Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Вирусы папиллом человека при раке мочевого пузыря: методы детекции, частота обнаружения, морфологические и клинические особенности заболевания

На правах рукописи

Головина Дарья Андреевна

ВИРУСЫ ПАПИЛЛОМ ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАКЕ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ: МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ, ЧАСТОТА ОБНАРУЖЕНИЯ, МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

ЗАБОЛЕВАНИЯ

Специальность 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005539365 2 7 НОЯ 2013

Москва-2013

005539365

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН) (директор — академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Всеволод Борисович Матвеев

доктор биологических наук Галина Михайловна Волгарева

Официальные оппоненты:

Александр Васильевич Карпухин доктор биологических наук, профессор,

ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН, заведующий лабораторией молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний

Анна Александровна Лушникова доктор биологических наук, ФГБУ

«РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, ведущий научный сотрудник

лаборатории онкогеномики НИИ канцерогенеза

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России

Защита диссертации состоится « 13 » fjg.(CCt)^X'2Q 13 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук (Москва, 115478, Каширское шоссе, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук (Москва, 115478, Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан «<£>Ь> Iica.Q 0 |»ч£2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

По последним оценкам, каждый пятый случай злокачественного новообразования человека возникает с участием инфекционного агента — вируса, бактерии, паразитического гельминта. Около 70 % таких случаев ассоциировано с вирусами. Согласно прогнозам, квота онкологических заболеваний, причинно связанных с инфекционными агентами, может в будущем достигнуть ~ 35 %.

Вирусы папиллом человека (ВПЧ) определенных типов, т.н. типов высокого риска, являются этиологическими агентами рака шейки матки (РШМ), а также рака влагалища, полового члена, ротовой полости и некоторых других форм злокачественных опухолей. Перечень форм рака, в возникновении которых доказано участие ВПЧ, постоянно пополняется. Вопрос о роли ВПЧ в возникновении инвазивных карциномам нескольких локализаций остается открытым; именно к этой категории международные группы экспертов относят и рак мочевого пузыря (РМП).

ВПЧ двух типов высокого онкогенного риска, 16-го и 18-го, обнаруживаются в -70% образцов РШМ; помимо них признаны канцерогенами для человека ВПЧ одиннадцати типов: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 66; еще для восьми типов ВПЧ получены ограниченные свидетельства их капцерогенности. Для превращения нормальной клетки, зараженной ВПЧ высокого риска, в раковую необходима экспрессия вирусных генов Еб и Е7. Кодируемые ими белки взаимодействуют со многими белками клетки, участвующими в контроле пролиферации, апоптоза, репарации генома и других важнейших процессов жизнедеятельности; в результате нарушается нормальное функционирование этих клеточных белков.

Для онкологической клиники в этой связи важно следующее. Все формы рака, в возникновении которых доказана роль ВПЧ типов высокого риска, этиологически гетерогенны: только определенная часть карцином ротовой полости, вульвы, полового члена возникает с участием ВПЧ, другая же часть опухолей той же локализации ВПЧ-негативна. В каждом из этих органов, включая шейку матки, ВПЧ-позитивный рак отличается от ВПЧ-негативного по молекулярно-биологическим, гистологическим и клиническим характеристикам.

Несмотря на сравнительно невысокую заболеваемость РМП в России (ниже средних европейских показателей), Россия отнесена экспертами ВОЗ к группе стран с высокой смертностью от РМП, причем высокие показатели смертности обусловлены

всецело высокой смертностью среди мужчин, - в большинстве регионов она выше максимальных показателей смертности в странах, представленных в статистике ВОЗ.

Известно много факторов, повышающих риск развития РМП. К их числу относятся: географическое положение, профессиональная деятельность, курение, характер питания, применение определенных лекарств, паразитарное заболевание, вызываемое гельминтами из рода Schistosoma.

До недавнего времени РМП выявлялся в основном у пожилых людей, но в последние годы наметились тенденции к его «омоложению», которая сопровождается изменением характерного для данной формы рака спектра молекулярных маркеров, что может указывать на появление новых факторов риска его развития, в т.ч. инфекционных агентов.

Вопрос о том, принимают ли участие ВПЧ типов высокого риска в уротелиальном онкогенезе, длительное время остается предметом дискуссий. Отсутствие единого мнения - результат систематического несовпадения данных, получаемых разными исследовательскими группами при детекции ВПЧ в раковом уротелии. Так, Международная группа экспертов отобрала более двадцати работ, выполненных в 1991-2001г.г. в разных лабораториях мира; доля ВПЧ-позитивных образцов РМП в этих сообщениях варьировала в пределах от 0 до 83%. В качестве вероятных причины такой неоднородности данных исследователи обычно упоминают объективную этно-географическую неоднородность РМП и методические особенности работ.

Изучение участия ВПЧ в генезе РМП актуально и в теоретическом, и практическом плане. В настоящем комплексном исследовании впервые на группе российских больных РМП получены ответы на следующие вопросы: способны ли известные биологические канцерогены, ВПЧ, участвовать в канцерогенезе эпителия особого типа, - уротелия, и, если да, то влияет ли ВПЧ на клинические особенности РМП? Результаты исследования представляют практический интерес: они важны для совершенствования способов профилактики РМП (например, с помощью профилактических прививок мальчиков вакцинами, разработанными для профилактики РШМ), для обоснования поиска новых молекулярных маркёров, а также для индивидуализации методов лечения РМП.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в проверке гипотезы о возможной ассоциации ВПЧ типов высокого риска с возникновением РМП.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг образцов уротелия на присутствие ДНК ВПЧ, определить тип вируса в позитивных образцах (в случае обнаружения таковых).

2. Исследовать экспрессию онкогенов Еб и Е7 ВПЧ в ДНК-ВПЧ-позитивных образцах на уровне мРНК и белка.

3. Исследовать экспрессию клеточного белка рI б'УЫа в образцах уротелия мочевого пузыря. Оценить возможную ассоциацию между гиперэкспрессией белка р16™к4а, являющегося ранним диагностическим маркёром папилломавирусного канцерогенеза в эпителии шейки матки, и ВПЧ-позитивностью РМП.

4. Сопоставить особенности клинического течения ВПЧ-позитивного и ВПЧ-негативного РМП.

Нуачная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.

Впервые на значительной выборке (101 образец РМП) проведена проверка гипотезы, согласно которой вирусы папиллом человека могут быть причастны к злокачественному превращению уротелия мочевого пузыря. Впервые для изучения данной проблемы использован комплексный подход: присутствие вирусного материала оценивали на трех уровнях: ДНК ВПЧ (в полимеразной цепной реакции), РНК, соответствующей онкогенам ВПЧ (методом ПЦР с обратной транскрипцией) и онкобелка Е7 ВПЧ (иммуногистохимическим методом).

В результате проведённой работы получены подтверждения участия ВПЧ16 (основной тип вируса, вызывающий РШМ) в злокачественном перерождении эпителия мочевого пузыря. Впервые проведена проверка применимости клеточного белка р161КК4а в качестве маркера ВПЧ-позитивного РМП.

Вопрос о том, являются ли такие сильные канцерогены как ВПЧ типов высокого риска (в первую очередь - по отношению к клеткам эпителия шейки матки) также канцерогенами для уротелия мочевого пузыря, представляет фундаментальный интерес. Результаты работы должны учитываться и в

практической онкоурологии: они позволят усовершенствовать методы профилактики, диагностики и лечения РМП.

Апробация результатов работы.

Работа прошла апробацию 16 апреля 2013 года на совместной конференции урологического отделения, централизованного клинико-лабораторного отдела, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток и лаборатории онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.

Материалы работы были представлены в виде стендовых докладов на Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), а также на нескольких международных конференциях и съездах, в т.ч. на Международном противораковом конгрессе (Швейцария, Женева, 2008) и на 25-й Международной конференции по папилломавирусам (Швеция, Мальме, 2009).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список использованной литературы и приложения. Работа изложена на 128 страницах машинопистного текста, включает 10 таблиц и 18 рисунков, в том числе Приложение с 3 таблицами. Список литературы содержит 143 источника.

Обзор литературы.

В Первом разделе Обзора литературы изложены современные представления о

группе вирусов папиллом и, в частности, о канцерогенных ВПЧ. В следующем

разделе проанализированы достаточно противоречивые сообщения о возможной

ассоциации ВПЧ с РМП; особое внимание уделено анализу причин такой

противоречивости. Как показал анализ, наряду с объективной этно-географической

неоднородностью РМП основной причиной несовпадения данных, опубликованных

разными исследовательскими группами, являются методические особенности этих

работ: малые размеры проанализированных выборок, использование единственного

6

метода детекции ВГТЧ (как правило - ПЦР или гибридизации in situ), отсутствие попыток подтвердить экспрессию вирусного генома в ВПЧ-позитивных образцах. В результате проведенного анализа стала очевидной целесообразность комплексного подхода к решению вопроса о возможной ассоциации ВПЧ с РМП, а именно, желательность подтверждения экспрессии генома ВПЧ на уровне мРНК и белков в ДНК ВПЧ-позитивных образцах РМП (в случае обнаружения таковых). При планировании работы представлялось актуальным включить в комплекс методов, среди прочих, детекцию клеточного белка pl6INK4a (этот белок является маркером ВПЧ-индуцированного канцерогенеза в эпителии шейки матки). В этой связи третий раздел Обзора литературы посвящен феномену гиперэкспрессии белка р 1 бПЧК4а в эпителии, зараженном ВПЧ высокого риска.

Материалы и методы.

Образцы РМП получали после трансуретральных резекций (ТУР) мочевого пузыря, в урологическом отделении ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН». От 10 больных РМП получили также образцы условно-нормального уротелия мочевого пузыря. Образцы нормального эпителия неонкологических больных получили из Городской клинической больницы №4 г. Москвы (диагнозы: ишемический инфаркт мозга, 2 случая; гипертоническая болезнь, 1 случай; атеросклероз, 1 случай).

В целом собранная коллекция включала 101 образец ракового уротелия мочевого пузыря (84 мужчины, 17 женщин, возраст от 35 до 84 лет), 10 образцов условно-нормального уротелия, 4 образца нормального уротелия неонкологических больных. В качестве референс-материала использовали 2 образца рака предстательной железы, которые получили в патологоанатомическом отделении отдела патологической анатомии опухолей человека ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН», в качестве положительного контроля - клеточную линию рака шейки матки SiHa, содержащую ДНК ВПЧ16, а также 3 образца РШМ, содержащих ВПЧ 16, 18 и 31 типов (коллекция лаборатории молекулярной биологии вирусов ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН»), В качестве отрицательного контроля в иммуногистохимической части работы использовали культивируемые клетки линии HCT 116 рака толстой кишки человека (коллекция лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН»),

Были использованы следующие методы исследования:

выделение ДНК и РНК из образцов тканей гуанидинизотиоцианатным методом с центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия; метод полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с несколькими видами литературных праймеров к генам И и Е7 ВПЧ; основными в этой части работы были реакции с праймерами Му09/11 и ОР5-ОР6: первые использовали в виде рабочих смесей олигонуклеотидов, специфичных к 7 наиболее часто встречающимся типам ВПЧ (6Ь, 11, 16, 18, 31, 33 и 35), вторые - в виде двух олигонуклеотидов, позволяющих амплифицировать наиболее консервативную часть генома ВПЧ и при низкой температуре отжига выявлять разнообразные типы папилломавирусов, включая до настоящего времени не описанные; при постановке ПЦР руководствовались Методическими рекомендациями по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР [Полимеразная цепная реакция (ПЦР). НПФ Литех, Москва. - 1997. - 16 стр.].

электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле; рестрикционный анализ (для определения типа вируса); получение радиоактивно-меченных зондов, проявление ПЦР-продуктов с помощью радиоактивного зонда;

метод обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР);

иммуногистохимическое окрашивание антителами к Е7 ВПЧ и к р16Е>1К4а; анализ данных историй болезни;

статистическая обработка результатов, с ипользованием критерия Вилкоксона - Манна — Уитни и критерия Стьюдента.

Результаты

1. Скршшнг образцов РМП па наличие генетического материала ВПЧ; определение типа вируса в положительных образцах.

При анализе 101 образца РМП в ПЦР с праймерами Му09/11 вирусная ДНК была выявлена в разных случаях, в зависимости от комбинации типоспецифичных праймеров в составе рабочей смеси, в 24-38 случаях (24-38%). Предварительно все эти праймеры мы апробировали в ПЦР с образцами ДНК РШМ. содержащими ВПЧ известных типов; полученные при этом результаты свидетельствовали о наличии некоторой неспецифичности у смесей, в состав которых входили праймеры к ВПЧ 3), 33 и 35 типов.

Для 52 образцов РМП мы провели ПЦР с праймерами ОР5-ОР6: при этом в 16 образцах была выявлена ДНК ВПЧ. Все образцы, положительные по результатам ПЦР с праймерами ОР5-ОР6, были положительными и в реакции с праймерами Му09/11, т.е. имело место 100%-е совпадение результатов скрининга. На рис. 1 представлены результаты ПЦР с двумя видами праймеров. Му09/11 и ОР5-ОР6.

Таким образом, на этом этапе мы обнаружили ДНК ВПЧ в значительной части образцов РМП.

СР5-6Рб

. . ■ ^^^

1 17 7 26 13 9 2 Отр.к.

|Ь» : 140 Ьр

Му09/11 7 26 13 9

450 Ьр

Рисунок 1. Результаты электрофореза продуктов ПЦР с праймерами ОР5-ОР6 (верхняя панель) и МУ09/11 к ВПЧ типов 6Ь, 11. 16 и 18 (нижняя панель) для семи образцов РМП. На электрофореграммах указаны номера образцов (здесь и далее номера образцов соответствуют единому их обозначению, принятому в Диссертации). «Отр.к.» - отрицательный контроль: рабочая смесь без матрицы.

Определение типа вируса мы провели по методу Аз(:оп О., ... Бе УЛНеге Е.-М. (1997), основанному на анализе длин продуктов рестрикции фрагмента ДНК, полученного в ПЦР с праймерами Му09/11. Результат типирования ВПЧ для одного

из позитивных образцов РМП представлен на Рис. 2. Оказалось, что все 38 исследованных образцов РМП содержали ДНК ВПЧ 16 типа.

577ТВПЧ16

Н(пП

30» Ь]> ыш

452 Ьр

ЗВ1» 1.р

4?2 Ьр

Р5А1

6Ь 63 73 149 160

11 26 73 134 216

18 38 73 85 134

33 38 73 101 236

3511 42 73 160 170

16 ГО 73 309

31 73 380

*

НтП

6Ь 214 235

11 214 235

31 215 238

33 214 235

16 452

18 455

3511 453

Рисунок 2. Результат определения типа ВПЧ в образце РМП. В таблице -ожидаемые размеры продуктов рестрикции для наиболее распространенных типов ВПЧ. Слева - результаты рестрикции ПЦР-продуктов, полученных с праймерами Му09/11, рестриктазами Я8А1 и НтГ1. Последовательность треков: 1). Продукт до рестрикции его Я8А1; 2). Он же после рестрикции Я8А1; 3). ДНК-маркёр с шагом 100 Ьр; 4). Продукт до воздействия НтП; 5). Он же после воздействия НтП. Размеры рестрикционных фрагментов для образца РМП №15 (нижняя часть электрофореграммы) и ВПЧ16-позитивного образца РШМ (позитивный контроль, верхняя часть рисунка), идентичны.

Достаточное для исследования количество ДНК нам удалось выделить из 4 образцов нормального уротелия мочевого пузыря, полученных от неонкологических больных. При их скрининге в ПЦР с праймерами Му09/11 в 2 образцах был найден генетический материал ВПЧ. В обоих случаях при типировании путем рестрикции ПЦР-продуктов подтвердилось присутствие ДНК ВПЧ 16.

2. Изучение экспрессии вирусных онкогенов Е61Е7 на уровне мРНК в ВПЧ16-позитивных образцах РМП

Известно, что в результате сплайсинга РНК, транскрибируемой с ранней области генома ВПЧ 16, образуется несколько сплайсированных РНК. Транскрипт гена Е6 часто подвергается сплайсингу, тогда как полноразмерная мРНК гена £7 присутствует практически во всех типах РНК ВПЧ. В большинстве случаев продукты

ПЦР, получаемые с праймерами к гену Еб (позиции в геноме 421-540) и Е7 (позиции 701-845), соответствуют разным участкам единой молекулы РНК. Поэтому в дальнейшем данные, полученные в ОТ-ПЦР с праймерами к двум этим онкогенам, мы объединили.

Экспрессию гена Еб ВПЧ16 на уровне мРНК изучили в 35 ДНК-ВПЧ16-позитивных образцов, а также в 7 негативных образцов. Из 35 исследованных образцов РМП, содержащих ДНК-ВПЧ16, в 10 (29%) была зафиксирована экспрессия онкогена Е6 ВПЧ16 на уровне мРНК (Рис. 3). Ни в одном из 7 ДНК-ВПЧ16 негативных образцов мы не наблюдали экспрессии гена Еб. В 7 ДНК-ВПЧ16-позитивных образцах была зафиксирована экспрессия гена Е7 ВПЧ16.

1 2 3 4 5 6 7 62 9 20 24 27 вЖа отр.к М

Н^ьр Е6ВПЧ16

62 9 20 24 27

450 Ьр

=*="- вАРОН

Рисунок 3. Результаты ОТ-ПЦР с праймерами к Еб ВПЧ16 для пяти образцов РМП.

Верхняя электрофореграмма: 1, 3, 4 и 5 треки - образцы РМП, в которых зафиксирована экспрессия Е6\ 2 трек - образец РМП, в котором не обнаружилось транскрипта Е6\ 6 трек - продукт амплификации ДНК из клеток 81На (ВПЧ16 -позитивный РШМ); 7 трек - отрицательный контроль (реакционная смесь без кДНК).

Нижняя электрофореграмма: результаты ОТ-ПЦР на матрице РНК с праймерами к гену ОАРОН.

3. Экспрессия белка Е7 ВПЧ 16 в образцах РМП

Иммуногистохимическую детекцию белка Е7 ВПЧ 16 мы провели в 26 образцах РМП; образцы включили в эту выборку безотносительно к их ДНК ВПЧ- статусу. Положительная реакция была зарегистрирована в 9 из 26 образцов РМП (35 %). В двух случаях окрашивание было диффузным (окрашено не менее 25% клеток, - Рис. 4 д, з), в семи - фокальным (Рис. 4 в, е). В одном случае

наблюдалась как ядерная, так и, - в отдельных клетках, - исключительно цитоплазматическая локализация белка Е7 (Рис. 4 е).

В обоих исследованных образцах условно-нормального уротелия иммуногистохимическая реакция оказалась негативной (как и в образцах РМП от тех же больных) (Рис. 4 ж), однако в 2 из 4-х образцов уротелия от неонкологических больных было отмечено диффузное окрашивание уротелия Е7 -специфичной сывороткой (Рис.4 и). В обоих изученных образцах рака предстательной железы Е7 ВПЧ16 не экспрессировался. Результаты иммуногистохимической детекции онкобелка Е7 ВПЧ16 в опухолевых и нормальных тканях суммированы в таблице 1.

Таким образом, мы подтвердили присутствие в опухолевых клетках больных РМП вирусного онкобелка Е7 ВПЧ16. Он был обнаружен только в ДНК-ВПЧ16-позитивных образцах.

Таблица 1

Результаты окрашивания образцов ракового и нормального уротелия мочевого

пузыря антителами к Е7 ВПЧ16.

Материал Всего образцов Количество образцов, в которых наблюдалась положительная реакция с антителами к Е7 ВПЧ16* Образцы, в которых наблюдалась негативная реакция с антителами к Е7 ВПЧ16*

диффузная фокальная

Образцы РМП 26 2(2) 7(7) 17(11)

условно-нормальный уротелий больных РМП 2 0 0 2 (н. о.)

нормальный уротелий неонкологических больных 4 2(2) 0 2(0)

референс-группа: рак предстательной железы 2 0 0 2 (н. о.)

* - в скобках: среди них ДНК ВП416-позитивных.

н.о. - не определяли

Рисунок 4. Онкобелок Е7 ВПЧ16 в раковом и нормальном уротелии мочевого пузыря. Окрашивание Е7 ВПЧ16-специфической поликлональной сывороткой, докрашивание гематоксилином.

а. Рак шейки матки (позитивный контроль). 400х

б. Клетки культуры НСТ116 (рак толстой кишки). Негативная реакция. 200х

в. Переходно-клеточный РМП. Фокальное окрашивание. 400х

г. Переходно-клеточный РМП. Негативная реакция. 200х

д. Переходно-клеточный РМП. Диффузное окрашивание. 400х

./ % »'к.

« , •. V? V ч

»

' г ' -.О

V Ч» л

.'.а*,; А'"

:/ г} „Лл-<

* V I \ I • » ч 1

•V -. •>; > , ,,,, «.'

Рисунок 4. (продолжение).

е. Переходно-клеточный РМП. Фокальное окрашивание. Отмечена исключительно цитоплазматическая локализация белка Е7. Стрелкой помечена окрашенная цитоплазма. 400х

ж. Условно-нормальный уротелий. Негативная реакция. 200х

з. Переходно-клеточный РМП. Диффузное окрашивание. 400х

и. Морфологически нормальный уротелий мочевого пузыря неонкологического больного. Диффузное окрашивание. 400х

4. Экспрессия клеточного гена 11УК4а в образцах ракового и условно-нормального уротелия мочевого пузыря

Было протестировано 10 пар образцов ракового и условно-нормального уротелия мочевого пузыря, полученных от 10 больных РМП. В эту выборку вошли 5 пар образцов «раковый- морфологически нормальный уротелий», в которых РМП был ДНК-ВПЧ16-позитивным, причем для двух из этих 5 пар иммуногистохимическим методом была показана экспрессия онкобелка Е7 вируса в раковых клетках (образцы 72 (опухоль) и 90 (опухоль)). В остальных пяти парах образцов опухолевая ткань не содержала ДНК ВПЧ. Результаты этого исследования представлены в Табл. 2 и проиллюстрированы на Рис. 5.

92Н92 94Н 94 96Н 96 72Н 72 90Н 90

МП ш

ШК4а

92Н92 94Н 94 96Н 96 72Н 72 90Н 90 »•*» ----------- ----САРРН

Рисунок 5. Экспрессия ШК4а в образцах переходно-клеточного РМП на уровне мРНК. Верхний ряд — продукты ПЦР с обратной транскрипцией с ШК4а-специфичными праймерами, проявленные с помощью радиоактивной пробы. Н -условно-нормальная ткань, полученная оттого же больного РМП.

Нижний ряд — результаты, полученные с йАРОН- специфичными праймерами (контроль стабильности и количества РНК) для тех же образцов.

В морфологически нормальном уротелии от разных больных содержание мРНК ШК4а различалось в десятки раз. Таковы, например, различия между образцами 90Н и 96Н, между образцами 92Н и 96Н. Очевидно, что корректно в этих условиях сравнивать транскрипционную активность ШК4а в РМП с таковой в морфологически нормальном уротелии мочевого пузыря того же самого больного. У 6 из 10 больных в раковых клетках наблюдалась значительная активация (приблизительно в 30-100 раз) транскрипции ШК4а по сравнению с уровнем транскрипционной активности данного гена в клетках условно нормального уротелия (Табл. 2: больные 90, 92, 94. 60, 61, 70; Рис. 5: больные 90, 92, 94). В остальных парах (кроме 72-й) транскрипционная

активность ШК4а также была выше в опухолевой ткани, но отличие от соответствующего условно-нормального уротелия было не столь значительным. В случае больного №72 /ТУА^/а-специфичный транскрипт полностью отсутствовал как в морфологически нормальном уротелии, так и в раковых клетках.

Таблица 2

Экспрессия ШК4а на уровне мРНК в образцах РМП и морфологически нормального _уротелия мочевого пузыря, полученных от 10 больных._

№ образца ДНК ВПЧ РНК ВПЧ Белок Е7 Транскрипция ШК4а

60 - н. о. н. о. +

60Н -

61 - н. о. н. о. +

61Н -

70 - н. о. н. о. +

70Н -

71 - н. о. н. о. +

71Н -

72 + - + -

72Н -

90 + - + +

90 Н -

92 + - н. о. +

92 Н -

93 - н. 0. н. О. +

93Н ■

94 + - н. о. +

94 Н -

96 + - Н. О. +

96Н -

н.о. - не определяли

Иммуногистохимическую детекцию белка, кодируемого ШК4а, - р 1 б|рдК4а5

выполнили для 38 образцов РМП и 4 образцов условно-нормального уротелия. В эту

вторую выборку из предыдущей были включены 4 образца РМП: 72, 90, 93 и 94.

Среди 38 ДНК-ВПЧ16-позитивных образцов РМП р16ШК4а-позитивными оказались 4

(11%) (рис. 6, е, Табл. 3). Во всех исследованных образцах условно-нормального

16

уротелия (Табл. 2: образцы 72Н. 90Н. 93Н и 94Н) реакция с р1611ч1К4а - специфичными антителами была негативной. Белок р16ш 4а отсутствовал и во всех 13 образцах РМП. в которых экспрессировались Еб и/или Е7 ВГ1Ч16. Негативную реакцию с р16|Гч1К4а-специфичными антителами мы наблюдали, среди прочих, и в образцах РМП №№ 90. 93 и 94. в которых ранее были выявлены транскрипты ШК4а.

Рисунок 6. Результаты иммуногистохимической детекции р16ГЫК4а (а-г) и онкобелка Е7 ВПЧ16 (д).

а— плоскоклеточный РШМ (положительный контроль): диффузное окрашивание р16|ык4а -специфичными антителами, ХЮ0.

б — клетки линии НСТ116, мазок (отрицательный контроль): негативная реакция с р16тК4а-специфичными антителами, х400.

в — переходно-клеточный РМП, диффузное окрашивание р161ЫК4а- специфичными антителами, х200.

г — переходно-клеточный РМП, негативная реакция с р16ШК4а-специфичными антителами, х400.

д — тот же образец, что и "г", диффузная реакция с Е7 ВПЧ 16- специфичными антителами, х400.

Таблица 3

Результаты иммуногистохимической детекции р16ШК4а в образцах РМП._

№ образца РМП ДНК ВПЧ Экспрессия онкогенов Е6 и Е7 Белок р16,КК4а

мРНК Е6/Е7 белок Е7

2 + - н. о. -

3 + - Н. о. +

6 + - Н. о. -

7 + - - +

8 + - Н. 0. -

9 - - - -

13 + - Н. 0. -

15 + - Н. 0. -

17 + - Н. 0. -

22 + - Н. 0. -

20 + + + -

24 + + + -

27 + + + -

28 + - - -

29 + + - -

32 + Н. 0. - -

34 + - Н. 0. +

36 + - + -

39 + - - -

40 + + - -

41 + - - +

47 + - - -

51 + - + -

52 + - Н. о. -

53 + + + -

57 + + + -

59 + + - -

62 + + , - -

65 + - - -

68 + - Н. 0. -

72 + - + -

74 + - Н. о. -

78 - Н. о. - -

79 - Н. О. Н. о. -

90 + - + -

93 - Н. О. Н. о. -

94 + Н. О. Н. о. -

95 + Н. О. Н. о. -

и.о. - не определяли

6. Клинические особенности ВПЧ-нознтнвного РЛ1Г1

В предыдущих разделах мы описали результаты проверки клинических материалов от больных РМП на предмет присутствия в них генома ВПЧ и экспрессии этого генома. Убедившись в ВПЧ16-позитивности значительной части образцов РМП, мы попытались получить ответ на следующий вопрос: отражается ли ВПЧ-статус опухоли на клинических особенностях заболевания? Были проанализированы данные из историй болезни пациентов. При этом представилось возможным провести следующие сопоставления:

1.)доля ВПЧ-позитивности среди случаев первичного РМП у женщин, с одной стороны, и у мужчин - с другой;

2.) средний возраст больных ВПЧ-позитивным первичным РМП, с одной стороны, и ВПЧ-негативным - с другой;

3.) доля ВПЧ-позитивных случаев в группах образцов, различающихся по гистопатологическому диагнозу (степень анаплазии опухолевых клеток I, II, Ш);

4.) доля ВПЧ-позитивных случаев в группе с мышечно-неинвазивным РМП, с одной стороны, и мышечно-инвазивным - с другой;

5.) доля ВПЧ-позитивных случаев в группе больных с первичным РМП, с одной стороны, и в образцах, полученных при рецидиве заболевания - с другой.

Среди изученных нам и случаев первичного РМП 15 были выявлены у женщин, 56

- у мужчин. ДНК-ВПЧ16-позитивными оказались 5 образцов РМП у женщин (33%) и 28 - у мужчин (50%); различия между этими показателями статистически недостоверны (Р=0,26).

В группе ВПЧ-позитивных больных первичным РМП средний возраст составил 61,7 года (46-79), а в группе ВПЧ-негативных - 60,8 года (35-84). Различия между средним возрастом в этих группах статистически недостоверны (Р=0,25).

При сопоставлении групп образцов РМП, различающихся по гистопатологическому диагнозу, в каждой из них было обнаружено следующее число ДНК-ВПЧ 16-позитивных случаев. В группе с анаплазией I степени (п=12 образцов), ВПЧ-позитивным был 1 образец РМП (8,3%), в группе с анаплазией II степени (п=48)

- 24 (49%), а в группе с анаплазией III степени (п=41) - 13 (32%). Объединив образцы РМП II и III степени анаплазии в единую группу, как это делают другие

исследователи (Са1 Т. й.аЬ, 2011; ЗИ^еИага К. е1.а1., 2011), мы оценили статистическую значимость различий следующих показателей: I степень анаплазии, 1/12, 8,3% ДНК ВПЧ-позитивных; II + III степень, 37/89, - 42% ДНК ВПЧ-позитивных. Различия между этими группами оказались статитистически достоверны (Р=0,02).

В группе с мышечно-неинвазивным РМП (п=41), ВПЧ16-позитивных образцов было 21 (51%); в группе с мышечно-инвазивным РМП (п=28), ВПЧ16-позитивных было 9 (32%). Различия между этими группами недостоверны: Р=0,17.

Среди 71 пациента с первичным РМП ДНК-ВПЧ16-позитивными оказались образцы опухолей от 33 (47%) больных, а в группе из 30 пациентов с рецидивом заболевания ДНК ВПЧ16-позитивными оказались образцы РМП четырех (13%) больных, различия между этими группами статитистически достоверны, Р=0,004.

Заключение

Решение вопроса об участии онкогенных ВПЧ в генезе РМП затянулось на десятилетия. Противоречивые данные о доле ВПЧ-позитивных опухолей этой локализации, опубликованные разными исследователями - главная причина затруднений. Источников большой вариабельности данных два: этно-географическая неоднородность РМП и методические особенности работ. Малые размеры изученных выборок, а также отсутствие попыток проверить, экспрессируется ли геном ВПЧ на уровне мРНК и/или белков в тех опухолях, где обнаруживалась ДНК вируса, позволяют усомниться в заключениях некоторых авторов, что папилломавирусы не играют роли в уротелиальном онкогенезе.

В настоящей работе предложен комплекс молекулярно-генетических и

иммуногистохимических методов для обнаружения в образцах РМП генома ВПЧ и

проверки присутствия в позитивных образцах мРНК и онкобелка Е7 ВПЧ. Впервые в

комплексном исследовании на выборке, включавшей 101 образец переходно-

клеточного РМП от российских больных (возраст от 35 и до 84 лет), дана оценка роли

ВПЧ типов высокого онкогенного риска в возникновении этой формы рака. С

помощью ПЦР было показано, что в 38 случаях (38%) в опухолях обнаруживается

ДНК ВПЧ; при определении типа вируса с использование набора рестриктаз

оказалось, что во всех этих образцах присутствовал геном ВПЧ 16, - основного типа

20

вируса, ответственного за возникновение рака шейки матки. Методом ОТ-ПЦР мы выявили присутствие транскриптов Е6/Е7 в 29% (в 10 образцов из 35) ВПЧ-позитивных образцах РМП. Иммуногистохимическая детекция онкобелка Е7 ВПЧ16 (этот белок вируса, связываясь с клеточным белком — супрессором опухолевого роста рШэ, вызывает бесконтрольную пролиферацию клетки) дала положительные результаты в 35% (9 из 26 изученных) образцов.

В ходе иммуногистохимического исследования мы отметили некоторые особенности экспрессии онкобелка Е7 в ВПЧ16-позитивных образцах РМП, не свойственные раку шейки матки. Это, в частности, присутствие Е7 в единичных клетках некоторых образцов (т.н. «фокальное окрашивание», - в противоположность диффузному окрашиванию, характерному для рака шейки матки); экспрессия этого онкобелка в некоторых ВПЧ-позитивных образцах РМП только в цитоплазме клеток при отсутствии его в ядре, что ставит под сомнение его способность инактивировать ядерный белок рШэ. Перечисленные особенности дают основание предполагать, что роль ВПЧ в генезе РМП может несколько отличаться от роли, которую этот вирус играет в онкогенезе в эпителии шейки матки.

Обнаруженная нами экспрессия генома ВПЧ 16 на уровне онкобелка Е7 положительно коррелировала с данными, полученными при детекции мРНК Е6/Е7 для образцов, в которых Е7 проявлялся диффузно (более чем в 25 % клеток), а также для части образцов, в которых этот онкобелок экспрессировался фокально. В тех случаях, когда данные ПЦР с обратной транскрипцией и иммуногистохимической детекции Е7 не совпали, это могло быть вызвано именно фокальным характером экспрессии вирусного генома: быстрым распадом мРНК из-за очень малого её количества в образце, непопаданием вирус-позитивных клеток во фрагмент, из которого выделяли РНК, или во фрагмент, использованный для окрашивания антителами. Весьма значимым является факт совпадения положительных результатов детекции ДНК ВПЧ, мРНК Е6/Е7 и онкобелка Е7 для 5 образцов РМП из 101 изученного образца (5%). Он свидетельствует, что ВПЧ 16 участвует в злокачественном перерождении клеток уротелия у части российских больных раком мочевого пузыря.

Следуя избранному при планировании работы принципу оценивать роль ВПЧ в возникновении РМП комплексно, мы исследовали экспрессию клеточного гена ШК4а

в ВПЧ-позитивном РМП на уровне мРНК (в ПЦР с обратной транскрипцией) и кодируемого этим геном белка р 1 б1КК4а (иммуногистохимически). Гиперэкспрессия ШК4а, определяемая иммуногистохимически на уровне белка, является ранним диагностическим маркером рака шейки матки. Она указывает на присутствие в ВПЧ-позитивной клетке цервикального эпителия онкобелка Е7. В нашей работе гиперэкспрессия ШК4а имела место в части образцов РМП и на уровне мРНК, и на уровне белка р16ЮК4а (4 образца, 11%, из 38 образцов ВПЧ-ДНК-позитивного РМП). Однако ни в одном из ВПЧ-позитивных образцов, в которых была обнаружена экспрессия генома вируса на уровне мРНК Е6/Е7 и/или белка Е7, клеточный белок р 1 бтк4а обнаружен не был. Таким образом, в ВПЧ-позитивном РМП р16ШК4а не может служить индикатором экспрессии генома вируса.

Сопоставив результаты лабораторных исследований образцов РМП с данными историй болезни, мы показали, что доля ВПЧ-позитивности РМП женщин не отличается от аналогичного показателя у мужчин; что средний возраст больных первичным РМП одинаков в группах «ВПЧ-позитивный» и «ВПЧ-негативный РМП», а также что доля ВПЧ-позитивных случаев в группе с мышечно-неинвазивным и мышечно-инвазивным РМП статистически значимо не различаются. В то же время, ВПЧ-статус РМП отражался на степени анаплазии опухоли: в группе с I степенью анаплазии было 8,3% ДНК ВПЧ-позитивных (1 образец из 12); в объединенной группе с II и III степенью - 42% ДНК ВПЧ-позитивных (37 из 89). Доля ВПЧ-позитивности РМП была значимо выше при первичном заболевании (33 больных из 71, 47%,) сравнительно со случаями рецидивов (4 из 30 больных , 13%). Эти различия служат подтверждение того, что в случаях ВПЧ16-позитивного РМП геном вируса действительно экспрессируется.

Результаты настоящей работы свидетельствуют, что ВПЧ16 принимает участие в канцерогенезе эпителия мочевого пузыря. Эти данные важны с точки зрения поиска новых подходов к профилактике РМП (в частности, с помощью профилактических вакцинаций мальчиков: известно, что раком этой локализации мужчины заболеваю в несколько раз чаще женщин). Они указывают на необходимость прояснения путей, которыми ВПЧ попадает в эпителий мочевого пузыря, - в частности, на целесообразность проверки возможного заноса ано-генитального вируса, имеющегося у больного, с помощью цистоскопа или катетера Эти данные делают актуальным

поиск маркеров для ВПЧ-позитивного РМП. С учетом появляющихся публикаций о разработке низкомолекулярных недорогих химических соединений, способных ингибировать экспрессию онкогенов ВПЧ, результаты настоящей работы могут стать шагом в направлении поиска новых способов лечения ВПЧ-позитивного РМП.

ВЫВОДЫ:

1. ДНК ВПЧ16 обнаружена в 38% образцов рака мочевого пузыря.

2. Экспрессия онкогенов Е6/Е7 ВПЧ 16 обнаружена в 29% образцов рака мочевого пузыря, содержащих ДНК ВПЧ 16, онкобелок Е7 ВПЧ 16 выявлен иммуногистохимическим методом в 35% образцов рака мочевого пузыря.

3. Клеточный белок pl6INK4a (ранний диагностический маркер рака шейки матки) экспрессируется в 11% ДНК-ВПЧ-позитивных образцов РМП, однако он не обнаружен в тех образцах, где онкогены Е6/Е7 ВПЧ 16 экспрессировались на уровне мРНК и/или белка; следовательно, pl6INK4a не может служить индикатором ВПЧ-позитивности рака мочевого пузыря.

4. ВПЧ-позитивный рак мочевого пузыря характеризуется более высокой степенью анаплазии клеток, чем ВПЧ-негативный. Пол, возраст и наличие инвазии в мышечный слой не коррелирует с ВПЧ-позитивностью РМП.

5. Полученные данные свидетельствуют об ассоциированности части случаев рака мочевого пузыря с ВПЧ 16.

Список работ. опубликованных по теме диссертации. I. В журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ:

1. Волгарева, Г.М. Экспрессия белка pl6INK4a в клетках некоторых распространенных форм рака./ Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Головина Д.А., Спитковский Д.Д. // Архив патологии — 2004.- № 5.- СС. 3-5.

2. Волгарева, Г.М. Обнаружение онкобелка Е7 HPV16 в раковом и нормальном

уротелии мочевого пузыря./ Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Головина Д.А.,

23

Андреева Ю.Ю., Ермилова В.Д., Чебан Н.Л., Куевда Д.А., Трофимова О.Б., Шипулина О.Ю., Павлова JI.C., Петров А.Н., Матвеев В.Б., Франк Г.А. // Архив патологии-2009,- Т.71,- № 1,- СС. 29-30

3. Волгарева, Г.М. ВПЧ как фактор риска при раке мочевого пузыря. Обзор литературы./ Волгарева Г.М., Франк Г.А., Головина Д.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Хачатурян А.В., Чебан H.JL, Матвеев В.Б. // Онкоурология - 2010.- № 4.- СС. 92-101

4. Волгарева, Г.М. Причастны ли ВПЧ к возникновению рака мочевого пузыря? Описание клинического случая./ Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Трофимова О.Б., Короленкова Л.И., Хачатурян А.В., Андреева Ю.Ю., Ермилова В.Д., Чебан Н.Л., Куевда Д.А., Шипулина О.Ю., Глазунова В.А., Головина Д.А., Петров А.Н., Матвеев В.Б., Франк Г.А. // Архив патологии - 2010.- Т. 72,- № 4,- СС. 24-27

5. Волгарева, Г.М. Экспрессия гена INK4a в клетках рака мочевого пузыря, ассоциированного с ВПЧ 16-го типа./ Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Головина Д.А., Андреева Ю.Ю., Ермилова В.Д., Трофимова О.Б., Куевда Д.А., Шипулина О.Ю., Глазунова В.А., Чен Ш., Павлова Л.С., Чебан Н.Л., Матвеев В.Б., Франк Г.А. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2010,- Т.149,- № 2.- СС. 204208.

II. Статьи по приглашению в тематических сборниках:

1. Volgareva, G.M. In search of bladder cancer markers: are human papillomaviruses and cellular INK4a expression associated?/ Volgareva G., Zavalishina L., Golovina D., Andreeva Y., Cheban N., Ermilova V., Petrov A., Bateva M., Matvejev V., Shtil A., Frank G. // Tumor Markers Research Perspectives (G.A. Sinise, ed.). Nova Science Publishers, NY-2007.- P.135-143

2. Volgareva, G.M. Role of HPV in urothelial carcinogenesis: current state of the problem. In: Bladder cancer - from basic science to roboric surgery./ Volgareva G.M., Matveev V.B., Golovina D.A. // (Ed. A.E. Canda) INTECHWEB.ORG - 2011.- Chapter 9.- P. 177-194

III. Тезисы научных конференций, симпозиумов и съездов:

1. Volgareva, G.M. Human papillomaviruses: is bladder urothelium a target of their carcinogenic action?/ Volgareva G.M., Kuevda D.A., Zavalishina L.E., Shipulina O.Y., Trofimova O.B., Golovina D.A., Andreeva Y.Y., Cheban N.L., Petrov A.N., Matveev V.B.,

Shtil A.A., Frank G.A. // In:World Cancer Congress, Geneva 2008.- Papers.- Р.216,-International Journal of Cancer - 2008. Suppl.

2. Frank, G. Can pie"®43 overexpression serve as an indicator of HPV-associated carcinogenesis in bladder urotelium?/ Frank G., Zavalishina L., Andreeva Y., Golovina D., Volgareva G. // In: Congress of the International Academy of Pathology, abstracts of papers.- Athens, Greece, October 2008.- Histopathology.- V.53.- Suppl.1.- P.274

3. Volgareva, G. HPV and urinary bladder cancer./ Volgareva G., Trofimova O., Kuevda D., Zavalishina L., Golovina D., Andreeva Y., Ermilova V., Cheban N., Glazunova V., Matvejev V., Shipulina O., Frank G. // 25-th International Papillomavirus Conference, Malmo, Sweden.- May 2009,- Abstract book.- P.-18.42

4. Волгарева, Г.М. Вирусы папиллом человека и этиология рака мочевого пузыря./ Волгарева Г.М., Головина Д.А., Трофимова О.Б., Куевда Д.А., Шипулина О.Ю., Глазунова В.А., Ермилова В.Д. // Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 21 июня-27 июня 2009 г., Москва,- Труды съезда.-4.1.- С. 399

5. Волгарева, Г.М. В поисках маркёров рака мочевого пузыря: участвуют ли в уротелиальном канцерогенезе вирусы папиллом?/ Волгарева Г.М., Хачатурян А.В., Головина Д.А., Глазунова В.А., Трофимова О.Б., Чебан H.JL, Ермилова В.Д., Матвеев В.Б. // Онкоурология — 2010,- Материалы V конгресса Российского общества онкоурологов.- М., 6-8 октября 2010 г.- СС. 130-131

6. Головина, Д.А. Комплексное изучение роли вирусов папиллом в возникновении рака мочевого пузыря./ Головина Д.А., Трофимова О.Б., Хачатурян А.В., Ермилова В.Д., Матвеев В.Б., Волгарева Г.М. // Сибирский онкологический журнал — 2012.-Приложение №1, материалы конференции.- С. 47

7. Головина, Д.А. Вирусы папиллом человека и рак мочевого пузыря: сопоставление вирус-позитивных и негативных случаев по возрасту обнаружения опухоли, стадии анаплазии и инвазивности./ Головина Д.А., Ермилова В.Д., Хачатурян А.В., Чебан Н.Л., Матвеев В.Б., Волгарева Г.М. // Сибирский онкологический журнал - 2013.-Приложение №1, материалы конференции,- С. 30

Подписано в печать 23.09.2013 Формат 60*84/16 Бумага офсетная "ЗуейСору". Тираж 100 экз. Заказ № 101

Отпечатано на участке множительной техники «Студия ЗБ» г.Москва Сущевский Вал, 14/22, корп.З