Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ВЫДЕЛЕНИЕ ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВ ИЗ «БЕЗВИРУСНЫХ» ОПУХОЛЕЙ ЖИВОТНЫХ

всесоюзный ордена ленина институт

экспериментальной ветеринарии Всесоюзной ордена Ленина академии сельскохозяйственны* ___наук имени В. И. Ленина

На правах рукописи

Аспирант ЗАЛЕВСКИИ Дмитрий Иванович

ВЫДЕЛЕНИЕ ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВ ИЗ «БЕЗВИРУСНЫХ» ОПУХОЛЕЙ ЖИВОТНЫХ

(16.00.03—ветеринарная вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

о

А

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ Всесоюзной ордена Леннна академии сельскохозяйственных наук имени В. И. Ленина__

На правах рукописи

Аспирант ЗАЛЕВСКИИ Дмитрий Иванович

ВЫДЕЛЕНИЕ ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВ ИЗ «БЕЗВИРУСНЫХ» ОПУХОЛЕЙ ЖИВОТНЫХ

(16,00. 03—ветеринарная вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ЫосхсБсиоЗ

. Работа выполнена в комплексной лаборатории по изучению лейкозов и злокачественных опухолей сельскохозяйствен-нмх;жыв9тдых Всесоюзного ордена Ленина института экспери- ■ . ментальной ветеринарии '(директор—заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, академик ВАСХ-, НИЛ, профессор Я. Р. КОВАЛЕНКО), ■. \.V.: ■ : .'■■

Материалы диссертации изложены на 203 страницах машинописного текста, из них;.2 стр. — введение, 36 — обзор литера-' туры, 13 — матераилы и методы, 90 — собственные исследования, 16 :— обсуждения и выводы. Диссертация нллюстрирова- v на 14 таблицами, 2 схемами и 39 фотографиями. Список использованной литературы включает 339 источников, в.том чис- . ": ^ . ле 195 иностранных авторов.

Научный руководитель —кандидат биологических наук : : б. и, сурйН;- ■' ':/."■:;,■ " ::.л '. -у/.

1 Научный консультант — кандидат ветеринарных наук Л. С. РАТНЕР. . .'.;,'..

Официальные оппоненты;

1. Доктор биологических наук, профессор С Я- ЗЛЛКИНД.

! ; 2. Доктор .биологических наук, профессор

П. А. СЕРГЕЕВ! С / V ' ■ ' ■

' Ведущее учреждение — Украинский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии. ,

Автореферат разослан « » tisyy € . 1975 г.

Защита диссертации состоится « ^f » CSs^s/J^ 1975 г. : в 14 часов на заседании специализированного Ученого совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ве* > теринарнн {109472, Москва, Ж-472, Кузьминки, ВИЭВ).

Ученый секретарь Совета ВИЭВ »

" ' кандидат биологических наук В. В. КАЛУГИН.

ВВЕДЕНИЕ

' KfK раздел вирусологии, занимающаяся

изучением возбудителей опухолевых процессов, возникла в начале этого столетия. Но долгие годы со зремеш? открытня онкогенвых вирусов у. птиц (Ellerman, Bang, ]908ГроиГюП) попытки выделить онкогенные вирусы у млекопитающих были безуспешными. И только в 1932-1933 ^SeSie^"

SSSySS^Sr-этим сущесТвован^ SoTbбедующим важным

теор1Ш "Расхождения опухолей

- Sl JIn £уса рака молочных желез мышей (Bittner. тУ и вируса лейкоза мышей (Gross, 1951)

11 ^Р°сса способствовал» быстрому раз-' ! '^следовании в этом направлении. В результате в ко-

, .роткни срок было выделено большое'количество н0ВЫх вирусов вызывающих различные типы лейкозов и опухолей мы-

7<$¡ КР^ (Shope' I932> 1933, 1955° Gross, 1951

1953, 1957; Thurzo et al-, 195Ü; Graffi, 1957; Stewart Eddv 1957

к« TqrÍ'm0^ mr19^' Kaplan et al., 959; H Е Мазурен-В°'н г1? ПпУ' 96.0; Sweet' HiUeman, I960; Rauscher?1962 п Т1П1,.,15.'лЛ- А■ 3"льбер, 1963; Buffet et al 1964 Jarret ffÄ 19675 Churhî"> Biggs,

,(ССладова«™ получилн широкое • J дах благодаРя исключительному успеху в

области общей вирусологии и накоплению новых фактов в 3'еНТаЛЬНОЙ онкологии, свидетельствующих о том что ерся>в![?русать СП0ПТа1|НЫХ опухолей млекоп1таЦ„°х Гызыва

4roßBHDvcMbT^L?=0^feHHb,X !,сслеД°ааннй было установлено, к 77НКУ,? 0нВЛадаюЩ11е оикогениымн свойствами, относятся к ДНК и РНК содержащим группам; вирусы грулпы «паоо-

компл?ксГРУСЫ' ГеРПеСа' °СП" й л ей козно - с арко м^тозно го

"ств? полТтт^пВпРепМ^ИМеЮТСЯ многочисленные доказательства роли вирусов в образовании опухолей v kvd мышей

крыс, однако, вопрос о значении вируса, как этио^гическо™

фактора, в генезе новообразований человека, крупного рогатого скота, свиней, овец и других видов животных остается. не решенным. Выделение ^онкогенных вирусов, в особенности ДНК-содержащих, с помощью общепринятых вирусологических методов из опухолевых или трансформированных клеток обычно не удается. Разработанные методы выделения вирусов из «безвирусных» опухолей имеют низкую разрешающую способность. Это побуждает исследователей к совершенствованию . имеющихся и разработке новых методов выделения вирусов из опухолей. '■ ■ -'

- В последние годы для этих целей чаще применяют методы -смешанных культур и гетерокарионов (Harris, Waíkins, 1965; Koprowski et al., ]967;Watkins, Dulbecco, 1967; М- Талаш, 1968; В. Я. Шевлягин, 1968г 1973;Harris, iiÜ; Watkins, 1970 и др.), , Из анализа состояния проблемы выделения онкогенных вирусов следует,'что для ее разрешения необходимы дальнейшие поиски методов выделения вирусов из «безвирусных» опухолей и трансформированных клеток, что позволит найти доказательства вирусной природы опухолей у тех видов животных, для которых роль вирусов в возникновении новообразований не доказана. Учитывая вышеизложенное, перед нами были поставлены следующие задачи: '

1. Изучить размножение и. накопление вируса полиомы н обезьяньего вируса 40 в чувствительных культурах клеток," .' 2. На золотистых хомячках и мышах различных линий изучить в динамике онкогениое действие вируса полиомы и обезьяньего вируса 40. Выяснить условия культивирования опухолевых клеток, индуцированных вирусом полиомы : и обезьяньим вирусом 40, in vivo iTíri vitro.

.*'■■■ 3. Изучить возможность выделения онкогенных вирусов из «безвирусных» опухолей различными вирусологическими.методами, в том числе ¡i методами смешанных культур,

4. Выяснить возможность применения гетерокарионов, полученных из опухолевых клеток и чувствительных культур клеток,для выделения вируса полиомы и обезьяньего вируса 40 из -«безвирусных» опухолей.

МАТЕРИАЛЫ И .МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

. В работе были использованы вирус полиомы SE |шт. 2510), обезьяний вирус 40 (шт- 128), вирус парагриппа 1 (шт. Сен-дай).

„ В опытах использовали лервичнотрипсиннзированные культуры клеток и их субкультуры: мышиной эмбриональной, тка-

'ИЛ (МЭТ), хомячковой эмбриональной ткани^(ХЭТ), почки зе-.леной мартышки (ПЗМ), почки 2—3 месячных телят - (ПТ), почки эмбриона коровы (Г1ЭК). культуры опухолевых клеток, приготовленных как из первичных опухолей, индуцированных .'вирусом полномы н ОВ<о, так н перевиваемых опухолей мышей !| хомячков. !

Первнчнотрипсннлзнрованные культуры клеток ПТ, ПЭК получали из лаборатории культуры тканей н питательных сред ВИЭВ, а культуры клеток ПЗМ — из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР. Культуры опухолевых клегок, МЭТ, ХЭТ готовили путем трнисннизации эмбрионов . мышей и хомячков по общепринятым методикам. Субкультуры 'из монослоя первичнотрипснннзнрованных клеточных культур' получали безцентрифужным методом. Для культивирования клегок МЭТ, ХЭТ, ПТ, ПЭК использовал» 0,5% гидролизат лактальбумнна (ГЛА) на растворе Хэнкса, а опухолевые клет-. ки и культуры клеток ПЗМ культивировали на среде Игла, содержащей о—10% сыворотки крупного рогатого скота и аи-, тибнотики (100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина на 1 мл среды). Вирус полномы культивировали в МЭТ, вирус 'ОВ»0 в культуре клеток ПЗМ. Материалом для заражения .■служила впруссодержащая культуральная жидкость предыдущего пассажа, осветленная центрифугированием при 1000 об/мин. в течение 10—15 мин.

Адсорбцию вируса проводили в течнене 60—90 минут при После удаления неадсорбированного вируса вносили поддерживающую среду 199 с содержанием 2°/о сыворотки крупного рогатого скота п инкубировал и При 37° до наступления . цнтопатогенного действия у 75—90% культуры клеток.

Для изучения морфологии опухолевых клеток н динамики размножения вируса полномы и ОВ<0 в чувствительных культурах клеток, суспензии клеток тканей выращивали па покров-пых стеклах в пепнцпллнновых флаконах. Препараты окрашивали по Романовскому-Гимза.

Вирус парагриппа I (штамм Сендай) культивировалн в хориона лл а нто иеной полости 9 суточных куриных эмбрионов в течение 48 часов.

Вирусы ОВ<о и полиомы титровали в чувствительных культурах клеток, выращенных в пробирках. Титр вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в логарифмах (1§/ТЦДзо/мл). Вирус полномы титровали также и в реакции гемагглютинацин (РГА) с 1% взвесью эритроцитов морских свинок при 4°, а вирус Сендай — в РГА с 1% взвесью эритроцитов кур при комнатной температуре.

В опытах использовал» новорожденных, взрослых, в том

числе и беременных, золотистых хомячков, мышей; линий Сз7 ВЬ, СБА, ЛКК н белых беспородных. • • V; --л;-

■ В и р усс п е циф и чес к не ант йсы во р от ки получали * гипериммунизацией кроликов породы шиншилла (3—3,5 кг) культураль-цымн вирусами с использованием полного)адыованта:Фрейн--

При изучнеии оикогенных свойств вируса полномы и ОВ^; заражали животных в возрасте не позже 24 часов после рождения подкожно по 0,1—0,2 мл вируса с тигром в реакции ГА 1:256—1:512 (вирус полиомы) и 7,2—7,4 ]£ ТШД^мл. (вирус-

ов«0). . ■■;■ I .". ; :

/ Трансплантацию опухолей проводили следующим образом: из опухолевой ткани, полученной в стерильных условиях, механическим путем приготовляли клеточную взвесь, ■ подсчитывали количество клеток в 1 мл с помощью камерыТоряева н вводили подкожно животных по 0,15—20 млн. клеток- Патологический материал для гистологических исследований фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Гистологические препараты готовили с использованием; целлоидиновой проводки и окрашивали гематоксилин-эозином, ; '"* ... Гистологический анализ материала проведен доктором ветеринарных наук Т. П. Кудрявцевой. _ ' ' V- ■'.';.

Дли выделения вирусов из «безвирусных» опухолей животных использовали обычный вирусологический метод, методы наслаивания опухолевых клеток на монослой чувствительных культур.клеток, кокультнвирования н гетерокарпоиов.. Л

При обычном вирусологическом методе приготовляли бесклеточные экстракты опухолей на среде 199, которыми зара-: ; жали чувствительные культуры клеток (МЭТ, ПЗМ)*: ";

Взвесь клеток, полученную путем трипсинизации опухолей, индуцированных вирусом полномы и ОВ40, вносили ; на монослой чувствительных культур клеток. В 50 мл флакон с выросшим монослоем клеток МЗТ, ПЗМ вносили 1—1,5 млн. опухолевых клеток, ■ '■ ' ■ ■; ■

При выделении вирусов методом кокультнвирования опухолевые клетки во взвеси смешивали с чувствительными'клеточными культурами в равных количествах, после чего их культивировали совместно в течение 5—12 суток. Через 5— 9 суток культивирования проводили следующий ■■ пассаж , со 'свежими чувствительными культурами клеток. Так проводили по три последовательных пассажа. Культуры клеток МЭТ и ; ПЗМ ежедневно микроскоп ирова л и с целью выявления ЦПД вирусов, а для выделения вируса полномы культуралъные жидкости, полученные в различные сроки совместного культивирования опухолевых клеток и культур клеток МЭТ, исследовали в реакции ГА- '-■ V -■ • б \

;■■■ Выделенные вирусы. пол номы и ОВ^'идентифицировали, в .. реакции нейтрализации (РН) с использованием кроличьих ги-пернммунных сывороток, Полученных нами в лаборатории , лейкозов и злокачественных опухолей ВИЭВ н кроличьей сывороткой против вируса ОВ«о серии 1575/72, приготовленной.в' Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.' Вирус полномы также идентифицировали в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА).

В опытах по получению гетерокарнонов использовали , культуры клеток МЭТ, ПЗМ, ПТ, ПЭК и клетки опухолей, нн-.дуцировапных вирусом полиомы и ОВ<0 по методу, предложен-, ному Harris, Watkins (1965). Гетерокарионы получали при помощи инактивированного вируса Сендай с титром его в реакции ГА 1:2048—1:20480. Вирус Сендай концентрировали на ультрацентрифуге при 60.000 g в течение 1,5 часов и инак-тивировали бетапропиолактоном. Через каждые 8 часов в течение первых суток культивирования и в последующем через каждые 24 часа готовили препараты, которые фиксировали метиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза п мик-.роскопировали. > . .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ВИРУСА ПОЛИОМЫ SE

Культивирование вируса полиомы в однослойных культурных клеток МЭТ, ПТ, ПЭК, ХЭТ и титрование его в реакции гемагглютинации. После заражения культур клеток МЭТ вирусом полномы на 4—5 сутки в отдельных участках монослоя ■отмечались единичные темные включения в ядрах, зернистость цитоплазмы, сморщивание клеток, а к 8—11 суткам в дегенеративный процесс вовлекались все клетки монослоя. Однако, полного разрушения всех клеток МЭТ вирусом полиомы не отмечали. Наивысший титр вируса (1:512—1:1024) .в куль-туралькой жидкости зараженных клеток МЭТ устанавливали в РГА на 8—11 сутки после заражения, а более низкие титры (1:16—1:32)—на 4 и 21 сутки. При заражении культур ■клеток ПТ, ПЭК, ХЭТ видимых изменений клеток монослоя jie отмечали (срок наблюдения 24 дня). В культуральных жид-■.нострях зараженных культур клеток ПТ н ПЭК, ХЭТ, взятых в различные сроки культивирования и нз различных пассажей, вирус полномы в реакции ГА не был обнаружен, что согласуется сдагишми Y. Brodsky, Rowe et al., (1959), Ф. И. Аджигн-:това (1964) и др. Всего было проведено 24 опыта по культиви\ рованшо вируса полиомы в МЭТ, который в данной культуре

: прошел 7 пассажей, 3 опыта в культуре клеток ПТ, 3 — в"культуре клеток ПЭК и 4—в культуре клеток .ХЭТ. В реакции ГА,, было исследовано ЭЗЭ'проб культуральных жидкостей. ■ •■.

Изучение онкогеняых свойств вируса пол и о мы на белых» беспородных мышах, мышах линий Сет, ВЬ, СВА,/ АКИ и зо-/ лотистых хомячках. Было поставлено 2.опыта по заражению^ 10. белых беспородных мышей вирусом полиомы (срок наблюдения 420 дней). Первый опухолевый узелок был обнаружен, через 180 дней после заражения, через 210 дней опухоли воз-никлн у 22,2%, через 240 дней — у. 33,3%, через 290 дней — у 55,5%, через 360 дней — у.77,7.% животных. Опухоли »мели округлую форму, не срастались с окружающими тканями,: локализовались подкожно в различных участках тела. "

На мышах линии С^ ВЬ было поставлено 8 опытов и заражено однократно 77 мышей вирусом полиомы и двукратно1 18 мышей с интервалом в 24 часа (срок наблюдения 274 дня)."; При клиническом осмотре.и последующем вскрытии изменений, характерных для неопластнческпх поражений органов и., тканей, установлено не было, что согласуется с данными, . И. С. Ирлика (1964), 3. И. Мерекаловой (196б>.

В 8 опытах на 130 мышах линии СВА изучали онкогенные: свойства вируса полпомы (срок наблюдения 420 дней). Первая опухоль возникла через 160 дней после заражения; через. 210 дней опухоли обнаружили у 10%, через ■ 300 дней — у . 26,6%,,через 380 дней — у 40%, через 420 дней — у 56,6% животных от числа'переживших срок появления 1-ой опухоли-Опухоли в 82% локализовались в подкожной клетчатке, в ; брюшной полости — 11,8%, грудной полости —: 5,9% . случаев. ■ При совместном содержании в течение 420 дней контрольных—' интактных мышей с зараженными, у контрольных животных.' опухолевые поражения обнаружены' не были. %

■ Было поставлено ■ )0 опытов на 55 мышах линии АКК по-изучению оикогенных свойств вируса полпомы (срок наблюдения 427 дней). Первый подкожный опухолевый узел появился через 130 дней после заражения, а через 269 дней опухоли возникли у 16,1%, через 315 дней —у 33,3%, через 360 дней— у 52,1%, через 427 дней —у 73,6% животных. В 64,2% случаев опухоли локализовались подкожно, в 28,5% отмечалось поражение сердца и легких н в 7,1% —на серозных покровах брюшной полости.

: Он ко генные свойства вируса пол номы изучали в 9 опытах на 89 золотистых хомячках,. Первые опухолевые узлы,*обна-' руживалн через 30—35 дней после заражения, через 90 дней; опухоли возникли у 72,2—78,2%, через 360 дней — у' 82,6—' 83,3й/» животных. Опухоли локализовались в подкожной, клет-8

чатке'в 54,5 —66,6%, в сердце— 26,6%, в легких —33%, в селезенке — 6,6%, . в печени — 13,3% случаев. Часто отмечали одновременное поражение "опухолями под— кожной ; клетчатки " и нескольких органов. Животные с опухолями во внутренних органах были малоподвижными, отмечалось их истощение и отставание в росте. В большинстве случаев обнаруживали множественные > опухоли, из которых 1—3 наблюдали при жизни животных, а остальные (10 и более) при вскрытии трупов. Опухоли быстро увеличивались в размерах н достигали 5—6 см в диаметре. Хомячки, носители подкожных опухолей, в течение 30—35 дней были под-1 важными, аппетит сохранялся, ухудшение общего состояния н гибель животных наступала через 45—60 дней после обнаружения опухолевых образований.

Культивирование in vitro u in vivo опухолевых клеток, индуцированных вирусом лолиомы. Культивированию in vitro было подвергнуто 8 первнчнопндукцпрованных опухолей - vi 7 опухолей различных пассажей (5—11 пассаж) и, приготовлено на покровных стеклах 150 препаратов. Через 48 часов., после засеза опухолевые клетки прикреплялись к стеклу, начиналось их деление п к 96 часам они образовывали сплошной монослой. Клетки имели звездчатую, веретепоподобную форму. Опухолевые клетки, культивируемые in vitro, после подкожного введения животным в дозах 0,1—3 млн- клеток индуцировали через 9—12 дней у Ю0"/о животных на месте введения опухоли.

В 33 опытах было проведено 14 пассажей клеток опухолей на 128 хомячках. Взвесь клеток, полученную путем механического измельчения ткани опухоли, вводили в дозе 0,05 — 20 млн. клеток хомячкам в возрасте 2 суток, 21 дня, 45 дней н взрослым хомячкам. Срок появления опухолевых узелков в 1-м пассаже равнялся 68—90 дням, во втором пассаже — 30 дням, в третьем пассаже—18 дням н в 6—12 пассажах — 8—9 Дням. Перевиваемые опухоли увеличивались в размере быстрее по сравннеиго с первнчнопндуцнрованиымн опухолями ¡i нередко достигали величины ? 1,5—2 раза превышающей величину хомячка. Гибель животных наступала иа 25—35 день после появления опухолей. Попытки трансплантации опухолей с мышей различных линий на хомячков и наоборот, без использования. пммунодепрессоров, не дали положительных результатов.

Гистологическая характеристика опухолей, индуцированных вирусом полиомы. При патологоанатомическом вскрытии трупов и гистологическом исследовании органов золотистых > хомячков, мышей линии СБА, AKR, белых беспородных мышей обнаруживали опухоли различной величины в подкожной

клетчатке, в сердце,'предсердии, легких, почках. С ^поверхности опухоли имели гладкий вид, плотной консистенции, на раз-резв- были серо-белого цвета, иногда с точечными кровоизлкя-: ,,ниямн и некротическими из мнениями в центральной части. На основании типа роста и морфологии клеточных элементов опухоли, индуцированные вирусом.полиомы, у мышей линии СВА, AKR, белых беспородных и хомячков были охарактеризованы как апгнофибросаркомы. У мышей линии Се7 BL в "органах и ; тканях изменений; характерных для неопластических заболе-: ваннй, установлено не было. " ,;; " ■ *■ ..-г-

V Опухоли, пассируемые in vivo, характеризовались теми же . гпстоморфологическими особенностями, что и первичноинду-цироваиные. Гистологическому исследованию был подвергнут, патматериал, полученный от 26 мышей, различных линий и /17 хомячков, зараженных вирусом полиомы. ■■'.'. " 1

2. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ОБЕЗЬЯНЬЕГО ВИРУСА 40 :К: ■ (ОВ<0>

i . Культивирование вируса ОВчо in vitro и его титрование по, цитопатсгенному действию. Всего было проведено 16 опытов ; по культивированию вируса ОВ<о в культуре клеток ПЗМ- Проанализировано 150 препаратов, приготовленных на покровных стеклах через 24, 48, 72, 96 часов и более после заражения вплоть до полного разрушения монослоя клеток. В культуре . клеток. ПЗМ вирус ОВ<о прошел 4 пассажа и накапливался в

титрах 7,2—7,4 1¿ ТЩис'мл..' ' 1 ......* " ."'.f

Обезьяний вирус 40 культивирвалн в культуре клеток почки зеленой мартышки. Вначале, после заражения клеток ПЗМ. вирусом ОВ<о, наблюдалось увеличение ядер, принимающих .шаровидную форму. На 3—4 сутки в цитоплазме "отдельных клеток.образовывались мелкие вакуоли, а иногда в 5—6 клет-" ках, находящихся рядом. На 7—8 сутки 4—8 мелких вакуолей' сливались" друг с другом. К 9—10 дню почти все клетки моно-' слоя подвергались дегенеративным изменениям и к 11—12 сут-' кам сохранялись лишь отдельные островки их. Полное разру-" Диение клеточного монослоя наступило на 13 сутки. ■'

'-'■'.; Обезьяний вирус 40 титровали в пробирочных культурах клеток ПЗМ. Установлено, что при малых заражающих дозах дегенерация клеток носила вначале очаговый характер, затем в этот процесс вовлекались все клетки монослоя. Каждое последующее десятикратное разведение вируса удлиняло'наступление ЦПД на 2—3 дня. Наибольшее накопление вируса, в культуральной жидкости отмечалось с б по 11—13 сутки после заражения культур клеток . и составляло ■ -7,0—7,3 lg

ТЦДзо'мл: 10

■Изучение онкогенных свойств вируса r0B<¿; Было проведено^-8 опытов на 55 новорожденных хомячках (срок''наблюдения ; ■.' 465"дней). Хомячков заражали в первые 24 часа после рожде-: ' ; ния подкожно в области лопаток введением ОД—0,2 мл вируса. \ ' ; ; Через 120 дней после заражения' была обнаружена первая опу-,-холь в подкожной клетчатке размером 0,5 см в диаметре. . ; По истечении 180 дней опухоли отмечали у 21,5%, через . 240—у 61,66%, через 300 дней —у 65,3%, через ,365 дней — у,

■ " 76%, через 465—у 88,44»/о подопытных, животных; Опухоли, ии-:

7 дуцировапные вирусом OBío, быстро увеличивались в размере и ' через 45—60 дней после их обнаружения достигали 5X6X4 см,-а иногда превышали размеры хомячка.в 1,5—2 раза. Разраста-■.'■■■■• кие опухолей вызывало истощение животных и их гибель че-'.

■ рез 60—90 дней после обнаружения опухолевых узел кос, кою-' ' рые локализовались в подкожной клетчатке в области спины,

шеи, боковой поверхности туловища и имели плотную коней-:, ; стенцпю и, как правило,'не прорастали подлежащие тканиГ'' . - Опухолевые узлы с поверхности были гладкими или1 бугристы-" V '■ ми, строго округлой, либо продолговато-приплюснутой формы, окружены соединительнотканной капсулой. •

. : Культивирование in vitro и in vivo опухолевых клеток, им- : ' дуцированных обезьяньим вирусом 40. Материалом для полу" -чения взвеси опухолевых клеток служили подкожные опухо- / левые узлы-величиной & лесной орех,, как первнчноиндуциро- *

■ .ванные вирусом ОВ<о, так и перевиваемые опухоли 2—12 пас- .

■ сажей. Через 24—48 часов культивирования in vitro, опухоле-. ^ ' ■-, вые клетки прикреплялись к стеклу и начинали размножаться.

Клетки, полученные из^опухолей, индуцированных вирусом,' ■ ОВ-ю, были намного крупнее и более полиморфными, по срав-i -' нению с культурами клеток, полученными из полномных опу-, холей. К; 10—12 суткам культивирования невооруженным гла-. '■ зом на-степках флаконов были видны фокусы: многослойного ;

■ роста в виде белосерых утолщений . (бугорков) размером от 0,2—0,4 до 1—2 мм в диаметре. Рост клеток, имел различную ' направленность, их.форма' была- неоднородной — вытянутые,., i

' веретен on одобные, звездчатые. В культурах отмечали большое,

■ число многоядерных клеток, ' содержащих от 3 до 15 ядер.;, ; Культуры опухолевых клеток поддерживались in vitro в течение 2 месяцев и проходили по 6—8 пассажей.: Всего было-подвергнуто трипсинизации 15 опухолей й приготовлено на' по-, .'

7 кровных стеклах 150 препаратов. Опухолевые клетки, культи-

■ , - вируемые in vitro в течение 2-х месяцев, были-введены десяти'

взрослым и семи 5—16 суточным хомячкам .подкожно в дозе, . 0,15—5 млн. клеток, Через 9—11 суток обнаруживали опухоли ' на месте введения клеточного материала у 100% зараженных • ■■'-"" - 7 ' ■ V : ' 1 ■ . ' " ,:.V - II .

животных. Существенной разницы в сроках возникновения опухолей у новорожденных и взрослых хомячков не установлено. "'','•• , На 60 хомячках проведено 14 пассажей опухолевых клеток, нидуцирозанных обезьяньим вирусом 40.-В первом пассаже каждому хомячку было введено подкожно по 20. млн. опухолевых клеток. Через 21 день на месте введения развились, мелкие, округлой формы опухолевые узелки, которые быстро увеличивались в размере и приводили животных к гибели по истечении 2 месяцев. В последующих пассажах число вводимых клеток одному хомячку уменьшали до150 тысяч и, несмотря на это, латентный период возникновения опухолей сокращался и составлял: в пятом пассаже—10—12 дней, в двенадцатом — 7—9 дней. При этом опухоли увеличивалисьв; размерах намного быстрее, чем в лервх пассажах, и достигали 4X4,5 см в диаметре. Смерть животных наступала на 30—45 день после обнаружения опухолевых узелков.

Патоморфол огическаи характеристика первичных и перевиваемых опухолей. Опухоли, нндуцнрованные обезьяньим вирусом 40, были гладкими или бугристыми, плотной консистенции, на разрезе серо-белого цвета с некрозом в центре. Гистологически исследован пат. материал от 6 хомячков с первкчно-нндуцпрованпымн н 8 хомячков с перевиваемыми опухолями.

При гистологическом исследовании опухолей, индуцированных вирусом О В «о, отмечали клетки фибробластического ряда, образующие диффузные поля, В таких опухолях обна; ружнвались сннусоидные образования венозного типа, имеющие неодинаковую форму н величину. Кроме того, закономерно отмечали некрозы в центре опухолей с полным лизисом клеток. В отдельных участках опухолей обнаруживали серозный отек и, как следствие этого, фпбробласты лишались син-цитиальной связи. Основным отличием опухолей хомячков, индуцированных вирусом ОВ«о от полномных, являлось наличие гигантских многоядерных клеток, которые образовывали скопления во многих участках ткани. В зонах некроза они принимала, вид бесформенных комочков хроматннового вещества-

Таким образом, опухоли, индуцированные вирусом ОВ^, можно охарактеризовать как ангнофнбросаркомы. Пассируемые опухоли на хомячках, по своему морфологическому строению не*отличались от первнчпонидуцпрованных опухолей вирусом ОВ<о. Пассируемые опухоли обычно имели вид четких, резко ограниченных образовании, располагающихся на месте введения клеточного материала. При выраженном росте центральные зоны опухолей подвергались общим некротическим

изменениям, где.не выявлялось каких-либо структурных элементов клеток и сосудов; -■ ' ' '-'7'' ■ • - ■.'.■-;

3. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА МЫШИНОЙ ПОЛИОМЫ 5Е И ОБЕЗЬЯНЬЕГО ВИРУСА 40 ИЗ «БЕЗВИРУСНЫХ» Ч Г; : * ОПУХОЛЕЙ . - ' ;..'./:

. Для1 выделения вирусов нз опухолей, индуцированных вирусом пол ломы н обезьяньим вирусом 40, были использованы методы . кокультивировання, наслаивания опухолевых клеток на моиослой чувствительных культур клеток и исследование бесклеточных экстрактов опухолей в чувствительных культурах клеток. ■ , ' " ■:*; 1 '. .■ '. ■':< "■ ■ -,■ \ :' Опыты по выделению вируса полиомы ЗЕ из первичноинду-цированных и перевиваемых опухолей.^ Выделение вируса'полиомы проводили из'двух опухолей; мышей лкшш АКЯ и белой беспородной, из сем1Гиервнчнопндуцнрованных и шести перевиваемых, опухолей золотистых хомячков!

Из тканнопухоли приготовляли бесклетйчные экстракты, заражали ими культуры клеток МЭТ и вели наблюдение в течение 7—12 дней.'Затем культуральную жидкость вносили в свежую культуру клеток МЭТ. Так проводили последовательно.по 3 пассажа бесклеточных экстрактов. Отбор культураль-ных жидкостей-зараженных.культур клеток для дальнейших пассажей и исследований в реакции гемаггл юти нации производили в различные сроки культивирования {5—12 сутки): Культуральные жидкости зараженных,'культур клеток нссле-' довали в реакции ГА с эритроцитами морских свинок на наличие вируса полномы. Реакция ГА была отрицательной. Из опухолей,мышей и хомячков выделить вирус полиомы этим методом не удалось. . ' -

В опытах, по выделению вируса "полномы методом наслан-, вання клеток опухолей на монослой.культуры,клеток МЭТ бы-, ли использованы, те же животные, которые подвергались исследованию с целью выделения вируса полиомы из бесклеточных экстрактов опухолей. "'■'

. В 50 мл флакон с выросшим; монослоем.клеток МЭТ вноси? ли по;1 —1,5 млн. первичнотрипсйнизировэнных^клеток опухо? ли и культивировали их в течение 7—12 суток. Через 5—Э дней-из монослоя приготовлял» взвесь смешанной культуры клеток, и вносили на свежий моиослой клеток МЭТ. Так было проведено три последовательных пассажа опухолевых клеток, ин-у дуцированных вирусом полиомы. Пробы" культуральной- жид-кости исследовали в реакции ГА, которая была отрицательной-,

1а

/Методом 'наслаивания опухолевых клеток на 'монослой ■куль-■■'туры клеток МЭТ выделить вирус не удалось. V: : ' . '.■-.-Для выделения вируса полиомы методом кокультивирова-" иня было проведено одновременное культивирование/первнч-:' нотрипсннлзнрованных клеток опухоли и: клеток*МЭТ. Клетки , соединял» во взвесив равных количествах, доводили их концентрацию до 500 тыс. в 1 мл и культивировали при 37е. После ' ■5—9 дневного совместного культивирования из выросшего мо; нослоя приготовляли взвесь клеток, смешивали ее со свежими . .клетками МЭТ и засевали во флаконы. Так было проведено . трн'пассажа опухолевых клеток с клетками МЭТ. Культу-/ ральные жидкости из 1—3 пассажей кокультнвнрования хо-; ■ мячковых опухолевых клеток и мышиных клеток исследовали в реакции ГА, а культуры клеток ежедневно подвергали мнк-■.;. роскопнрованню с целью выявления цнтопатогенного действия вируса.

;/ Совместным культнвированнем опухолевых клеток и клеток МЭТ вирус полномы не был выделен ни в одном случае из 13 исследованных опухолей хомячков.

! При исследовании опухолей мышей кокультивированием опухолевых клеток и клеток МЭТ во втором пассаже отмеча- ■ - ■ лось слабое ЦГ1Д в отдельных клетках, реакция ГА была от-' : рицательной. В третьем пассаже отмечалось четкое ЦПД, а; - культуральные жидкости агглютинировали эритроциты морских свинок в разведениях 1:2—1:8.

' Вирусы, выделенные из опухолей мышей, линии АКК и бе.. лон беспородной, были идентифицированы в реакции нейтра- ' "лизацин (РН) на культуре клеток МЭТ и реакции задержки , гемагглютннацнн (РЗГА) с кроличьими гипериммунными сыворотками и оказались идентичными исходному вирусу полиомы БЕ.

.■-.."' Выделенный вирус был изучен на онкогенность. Было за. ражено 7 хомячков в первые сутки после их рождения. Через 60 дней (срок наблюдения) у 3-х пз 7 хомячков были обнаружены опухоли, которые ло своему морфологическому строению были охарактеризованы, как ангиофибросаркомы".

Выделение обезьяньего вируса 40,из «безвирусных» опухолей- Выделение вируса ОВ*о проводили на культуре клеток ПЗМ из: 8 первичноиндуцированных и 4 перевиваемых (2 ону-..■:/■' холи первого пассажа и по одной 5 и 8 пассажей) опухолей • ..золотистых хомячков.

. Культуры клеток ПЗМ заражали бесклеточными экстрактами опухолей н вели наблюдение в течение 7—12 дней. Через.' . 9 дней после заражения, культуральную жидкость, свободную от клеток, вносили в свежую культуру клеток ПЗМ. Так И '

проводили последоательно 3 пассажа.*;1 Культуры 'клеток ежедневно мш'.роскопировалн с целью выявленияЦПД вируса. ОВад' на клетки ПЗМ. Из; 12,исследованных опухолей хомячков вирус ОВ^о ни в одном,случае выделен не был. '"

В последующем первичнотрнпспннзированную взвесь кле-: ток опухоли наслаивали на\монослой клеток ПЗМ.: Через 5— 9 дней:из монослоя клеток приготовляли смешанную клеточную взвесь и'снова вносили на свежую культуру клеток ПЗМ.. Так было проведено три последовательных пассажа опухолевых- клеток на культуре клеток ПЗМ. В первом пассаже характерного ЦПД вируса в культуре клеток ПЗМне отмечали.. Во втором, пассаже в "двух случаях была обнаружена вакуолизация клеток ПЗМ. В. третьем пассаже на 12 сутки кокульти-' 'вирования клеток опухоли и ПЗМ было выявлено характерное ЦПД еще в одной исследуемой опухоли. '.■'■'■ ;

-'■'.■"■ Таким образом, методом наслаивания клеток опухоли на монослой клеток ПЗМ, вирус ОВ<обыл выделен в трех случаях из'. 12 исследованных первнчноиндуцированных : опухолей

хомячков.;. ....;...'.".! '••'• •• ' - ■■■;

•' При совместном кокультнвнрованни клеток-опухолей, индуцированных вирусом ОВч и культур клеток ПЗМ в первом пассаже характерной вакуолизации клеток ПЗМ не было ус: тановлено, . ■ ■ • . . _. ;;

Во втором пассаже на 5—9 сутки кокультнвирования клеток 5 исследуемых первнчноиндуцированных опухолей с клетками ПЗМ отмечалось характерное для вируса ОВ+о ЦПД. В третьем пассаже характерное ЦПД было выявлено еще в 'трех случаях; В одном случае ЦПД отмечалось при исследовании первичноиндуцированнсй' опухоли хомячка п в двух случаях из пассируемых опухолей первого пассажа.

■■V Таким-образом, вирус ОВ<о был выделен в результате наслаивания, клеток опухолей на монослой чувствительных клеток »методом кокультнвирования клеток опухолей и клеток ПЗМ в 9 случаях из 12'исследованных «безвирусных» опухолей золотистых .хомячков.: :; •'.

Вирусы, выделенные нз опухолей золотистых хомячков, в : реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток ПЗМ с кроличьими гипериммуными сыворотками, оказались идентичны^ ми исходному вирусу ОВ<о (шт. 128). ..;.;'- '■■',.

: Выделенный вирус ОВ40 был изучен на онкогенность,; Перед заражением животных вирус прошел два.пассажа в куль-;туре клеток ПЗМ: Было заражено 18 хомячков в первые сутки после рождения. Через 120 дней после заражения были обнаружены первые подкожные опухоли. Через 230 дней (срок на-

/блгодеиня) опухоли были обнаружены у 87,5% хомячков. По , ^своей морфологии они был» идентичны опухолям, нндуциро- . .ванным исходным вирусом ОВ<о (шт. 128).

4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ГЕТЕРОКАРИОИОВ

ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ ИЗ «БЕЗВИРУСНЫХ»

ОПУХОЛЕЙ

. Культивирование вируса Сен дан в куриных эмбрионах, его -титрование, концентрирование и ннактивирование. Было про-, ведено 9 опытов с использованием 165 куриных эмбрионов по культивированию вируса Сендай в аллантонсной полости 9 суточных куриных эмбрионов (КЭ). Из одного КЭ получали по '-6—10 мл вируссодержащей аллантонсной жидкости. Титр вируса колебался в пределах 1:2048 —1:4096, В реакции ГА было исследовано 165 проб вируса. Каждую пробу проверяли на бактериальную контаминацию путем высева на мясо-пептонныи бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА) и среду Китт-Тароцци. После осаждения вируса на ультрацен- -трнфуге при 60- ООО g, осадок ресуспепд провал и в среде 199 с таким расчетом,-чтобы его концентрация в реакции ГА равнялась 1:20480—1:40960. Установлено, что после проведения инактивации вируса Сендай гемагглютннпрующне свойства его сохранялись, а инфекционные полностью утрачивались. При заражении КЭ инактивированным вирусом Сендай его реактивации не установлено.

Получение гетерокариоиов из культур клеток МЭТ, ПЗМ, ПТ, ПЭК и клеток опухолей, индуцированных вирусом полио-мы и обезяньим вирусом 40. Всего было проведено 14 опытов по получению гетерокариоиов из клеток опухолей, индуцированных вирусом полномы, обезяньнм вирусом 40 и культур клеток МЭТ, I13AÏ. В опытах были использованы первнчно-индуцнровашше и пассируемые in vivo (1—10 пассажей) u in vitro (1—3 пассажей) опухоли. Установлено, что в тех случаях, когда для слияния клеток применял» вирус Сендай с титром в реакшгн ГА 1 :20480 и выше, и культурами клеток, адаптированных к росту in vitro гетерокариоиов образуется значительно больше. Через 7 часов после засева клеточной взвеси in vitro, в препаратах отмечали образование и прикрепление к стеклу многоядерпых клеток, максимальное количество которых прикреплялось к стеклу к 24 часам их культивирования. Эти клетки сохраняли жизнеспособность в течение 5--7 суток,.затем они начинали отслаиваться от поверхности ■стекла. Очень редко отмечали жизнеспособные многоядерные клетки на —10 сутки их культивирования in vitro. Гетерока-Л6

:рионы состояли из .1—3 ядер опухолевых клеток и 2—10 и бо-"лее ядер культур клеток МЭТ, ПЗМ^Ядра опухолевых клеток1 более, интенсивно окрашивались по Романовскому—-Гимза -и были крупнее, чем ядра клеток МЭТ, ПЗМ, Гетерокарионы культивировали на среде Игла с содержанием 10—20% сыворотки крупного рогатого скота...-...-. - ; ' ' Л . Было проведено 2 опыта по изучению возможности получе-■ння-гетерокарионов из клеток опухолей, индуцированных ви-. .русом полиомы II О В н клеток, в которых эти вирусы не.раз-, множаются (клетки по^ки теленка и тимуса эмбриона коровы ) -Уст а но в л е но , что независимо от видовой принадлежности 'клеток действие инактивированкого'вируса Сендай приводит . закономерно к образованию гетерокарнонов. -

- - Всего было приготовлено на покровпых стеклах й проанализировано 400 препаратов.

- Получение-многоядерных клеток (гетерокарнонов), состоявших из ядер'клеток различной видовой принадлежности, подтверждается рядом исследователей/ проводящих опыты по по. лучению гетерокарнонов с использованием культур клеток меченых Н3 — тимидином' (Harris, Watkins, 1965; Watkins, Dul-■becco, 1967; Marin,-1969; Harris, 1970; Watkins, 1973);

Опыты по изучению возможности выделения вируса полиомы и обезьяньего вируса 40 из «безвирусных» опухолей методом гетерокарнонов. Было исследовано 4 хомячковых опухоли, первциноиндуцированных вирусом нолномы, одна опухоль хомячка 4 пассажа и две опухоли 10 пассажа. После получения гетерокарнонов, их культивировали in vitro в течение 7—12 су-ток. Через 5—9 суток культивирования гетерокарнонов in vitro :культуральной жидкостью заражали клетки МЭТ и таким пу* тем проводили три последовательных пассажа. Культуры клеток ежедневно микроскопировали для выявления ЦПД виру--са,- а культур а льные жидкости иследовалн в реакции, ГА, которая была отрицательной. ' ■

Ш;рус полиомы ни ,в одном случае.из 7 исследованных хомячковых опухолей не был выделен. ■

Методом гетерокарнонов исследовали 5 хомячковых опухолей первнчноиндуцлрованпыя вирусом ОВ*0 и по одной опухоли 3 и 5 пассажей. Исследования по выделению вируса ОВ*о проводили с использованием культур клеток ПЗМ. В первом пассаже опытные культуры клеток не отличались от контрольных. Во втором пассаже на 5—7 сутки, в культурах .клеток ПЗМ, зараженных культуральной жидкостью гетерокарнонов, отмечали в одном случае дегенеративные изменения клеток ПЗМ и в двух случаях включения в клетках, В третьем пасса-уже дегенеративные изменения были выявлены еще в двух слу-

■чаях на 5—7 сутки после заражения клеток, ПЗМ культураль-ной жидкостью 2 пассажа. : ' ■ ' : :

7 Несмотря на то, что в культурах клеток ПЗМ во втором и третьем пассажах отмечали дегенеративные изменения и включения в цитоплазме и ядрах меток, выделить вирус ОВ<0 в активной форме из «безвярусных» опухолей хомячков методом гетерокарнонов не удалось,1.

ВЫВОДЫ

1, Вирус пол номы размножается в культуре клеток мыши; ной эмбриональной ткани (МЭТ) с проявлением цитопатоген-ного действия (ЦПД). В культуре клеток почки теленка (ПТ), почки эмбриона коровы (ПЭК) вирус полиомы не размножается, Вирус полномы обладает гемагглютннирующими свойствами и агглютинирует эритроциты морских свииок при 4". В культуральных жидкостях МЭТ, зараженных вирусом полиомы, он накапливается в тптрах (в РГА) 1 :512— t : 1024. \ 2. Вирус полиомы индуцирует опухоли; у мышей линии СВА — в 56,66%, линии AKR— в 73,6V», белых'беспородных мышей — в 77,7% случаев при сроке наблюдения за подопытными животными от 360 до 427 дней. Латентный период возникновения первых опухолей у мышей колебался от 130 дней (линии AKR) до 180 дней (белых беспородных). МЫшн линии C57BL оказались устойчивыми к онкогенному действию вируса полиомы.

3. Вирус полиомы индуцирует опухоли у 83,3% золотистых хомячков при сроке наблюдения за подопытными животными в течение 360 дней. Латентный период возникновения первых опухолей у хомячков равнялся 30—35 дням,

4. Обезьяний вирус 40 (ОВ<о) размножается в культуре клеток почки зеленой мартышки '(ПЗМ) и вызывает ЦПД, характеризующееся вакуолизацией клеток и накапливается в

: культуралыюи жидкости в титрах 7,2—7,4 Ig ТЦДзо/мл.. v 5. Вирус ОВн0 индуцирует опухоли в подкожной клетчатке-золотистых хомячков в 88,44% случаев (срок наблюдения 465 дней) при латентном периоде возникновения первых опухолей— 120 дней.

6. Гистологически опухоли ,индуцп ров энные вирусом полиомы и обезьяньим вирусом 40, представляли собой ангио-фибросаркомы.

При подкожном введении обезьяньего вируса 40 опухоли обнаруживались лишь в подкожной клетчатке на месте его введения. Вирус полиомы, введенный подкожно новорожденным мышам и хомячкам, индуцировал опухоли; в подкожной t8

клетчатке 54,5—82»/»,-в брюшной- полости 7,1—13,3%, в легких 5,9—33,3 %; в" сердце — 26,6 %1 ¿л у чаев;":'' * ;" 1 1 -'■"■■.'■;.■ л.:; 7* Рпухолевые клетки, индуцированные э и р у сом пол номы и ■обезьяныш вирусом 4,0, культивируются in vitro в течение длительного периода с сохранением онкогенных свойств для жи: вотных. При пассировании^опухолей in.vivo отмечается со;■ крашение периода от момента введениягклеток до возникновения опухолей". Латентный период возникновения полиомных ■опухолей в первом пассаже равнялся 68—90 дням, во втором— 30 дням/в третьем^ 18-. дням! И; с шестого^, пассажа — 10— 12 дням. При пассировании опухолей, индуцированных вирусом ОВчо/.татентный""период " в' первом" пассаже " равнялся 21;дню";в пятом—10—12'дням, в'двенадцатом— 7 — 9 дням.

, 8. При пассировании на культурах клеток МЭТ и ПЗМ бесКлеточных экстрактов" о пух олей, индуцированных вирусом полиомы, обезьяньим вирусом 40 и пассируемых in vivo, вирусы не'были выделены" *■'"■ '■ - ■ ■ ■ ■ ■■-■-• ■

V* 9; Методами наслаивания опухолевых клеток на монослсй клеток МЭТ и ко кул ьт и в й ро в а ни я вирус полиомы из первично-индуцированных и пассируемых опухолей хймячков выделить не удалось. -■•■...

10. Из первичных'опухолей мышей, индуцированных вирусом полиомы, при совместном культивпровании клеток опухолей и мышиной эмбриональной ткани был выделен вирус полиомы в двух случаях.

11. Методами кокультивнрования и наслаивания клеток опухолей, полученных как из первичноиндуцированных, так и пассируемых опухолей на монослой клеток ПЗМ. обезьяний вирус 40 был выделен из «безвирусных» опухолей хомячков в 75% случаев. ■

■ 12. Из клеток опухолей, индуцированных вирусом полиомы и обезьяныш вирусом 40, и культур клеток ПЗМ, МЭТ, ПТ, ТЭК при помощи ннактивированного вируса Сендай были получены гетерокарионы, состоящие из 1—3 ядер опухолевых, клеток и 1—10 и более ядер одной из культур клеток (ПЗМ, МЭТ, ПТ, ТЭК).

Методом гетерокарионов выделить активный вирус полиомы и обезьяний вирус 40 из «безвирусных» опухолей не удалось.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ

Полученные результаты дают основание рекомендовать методы сметанных культур для проведения исследований по выделению вирусов из опухолей животных с целью доказательства их роли в этиологии опухолевых заболевании.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Онкогенные свойства вируса полиомы 5Е Ж- «Доклады БАСХНИЛ*, 1974, № 12, стр. 36 (в соавт. с Т. П. Кудрявцевой) .

2. Об онкогенном действии вируса ОВ^. Ж- «Ветеринария», 1975, № 1, стр. 39—40.

Материалы диссертации доложены на заседании Ученого-Совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии. Москва, 1975, январь.

Ответственный за выпуск автореферата — кандидат биологических наук Б. И. Сурин.

Тираж 150

Зак. 602

Типография Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринар ной академии им. К. И. Скрябина