Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Распределение аллелей онкогена HRAS1 и их перестройки в карциномах у человека

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ им. проф. Н. Н. ПЕТРОВА

На правах рукописи УДК 616—018—006:576.858.6

НИКИФОРОВА Ирина Феликсовна

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ ОНКОГЕНА НЯА81 И ИХ ПЕРЕСТРОЙКИ В КАРЦИНОМАХ У ЧЕЛОВЕКА

Специальность: 14.00.14 — Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте онкологии им. проф. Н. Н. Петрова Минздрава СССР.

Научный руководитель: доктор медицинских наук П. Г. Князев.

Консультант: доктор медицинских наук, профессор В. Ф. Семиглазов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Б. Д. Животов-ский, доктор медицинских наук В. С. Гайцхоки.

Ведущее научное учреждение: Институт проблем онкологии им. Р. Е. Кавецкого АН УССР.

Защита диссертации состоится « 1991 г. в часов

на заседании Специализированного совета НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова (Ленинград, 189646, Песочный-2, Ленинградская ул., д. 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан » ^/¿¿¿О? г.

/

Ученый секретарь /'

Специализированного совета, /

доктор медицинских наук В. В. Худолей

Актуальность работы.

Онкогены семейства RAS причзстны к развитию широкого спектра опухолей человека и лиеотных. В некоторых типах неоплазм у людей обнаружено до 90% случаев мутаций е "горячих" кодонах генов HRA31, ■ KRA.S2 или NRAS, а их повышенная экспрессия пска1--вана-- примерно - в половине изученных новообразований (Vteinborg R. et al. ,1937; Eos J. L. ,1989). Мутацич в онкогене KRASl регистрируются, в целом, реже; чем' в KRAS2 или HRAS. Однако HRAS1 является одним из наиболее часто экспреесирукяцихся в злокачественных опухолях человека онкогенов, наряду с KRAS2, CMYC и CFCS (Slamon D. J. et al., 1984). Нэ исключена вероятность того, что конститутивные особенности гена HRAS1,. отличающегося от других генов RAS аллельнкм полиморфизмом, .оказывают влияние на изменение его экспрессии и, возможно, на злокачественное перерождение клеток. ,

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПД?<1) онкогена HRAS1 . в геноме.человека обусловлен наличием на 3'- конце гена области вариабельно-тандемного повтора (ВТП), структурной еди-' ницей которого является палиндромная последовательность, длиной 28 пар нутслеотидов (Capen D. J. et al. ,1983, см. рис.1). Эволюцией оказались отобраны 4 варианта амплификации этой последовательности, формирующие 4 основных аллеля (ОА) гена': Al, А2, АЗ и А4 (Krontlris Т. D. et al. ,1985). Они составляют 96% ст. всех выявленных аллелей. Помимо ОА в геноме человека было найдено несколько, редких аллелей (РА), встречающихся у 4-5% людей и незначительно, на, 0,1-0,3 тысяч пар ■ нуклеотидов (т.п.н.),. отличающихся по своему размеру от основных.

Т. D. Krontlris с соавт. (1985) обнаружили у онкологических больных, по сравнению со здоровыми донорами, вдвое большую частоту РА(10% и 5%, соответственно). Те же авторы предположили, что область ЮП онкогена HRAS1 может вести себя как энхан-сер и показали в опытах по трансакции увеличение в 5-10 раз экспрессии HRAS1 под влиянием ВТП. R, Lidereou с соавт. (1966) выявили не толысо значительно прикину» частоту РА у больных раком молочной яр.тзгн Í41";, по ерзшюгага с 101 в здорово« попу-

Рис. 1 .'Схс-Иа ptiCiWACj^IHW ПОДИруНВДХ ПОСЛС'ДОВаТйЛЬНОиУ^Й (Чч5рнш ирлшугодыигки) и области вариабельно -тан-доиасго поетсра(Е?П - белый прямоугольник) EJ ■• I iRAS 1 - о шсоге на (Capon и. J. et al. , 1S83)

1 2 3 4 5 6 7 т п.н.

Bam HI Mspl Mspl BamHI

5'«-no™---r^ff*-L~l3"

Pvall Pvull ВТП PvuII

I • I

' I I

pttlu-фрагмент, i_!

размером 2,6 т.п.н. PvuII-фрагмент, размером 2,7 т.п.н.

; Еергикасьныыи ллннлми стмс-чэны сайты рестрикции эидонуклоаэ ВапШ, PvuII и blspl.

ляции), но и связь РА с агрессивны?,« течением .опухолевого габо-.лэвания. • Однако сразу в нескольких поелодогазких публикациях били представлены данные о примерно равной дола-РА у, больных-и эдоровых людей, в том числе и у больных-раком молочной' лелesti (White G.R.U et al., 1588).

ПДРФ HRASl позволяет. ие только опр-^д-л-ить комбинацию аллэ-леП или генотип индивида, но к вылвлн'гь в опухолевой ДНК перестройки онкогена, например, потерю одного из его аллелей. Нередкие делеции (20-60;.) последовательностей короткого плеча.

11 хромосомы, в том числе и гена HRAS1 (р15.5) , были найдены в _ опухолях Вильмса, рабдомиосаркомах, карциномах .мочевого пузы- ' ря, молочной железы'и некоторых других,злокачественных новообразованиях человека (Koufos .F. et al., 1985; Scrable Н. J. et al., 108У; Fearon E. R. et al;, 1984; 1985;-Theilleb C. et al. , 1986). .

Делеция нормальных клэточних последовательностей шш • бить следствием высокой генетической ктетсоил^ностл опухолевых 1 клеток, to как было показано для аи'шонкогснав - гена рети-- .

псбластош и гола р53, потери еллвля дикого типа' мога?т .так»» демаскировать рецессивную мутацию другого, аллели/что в свою очередь индуцирует развитие опухоли (Cávense .VA К. et ai., 1983). С этой точки зрения, частые делении какого-либо "гена свидетельствуют о его возможной супреиснруш^й функции в кдет--ке.- -Учитывай то, что гены 11 хромосомы, особенно последовательности короткого плеча, вовлечены в-супрессию туморогеннос-ти клеток HeLa (Strivatsan Е. et -al. ,19So; Saxon Р. J. et al. ,1986), momio сделать предположение сб участии онкогена HRA31 в подавлении неопластического фенотипа, а значит и о том. что какой-либо аллель HRAS1 дикого типа способен нивели-. ровать действие мутаитного гомолога.

Число работ, посвященных изучению структуры и функции онкогена HRAS1 в неоплазмах человека, сравнительно невелико. Основное внимание до последнего времени уделялось линиям опухолевых клеток, которые, как известно, не по всем параметрам адекватно отражают ситуацию i и vivo. В большинства исследований ЛДРФ онкогена HRAS1 в первичных опухолях ассоциаций каких-либо ОА с предрасположенностью к развитию рака не было найдено. Существуют только 4 работы, в которых была установлена повышенная частота самого большого аллеля А4 у больных ке-мелкоклеточным раком легкого, раком толстой кишки и меланомой (Heighway J. et al. ,1935; Vyllie F. S.et al. ,19S8; Radice P. et al. ,1987; Hayvcxd N. K. et al. ,1989). Вследствие неполноты и разрозненности данных о ПДРФ онкогена HRAS1, в настоящий момент не существует каких-либо конкретных заключений о функции определенных аллелей HRAS1 в канцерогенезе у человека, а тага» о частоте-и специфичности его 'делеций.

Поэтому представляется ватаым и Еесьма перспективным изучение конститутивных различий гена HRAS1 у онкологических больных в сопоставлении со здоровыми людьми. Детальный сравнительный анализ частот и перестроек аллелей онкогена HRAS1 в ДНК опухолей разных локализаций, гистологических типов, стадии прсгрзссии поможет прояснить голь аллелей этого гена в возникновении карцином определенного тип?.. Кроме того, это позволит

глув«& пзил'Ь ' рогуляторный характер области ВТП онкогена №taSX,-a trow» адзшмшз м<*хакиаыы его астиващГи.

Поль п ра,:'у-.чл ^¡о-тецовакия. Целью настоящей работы является . п.'-учиние рзсгф'ЗДдлс'ННЯ и перестроек аллелей онкогена KRAS1' в' I'.-iKdxopHx распространенных карщшоыах человека. В связи с этим • 'поставлены слэдушдз задачи: '

1) анализ распределения аллелей прстоонкогена HRAS1 у б-дышх ракзм кадочной. (КМ), толстой кишки (РТЮ, легкого (РЛ), а5«совяд!гой '»йлеаи (ТЩ£) я яичникоб (РЯ), б сравке- ' нии с популяцией сдороних доноров; . ■

2) исследование структурных перестроек.онкогена: делецнй, амплификаций, изменения длшш гллеля - в первичных и мэтаста-,' дамских опухолях тех кз нозологических групп;' . -. ' . ,.

; .3) выявлание ассоциаций..определенных • аллелей HRAS1 и йх струкгурких нарушений, со стадией' прогрессии -злокачественных ' признаков опухолей, например, уровнем метастазцрования и дру-' гш.:и клинико-патологичебкиш параметрами еайолевания,

' Научим новизна и практическая значимость полученных ре--гультатов. 3 результате выполнения диссертационного исследования получен ряд новых данных:

- впервые на большем количестве клинического материала (ЙС'5 больных) представлено распределение аллелей онкогена '

' HF2AS1 в основных типах рака человека, по сравнении с популяцией здоровых доноров; . : •. '

- в результате сравнительного,анализа собственных и литературных данных впервые .повааана' значимая сьЛеь редкого аллеля AS онкогена HRAS1" с развитием" влокачественных опухолей (Pi 0,01); . '

-"впервые обнаружена ассоциация аллеля А2 онкогена HRAS1 с активным метастазнрованием Pffii, низким уровнем эстрогеновых и прогеетероновых рецепторов (Р<0,05) и пременопаузальным статусом больных РШ£ (Р<0,05). Большая часть делений (7 из 10 случаев) также найдена в ДНК'опухолей, •' содзржздрх А2 аллель;

- установлена статистически достоверная, снизь встречаемое- ' ти онкологических ваболзваний среди бли»ай:икх 'родственников

больных РМЖ о наличием в их генотипе А2 аллеля онкогена HRAS1 (Р<0,01) и с повышенной частотой делеции короткого пле-ча(р15.5) 11 хромосомы в опухолевой ДНК этих больных (Р<0,02);

- выявлена тенденция к повышению частоты аллеля А2 онкогена HRAS1 и понижению A4 у больных с активно метастазирующики, низкодифференцированными РЯ (Р<0,1) и инвазивными РВД (Р<0,1);

- показано у кеншин с пора»миеь: различных органов (РШ, РЯ, РЩ!К, РЛ и РТК) значительно' большее содержание аллеля А2 в возрастной группе до 50 лет, чем в группах от 50 до 65 и, особенно, старше 65 лет (Р<0,05). Напротив, для мужчин, имеющих этот аллель в генотипе, отмечена тенденция к более поздним срокам возникновения онкологического заболевания (РЛ, РТК) -старше 65 лет, а в группе до 50 лет был обнаружен всего один пациент с аллелем А2 онкогена HRA31 (Р<0,1);

. - впервые обнаружена значимая связь повышенной частоты перестроек локуса гена HRAS1 в немелкоклеточных РЛ с присутствием в последних аллеля A4 (Р<0,01). В большинстве выявленных нарушений онкогена (6 из 8 случаев) аллель A4 . либо оставался неповрежденным при делеции или изменении длины другого аллеля, либо число его копий увеличивалось. У больных РЛ указанный аллель ассоциировался тага© с прогрессией злокачественных признаков опухолей и низкой выживаемостью.

Диссертационная работа имеет научно-теоретический характер. Ее практическая значимость характеризуется следующим.

Данные о распределении и перестройках аллелей онкогена HRAS1 в РШ, РТК, РЛ, РШД и РЯ могут быть использованы для дальнейшего изучения кооперативного участия генов RAS и других онкогенов- в развитии этих типов карцином, а в будущем, возможно, для разработки молекулярно-генетических тестов, применимых в диагностике злокачественных новообразований у человека и прогнозе течения заболевания. Выявление сеязи аллеля А2 онкогена HRAS1 с определенными признаками семейного заболевания PME, открывает перспективу использования А2 аллеля как маркера генетической предрасположенности к заболевании ?!/5. Обнаруженная ассоциация аллеля Ai с агрессивными пог'ътни^м ?Л и позы-

шенной частотой перестроек в карциномах, содержащих A4, позволяют с определенной осторожностью рассматривать A4 аллель онкогена HRAS1 как эндогенный фактор риска заболевания немелкок-леточнш РЛ.

Апробация работы. Основные положения . диссертации были представлены на республиканской конференции "Механизмы канце-ро- и лейкозогенеза" (Киев, 1990), советско-французских симпозиумах "Вирусология и молекулярная онкология" (Париж, 1988;. Рига, 1990), симпозиумах "Современные направления в изучении лейкемий человека YIII и IX" (Гамбург, ФРГ; 1989 и 1990), а также на'совместном заседании.лабораторий биохимии, онкоимму-нологии,' экспериментальных опухолей и эндокринологии НЩ онкологии им. проф. Е Н. Петрова Ыинздрава СССР.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстри-. рована 18 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель включает 171 публикацию на русском' и английском языках.

ШЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве материала исследования использованы препараты ДНК, выделенные из операционного материала участков тканей первичных опухолей 255 больных; раком молочной железы (76 образцов), толстой кишки (68), легкого (52), яичников (29) и. щитовидной железы (30), а также метастазов рака щитовидной тле- , зы (13), молочной железы (4), яичников (14) и доброкачественных опухолей яичников и щитовидной железы (11). Для установления конститутивного генотипа больных били исследованы 120 образцов макроскопически неизмененной ткани по краю резекции указанных карцином и. 32 препарата лейкоцитов крови. Для сравнительного анализа взяты лейкоциты периферической крови 32., здоровых доноров. Всего было изучено около 500 образцов ДНК.

Операционной материал поступай из 1, 2 и 4 хирургических и

онкогинекологического отделений НИИ онкологии им. проф. Е Н. Петрова Минздрава СССР в соответствии с выполнением НИР.

В сравнительном анализе были использованы данные историй болезней, регистрирующие клиническую, патоморфологическую картину заболевания, степень развития и распространения опухоли, сведения о выживаемости и семейном анамнезе больных (наличие онкологических заболеваний среди ближа.1ших родственников).

Выделение ДНК из опухолевых и неизмененных тканей осуществляли фенольно-детергентным методом (Mani at is Т. et al., 1982). Для фрагментации образцов ДНК использовали следующие эндонукле'азы рестрикции: BamHI, PvuII, PstI и Mspl (НПО "Фермент", Вильнюс). Электрофоретическое разделение рестрикционных фрагментов ДНК осуществляли в 0,8-1 % геле агарозы ("Serva", ФРГ) и после денатурации и нейтрализации фрагменты ДНК переносили на нитроцеллюлозные фильтры ("Хийу-Калур, Таллинн).

■ В качестве гибридизационного зонда была использована последовательность онкогена HRAS1 человека (pEj-6,6) - фрагмент, длиной 6,6 т.п.н. по BamHI сайту (Tabin С. et al., 1982). Этот фрагмент содержит 4 зкзона HRAS1, промоторную 5'-концевую часть' и область ВТП на 3' -конце.

Плазмиды накапливали в бактериях Е. col i (штамм НВ101) и выделяли по методу Н. С. Birnboim, J. Doly (1979) с нашими модификациями. Онк-специфическую вставку выделяли с помощью препаративного электрофореза (Maniatis Т. et al. , 1982).

Удельная радиоактивность зонда, меченного в реакции ник -трансляции с 32Р - дЦТФ (НПО "Изотоп", Ташкент)-, составляла

s

2x10 имп/мин/мкг. ДНК на фильтрах гибридизовали в растворе следующего состава: 50% формамид, 5-кратный SSC, О,IX SDS, 0,05% поливинилпирролидон, 0,05% фикол, 0,05% бычий сывороточный- альбумин, 100 мкг/мл дрожжевой тРНК и 2x10е имп/мин/мл меченого ДНК-зонда при 42аС в течение 24-36 час. Отмытые от неп-рореагировавшей метки фильтры экспонировали на рентгеновской пленке "Kodak" RX-5 (США) в кассетах с усиливавшими экранами при -20"с в течение 4-14 суток. Интенсивность гибридизации оп-

редйлали деноитометрически или визуально по степени засвечивания рентгеновской плеики.

Статистическая обработка результатов проводилась по методу "Хц- квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

'I. Распределение основных аллелей онкогена НЯА51 у онкологических больных (РММ, РШД, РЯ, РД и РТУ.) и здоровых доноров

Рестрикционный анализ образцов ДНК. позволил выявить у больных и 'здоровых людей четыре основных .аллеля онкогена Н1?А51: А1, А2, АЗ и Ai, имеющих следующие размеры РуиП - рес- ' трикционных фрагментов: 2,7; 3,2; 3,8; 4,2 т. п. н., соответственно (рис.2). Было такав обнаруавно небольшое число редких аллелей НЙАЗ!: 13 у 255 онкологических больных и 1 у 32 здоровых доноров (табл. 1).

Рис.2 Комбинации основных аллелей А1, А2, АЗ и А4 про.то-онкогена НИА31, встречающиеся.в геноме человека

ы < см < со < < < <

ы «т; и -< М И 3 со"

21

5

9

со го

С\2 СО

«Я» — •т ¿28

«Я»

ао ш ЛгЛ ( « г

^4,2 - А4 -3,8 - АЗ -3,2 - А2 -2,7 - А1 -2,6

I 23 4 5 6 7 8 9 10

Размеры Руи!1-рестрикционных фрагментов, соответствующих четырем основным аллелям и смысловой части ННА51 (2,6 т. п. н.), даны справа.

Таблица 1 Распределение аллелей онкогена Ш?АБ1 у

онкологических' больных и здоровых доноров

Аллели Здоровые доноры Онкологические больные

1 2 3 4

основные:

А1 42(65,6)* 859(64,1) 329(64,5) 864(61,6)

А2 9(14,1) 164(12,2) 65(12,7) 171(12,2)

АЗ 7(10,9) 146(10,9) 50( 9,8) 147(10,5)

А4 Б( 7,8) 119( 8,9) 53(10,4) 126( 9,0)

редкие: К 1,6) 52( 3,9) 13( 2,5) 94( 6,7)

Общее число

исследованных

аллелей: 64 1340 510 1402 .

* - в скобках частота аллеля в процентах от

общего числа аллелей;

1.3 - собственные данные;

2.4 - суммарные литературные данные.

Изучение ПДРФ онкогена ННАЗ! не выявило существенных различий в распределении ОА в объединенной группе онкологических больных, в сравнении как со здоров&ми донорами Ленинградской, области, так и с аналогичными группами по суммированным наш 'литературным данным (табл.1). Однако каждая из рассматриваемых локализаций опухолей имела свои характерные отклонения от контрольной . группы в частотах ■ аллелей А2, АЗ и А4, но не А1 (табл.2). -А именно, отмечена тенденция к повышению частоты ал-леля -А2 у больных РШ, РШД и РЛ, в отличие от ?ТК и РЯ; содержание АЗ аллеля было уменьшено у больных опухолями всех изучаемых локализаций, кроме РТК; доля аллеля А4 была выше нормы у больных РТК, РЛ и РЯ, почти не, отличалась от нормы в РМЖ и была снижена в РШД. '

- 10 -

Таблица 2 Распределение аллелей онкогена ННА51 у больных . раком молочной железы (РМЖ), щитовидной железы (РЩй), яичников (РЯ), легкого (РЛ) и толстой кишки (ГТК)

Аллели РШ . РШЖ . РЯ РЛ РТК

1 2 3 4 5

основные:

А1 96(63,2) А 40(66,7) 40(69,0) 63(60,0) 90(66,2)

А2 24(15,8) 10(16,7) б( 8,6) 16(15,4) Ю( 7,4)

АЗ • 11( 7,2) 4( 6,7) Б( 8,6) 10( 9,6). 20(14,7)

А4 14(. 9,2) 5( 8,3) 8(13,8) 12(11,5) . 14(10,3)

редкие: 7( 4,6) 1( 1,7) 0( 0,0) 3( 2,9) 2( 1,5)

Обшэе число

исследованных

аллелей: 152 60 58 .104 1.36

л - в скобках частота аллеля в' процентах, от общего .

числа аллелей.

,2." Анализ частоты и размеров редких аллелей онкогена- Ш?АБ1 £ онтологических больных и здоровых доноров •

Комплексное сравнение размеров и частот РА, выявленных'в нашем исследовании и работах других'авторов у онкологических 'больных, в целом, и здоровых людей, обнаружило в здоровой популяции одинаковую частоту (26-29%) РА с промежуточными между аллелями А1 и А2, А2 и АЗ, АЗ и А4 размерами (табл.3). У онкологических больных встречаемость РА большого раамёра (больше АЗ аллеля) оказалась.уменьшенной, а РА, располагающихся по своей длине между А1 и А2 аллелями, увеличенной. Причем, частота РА А6 (А1 + 0,15-0,20 т.п. н.) была с высокой степенью достоверности выше у больных, по сравнению со здоровыми донорами (Р<0,01), и составляла 51% от обнрго числа РА.

Таким образом, несмотря на то, что РА' гена ННА31 не могут быть использованы, как маркеры предрасположенности к развитию

1 -11 -

Таблица 3 Распределение редких аллелей онкогена НЯА31

у онкологических больных и здоровых доноров

Редкие Основные Размеры аллели аллели аллелей

Онкологические

больные 1_2_3_

Здоровые доноры _4_5_6.

А5

Аб А7

А6 А9

А10

АН А12

А1

А2

АЗ А4

2,4 2,7 2,9

3.0

3.2 3,4 • 3,5

3.3

4.1

4.2 4,6 5,6

1

4 1

О 4

' 1 ( 2,2)

23 (51,1)

3 ( 6,7)

3 ( 6,7)

9 (20,0)

3 ( 6,7)

2 . ( 4,4)

1 ( 2,2)

0 1 ( 2,9)

О 8 (22,9)

0 1. ( 2,9)

О 7. (20,0)

О 3 ( 8,6)

0 9 (25,7)

1 5 (14,3) О 1 ( 2,9)

Всего редких аллелей: 13 45 Всего аллелей: 516 1136

Процент редких аллелей: 2,5 4,0 •

1 35 64 968 ' 1,6 3,6

* - размеры редких и основных аллелей в т. п. н., полученные при расцеплении ДНК рестриктазой Р7и11; '

1.4 - собственные данные;

2.5 - суммарные собственные 'и литературные данные;

3.6 - процентное содержание аллеля от всего количества редких аллелей у больных или здоровых людей.

рака (хотя бы из-за незначительного их количества в генофонде людей), • проведенное исследование позволило выделить среди РА аллель Аб, героятно, вдоципрованный с развитием злокачественных опухолей. Fa.3i.iep аллеля НКА51 определяется длиной ВТП, а

О

редкие аллели формируются непорцнонным, отличным от ОА наращиванием ВТП, что предположительно может нарушать механизм нормального функционирования указанного гена (Кгопипз Т. й. et а1., 1985). Однако истинное значение возрастания частоты РА конкретного размера (А6) в" популяции онкологических больных пока непонятно. При этом стоит отметить обнаруженное А. Казрегсгус с соавт. (1689). структурное отличие от других аллелей именно А6, а также ОА А2: микроделецию (6 п. н.) на 5'-. конце онкогена ННА31.

3. Частоты основных аллелей ННАЗ! и специфика их перестроек у больных РЛ разных стадий прогрессии и у больных РТК

Различия в частотах основных аллелей у больных опухолями исследованных локализаций в сопоставлении с контрольной группой носили лишь характер тенденций, не достигеа статистической достоверности, в связи с чем мы предприняли попытку .вычленить клинико-патологические параметры заболевания,: ассоциированные с повышенной или пониженной встречаемостью аллелей ННА31. В этот сравнительный анализ были' вовлечены и обнаруженные нами ' лерестройки лркуса гена НИА31 в ДНК злокачественных опухолей -их специфика и частота.

В РЛ, характеризующемся повышенной частотой аллеля А4 (см. табл. 2), было обнаружено значительное превалирование этого аллеля, наряду со снижением частоты аллеля АЗ, в метастазирую-щих карциномах, в отличие от неметастазируюдщ (рис.3), Наблюдалась такжа ассоциация А4 аллеля.онкогена с III - 1У стадиями развития опухоли. Для больных раком легкого, содержащих аллель А4, показана пониженная в 2,5 раза 5-летняя выживаемость,' по' сравнению с больными, у которых этот аллель отсутствовал. По-, мимо "этого, частота перестроек локуса онкогена Н{?АБ1 в опухог лях была статистически достоверно связана с присутствием ь них аллеля А4 (Р<0,01). В 6 из 8 выявленных нарушений гена указанный аллель либо оставался неповрежденным при делеции или изме-' нении длины другого аллеля, либо' число его копий увеличивалось. В последних случаях карциномы легкого имели преимущественно Ш-1У стадию развития и распространения по' Т№М-тесту.

- 13 -

Рис.3 Частота аллелей А2, АЗ и А-1 протоонкогена НЯЛ2!. у больных РЛ разного уровня метастазирования

ЧАСТОТА АЛЛЕЛЕЙ

4 31 г 1

РАбез№$

/

РА ста

А2

АЗ

А4

АЛЛЖИ' НДШ

Для опухолей толстой кишки ' также характерно увеличение частоты А4 аллеля, наряду с повышенной встречаемостью АЗ и значительно пониженной - А2 аллеля онкогена Н!?АБ1. Очень ред-,кне для этой локализации.карцином поломки онкогена заключались в делеции аллеля А1. При этом АЗ и-- А4 аллели сохранялись в опухолевых клетках. .

Как сказано выше, существует всего несколько публикаций, в которых была установлена повышенная частота аллеля А4 у больных немелкоклеточным РЛ, РТК и мёланомой . Авторы исследований предположили, что А4 аллель НЯА31 опосредованно или прямо, из-за особенностей функционирования области ВТП, связан с возникновением этих карцином и может быть использован в качеатве маркера генетической предрасположенности (ЬЫгЬгау ,1. ее ' а1., 1986; ИуШе Р.5. еЪ а1. , 1988).

Результаты нашей работы, касающиеся РЛ и РТК, полностью подтверждают фактические данные упомянуть« публикаций. Более того, .благодаря сравнительному анализу распределения аллелей в разных до стадии заболевания группах немелкоклэточного РЛ и характерным ' поломкам в опухолевой ДНК, эти результаты свидетельствуют об особом значении аллеля А4 в прогрессии указанного типа рака. Необходимо отметить; что именно выявленная асео-

циация аллеля A4 онкогена HRA31 с активно метастазирующими карциномами' легкого III, IY стадий, а также специфика перестроек, в результате которых аллель сохраняется в опухолевой ДНК, позволяют расценивать A4 - аллель как эндогенный фактор риска, наряду с характерными для немелкоклеточного РЛ экзогенными (например, курение).' Таким образом, гипотеза о прямой .или, опосредованной'связи одного из аллелей онкогена HRAS1 с локу-сом геному, определяющим наследственное возникновение РЛ, нуждается в дальнейшем исследовании.

4. Распределение аллелей онкогена HRAS1 и их перестройки в опухолевой ДНК больных РМЖ, РЯ и РШД, имеющих разный уровень метастазирования, менопаузальный статмс, семейную отягощен-ность

Другая ситуация имела место з отношение РМЖ, РЯ и РПЩ. А именно, • была выявлена ассоциация аллеЛя А2, но не A4 онкогена ' HRAS1, с активно метастазирующими РШ, имеющими низкий уровень зстрогеновых и прогестероновых рецепторов (Р<0,05) и возникающими преимущественно у пременопаузальных больных(рис. 4). Большая часть делеций (7 из 10 случаев) также ■ обнаружены в ДНК, карцином, содержащих аллель А2. Аллель A4 чаще встречался в генотипе постменопаузальных пациенток с наиболее благоприятными по течению и прогнозу заболеваниями (рис.4). А2 аллель, в отличие от других аллелей онкогена, у больных РМЖ с высокой * степенью достоверности коррелирует с наличием злокачественных заболеваний среди ближайших родственников (Р<0,01) и частотой поломок локуса 'гена HRAS1 в ДНК карцином этих- больных (Р<0,02). Более того, частота аллеля А2 онкогена HRAS1 значительно повышена в группе больных РМЕ со случаями рака среди родственников 1-ого и 2-ого поколений (Р<0,02), а также у больных, родственники которых имели карциномы связанных локализаций: РМЖ, РЯ и РТК_(Р<0,1).»

' Таким образом, ОА А2 онкогена KRAS1 является серьеаным претендентом на роль маркера генетической предрасположенности к FMK, и, возможно, семейной формы этого заболевания. По последним данным изучения семей с наследственным поражением мо-

- 15 -

Рис. 4 Частоты аллелей А2 и A4 в группах больных Ш» с

рл-ттшс-л«» тшшшррачц rrnfrawawnyn

Ш с Uts dea до QooT ЭР- ЭР+ 1гр. 2гр.

. лочной мзлезы, в части из них обнаружена ассоциация с последовательностями длинного плеча 17 хромосомы (Narod S.A. étal. ,1990; Hall J. M. et al., 1991). При этом, гены короткого плеча И хромосомы (в том числе онкоген HRA51) остаются объектом, пристального внимания и наши результаты хорошо согласуются ; с молекулярно-генетическими данными . других . исследований' (Callahan R. et al., 1990) и конкретизируют их в отношение ал-леля А2,

Несмотря на незначительное число проанализированных РЯ (29 случаев), в этих, патогенетически связанных с РМЖ карциномах, были обнаружены сходные тенденции, то'есть увеличение в ниэко-дифференцированных цистадекокарциномах частоты аллеля А2 (14,3% случаев, в сравнении'с 3,3% в высоко- и.среднедифферен-цированных опухолях) и уменьшение'A4 (7,1% и 20,0%, соответст-

венно). В активно метасхаоирувщнх карциномах яичников показан рост содержания А2 аллеля, сопровождающийся снижением ' А4 (10,5% А2 и 10.5% А4, по сравнению с 5,0% и 20,0%, соответственно, в не^чтастазирувцих пли давших не более одного регио-. нального мете, таза опухолях яичнйков). У пациенток, среди ближайших родственников которых встречались онкологические заболевания, наблюдалась повышенная до 16,7% частота аллеля А2 (в общей популяции Сольных РЯ А2 встречается в 8,6% случаев).

В агрессивных, инвазивных раках щитовидной железы доля аллеля А2 была также увеличена, а А4 уменьшена (18,2% А2 и 4,5% А4, посравнению с 13,9% и 8,3%, соответственно, в РЩД, имеющих более благоприятные течение и прогноз), причем во всех случаях потери одного из аллелей гена в опухолевой ДНК щитовидной железы сохранялся аллель.А2.

Обращает на себя внимание также обнаруженное у женщин с карциномами разных локализаций .(РМЖ, РЯ. РЩЖ, РЛ и РТК) значительно большее содержание аллеля А2 в возрастной группе до 50 дет (17,1%), чем в группах от 50 до 65 (12,1%) и, особенно, старше 65 дет (6,0%; Р<0,05). Напротив, для мужчин, имеющих, этот аллель в генотипе, отмечена тенденция к более поздним срокам возниконовения онкологического заболевания (РЛ, РТК): в группе от 50 до 65 лет 15,6% пациентов содержали аллель А2, старше 65 дет - 18,4%, а в группе до 50 лет обнаружен всего один больной с адлелем А2 (3,7%; Р<0,1).

Обобщая изложенные данные, следует отметить, что, во-первых, во всех типах карцином повышение частоты какого-либо аллеля онкогена НЯА51, по сравнению с нормой, коррелировало с ростом агрессивных признаков заболевания и с увеличением доли перестроек в опухолевой ДНК, большую часть которых составлял^ делеции (рис.5). Во-вторых, основные аллели А1, А2, АЗ и А4 онкогена имели различное значение в канцерогенезе у человека: если А1 и АЗ аллели, в целом, индифферентны (более того, аллель АЗ реже встречается у онкологических больных, чем у здоровых доноров и имеет тенденцию к ассоциации с благоприятным течением злокачественного заболевания), то А2 и А4 допустимо

Рис. 5 Корреляция частоты перестроек локусз онкогена ^.„„Л в различных карциномах с содержанием в них аллелей А2 и А4

еш- - частота адяеля - частота перестроек

Р<0,05 Р<0,05 ' Р<0,01 ■

рассматривать, как аллели "риска". В отношение последних, изученные локализации опухолей можно разделить на две группы: для

1-й группы, в которую входят РЩЖ, PEI и РЯ, показано повышенное содержание А2 аллеля и'eró ассоциация как с агрессивным развитием опухолей, так и с частотой поломок локуса HRAS1. Во

2-й группе, объединяющей РЛ и РТК, сходную роль играет А4 аллель, а значение А2 по многим параметрам снижено.

Целесообразность такого разделения подтверждается следующими характерными для двух групп различиями; 1) большую часть 1-й группы составляют больные женского пола, 2-й - мужского; 2) карциномы 1-й группы являются значительно более гормоизавн-симыми, чем 2-й; 3) для больных, входящих в 1-в группу, свойственно повышенное содержание холестерина в крови, ео 2-ю - пониженное;' 4) на возникновение и прогрессию опухолей 2-й (РЛ, РТК), но не 1-й группы'(РЖ, РЯ, РЩЖ) большое влияние оказывают экзогенные факторы риска (например, курение).

Биологические■причины показанных в данном исследовании различий функционирования аллелей онкогена HRAS1 в канцерогенезе у человека пока не ясны. Помимо результатов молекуляр-но-генетического скрининга аллельного полиморфизма, вызывают интерес данк< * о структурных особенностях основных аллелей HRAS1, не обусловленных областью ЕГП. L. A. Chiandler с со-авт. (1987) обнаружили в геноме человека с помощью рестриктазы Xhol два аллеля HRAS1, один из которых объединял Al и A3 ВТП-аллели онкогена, другой - аллели А2 и A4. Кроме того, основные аллели А2 и A4 имеют свои собственные уникальные черты строения. A4 аллель, в отличие от всех других аллелей онкогена HRAS1, характеризуется двумя дополнительными Taql-рестрикцион-ными сайгами в области ВГП (Pierotti М. et al., 1986). <йо касается аллеля А2, в недавней работе A. Kasperczyk с соавт, (1989) была выявлена микроделеция в'5'-концевой части только А2 аллеля (и, как говорилось выше, РА Аб).

Одна из ветвей нашего теоретического поиска привела к весьма любопытной находке сходства палиндромной последовательности ДНК, формирующей область ВГП онкогена HRAS1 и последовательности ДНК, с которой связывается комплексы рецепторов с эстрогеновыми, но не тиреоидными, прогестероновыми или глюко-кортикоидными стероидными гормонами (Beato М., 1989). Не исключено, что комплексы рецепторов с эстрогеновыми гормонами могут связываться с областью ВТП и оказывать влияние на .изменение экспрессии онкогена HRAS1.

Мы надеемся, что представленная работа в качестве составляющей войдет в дальнейшие комплексные исследования онкогенов в первичных опухолях человека, которые позволят разработать молекулярно-генетические тесты, пригодные в диагностике у прогнозировании злокачественных новообразований. Для изучения функции аллелей онкогена HRA31 в злокачественном перерождении клетки in vivo и в развитии различных карцином у человека, очевидно, необходимо и создание' экспериментальных моделей (тгансфекция клонированных аллелей, опыты на бестимусных мышах к тр.чнсгекных животных;.

ВЫВОДЫ

1. Изучение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов протоонкогена НЯА31 не вьшвило существенных различий в частотах его основных аллелей А1, А2, АЗ и А4 у 256 онкологических больных, в делом, по сравнению со здоровыми донорами.

2. Больные карциномами исследуемых локализаций: рак легкого (РЛ), яичников (РЯ), толстой кишки (РТК), молбчной и щитовидной желез (РШ и РПШ) - имели характерные отклонения в частотах аллелей А2, АЗ и А4 онкогена ННА31 от контрольной группы. При этом содержание аллеля А1 оставалось во всех случаях близким к норме.

3.' Повышенная или пониженная частота основных аллелей А2, АЗ и А4 онкогена НЯАБ1 у больных с разными типами неоплазм -явление неслучайное. Уменьшенное содержание аллеля АЗ ассоциировалось с наиболее благоприятными по течению и прогнозу заболеваниями. Увеличенная частота аллелей А2 или А4 во всех случаях .коррелировала с ростом агрессивных признаков опухолей и увеличением в них доли перестроек онкогена.

• 4. Аллель А2 онкогена №А51 у больных РМЖ с высокой степенью достоверности связан с наличием онкологических заболеваний среди ближайших, родственников, в том числе 1-ого и 2-ого поколений с неоплазмами связанных локализаций: РМЖ/РЯ/РТК. Учитывая ассоциацию- этого аллеля.с активно метастааируюшими ' карциномами молочной железы, имеющими низкий уровень эстроге-1 новых и' прогестероновых рецепторов и возникающими преимущественно у пременопаузальных больных, можно предположить, что аллель А2 онкогена Н1?АБ1 является серьезным претендентом на роль маркера генетической предрасположенности к заболеванию РМЖ.

5.. Аллель А4 онкогена значимо связан с перестройками локу-са Н!?АБ1 в немелкоклеточных РЛ, в результате которых у1сазаиный аллель сохраняется или умножается в опухолевой ДНК. Учитывая превалирование А4 у больных'с активно метастазирующими РЛ III, IV стадий и сниженную выживаемость пациентов, содержащих этот

- ¡¿0А~

аллель, мокно с определенной долей осторожности рассматривать аллель М онкогена ННА31 как эндогенный фактор риска ваболбва-нием немелкоклеточным РЛ. ■ .

6. Б р^ 'ультате анализа собственных и литературных данных показана ста'- чстически достоверно повышенная у онкологических больных частота редкого зллеля Аб онкогена НКА51, ■

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ СОИСКАТЕЛЯ . ' .'• 1. Никифорова IIФ. Мшлификация, 'перестройки и экспрессия цротоонкогенов с-шус и с-На-газ-1 у больных раком молочной железы. Экспериментальная онкология, т.10, N1, ,е. J7-20, 1988." ." •'■ £•' Knyazev Р. а , I. F; Nikiforova,' 0. Ы SVrcr/a,. L. B.-Hovikov, 0. F, PiUshrufcova, A. M. Abramov, J.F.Saife./ Restriction frspvmt. length polymorphism . of HRAS1 prqtoonso^ne '.аг a marker oi" genome alterations an<i susceptibility to -jte ' diveiopirant . of souk- human -,carcinomas. Modern. Trends in Human [leukemia YUI, v. 32, pp. 433-435, 1988. • . ' '

3.. Никифорова Я. Ф. , Серова О. ьГ<11лукт;кзва. Г. Ф. , Князев' П. Г., Сейц. И. Ф. ■ Частоты и перестройки аллелей протоонкоген'л с-Иа-газ-1..и их связь с развитием некоторых злокачественных опухолей у человека. Генетика, т. 26,-N 3, с. 531-5-10, .1990.

. 4. Серова О.М., Никифорова И. Ф. , Юркоза Л. 2., Винокуров ЕЛ., Князев IL Г. Швреадение локусов онкогенбЕ c^Ha-ras-'l и с-кус в карциномах яичников человека Экспериментальная онкология, т. 12, N 6, с.' 47-49, 1990. . . ' . ' •■'

5.- P. a Knyasev,' I. F. Nikiforova, - 0. f.tSerova,

Q. F. Plushnikava. Distribution and rearrangements If alleles of c-Ha-ras-l protooncogene- and. their.-, correlation with the development of lung, ovarian and thyroid' cancers. Neoplas/ra, v. 37, N 6, pp. 647-655, " 1990. '

ИП.Тип.ВИР.зак.ЗЗО,тир.120,17.05.91.Бесплатн.