Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Выделение возбудителя хламидиоза индеек, изучение его биологических свойств и получение штамма, адаптированного к культуре клеток

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

--------------------л-------п— ---------------

На правах рукописи

ДАНЧЕНКО ГАЛИНА НИКОЛАЕВНА

УДК 619:616-07:636. 5

ВЫДЕЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХЛАМИДИОЗА ИНДЕЕК. ИЗУЧЕНИЕ

ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА. АДАПТИРОВАННОГО К КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург, 1995 г.

- г -

Работа выполнена во всероссийском научно-исследовательском ветеринарном иснтиуте птицеводства (ВНИВИШ. северо-кавказской зональном научно-исследовательском ветеринарном институте (СКЗНИВИ)

Научный руководитель - член-корреспондент Россельхозакаде-

мии, доктор ветеринарных наук, профессор Коровин Р. Н.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук.

профессор Зеленский В. П. доктор ветеринарных наук старунова н. п.

Ведущая организация - Донской государственный

агропромышленный университет

Зашита состоится '^¿/слЗ^л__1995 год в "часов на

заседании диссертационного совета Д 120, го, 02 при Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины по адресу: 196084, Санкт-Петербург, черниговская ул. .5

с диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной акакдемии ветеринарной ■ медицины

Автореферат разослан " 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат ветеринарных наук

Узюмова о. в.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы, индейководство одно из

наиболее перспективных отраслей птицеводства— Индейки крупная______________

скороспелая птица, нясо которой обладает хорошими вкусовыми качествами и высокой питательностью. Однако, на развитие индейководства отрицательно сказывается неблагополучие птицехозяйств по ряду инвазионных и инфекционных болезней, к числу которых относится хлакидиоз.

Впервые хламидиоз зарегистрирован в штате Техас (США) в 1951. В это же время выделен возбудитель болезни (Irons J. V. et al. , 1952).

О наличии болезни в ряде крупных индейководческих Ферм в разных государствах сообшали (Mayer к. F.. 1965; storz J.. 1971; Page L. A. . 1975; Lang G. H. . 1984; Andral B.C.. 1985 и др.). Хла-мидиоз индеек причиняет значительный экономический ущерб, вызывая гибель молодняка индеек до 20'/, у маточного поголовья снижается яйценоскость, на Фоне стресса хламидиоз сопровождается высокой летальностью. Потери птииы при этом достигают зох, а вывод индюшат уменьшается до 40'/.

На территории России и в странах ближнего зарубежья эта болезнь зарегистрирована у индеек, гусей, уток в Московской области (Куэнь джоу, 1961), в Омской области (Цыро В. а. , 1966). в Киргизии (Ерохина А. Н. , 1967), на Украине (Гирич В. И. . 1969), в Эстонии (Пейкре Э. а. , 1969),

очаг инфекции сохраняется длительное время по скольку болезнь часто приобретает субклиническую Форму при которой переболевшие птицы длительно остаются носителями инфекционного начала.

В специальной литературе хламидиоз освешен очень кратко; в ветеринарных лабораториях он не дифференцируется от других, сходно проявляющихся заболеваний, хотя наличие болезни в птицеводческих хозяйствах не исключается. Недостаточно изучены эпизоотические штаммы возбудителя.

Следует отметить, что хламидиоз имеет также социальное значение (Безденежных И. С. с с о авт. , 1969; Казанцев А. П. ,1973; Иль-инскийЮ. А.. 1974; Абушевф. А., 1977; Терских и. И., 1979; Девки-на Н. В.. 1990; Рейзис А. Р. , 1993; и др. )

Надежные средства лечения и профилактики хланидиоза не разработаны. необходимость изучения этих вопросов диктуется их на-

- 4 -

учной и практической значимостью.

Цель и задач и исследований. Целью работы являлось изучение биологических свойств возбудителя хламидиоза индеек. адаптация его к культуре клеток.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

- выделить возбудителя хламидиоза индеек;

- изучить его биологические свойства;

- адаптировать возбудителя к ионослою первичных и перевиваемых культур клеток, получить высоковирулентный штамм хламшшй, обладающий дитопатическим действием;

- разработать технологию накопления биомассы в культуре клеток с последующий приготовление эффективного вакцинного препарата.

Научная новизна. Впервые получен высоковирулентный. иммуногенный цитопатогенный штамм возбудителя хламидиоза индеек, адаптированный к монослою клеток культуры фиброблас-тов эмбрионов кур (ФЭК) и перевиваемых линий (Ь. МДВК. нак-Коя).

Выделенный нами штамм "ДХ-7" возбудителя хламидиоза индеек, семейства СЫашус11ас1ае, вида СЬатусНа рзтас1 депонирован во Всесоюзном государственном научно-исследовательскон институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) в качестве производственного штамма для изготовления вакцин. Регистрационный номер 23-ДЭЕ.

Разработан способ культивирования возбудителя хламидиоза индеек на монолое ФЭК ролерным методом для производства биомассы хланидий (описан в патенте, регистрационный номер 95103695).

Практическое значение работы. Получен вакцинный штанм "ДХ-7" возбудителя хламидиоза индеек.

Разработан способ культивирования возбудителя хлимидиоза индеек в культуре клеток ФЭК. Способ предложен для использования в технологическом процессе изготовления культуральной инактивиро-ванной вакцины (описан в патенте, регистрационный номер 95103695).

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на методическом совете отдела вирусологии, ученом совете ВНИВИЛ. на Всесоюзной конференции "Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, обших для человека и животных" (Львов, 1968),

ученом совете СКЗНИВИ. научно-практическом семинаре ветеринарных специалистов птицеводческих хозяйств и специалистов ветеринарных лабораторий России (Санкт-Петербург. 1995).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в трех научных работах. Достоверность разработки подтверждена комиссионными опытами в СКЗНИВИ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 14 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложения, списка использованной литературы и приложения, Библиография содержит отечественных и иностранных источников.

Основные положения, выносимые на защиту:

- характеристика штамма Ciilamydla pslttacl, вариант avis "ДХ-7", адаптированного в культуре клеток ФЭК;

- технология получения биомассы хламидий в культуре клеток с высоким инфекционным титром, с последующим приготовлением эффективной вакцины.

2. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

S. 1. материалы и методы исследований

Работа выполнена в 1986 - 1995 гг. в отделе вирусологии всесоюзного научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства (ВНИВИП), на базе лаборатории вирусологии северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института (СКЗНИВИ), на птицефабриках "Мырзытайская" (Казахстан), "Егорьевская" (Московская область), "Ерденевская" (Калужская область).

Клинически обследовано более 40000 голов молодняка до з-ме-сячного возраста и взрослого родительского стада. С целью изучения патологоанатомических изменений вскрыто 136 павших и вынужденно убитых птип.

В опытах по вопроизведению заболевания и испытанию патоген-ности выделенных изолятов использовано: куриных эмбрионов - 440. белых нышей - 52. кроликов - 16 и индюшат - 81. Исследовано 317 проб сыворотки крови птип методой рек и НРСК и 24 пробы материала - методом имнунофуореспенпии.

Выделение изолятов возбудителя проводили на культуре клеток ФЭК и перевиваемых линий (Ь. НДВК. Мак-Коя) и куриных эмбрионах. Для этого исследуемый материал в форме юх-ной суспензии паренхиматозных органов свободной от бактериальной и грибковой контаминации, вносили в пробирки со сформировавшимся монослоем клеток или иноклуировали в желточный мешок 7-8-суточных куриных эмбрионов. Пробирки с монослоем и зараженные куриные эмбрионы ежедневно просматривали, овоскопировали и готовили мазки-отпечатки с целью индикации возбудителя.

Индикацию хламидий в форме цитоплазматических включений и зрелых элементарных телец проводили в зараженной клетке монослоя и мазках-отпечатках из желточной оболочки зараженных куриных эмбрионов. окрашенных методом Романовского-Гимза. электронно-микроскопические исследования проводили в СКЗНИВИ, изучали возбудителя в клетках зараженного монослоя. Препараты просматривали в электронном микроскопе ЭМВ-ЮО б при ускорявшем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении 6000-70000.

Индикашто возбудителя проводили с использованием непрямого метода иммуноФлуоресценции (ИФА). реакции связывания комплемента (РСК) и непрямой реакции связывания комплемента (НРСК) ■ которые выполняли по общепринятой методике.

Для перекрестной РСК получали гомологичную антисыворотку путем гипериммунизании голубей. Гомологичный антиген готовили по методу Червонского В. и. и Поповой о. н. (1959). В качестве специфического антигена использовали стандартный хламидийный антиген, выпускаемый Одесским заводом бактериальных препаратов.

Для непряного метода инмуноФлуоресценпии использовали специфическую немеченую сыворотку крови и меченую антикроличью сыворотку. изготовленных иэм им. н. Ф. Гамалеи РМАН. Препараты исследовали в люминисцентном микроскопе ЛМ-З при использовании светофильтров ФС-1-2; 1С-18. объектива му1-3 и иммерсии х90 и окуляра х5 или х7.

Инфекционный титр хланидий определяли на 7-8-суточных куриных эмбрионах (ЭЛД^/О. 2 см'*) и в культуре клеток, культивируемых в пробирках с хорошо развитым монослоем (ТЦД^/сн3).

Расчет результатов титрования проводили по методу Рида и мен-ча (1938).

Для определения вирулентности изолятов хланидий использова-

ли белых нншей массой 7-10 г. индюшат 14-дневного и 3-месячного возраста, культуру первично трипсинизированных клеток куриных Фибробластов (ФЭК) и перевиваемых линий (Ь. мдвк.^ Мак-Коя).____________

Культуры ФЭК готовили по общепринятой методике. Адаптацию изолятов хламидий клеточного монослоя проводили в условиях стационарного и роллерного культивирования при режимах, отобранных опытным путем.

Антигенные свойства и иммуногенную активность изолятов "Егорьевский" и "Джамбулский". изучали на голубях и индюшатах, в качестве антигена использовали инактивированную культуру хламидий.

Накопления биомассы хламидий (возбудителя хламидиоза индеек) проводили по способу, описанному в заявке на получение патента (N95103695).

2. 2. Выделение, культивирование и идентификация возбудителя хламидиоза индеек

Сложная эпизоотическая ситуация, постоянное выявление больных индеек всех возрастов и гибель птицы независимо от сезона года наблюдалась на крупных индейкоФермах птипефабрик "Мырзытай-ская" (Казахстан), "Егорьевская" (Московская область), и "Ерде-невская" (Калужская область). В названных хозяйствах отмечалась сложная эпизоотическая ситуация. Заболевание проявлялось такими признаками как угнетение, затрудненное хрипяшее дыхание, синюш-ность в области клюва, конъюнктивит, озноб, взъерошенные перья, опушенные крылья, истощение, мышечная дистрофия).

вывод шшпат не превышал 56, 2?.. индюшата отставали в росте, в развитии, смертность достигала зох и более.

При эпизоотическом обследовании хозяйств и клиническом наблюдении за птицей возникло подозрение на прояление хламидиоза. Одновременно в стаде регистрировали пастереллез, сальмонеллез, колибактериоз, однако, их клиническое проявление не всегда было типично.

С целью исключения хламидиоза у клинически больных птиц вышеупомянутых хозяйств у 136 голов были исследованы пробы патологического материала от павшей и вынужденно убитой птицы. Исследование проводили комплексно, при этом в мазках-отпечатках, окрашенных по методу Романовского-Гимза. в большинстве проб (70-80'/.)

- в -

были обнаружены хламидии в форме зрелых телец возбудителя и пито плазматических включений. Из этого же материала были выделены изоляты хланидий в культуре ФЭК на первом-втором пассажах матери ала. При морфологической исследовании монослоя, выращенного в пробирках на покровных стеклах и окрашсппого методом 1'онаповско-го-Гимза просматривались шггоплазматические включения, окрашенные в темно-фиолетовый цвет, чаше внутриклеточно; иногда они заполняли всю цитоплазму клетки, оттесняя ядро, вне клеток, одиночно или россыпями, располагались зрелые тельца хламидий. Такая морфологическая картина характерна для возбудителя вида Chlamydia pslttaci - возбудителя хламидиоза индеек.

поддержание выделенных изолятов хланидий проводили еженедельно, пассируя их на культуре ФЭК с последующим контролем на стерильность и определением титра возбудителя в каждой пятом пассаже. Всего проведено более 100 пассажей каждого изолята.

Электронно-микроскопически изучен цикл развития изолята хламидий в клетке, при этом установлено, что в инфицированной клетке в первые 2 часа инкубации хламияии обнаруживались в стадии адсорбции и Фагоцитоза. На одной клетке адсорбировалось до 3-6 хламидий. Зрелые хланидии были овальной флормы. имели трехслойную оболочку и центрально расположенный нуклеоид величиной около 200 мн. Через б часов инкубации в цитоплазме отдельных клеток встречались Фагосомы значительных размеров, ииеюшие четко выраженную мембрану, заполненную Фибриллярно-гранулярным материалом, так называемые "виропласты". К 12 часам в них отнечали участки пониженной электронной плотности и образование овальных ретикулярных телец величиной 500-1200 нм. структура самой клетки в этот период значительно нарушалась, изменялись контуры ядра. После 24 часов инкубации количество ретикулярных телец значительно увеличилось. В дальнейшем они претерпевали изменения; нуклеоид уплотнялся, пространство между нуклеоидом и оболочкой увеличивалось. В цитоплазме одной клетки выявляли хланидии различной стадии развития. К 48 часам инкубации значительная часть клетки заполнялась многочисленными виро пластами и хламидиями различной стадии развития. Электронно-микроскопическими исследованиями подтверждена принадлежность выделенного изолята к виду Chlamydia pslttaci. Контролем служили клетки неинФипиРованного монослоя, в которых подобных изменений не наблюдали.

Результата'идентификации изолятов в РНСК и ифа показали их принадлежность к виду Chlamydia pslttaci - возбудителя хламидио-за индеек. — ■ - --------- -------------- ----------------

Выделенные изоляты "Егорьевский". "Джамбулекий". "Ерденевс-кий" в,нашей дальнейшей работе условно названы "ЕГ-б", "ДХ-7". "ЕИ", соответственно.

2. 3. Вирулентность выделенных изолятов "ЕГ-б" и "ДХ-7"

возбудителя хламидиоза индеек для куриных эмбрионов, белыг мышей и индюков

На куриных эмбрионах проведено г опыта. Зараженные куриные эмбрионы помешали в термостат при температуре 37 - 38°с и инкубировали 8-9 суток. Вирулентность изолятов "ДХ-7" и "ЕГ-б" изучали в сравнительном опыте.

Оба изолята оказались вирулентными для 6-7-суточных куриных энбрионов. Более вирулентнын оказался Изолят "ДХ-7". В повторном опыте были поюлены'аналогичные результаты, инфекционный титр изолята "ДХ-7" составил 5,5-6,0 lg э/Ш^/о. 2 см"*, а изолят "ЕГ-б" - 4,0-5.5 18 ЭЛД^/0,2 СМ5.

Вирулентность изолятов для белых нышей определяли путем ин-траназального или внутрибрюшинного введения культуральной сус-пенпии (титр изолята 10 lg 3/W^/cmj) в объеме 0,3 нл. В опыте использовали 10-12 мышей, мыши, как правило, заболевали на 3-4-и сутки. Болезнь проявлялась следующими симптомами: взъерошенной шерстью, адинамией и тремором. Хивотные обычно погибали на третьи и шестые сутки. При" вскрытии обнаруживали катаральную пневмонию, увеличение селезенки в 1.5-2 раза. На 3-4-ом пассажах отмечали стопроцентную гибель зараженных мышей, вирулентность хламидий определяли путей их титрования на здоровых мышах. Инфекционный титр изолята "ДХ-7" был всегда выше и достигал 4. 5 1в. а инфекционный титр изолята "ЕГ-б" не превышал 4.0 lg ЛД^/см"5.

Для подтверждения этиологической роли изолятаов в заболевании хламидиозом индеек были выполнены опыты на индюшатах.

Индюшат 3-месячного возраста разделили на 2 группы по. 12 голов в каждой. Для заражения использовали клеточную суспензию изолята "ЕГ-'С": с инфекционным титром 10 lg ЭЛД^/см3. суспензию вводили внутримышечно'в объеме 2 мл. Наблюдение за птицей проводили в течений суток. в первые 14 суток утром и вечером изме-

ряли температуру.

Первые признаки болезни в опытной группе проявлялись на 78-е сутки после заражения плохим аппетитом. На 8-10-е сутки у больной птиды отмечали ремитирующую температуру. В области образовывались катаральные струпья. Заболевшие индюшата сидели, были малоподвижны, отмечался слабый аппетит, но повышенная жажда. В сравнении с птицей контрольной группы, отмечалось отставание в росте и развитии.

Индейки контрольной группы, не подвергавшиеся заражению, были активны, хорошо поедали корм, повышения температуры не отмечалось. На 45-й день проводили контрольное взвешивание индюков опытной и контрольной групп. Результаты взвешивания показали, что за период наблюдения масса тела у индеек опытной (зараженной) группы снизилась и составила 505-1400 г против 2432-3525 г. - в контрольной не зараженной группе.

из 12 зараженных и заболевших индюков положительную НРСК на хламидиоз дали - 7 и сомнительную - 2 . Из 12 контрольных индюков положительно реагирующих не выявлено и только один - дал сомнительную реакцию.

Из органов убитых птид опытной группы удалось реизолировать хламидии в культуре ФЭК.

2. 4. Адаптация изолятов хламидий "Егорьевский" и

"Джамбулский" к монослою клеточных культур

для культивирования выделенных от индеек изолятов хламидий

использовали перевиваемые культуры клеток: мак-Коя, МДВК, линия

клеток Ь и первичная ФЭК.

На монослое клеток линии Ь было проведено три пассажа, а на

монослое ФЭК - 15 пассажей. Культуру клеток инкубировали при тем-0

пературе 37,5 с 8-9 суток в стационарных условиях. В качестве контроля использовали незараженные культуры клеток. За весь период наблюдения в зараженных культурах не отмечали цитопатического действия, однако, через 48 часов инкубации при окраске зараженного нонослоя методом Романовского-гимза в цитоплазме клеток обнаруживали округлой Формы гомогенные образования - Фагосомы. в которых просматривались 1-2 тельца хламидий. Инфекционный титр возбудителя, рассчитанный методом Рида и Кенча. в этих культурах не превышал 5. 5-б. о эда^/см*3.

В последующем мы использовали метод роллерного культивирования, надеясь на усиление адсорбции хламидий клетками, что должно

было привести к массированному заражению нонослоя и. в свою оче-______________

редь, к повышению титра возбудителя.

Контроль цитопатического действия хламидий в монослое проводили в течение 5 суток путем визуального просмотра культур под малый увеличением микроскопа.

Провели ряд последовательных пассажей. Изолят "ДЖ-7" проявил оитопатическое действие на пятом пассаже, изолят "ег-б" -на 7.

тканевое цитопатическое действие (ТЦД) хламидий проявилось через 72-96 часов в виде набухания (вздутия) клеток, образования синпластов, вытягивания в тяжи, округления клеток, проявления в них зернистости и отслоения от стекла отдельных участков и в конечном итоге сползания монослоя. Степень дегенерации монослоя оценивали в крестах. Уже на вторые сутки монослой приобретал молочный оттенок, затем разрывался, появлялись негативные островки, и при встряхивании смывался весь монослой. Одновременно производили оценку не зараженного хламидияни контрольного монослоя, затем проводили контроль на бактериальную и грибковую кантаминацию и брали усредненную пробу из Флаконов для последующего титрования на инфекционную активность.

Инфекционный титр хламидий в изолятах "Дэ:-7" и "ЕГ-б" составил, соответственно, 6,5 и 6,0 is ТДД^/О. 3 см-3. В последующих пассажах оба изолята сохраняли способность индуцировать цитопа-тический эффект, на нонослой ФЭК, который проявлялся в течение 72-96 часов инкубации.

Результаты опытов показали возможность определения инфекционного титра штаммов Chlamydia pslttaci методом тнд^/см-3. Этот метод мы использовали в своей дальнейшей работе.

Нам удалось адаптировать оба изолята к культуре клеток ФЭК. Изоляты приобрели новое свойство - цитопатическое действие на монослой клеток. Цитопатическое действие возбудителя сохранялось в течение 8 лет, за этот период даже повысился инфекционный титр, который составляет 8.25-9.25 lg TVM.^/chj.

Представлялось важным выяснить: сохранили ли полученные изоляты вирулентность для индеек после адаптации на култьуре ФЭК. с этой целью ны провели испытание вирулентных изолятов на 14-днев-

ных индюшатах. до начала'^пйй'а'^тица в течение 5 дней находилась под наблюдением, в ошл^бйли взяты 45 клинически здоровых индюшат. Они были, активны, *™%<>блйАа&и хорошим аппетитом. По принципу аналогов мы сформировали ^tWiñui: две опытные и одну контрольную (по 15 голов в каждой Я'"-¡йкдюшат первой опытной группы заражали культуральной взвее вю гкламйдий изолята "ДЖ-7" с инфекционным титром 8.0 le twJ^/ch^í1^ индюшат второй группы - взвесью хламидий изолята "ЕГ-б":' инфекционным титром т: 5 lg ТИД^/ сн3. заражение проводили notíHoUho в объеме о.5 мл. за индюшатами вели ежедневные клинические 'наблюдения. Контрольных индюшат не подвергали заражению и содержали изолированно.

У заболевших индюшат"'была116тмечена лихорадка, плохой аппетит. понос. в дальнейшем^рйзнУо! болезни прогрессировали: индюшата неуверенно держались ; начс;ногах, оставались долгое время в одной позе, появилась одышй.'"развивался конъюнктивит, перья становились тусклыми, грязнымй. слипшимися. На заключительной стадии болезни индюшата погийайй.йГ-5'в контрольной группе птипа оставалась здоровой в течейй§-аёее^йяпериода наблюдения.

Проведенные опыты йоёвбляй? нам сделать заключение о том. что штаммы хламидий "Д*Тв1>и "ЕГ-б" после длительного пассирования в культуре клеток ФЭКкб$Йранили вирулентность для индюшат.

2. 5. Антигенные и иммуногенные свойства изолятов

"ЕГ-б" и "ДЖ-7* возбудителя хламидиоза индеек

с целью изучения антйРенных свойств изолята "ДХ-7" и "ЕГ-б" гипериммунизировали голубей«''^пс^б голов в опытных и контрольной группах. Инмунизапию ийактавйрб'йанными изолятами "ЕГ-6" и "ДХ-7"

с титрон 5 lg ТЦД¿y/tu¿i проводили трехкратно подкожно с интер-

валом 3-е суток. Через ?204днёй^Ьсле инмунизации исследовали сыворотку в РСК со стандартным -гкламидио зным антигеном. Антитела в титрах 1:5, 1:10 были Обнару^ёнй5 спустя 20 дней после иммуниза-

ции и удерживались до 40 -дней'. 'Считая, что оба изолята обладали достаточно активными антйгеншВд? свойствами, мы продолжили исследования. опыт повторили ¡'С1 <1Шйя¥он "ДХ-7". получили аналогичные

результаты.. о нпбннхчч

Далее в опытах на:толУбйх'1'с('йо 4 в каждой группе) была опре-

делена зависимость иммУНад?ей8Ш>%ктивности антигена от его инфек-

ционного титра, в рек иссяешьали групповую сыворотку. Результа-

- 13 -

ты опыта сведены в таблицу 1.

Таблица 1

зависимость антигенной активности штамма "дх-7" от его инфекционного титра

н доза результаты исследования СЫВОРОТКИ

группы прививки крови ; голубей в РСК

(18 ТЦД ^/^3)

1:5 1:10 1:20

1 5, 5 + + + + + —

2 6. 0 + + + + + + + +

3 б, 5 + + + + + + + +

4 7. 0 + + + + <- + + + + + + +

5 7,5 + + + + + + +

б 6,0 + + + + + + + ♦ + + + +

Как следует из таблицы иммунный ответ коррелирует с величиной инфекционного титра: более высокие титры антител обнаружены в сыворотке крови голубей, привитых антигеном, имеющим титр 7,06,0 и ТВД^/г^З.

иммуногенные свойства штамма "ДХ-7" были проверен« ° на 4а индюках трехмесячного возраста весом 2,5 -3,0 кг. 24 индюка были привиты подкожно в объеме о. 5 мл инактивированной культурой штамма "ДХ-7" с исходным титром 7,5 1г ТПД^у^з. остальные 24 индюка составили контрольную группу. Спустя 20 дней после имнунизадии 12 опытах и 12 контрольных индюков заразили подкожно в объеме 1, о мл подтитроваяным полевым изолятом с титром 7,0 1 в ТОДл7/««.5. затем через 20 дней после введения вакцины заразили еше 12 привитых и 12 не привитых индюков. Результаты опыта представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2 штамм "ДХ-7" обладает выраженными иммуногенными и защитными свойствами, что позволяет предложить его для изготовления инактивированной вакцины.

Учитывая результаты изучения биологических свойств штамма "ДХ-7". его способность оказывать шщ на монослой культуры ФЭК и перевиваемые линии (Ь. МДВК, иак-Коя). а также уровень его анти-

Таблица г

Защитные свойства изолята "ДГ-7" для индюшат

Группа Реактогенность Результат заражения птиц вакцины 14 дней го дней

Иммунитет 14 дней 20 дней

Вакпини- отсутствует

3/9

0/12

частичный полный

рованная

Конт- отсутствует 12/0

12/0

0тсутст- отсутст-

рольная

вует

вует

Примечание: числитель - число заболевших

знаменатель - число не заболевших

генной активности, материал был представлен комиссии ВГНКИ ветеринарных препаратов на депонирование. При комиссионном испытании штамм "ДХ-7" согласно программе, утвержденной ВГНКИ ветеринарных препаратов, установили следующее:

1. Штамм "ДХ-7" относится к порядку Chlamydlales, семейству Chlamydlaceae, роду Chlamydia, виду Chlamydia pslttacl. вариант avis.

2. Штамм "ДХ-7" возбудитель хламидиоза - стерилен (не содержит бактериальной и грибковой Флоры).

3. Штамм специфичен, обладает антигенно-иммуногенной активностью. патогенный для б-7-суточных куриных эмбрионов, индюшат, морских свинок, белых мышей.

4. Штамм "ДЖ-7" адаптирован к культуре клеток, вызывает образование пито плазматических включений через 40 часов культивирования. проявляет цитопатическое действие.

5. Штамм "ДХ-7" возбудителя хламидиоза может быть использован в качестве производственного при изготовлении вакяин для специфической профилактики.

6. Леофилизированный штамм "ДХ-7" хранится в группе по изучении хламидиозов в скзниви.

Таким образом, нами получен производственный (вакцинный) штанм "ДХ-7" возбудителя хламидиоза индеек.

Изучена его антигенная и иммуногенная активность. Разработана технология накопления биомассы хламидий с высоким титрон в

- 15 -

культуре клеток ФЭК при роллерном культивировании.

Данный нетод характеризуется высокой экономичностью, предотвращает рассеивание хламидий во внешней среде. Выход биомассы хламидий при данном методе культивирования увеличивается не ме-нее, чем в 10 раз по сравнению с ее выходон при использовании методики культивирования в куриных эмбрионах. Полученные данные явились основанием для создания культуральной инактивированной вакцины против хламидиоза птид. Разработан проект НТД на изготовление вакпины.

ВЫВОДЫ

1. На птицефабриках "Егорьевская" Московской области. "Ер-деневская" калужской области, "Мырзытайская" Казахстана выявлен хламидиоз индеек среди всех возрастных групп.

2. Изоляты "ДХ-7" и "ГХ-б" адаптированы к монослою первично трипсинизированных клеток Фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) и перевиваемых линий: L, МДВК, Мак-Коя. При культивировании в условиях роллера изоляты приобрели способность оказывать выраженное цитопатическое действие на монослоя испытанных культур клеток. Эта способность изолятов стойко сохраняется при длительном пассировании. Наиболее активен штамм "ДХ-7".

3. Адаптированные к монослою клеточных культур штаммы хламидий "ДХ-7" и "ГХ-б" обладают антигенно-иммуногенными свойствами, которые коррелируют с величиной инфекционного титра возбудителя. Более активен штамм "ДХ-7".

4. Впервые расчет инфекционного титра возбудителя хламидиоза индеек предложено проводить по 50?.-ному тканевому питопати-ческому действию на монослой культур клеток (ТЦД^ /см3).

5. Штамм "ДХ-7" возбудителя хламидиоза индеек семейства Chlamydlaceae. рода Chlamydia, вида Chlamydia psittacl. варианта avis депонирован во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов в качестве производственного (вакпинного) для изготовления вакцины против этого заболевания (регистрационный номер 23-ДЕП).

6. Разработан способ накопления биомассы штамма Chlamydia psittacl "ДХ-7" в ионослое клеток ФЭК в условиях роллера в больших объемах.

- 16 -

Практические предложения Получен вакцинный штамм "ДХ-7" возбудителя хламидиоза индеек в культуре клеток ФЭК для использования в технологическом процессе для изготовления культуральной инактивированной вакцины (описан в патенте, регистрационный номер 95И03695).

Публикации

1. щербань Г. Н. Диагностика хламидиоза индеек: ИнФорм. листок / Нежотраслевой территориальный центр науно-технической информации и пропаганды. 1907. - 2с.

2. Шербань г. Н. Выделени культур хламидий от индеек // Эпизоотология. эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики болезней обших для человека и животных: Материалы Всесоюзн. конф. - Львов, 1900.

3. Пигалкина В. В. , Щербань г. П., Кравченко Т. ф. , Щербань Г. Н. Ультраструктура хламидий, выделенных от сельскохозяйственных животных и птиц // Там же.

4. Данченко г. н. , шербань г. п.. Кравченко т. Ф. - справка о депонировании штамма "ДХ-7" возбудителя хламидиоза индеек микроорганизма семейства Chlamydlaceae, вида Chlamydia psittacl, вариант avis / СКЗНИВИ - Новочеркасск. 1993. Регистрационный номер 23-ДЕП во ВГНКИ стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, 1993.