидина от общей введенной активности. В процессе оплодотворения наблюдается небольшой рост количества включенного Н3-тимидина (33,6 + 0.41%) с последующим с ¡-1 и ж е н и е м д о 24,7 Ь +0,751 актив н о сти п о с л е в нх од а эмбриона 113 яйцеклетки в полс-сть матки. Таким образом, у коров-доноров при суперовуляции отчетливо прослеживается выраженное угнетение Т-клеточного иммунитета и относительная активация функции В-лимфоцитов-

Исследуя активность сывороточной гиалуронидазы в крови животных, мы установили значительный разброс-содержания данного фермента у телок-реципиентов. Так, в крови телок-реципиентов отмечаете я наивысшая активность гиалуронидазы в предсвуляционный период полового цикла. При этом содержание фермента почти в два раза превышает его концентрацию в крови в сравнении с остальными периодами исследования, разница отатистически достоверна (Р<0,05) .

Проведенные исследования показали, что не обнаружено' достоверных различий показателя по сосудам матки (артериальная кровь — 6,3+0,19, венозная —7,0+0,18 ус.ед., Р>0,05) У телок-реципиентов. Так, значительнее изменение активности фермента гиалуронидазы выявлено при суперовуляции у корев-доноров (в артериальной крови содержание составило 10,7+0,27, а в венозной 11,1+0,54 ус.ед., Р>0,05), что свидетельствует об отсутствии связи активности фермента с процессами оплодотворения и бластогенеза.

Достоверное увеличение в маточных сосудах сывороточной гиалуронидазы у коров-доноров при суперовуляции указывает на накопление высокололимерных полисахаоидных субстанций в процессе оплодотворения и бластогенеза.

В связи с этим активация ферментов, участвующих в катаболизме поли\гронидов, происходит под действием с ульфгмдрильных групп в сыворотке крови, так как ЗН-группа является активным центром тиоловых ферментов.

Следовательно, полученные данные дают 'основание полагать, что выявленные изменения в тиол-дисульфидных системах лежит процесс стабилизации нарушения мембран-

ной проницаемости. Пусковой механизм регуляции проницаемости мембран связан с изменением реакционной способности БН-трупп к конформациокным перестройкам аполротеина комплекса. Таким образом, полученная нами информация о специфической клеточной иммунологической реакции телок-реципиентов и коров-доноров свидетельствует о закономерном характере этих изменений в зависимости от индукции суперовуляции.

При суперовуляции фагоцитарная активность лейкоцитов у коров-доноров была самой низкой по сравнению с другими периодами исследований (46,32+3,251}.

По мере увеличения количества вымытых эмбрионов происходит возрастание фагоцитарной активности, так при 4-6 эмбрионах она составила 58,37+3,38 (Р>0,05), а при 6-8 — 47,65+3,27% (Р>0,005), в то время как при вымывании 8-10 эмбрионов возрастает до 63,27+2,831.

К моменту суперовуляадга фагоцитарный индекс составляет 2,53+0,19 и удерживается в пределах 2,87+0,15 до завершения процесса оплодотворения. Властогенез характеризуется закономерным, статистически достоверным возрастанием фагоцитарной интенсивности лейкоцитов. Так, на 7-8 сутки после оплодотворения фагоцитарный индекс, составляет 3,5б±0,09. Обычно наиболее вира-венное нарастание интенсивности отмечено при вымывании 4-6 эмбрионов с сохранением .и превышением данного уровня при вымывании 8-10 эмбрионов. У коров-доноров с большим процентом годных к трансплантациям эмбрионов 3,02:10.20: несколько повышаясь с преобладанием условно — полноценных 3,3 8±0,17.

Анализ полученных данных позволяет сделать заключение, что агрессивность лейкоцитов резко снижена у коров-доноров при вымывании 2-4 эмбрионов и повышается у коров-доноров с вымыванием 4-6 эмбрионов. У коров-доноров с продукцией 6-8 эмбрионов происходит снижение активности лейкоцитов с резким возрастанием при вымывании 8-10 эмбрионов (Р<0,05). С преобладанием большого количества годных для трансплантации эмбрионов, наблюдается снижение фагоцитарного числа до 2,08+0,20, с возрастанием данного' показателя с увеличением количества эмбрионов до 8-10. Средние показатели бактерицидности крови у телок-реципиентов составили в среднем 57,2±9,25%. У коров-доноров при суперовуляции

степень подавления роста колоний сывороткой крови снижается до 50,2+10,03? при вымывании 2-4 эмбрионов. При вымывании 4-6 эмбрионов у коров-доноров наблюдалась низкая бактерицидная активность сыворотки крови (38,7 + 8,01?.) с последующим резким возрастанием, у коров-доноров при вымывании 6-8 эмбрионов до 57, 1 ±б , 72 'é. При суперовуляции и вымывании 8-10 эмбрионов отмечается самая низкая бактерицидность крови (36,8+10,02%), что свидетельствует о слабой степени подавляющего эффекта сыворотки крови на рост колоний кишечной палочки in vitro.

Так, в период суперовуляции происходит повышение естественного титра антител с 31,4+1,25 ед. до 57,3:1.2,24. ед. в процессе оплодотворения с последующим, снижением на статистически недостоверную величину, в процессе бластогенеза. С увеличением количества вымываемых эмбрионов происходит всплеск накопления в организме коров -доноров естественных антител, особенно восьми - десяти эмбрионов — (82,7±2,7Б — 93,4+3,92 ед.) . Характерные изменения отмечаются и со стороны уровня комплементарной активности сыворотки крови коров-доноров. При суперовуляции у коров-доноров отмечается высокая комплементарная активность, о чем свидетельствует очень низкой титр комплемента (0,09+0,09 ед.). В процессе оплодотворения происходит незначительное статистически недостоверное понижение комплементарной активности сыворотки крови. Однако в процессе бластогенеза наблюдается резкое повышение активности комплемента сыворотки крови, особенно в конце восьмого дня после осеменения, титр комплемента в зтст период составил 0,24+0,0 ед. (?<0,001).

Таким образом, проведенные наблюдения позволяют считать, что взаимоотношения сывороточных (гуморальных.) и клеточных факторов иммунитет» играют важную роль в создании временной функциональной иммунологической ареактивности организма коров-доноров к гормональной индукции полиовуляции. От количественного и качественного соотношения иммунных лимфоцитов и сывороточных блокаторов зависит эффект суперовуляции и качества получаемых эмбрионов, пригодных для трансплантации. Иммунологическая регуляция этих физиологических процессов происходит в тесной связи с ферментативными

изменениями, которые могут активно влиять на интенсивность 'и специфические особенности иммунитета.

3.3. Разработка иммуно л огиче ск ог о тест а прогнозирования суперовуляции у коров-доноров

и качества полученных эмбрионов^ Проведенные нами исследования показывают, что течение суперовуляыии в большей мере зависит от иммунологического статуса организма, который, в свою очередь, определяет компоненты механизма оплодотворения, возникающих в результате толерантности, усиления и аллергизацми коров-доноров гормональными препаратами.

Наиболее четкие признаки усиленного иммунологического ответа во время суперовуляции регистрируются при повышенном количестве получаемых эмбрионов показал, что при. вымывании 2-4 и 6-8 эмбрионов соотношение и величина показателей соответствовали данным аналогичного периода у телок-реципиентов.

При 4-6 и 8-10 эмбрионах увеличивается показатель содержания фетального гемоглобина, который достигает 6,8?, от общего количества гемоглобина

Количество глпкозамииаглккана в сыворотке крови в 1.5 раза превышает соответствующую величину у телок-реципиентов .

Одновременно' увеличивается и количество неклеточных антигенов, адсорбированных на клетках крови (гликозами.чагликана в элюатах 8,6 против 4,9). Поступление большого количества клеточных антигенов оказывает иммунизированный эффект и начинается увеличение показателей ответной реакции, которая по суммарной величине превышает аналогичные у телок-реципиентов на 20,8%.

Венозно-капиллярная разница лимфоцитов в этот период равна в среднем +2,4%. а активность гиалуронидазы в среднем 20,9+1,27 ед. И в отдельных наблюдениях достигает 4 5 ед.

Одновременно с увеличением показателей иммунологической реакции отмечается закономерное и значительное уменьшение величины антигенной информации, отражающей количество несвязанных антигенов в крови коров-доноров при гормональной обработке.

2 6

Это очевидно, служит следствием интенсивного разрушения и деполимеризации поступающим в организм коров-доноров клеточных и неклеточных субстанций.

Значительное разрушение клеток крови сопровождается прогрессивным увеличением показателя, характеризующего адсорбцию антигенов на клетках крови и в тканях.

Иммунизирующий эффект большого поступления антигенов за несколько дней при супер-овуляции З-б и 8-10 эмбрионов вызван не только значительным и неадекватным в дальнейшем увеличением показателей реакции, но и соответствующим увеличением интенсивных процессов связывания антигенов с белком крови. Они, как правило, начинаются раньше обычного срока и выражены больше, чем у телок-реципиентов.

Проведенный нами анализ иммунного статуса коров-доноров свидетельствует о том, что некоторые показатели реактивности организма могут служить критерием прогноза суперовуляции, качества и количества полученным эмбрионов.

Таблица

Иммунологический тест состояния коров-доноров при суперовуляции в зависимости от количества к качества эмбрионов______ __________________

Получено эмбрион о в на ]. донора

Показа- Соотно- Эффек- Все- Пол- Услов- Деге- Незпло-

тели шение тивность го но - ко пол- нери- дотво-

судере- цен- ноцен- Г-с- - репные

ву ляции ные ные ванные яйце-га! е тки

НР (г % ) о1, 5 43, 00 п<4 <1 2 - 4 3-5 3-7

1, 5-3 5'?, 00 4-10 3 - 7 1-2 1-2 2-3

> 3 63, 00 >10 >4 0 -1 0-1 1-2

КМПС <0, 3~1 57, 30 >6 >4 <1 < 2

(ед.от. 0,3-0,4 34. 00 3 - 9 2 - 3 2 з.' 3 - 4

пл) >0, 4 27, 00 <3 >4 >4 >5

Фибримо- >-'3,. 5 53, 00 >7 >5 <3 <2 с 4

рен (ад. 3,5-4,5 40, 00 4 - 9 3-4 р _ •*> 2-3 4-5

титра) >4, 5 35, 00 <4 <3 > >3 >5

Тип ри- <1г 5 58, 00 >6 >5 <3 <4

ноцито- 1, 5-2,0 43, 00 5-10 3-4 2-3 2-3 3-4

ррамм >2, 0 28, 00 <4 с 2 >3

ВКр < 1, 5 63, 00 >6 >5 <:? ч.З <4

лимф . 1, 5-2,5 41, 00 4-9 3-4 2-3 ■*> _ 4-5

>2, 5 32, 00 <4 <3 >3 >3 >5

Анализ информативного материала представленного в таблице свидетельствует о том, что при показателя;-: феталъного гемоглобина выше 3 г! эффект суперовуляции наблюдается у 63% коров-доноров при полноценной продуктивности 4 и более эмбрионов. Однако, наиболее оптимально соотношение содержание Н* в пределах 1,5-3,0 г%. Снижение содержания Нг с 1,5г% является плохим прогностическим признаком полноценной суперовуляции у коров-доноров.

Содержание гликозаминагликана в сыворотке крови с 0,3 ед.опт.пл. свидетельствует с; хорошей эмбриопродук-тивности коров-доноров•

Однако, повышение содержания гликозаминагликана выше 0,4 ед.опт.пл показывает о недопустимости данного животного в использовании в качестве донора.

Оптимальным содержанием фибриногена является соотношение до 4,5 ед.титра, при котором получаем наибольшее количество полноценных, пригодных для трансплантации эмбрионов.

Тип риноцитограмм ха растеризующий а ллергическое состояние коров-доноров показывает, что чем меньше в пунктате носового зеркала будет эозинсфилов, тем выше эффект суперовуляции (58,00%) и больше полученных эмбрионов. При этом, чем меньше будет венознокапилляр-ная разница в содержании лимфоцитов (до 1,5), тем выше будет эффект суперовуляшда (63,001) и эмбриопродуктив-ность коров-доноров.

Таким образом, динамика показателей иммунологической реактивности коров-доноров при суперовуляшш характеризуете я кратковременным увеличением, содержания корпускулярных антигенов в крови, вслед за которым развивается усиление реакции организма и значительное уменьшение антигенов в крови, т.е. состояние иммунитета.

Причинами частых неудач при трансплантации эмбрионов являются пересадка некачественных эмбрионов и качество гормональных препаратов, применяемых при индукции полиовуляции.

Анализ полученных показателей свидетельствует о том, что иммунологиче с кий статус телок-реципиентов существенно отличается от соответствующей характеристи-

ки коров-доноров при суперовуляции, поэтому разработанный нами тест следует использовать в практике трансплантации эмбрионов, как неотъемлемую часть технологии э мб ри о т р а н с ф е р з а.

4. Выводы.

1. Эффект суперовуляции не имеет достоверных отличий по числу и качеству полученных эмбрионов от применяемых гонадотропных препаратов, а имеет достоверное различие при введении разных доз. Так, для ФСГ-п это является доза 37 мг, фоллитропина 1200 ЕД и фолликотрошша 24 мг в сочетании с двукратным введением простагландина ¡?2а на 11 день полового цикла.

2.Эффективность получения полноценных эмбрионов от коров-доноров при индукции полиовуляиии зависит от исходного клинического и морфологического состояния яичников, определяющего-:; я не только размерами, но и местоположением желтого тела полового никла, которое располагается на правом яичнике предшествующей суперовуляции.

3. Введение в организм экзогенных гонадотропинов предполагает иммунологический ответ секреторных клеток яичников и зрелых фолликулов в виде специфических антител в 1,8-2,2 раза снижающих эффект супер овуляции, количество и качество эмбрионов.

1.Индукция полиовуляции у коров-доноров гонадо-тропными препаратами повышает содержание Т п-супрессоров на 20,9± 0,7%, в то время как содержание Ту-хелперов снижается на 21,4 ±0,9$, а В-лимфоцитов увеличивается до 47,38±2,07% после сперовуляции и понижается до 26,34+1,78% после выхода бластоцистов в полость матки.

5.Бластогенез характеризуется элиминацией антигенных субстанций, а накопление корпускулярных антигенов после индукции гюлиозуляции связано! с и зме не нием функци ональной с т руктуры пл а зма тиче ской мембраны эритроцитов, сопровождающихся снижением активности На, К, АТФазы в 1,0 раза, а скорости утилизации глюкозы на 35,00?.

6.Способность к конъюгации с чужеродными полиса-хариднкми субстанциями существенно снижается при введении экзогенных гонадотропинов, что ведет к получению неполноценных эмбрионов (42,00 6) и значительному количеству неоплодотворенных яйцеклеток (30,00%).

7.В период суперовуляции у коров отмечается активация механизмов естественной неспецифической резистентности, что свидетельствует об усилении метаболических процессов в организме .доноров в связи с формированием и развитием эмбрионов,

6. Эффект суперовуляции у коров-доноров сопровождается возрастанием НЕ в 2,23 раза, содержание гликозаминагликана в элюатах с эритроцитов на 8,491, фибриногена б 1,43 раза и ВКр лимфоцитов в 3,0 раза, что связано с увеличением интенсивности процессов связывания антигенов с белками крови, которые начинаются раньше и выражены более отчетливо, чем при спонтанном половом цикле.

9. При подготовке коров-доноров к получению эмбрионов необходимо учитывать иммунный статус животного, так как выявлена тесная корреляционная связь уровня гуморальных и клеточных факторов иммунитета с полиову-ляторной реакцией яичников, числом и качеством .эмбрионов.

5. Практические предложения

1.Результаты исследований, изложенные в диссертации, рекомендуются для использования в учебном процессе по эмбриологии, патфизиологии и биотехнике размножения животных.

2. С целью повышения эффективности суперовулятер-ного ответа и выхода качественных эмбрионов необходимо учитывать и корректировать иммунологическую реактивность у коров- доноров.

3.Ддя увеличения выхода полноценных эмбрионов в процессе индукции полиовуляции следует принимать во

внимание клинико-морфологическое состояние яичников с учетом местонахождения желтого тела на правом яичнике.

4.В технологии трансплантации эмбрионов при подготовке коров-доноров к суперовуляции следует руководствовать с я иммунологи ч е ским тест ом

- Н* - более 3,0

- гликозаминагликан - менее 0,30 0 ед.опт.пл ;

- фибриногена - менее 3,5 ед.титра ;

- ВКр лимфоцитов - менее 1,5%;

- положительный тип рииоцитограммы

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Материалы по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в хозяйствах Саратовской области //Тез. Докл. Всесоюз. совещ. в ВИЖе,/ 1990, Дубро-вицы, (в соавторстве).

2. Некоторые результаты работы по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота 1990 г. //Сб. науч. тр. УСХИ.-Ульяновск, 1990.-С32-35. (в соавторстве) -

Л, Результаты исследований по трансплантации эмбрионов, крупного рогатого скота //Сб. науч. тр. ПНИИЖК.-Саратов, 1992. -с.23-27. (в соавторстве) .

4. Рост и развитие телят-трансплантатов //Зоотехния.-1991.- №5.-С.13-14. (в соавторстве).

Ъ. Гормональное вызывание суперовуляции у коров-доноров /'/Тез. Докл. всесоюз. науч.-техн. конф. Москва, Дубровицы, 1991-с.21 (в соавторстве).

6. Эффективность препаратов для вызывания полиовуляции у коров-доноров //Степные просторы.- 1992-М2. -С.15-17. (в соавторстве).

7. Влияние гормональной обработки извлечения к пересадки эмбрионов на воспроизводственную способность доноров и реципиентов //Сб. науч. тр. ПНИИЖК. Саратов, 1992-С. 37-39 . ¡.в соавторстве) .

8 . Сравнительное изучение эффективности применения различных препаратов для вызывания полноеуляции у доноров ///Сб. науч. тр. ПНИИЖК. Саратов, 1992-С.45-46. (в соавторстве).

9. Использование эстрофана для борьбы с бесплодием коров и телок //Сб. науч. тр. ПНИИЖК. Саратов, 1992-С.51-53. (в соавторстве).

10. Морфологическая реакция яичников на пслиовуляхдию у коров-доноров //Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных /Матер, междуна-род.координац. совещ. -Воронеж, 1957.-С.417

11. Разработка иммунобиохимического теста прогнозирования суперовуляции У коров-доноров //Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных /Матер. международ-координац. совещ. -Воронеж, 1997.-С.418