Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эффективность применения нового комплексного антибактериального препарата "ЭНРОГЕН" для санации спермы хряков-производителей

На правах рукописи

БОРУНОВА Сеидфатима Мировна

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ НОВОГО КОМПЛЕКСНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА «ЭНРОГЕН» ДЛЯ САНАЦИИ СПЕРМЫ ХРЯКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

003172209

Работа выполнена в Федеральном государственном образова-тельском учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины биотехнологии им К И Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ) и Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГИКИ)

Научные руководители доктор ветеринарных наук, профессор

Петров Алексей Михайлович Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Баймишев Хамидулла Балтуханович доктор биологических наук Бедоева Залихан Михайловна

Ведущая организация Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н Э Баумана»

.. К ^

Защита состоится « ¿О » 2008 г в часов на засе-

дании диссертационного совета Д 220 042 01 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина» по адресу 109472, Москва, ул Академика Скрябина, д 23, тел (495) 37793-83

С диссертацией можно о жакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ

Автореферат разослан « » ^иДЛ 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Т Н Грязнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для обеспечения потребности населения в мясе и мясных продуктах важная роль отводится свиноводству, как отрасли наиболее скороспелого животноводства (Шахов А Г , 2001, Мисайлов В Д , 2003, Макарова Ю В , 2007)

Наибольший эффект в свиноводстве достигается путем его интенсификации с максимальным использованием маточного поголовья, а репродуктивные возможности свинеи во многом зависят от качества хряков-производителей, используемых в технологии искусственного осеменения (Филатов А В , 2005 и др )

Широкое применение антимикробных средств вызвало появление высокоустойчивых штаммов микроорганизмов, значитетыю снижающих качественные показатели спермы, что приводит к снижению оплодотворяемости, абортам и бесплодию самок, рождению мертворожденного потомства и др (Щербаченко Д 10 , 20061

Сперма, используемая при искусственном осеменении животных, должна отвечать определенным санитарным требованиям, предусмотренными нормативными документами, а препараты, используемые для разбавления и хранения спермы должны быть безвредными для спермиев

Основными требованиями к санирующим веществам (антибиотики, сульфаниламидные и химиотерапевтические препараты) являются их высокая бактерицидная активность, способность затормаживать обменные процессы спермиев и, тем самым, повышение их способности к хранению

В связи с этим наше вннмание было обращено на ряд новых антимикробных средств Так, в настоящее время в ветеринарной практике находят все более широкое применение антимикробные препараты, относящиеся к группе фторхинолонов, и антибиотики широкого спектра действия из группы аминоглюкозидов

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка нового комплексного антимикробного препарата, малотоксичного для спермиев производителей и обладающего широким спектром действия на микрофлору, выделяемую из спермы сельскохозяйственных животных

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи 1 Изучить уровень инфицирования спермы хряков-производителей различными

видами микроорганизмов

2 Провести сравнительную оценку антибактериальных препаратов, применяв мых для санации спермы хряков производителей сельскохозяйственных животны по ряду показателей (бактерицидная активность, выживаемость и оплодотворяющ способность спермиев)

3 Определить бактерицидное действие энрофлоксацина и гентамицина сульфат на микроорганизмы, выделяемые из спермы

4 Определить синергидное бактерицидное действие энрофлоксацина и гентами цина сульфата на штаммах и изолнтах микроорганизмов

5 Установить максимально бе .вредную дозу для спермиев хряков и минимальн бактерицидную дозу препарата Э1 [РОГЕН

6 Определить эффективность применения препарата ЭНРОГЕН для санаци спермы хряков - производителей

7 Изучить влияние препарата ЭНРОГЕН на оплодотворяющую способност спермиев хряков-производителей

8 Разработать нормативно-техническую документацию на препарат ЭНРОГЕН определить его экономическую эффективность при искусственном осеменении сви ней

Научная новизна. Впервые ,щя санации спермы хряков-производителей бы создан комплексный препарат ЭНРОГЕН на основе гентамицина сульфата и энроф локсацина из группы фторхинолонов и изучены его фармакологические свойства

Установлены безопасность препарата ЭНРОГЕН для спермиев и более высока бактерицидная активность в отношении условно - патогенной микрофлоры (псев домонад, эшерихий, стрептококков, стафилококков, протея и др) по сравнению применяемым в настоящее время санирующим препаратом ПОЛИГЕН

Разработана технология произродства препарата ЭНРОГЕН

Практическая значимость заключается в том, что предложенный комплексны1 санирующий препарат ЭНРОГЕН позволяет получать сперму высокого санитарног и биологического качества, способствует снижению гинекологических заболевани у свиноматок, а также повышении! оплодотворяемости маточного поголовья при ис куссгвенном осеменении Полученные данные подтверждены актами, утвержден

1ми руководителями опытно-производственных хозяйств и свинокомплексов Мо-овской, Белгородской и Воронежской областей

На основании результатов исследований разработана нормативно-техническая кументация на препарат ЭНРОГЕН (Технические условия, инструкция по приме-нию)

На базеЗАО «Мосагроген» г Москва организовано производство препарата РОГЕН Полученные серии по качеству соответствовали нормативным докумен-м и прошли производственные испытания

Материалы исследований вошли в «Методические указания по диагностике, те-пии и профилактике болезней органов размножения и молочной железы свиней», обренные секцией патологии, фармакологии и терапии Российской сельскохозяй-венной академии 24 марта 2005 г (протокол № 1)

Материалы исследований используются в учебном процессе в Саратовском госу-рственном аграрном университете им Н И Вавилова, Воронежском государст-нном аграрном университете им К Д Глинки, Московской государственной ака-мии ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина студентами ве-ринарных факультетов при изучении дисциплины «Ветеринарное акушерство, ги-кология и биотехника размножения животных», а также на курсах повышения алификации зооветеринарных специалистов свиноводческих хозяйств Апробация результатов диссертации Материалы диссертационной работы до-жены, обсуждены и одобрены на ежегодных научно-практических конференциях учных сотрудников и аспирантов ФГУ «Всероссийский государственный Центр чества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ГНКИ, 2003-2006), на международных научно-производственных конференциях проблемам лечения и профилактики акушерско-гинекологической патологии с -х ивотных (Ульяновск, 2007, Ставрополь, 2007), на XV Московском международном теринарном конгрессе (2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в т ч статьи - в материалах Всероссийских, региональных и республиканских научных нференций и 2 статьи - в научных журналах

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ^^ страницах

машинописно! о текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов соб сгвенных исследований, обсужде!шй полученных результатов, выводов, данных практических использованиях научных результатов, рекомендаций по использова нию научных выводов, списка использованной литературы ( 1источников, в тч п . иностранных авторов) и приложений Работа иллюстрирована 17 таблицам и 7 рисунками

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Уровень инфицирования спермы хряков-производителей различными видами микроорганизмов

2 Сравнительные испытания различных антибактериальных препаратов, приме няемых для санации спермы животных по ряду показателей (бактерицидная актив нос гь, выживаемость и оплодотворяющая способность спермиев)

3 Технология получения нового санирующего препарата ЭНРОГЕН и его фарма ко-токсико тогическне свойства;

4 Эффективность ЭНРОГЕНа при искусственном осеменении свиней

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Диссертационная работа была выполнена в период с 2003 по 2007 гг на кафедре акушерства и гинекологии ФГОУ ВГЮ МГАВМиБ, в лаборатории отдела пробиоти-ков и биологически активных препаратов ФГУ ВГНКИ, в опытно-производ-сгвенном хозяйстве «Манихино» Истринского районам свинокомплексе «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области, на базе свинокомплекса колхоза им Фрунзе Белюродской области, Межхозяйственного предприятия по производству свинины «9-я пятилетка» и «Краснодонское» Воронежской области

Объектом исследования служили 15 голов хряков-производителей крупной белой породы, ландрас, дюрок и препарат ЭНРОГЕН Предметом исследования явились сперма хряков-производителей, а также клинические, морфо-биохимичес-кие, иммунологические и статистические показатели свиней Всего было исследовано 323 пробы спермы хряков

Животных подбирали по принципу аналогов Искусственное осеменение свиней

проводили спермой от одних и тех же хряков на разделенных эякулятах спермы, разбавленной ГХЦС средой по ГОСТ 17637 - 72 в соотношении 1 3 Всего было осеменено 323 свиноматки

Санитарное качество спермы определяли в соответствии с ГОСТом 20909 2-75 и «Методическими указаниями по ветеринарно-санитарному контролю качества спермы производителей» (1999)

Для выделения и идентификации микроорганизмов из исследуемого материала использовали общепринятые методы, а также методику микологического исследования и оценки спермы, применяемой при искусственном осеменении сельскохозяйственных жнвотных (1978)

Патогенность выделенных микроорганизмов определяли по плазмокоагулирую-щим и гемолитическим свойствам

В сравнительном аспекте была изучена эффективность таких препаратов как ПОЛИГЕН, ГАМП, гентамицин и энрофлоксацин Максимально безвредную дозу изучаемых препаратов определяли по ГОСТ 20909 4-75

В работе были использованы следующие штаммы микроорганизмов F. coli 02, Р aeruginosa (ЦСИО), Р vulgaris a, S faecalis, штамм «Константиновский»

Экономическую эффективность применения препарата ЭНРОГЕН определяли согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (2002)

Экспериментальные данные обрабатывали по Ашмарину И П и Воробьеву А А (1962), а также методами корреляционного, вариационного и факторного статистического анализа с использованием компьютерной программы «Statistica 6,0»

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Определение уровня инфицирования спермы хряков-производтслей различными микроорганизмами

При сравнительной оценке санитарного качества спермы, полученной от одних и

тех же хряков в разное время года, установлено, что в осенне-зимний период свеже-

полученная неразбавленная сперма хряков имела высокое микробное число и коли-

титр (табл 1)

Таблица 1 Качество спермы хр-iKOB в зависимости от периода исследования

Исследуемая сперма

Показатели В осенне-зимний период В весенне-летний период

Свелеполученнам неразбавленная Разбавленная ГХЦС Свежеполученная неразбавленная Разбавленная ГХЦС

Число хряков 30 30 30 30

Исследовано эяку- 120 120 120 120

лятом

Число микробных 78428 i 19237 26166 ± 7399 122268131565 28742 ± 9674

клеток в 1 см1

<0,1 -/- 4/3,3 -/- -/-

Кош- 0,1 4/3,3 6/5,0 -/- 5/4,2

титр, 0,01 16/13,3 37/30,8 8/6,6 23/19,1

ЧИСТО 0,001 30/25,0 42/35,0 40/33,3 38/31,6

% 0,0001 70/58,4 31/25,S 72/60,0 54/45,0

Грибы, число/% 80/66,7 60/50,0 90/75,0 74/61,6

Услошго-шиогек- 60/50,0 48/40,0 73/60,8 60/50,0

ная микрофлора (УПМ), число/%

Так, в целом число микроорганизмов в исследуемых эякулятах от хряков в осен-

не-знмний период было на уровж 78428 ± 19237, а в весенне-летний - в 1,5 раза выше - 122268 ± 31565 КОЕ в 1 см3 неразбавленной спермы Достаточно высокий коли-титр (0,0001) имели 58,4-60,0% образцов во все периоды исследований, что 1акжеуказывает на значительный >ровень микробной контаминации спермы

Разбавление спермы ГХЦС среюй способствовало существенному снижению в ней количества микроорганизмов Так, среднее микробное число по 120 исследо-нанным пробам разбавленной спермы в осенне-зимний период составило 26166 ± 7399 и в весенне-летний - 28742 9674 КОЕ/см3, причем количество образцов с коли-тшром 0,0001 составляло 25,7% и 45,0 % соответственно

По сравнению с результатами ьсследований образцов свежеполученной спермы снижение микробного числа поспе ее разбавления ГХЦС средой было в 3,0 (осенне-шмний период) и 4,25 (весенне-летний период) раза, а количество проб с коли-гитром 0,0001 - в 2,26 и 1,33 раза соответственно Однако, несмотря на такое сни «кение числа микроорганизмов, ¡иикробная контаминация спермы оставалась ещ достаточно высокой Аналогичные результаты получены и по уровню контаминаци спермы условно-патогенными микроорганизмами и грибами Так, в ноябре-феврал 50,0% образцов свежеполученной и 40,0% разбавленной спермы были контамини

юваны условно-патогенными микроорганизмами, а в марте-июне их количество ыло увеличено уже до 60,8% и 50,0% соответственно

Анализ образцов как свежеполученной, так и разбавленной ГХЦС средой спермы оказал, что чаще всего выделяли бактерии группы кишечной палочки (ЬГКП) -100,0% и 100,0%, дрожжеподобные грибы - 75,0% и 61,6% образцов соответствен-о В 24,1% образцов свежеполученной и 15,0% - разбавленной спермы была обна-ужена Ps aeruginosa, в 26,6% и 20,0% - сенная палочка (В subtilis) соответственно оля других микроорганизмов (стрептококков, стафилококков, протея) была на ровне от 4,2 до 12,5% Ни в одном случае не были выделены S aureus (табл 2)

Таблица 2 Видовой состав микрофлоры, выделенной из спермы хряков

Микрофлора Выделено из образцов спермы (п-120)

Свежеполученной неразбавленной Разбавленной

количество пзолятов % количество пзолятов %

БГКП 120 100,0 120 100,0

Дрожжеподобные грибы 90 75,0 74 61,6

В sublihs 32 26,6 24 20.0

Р aeruginosa 29 24,1 18 15,0

Стрептококки 15 12,5 10 8,3

Счафилококки 8 6,6 5 4,2

Протей 7 5,8 5 4,2

Анализ видового состава микроорганизмов, присутствующих в сперме животных в ассоциации, позволил установить, что если БГКП чаще всего встречаются в ассоциации, то Р aerugп10sa присутствовал в монокультуре у 35,7% образцов эякуля-тов

Сравнительная оценка антибактериальных препаратов, применяемых для санации спермы производителей сельскохозяйственных животных

Определение бактерицидного действия препаратов

В настоящее время для санации спермы животных предложены препараты ГАМП (гентамицин+ампициллин) и ПОЛИГЕН (полимиксин+гентамицин) С целью определения их эффективности нами были проведены исследования по оценке влияния этих препаратов на микробиологические показатели разбавленной и замороженно-

оттаянной спермы хряков Для этого данные препараты вносили в образцы спермы концентрации 300 и 600 мкг на 1 см3 ГХЦС среды, а контролем служили образц спермы без их внесения

Добавление к сперме хряков препаратов ГАМП и ПОЛИГЕН значительно повь шало санитарное качество спермы, снижая уровень контаминации по сравнению исходным уровнем в 29-192 раза Гак, если в разбавленной ГХЦС средой (1 3) спе ме до замораживания число микробных клеток было в пределах 26166+739 КОЕ/см', то после добавления 300 мкг/см' ПОЛИГЕНА их число стало 581,0+5 КОЕ/см\ 600 мкг/см3- всего 153,11+25 КОЕ/см3 В случае добавления ГАМПа сн жение микробной обсемененность спермы до и после ее замораживания было н сколько хуже 873,5±76, 394,0+29, 699,0±76 и 210±17 КОЕ/см3 соответственно

Анализируя полученные результаты можно заключить, что ПОЛИГЕН облада более выраженным бактерицидным действием, чем ГАМП Так, при добавлении разбавленной сперме ПОЛИГЕНА в дозе 300 мкг/см3 ее микробное число было сн жено в 45 раз по сравнению с исходным уровнем (без внесения препарата), а пр дозе 600 мкг/см3 - в 171 раз, тогда как. ГАМП в тех же дозах обеспечивал снижен числа микроорганизмов в 30 и 66,4 раза Аналогичные данные получены и при с-нации замороженной спермы - 60,3-192,8 и 34,5-114,8 раза соответственно

Следует отметить, что исследованные препараты губительно действовали на у ловно-патогенную микрофлору, так как ни в одной из проб спермы с добавление препаратов ГАМП и ПОЛИГЕН укатнная микрофлора не была выделена, а коли титр во всех пробах с препаратами был выше 0,1, тогда как в пробах спермы, нео работанной санирующими препаратами, грибы и условно-патогенная микрофло выделялась в 50-70 и 30-40 % случаев соответственно

Таким образом, добав пение комплексных препаратов ГАМП и ПОЛИГЕН как разбавленную, так и в замороженную сперму хряков, значительно улучшало ее саш гарное качество подавляло условно патогенную микрофлору и снижало микробн число, причем бактерицидное действие препарата ПОЛИГЕН было в 1,5 раза э фекгивнее, чем препарата ГАМП

и

. Определение максимально безвредной дозы препаратов

Одним из наиболее важных моментов в применении препаратов для санации спермы наряду с определением их бактерицидного действия является определение их максимально безвредной дозы для спермиев Для этого было проведено 3 опыта по изучению изменения биологического качества спермы хряков по абсолютной выживаемости и выживаемости спермиев в часах при добавлении санирующих препаратов ГАМП и ПОЛИГЕН в рекомендуемых дозах В качестве контроля использовали образцы спермы без добавления санирующих препаратов

Было установлено, что наиболее безвредным препаратом для спермиев оказался ПОЛИГЕН в дозе 300 и 600 мкг/см3 среды, в присутствии которого спермии хряков выживали в течение 317+25 и 351+32 ч (на 21-34% выше контроля), тогда как при ГАМПе - 281+19 и 286±10 ч (на 2-4% выше контроля) соответственно В контрольных образцах спермии выживали в течение 223±15 - 262±25 ч

Анализ данных по абсолютной выживаемости спермиев хряков показал, что лучшие результаты были получены при внесении в сперму ПОЛИГЕНа, хотя выживало в зависимости от дозы 111-118% спермиев по сравнению с контролем, тогда как при ГАМПе данный показатель был в пределах 103-108% Кроме того, в случае применения ГАМПа в 9-26% образцов отмечали агглютинацию спермы хря-ков Так, выживаемость спермиев повышалась в часах по сравнению с контролем на 5-18% и 18-23% соответственно Кроме того, было отмечено снижение числа выбракованных эякулятов из-за ухудшения подвижности спермиев на 6,0- 6,1%, а при ПОЛИГЕНе в дозе 600 мкг/см3 - на 100%

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что применяемые в настоящее время для санации спермы хряков-производителей препараты ГАМП и ПОЛИГЕН обладают достаточно высокой бактерицидной активностью в отношении микроорганизмов Однако при рассмотрении их безвредности в отношении спермиев хряков можно отметить, что абсолютная выживаемость спермиев несущественно отличалась от результатов анализа контрольной (несанированной) спермы - всего на 3-8% при использовании ГАМПа и 11-18% - ПОЛИГЕНа

Разработка нового антибактериального препарата для санации спермы хряков-производителей

Определение безвредно! тн для спермиев хряков-производителей энрофлона и гентамицина

Для определения максимально безвредной дозы выбранных антимикробных компонентов разбавленную сперму с препаратами исследовали по биологическим показателям абсолютной выживаемости ($) и выживаемости спермиев в часах (ч) Для этого в разбавленную сперму хр; ков (ГХЦС средой) вносили энрофлон в дозе от 50 до 2000 мкг/см3 (табл 3) и тенгамицин - от 100 до 2000 мкг/см3 (табл 4) В качестве контроля использовали образцы спермы без добавления санирующих препаратов Всего было проведено 4 опы 1а

Таблица 3 Абсолютная выжив <емость (8) и выживаемость спермиев хряков в часах в зависимости от дозы энрофлона (п = 4)

Энрофлон, мкг/см3 среды Результаты анализа спермы

Заморожено-оггаяная сперма Свежеполучснная сперма

Абсолютная выживаемость, S S, % к контр СП К) Выж1 ва-емось, час Выжива-е-мость, % к контролю Абсолютная выживаемость, S 8,% к контролю Выживаемость, час Зыжива-е-мость, % к контролю

50 S 97 108,7 213 112,/ 993 120,8 210 121,4

100 981 118,9 225 119,0 1048 127,5 219 126,6

200 1035 125,4 225 120,6 1110 135,0 231 133,5

300 1041 126,2 223 120,6 1122 136,5 231 133,5

400 1041 126,2 223 120,6 1105 134,4 235 135,8

500 1065 129,1 22% 120,6 1077 131,0 231 133,5

600 1065 129,1 231 122,2 1036 126,0 231 133,5

750/800 960 109,1 199 105,3 1021 124,2 211 121,9

1000 897 108,7 I9S 104,8 1010 122,9 204 117,9

1250/1300 894 108,4 195 103,7 952 115,8 196 113,3

1500 891 108,0 192 101,6 904 110,0 180 104,0

1750/1800 S46 102,5 190 100,5 744 90,5 147 85,0

2000 S37 101,5 190 100,5 580 70,6 118 68,2

Контроль 825 1000 189 100,0 822 100,0 173 100,0

Как видно из представленны* в таблице 3 данных, энрофлон оказывал незначительное токсическое действие на спермии хряков при внесении его в дозе 60 мкг/см3 и менее Так, если при вьесении энрофпона в дозе от 50 до 600 мкг/см3 абсо

лютная выживаемость и выживаемость спермиев в часах превышали значения кон трольного образца спермы на 18,9-29,1% и 19,0-22,2%, то уже при концентрации 80

мкг/см3 - только на 9,1% и 5,3% соответственно При увеличении концентрации эн-рофлона происходило постепенное снижение абсолютной выживаемости и выживаемости в часах и при внесении 1800-2000 мкг/см3 значение этих показателей имело несущественную разницу с контрольным образцом - всего 0,5-1,5%

Таблица 4 Абсолютная выживаемость (8)н выживаемость спермиев хряков в часах в зависимости от дозы геитамицина (п = 4)

Гентамицин, мкг/см5 среды Результаты анализа спермы

Заморожсно-оттаяная сперма Свежеполученная сперма

Абсолютная выживаемость, S S, % к контролю Выживаемость, час Выжива-е-мость, % к контролю Абсолютная выживаемость, S S, % к контролю Выживаемость, час Выжива-е-мость, % к контролю

100 714 112,3 153 108,5 823 111,8 202 110,4

200 723 115,1 156 110,6 880 119,6 208 113,7

400 756 118,9 156 110,6 1013 137,6 231 126,2

600 777 122,2 165 117,0 1050 142,7 237 129,5

800 708 111,3 159 112,8 1020 138,6 229 125,1

1200 708 111,3 159 112,8 996 135,3 228 124,6

1400 645 101,4 147 104,3 957 130,0 223 121.8

1600 616 96,6 135 95,7 918 124,7 207 113,1

1800 576 90,6 128 90,8 900 122,3 202 110,4

2000 513 80,7 117 83,0 876 119,0 196 107,1

Контроль 636 100,0 141 100,0 736 100,0 183 100,0

В отличие от энрофлона, гентамицин оказался более токсичным для спермиев хряков снижение абсолютной выживаемости и выживаемости спермиев в часах наблюдалось при его концентрации в среде 1600 - 2000 мкг/см3 среды При этом абсолютная выживаемость спермиев была ниже контроля на 3,4-19,3 %, а выживаемость спермиев в часах (ч) -на 4,3-17,0 % Лучшие результаты по двум показателям выживаемости отмечались при концентрации гентамицина 600 мкг/см3, которые превышали значения контроля на 22,2% и 17,0% соответственно

По сравнению со спермой хряков гентамицин для спермиев быков оказался менее токсичным, чем энрофлон Так, при дозах антибиотика в пределах 1600-2000 мкг/см3 абсолютная выживаемость спермиев по сравнению с контролем была выше на 24,7-19,0 %, а выживаемость спермиев в часах - на 13,1 - 7,1 %, тогда как при меньших концентрациях гентамицина значения этих показателей превышали таковые в контроле на 22,3-42,7% и 21,8-29,5% соответственно

Таким образом, результаты исследований показали, что степень токсичности од-

них и тех же антибиотиков на спермии разных видов животных неодинакова. Так, спермин хряков заморожено-оттая лая оказались менее чувствительными к энрофло-ну, чем сперма свежеполученная, а к гентамицину - наоборот

Изучение бактерицидного действия энрофлона и гентамицина на штаммы микроорганизмов, выделяемых из спермы

После установления безопасньх концентраций энрофлона и гентамицина следующим этапом исследований являлось определение их минимальной бактерицидной дозы в отношении штаммов культур УПМ, чаще всего контаминируюших сперму производителей и взятых как по отдельности, так и в ассоциации В опытах были использованы 2-х суточные агаровые культуры Р aeruginosa, Е coli, Р vulgaris а и S taecalis Из данных микроорганизмов при помощи оптического стандарта мутности ютовили одномиллиардную микробную взвесь, из которой затем путем последовательных разведений в физиологическом растворе получали взвесь, содержащую 50 тыс микробных клеток в 1 см3 Для приготовления ассоциации микроорганизмов, чаще всего встречающейся в сперме, их смешивали в соотношении 1.1 При изучении бактерицидных свойств гентамицина, его вносили в среды в концентрации от 12,5 до 600 мкг/см3

Было установлено, что минимальные бактерицидные дозы гентамицина для Е coli находились в пределах 300 мкг/см3 (бактериостатическая - 200 мкг/см3), Р aeiuginosa - 350 мкг/см3 (300 мкг'см3), S faecalis - 400 мкг/смЗ (350,0 мкг/ см3), на протеи и ассоциацию микроорганиз\юв гентамнцин оказывал только бактериостати-ческое действие в дозах 350-500 мкг/ш" среды

Аналогичные исследования были проведены с энрофлоном, который вносили в среды в концентрации 12,5-300,0 мкг/ см3 Минимальные бактерицидные дозы энрофлона для Е coli находились в пределах 200 мкг/см3 (бактериостатическая - 100150 мкг/см3), Р aeruginosa - 300 мкг/см3 (150-250 мкг/см3), стрептококка - 250 мкг/см3 (100-200 мкг/см"1), протея - 250 мкг/см3 (100-200 мкг/см3), а ассоциации микроорганизмов - 300 мкг/см3 (200-250 мкг/см')

При сравнении бактерицидной активности изучаемых антимикробных соединений установили, что минимально бактерицидная доза энрофлона для Ecoli, Р aeiuginosa, Р vulgaris a, S taecalis и ассоциации микроорганизмов была значитель-

но выше по сравнению с гентамицином

Таким образом, проведенные исследования показали, что среды, используемые для разбавления и хранения спермы хряков, не оказывали существенного влияния на бактерицидную активность санирующих препаратов по сравнению с физиологическим раствором

Изучение синергидного бактерицидного действия энрофлоксацина и гентамицина сульфата на штаммах и изолятах микроорганизмов

Учитывая бактерицидные концентрации энрофлона и гентамицина, нами была изучено синергидное действие данных антимикробных средств с целью снижения их суммарной концентрации в препарате и повышения бактерицидного действия в отношении микроорганизмов, контаминирующих сперму хряков Для этого нами были испытаны бактерицидные и бактериостатпчсские свойства различных соотношений энрофлона и гентамицина для выбора наиболее оптимального Данные вещества в концентрациях от 12,5 до 150 мкг/см3 смешивали в соотношениях 1 1, 3 1, 1 3, 1 б Данные определения оптимального соотношения гентамицина и энрофлоксацина в препарате ЭНРОГЕН, показали, что оптимальными их соотноа!ениями являются 1 1 и 1 3 Важно также отметить, что подбор оптимальных соотношений антибиотиков в комбинированном препарате целесообразно проводить при низких концентрациях на уровне бактериостатических, т к при более высоких концентрациях можно не уловить их сочетанное бактерицидное действие на микрофлору Так, при соотношении гентамицина и энрофлоксацина в препарате ЭНРОГЕН в общей дозе 12,5 мкг/см3 среды он уже проявляет бактериостатическое действие на кишечную палочку, а в дозе 25,0 мкг/см' при том же соотношении гентамицина и энрофлоксацина бактерицидную, что не наблюдается при соотношении гентамицина и энрофлоксацина 3.1 и 1 6 в той же дозе

Определение максимально безвредной дозы для спермиев хряков и минимально бактерицидной дозы препарата ЭНРОГЕН

После отработки состава комплексного антимикробного препарата для санации спермы хряков были проведены исследования по определению его максимально безвредной дозы для спермиев Для этого в разбавленные Г'ХЦС средой сперму хряков

вносили различные концентраци I разработанного препарата ЭНРОГЕН и изучали абсолютную выживаемость и выживаемость спермиев в часах (табл 5)

Таблица 3 Абсолютная выживаемость (8) и выживаемость спермиев хряков в часах в зависимости от дозы ЭНРОГЕНА

ЭНРОГЕН, мкг/см3 среды Результаты анализа спермы

Заморожено-оттаян.ш сперма Свсжсполученая сперма

Абсо пют-«я выживаемость, Б Б, % к контролю Выжл-ва-емост|, час Выжива е-мость, '/о к контролю Абсолютная выживаемость, Б % к контролю Выживаемость, час Выживаемость, % к контролю

50 687,0 103.2 144,0 102,1 1110,0 118,4 240,0 119,4

100 711,0 106,8 162,0 114,9 1036,0 110,6 234,0 116,4

200 798,0 119,8 172,') 122,3 1081,5 115,4 238,5 118,6

400 813,0 122,1 174,0 123,4 1105,5 117,9 244,5 121,6

800 846,0 127,0 184,) 130,8 1098,2 117,1 241,5 120,1

1200 849,0 127,5 184,5 130,8 1069,5 114,1 241,5 120,1

1600 810,0 121,6 184,) 130,8 985,0 105,1 214,5 106,7

2000 762,0 114,4 181,5 128,7 945,0 100,8 211,5 105,2

2400 730,5 109,7 172,5 122,3 790,5 84,3 183,0 91,0

2800 661,5 99,3 157,5 111,7 729,0 77,8 169,5 84,3

3200 625,5 93,9 156,0 110,6 694,5 74,1 157,5 78,3

Контроль 666,0 100,0 14] 100,0 937,5 100,0 201,0 100,0

Изучение безвредности ЭНРОГЕНА для спермиев хряков показало, что их абсолютная выживаемость снижалась соответственно на 0,7-6,1 % по сравнению с контролем при концентрации препарата в ГХЦС среде в количестве 2800-3200 мкг/см3, тогда как выживаемость спермиев в часах была при этих же концентрациях препарата на 10,6-11,7% выше значений контрольного образца

Наилучшие результаты по безвредности ЭНРОГЕНА для спермы хряков отмечены в интервале его концентраций от 200 до 2000 мкг/см3, тогда как для спермы свежеполученной - от 200 до 1200 мкг/см3 Это показывает, что сперма хряков оказалась менее чувствительной к ЭНРОГЕН У, чем сперма замороженно-оттаянная

После изучения безвредности ЭНРОГЕНа для спермиев хряков важным являлось выяснение минимальной бактерицидной дозы препарата в отношении микроорганизмов, выделяемых из спермы эгих производителей Для этого различные дозы препарата вносили в среды, применяемые для разбавления и хранения спермы (физиологический раствор, среды ЛГЖ, ГХЦС) Были использованы концентрации ЭНРОГЕНА в пределах 12,5 - 300 мкг/ см3, т к использование более высоких кон-

центраций, на наш взгляд, было нецелесообразно по причине большого расхода препарата (табл 6)

Таблица 6 Мнниальные бактерицидные концентрации гентамицнна, энрофлоиа и ЭНРОГЕНА в отношении ряда микроорганимов

Культуры микроорганизмов

Доза, мкг/см3 Препарат Е coli Р aerugi- Р vulgaus S faecal is Ассоциация мик-

nosa а роорганизмов

Гентамицин + + + + +

12,5 Энрофлон + + + + +

ЭНРОГЕН + + + +

Гентамицин + + + +

25,0 Энрофлон + + + + +

ЭНРОГЕН - ± + + +

Гентамицин + + + + f

50,0 Энрофлон + + + + +

ЭНРОГЕН - - ± +

Гентамицин + + + + +

100,0 Энрофлон ± + ± + +

ЭНРОГЕН - - ± ±

Iентамицин + + + + +

150,0 Энрофлон ± +

ЭНРОГЕН - - - - -

Гентамицин + + + +

200,0 Энрофлон - -

ЭНРОГЕН - - - - -

Гентамицин ± + + + 1-

250,0 Энрофлон - - -

ЭНРОГГН - - - - -

Гентамнцин - ± + + +

300,0 Энрофлон - - - -

ЭНРОГЕН - _ - - -

"+"- рост микроорганизмов "- "- рост отсутствует, "+"- задержка роста микроорганизмов

Проведенные исследования показали, что препарат ЭНРОГЕН обладал более высокой бактерицидной активностью в отношешш ряда микроорганизмов, чаще всего присутствующих в сперме животных, по сравнению с гентамицином и энрофлоном

Из полученных данных следует, что комплексный препарат ЭНРОГЕН в дозе 25 мкг/см3 среды оказывал бактерицидное действие на Е сок и бактериостатическое - на Р аеп^тоБа, тогда как отдельно гентамицин и энрофлон не подавляли рост вышеуказанных микроорганизмов В дозе 50 мкг/см3 среды ЭНРОГЕН проявлял бактерицидное действие на кишечную и синегнойную палочки и бактериостатическое действие на стрептококки и протей, что не наблюдалось при применении отдельно ген-

тамицина н энрофлона В дозе 20 ) мкг/см3 ЭНРОГЕН оказывал бактерицидное действие на все использованные в опытах микроорганизмы

Таким образом, результаты экс периментапьных исследований позволяют сделать вывод о синергидном бактерицидном действии энрофлоксацина и гентамицина при их комплексном применении, что позволяет существенно снизить их суммарную концентрацию в препарате ЭНР01 'ЕН

Эффективность применения нового комплексного антимикробного препарата ЭНРОГЕН для санации спермы хряков-производителей

Следующим этапом исследовгнии являлось изучение бактерицидного действия ЭНРОГЕНА непосредственно на 4 перме животных Для определения эффективности препарата были проведены исследования по оценке его влияния на микробиологические показатели разбавленной спермы хряков Для этого в образцы спермы препарат добавляли в концентрациях 50, 100 и 150 мкг на 1 см3 ГХЦС среды, а контролем служили образцы спермы без его внесения (табл 7)

Таблица 7 Бактерицидное действие препарата ЭНРОГЕН на микрофлору

спермы хряков

Неразбавленная Сперма, разбавленная ГХЦС средой

Показатель без препа-ра-та с 50 мкг/см3 с 100 мкг/см3 с 150 мкг/см3

сперма ЭНРОГЕНа ЭНРОГЕНа ЭНРОГЕНа

Количество проб 150 150 57 140 36

Среднее число мик- 574941,95 90207,5±1004 87,57± 32,6± 13,5±

роб клеток ±51732,0 ,9 18,7 9,5 2,9

в 1 см1 спермы

Число проб без - - 35 91 25

микрофлоры / % 61,4 65,0 69,4

Колн-титр 0,00001 30/32,3

0,0001 24/25,8 - - - -

0,001 57/38 0 25/16,7 - - -

0 01 17/11.3 29/19,3 - - -

0,1 4/2,6 24/16,0 2/3,1 - -

выше 0,1 18/12,0 72/48,0 57/100,0 140/100,0 36/100,0

Анализ полученных данных показывает, что свежеполученная неразбавленная и

разбавленная 1 2 ГХЦС средой сперма хряков до внесения препарата ЭНРОГЕН имела высокую микробную контаминацию, которая составляла соответственно

574941,9±51732,0 и 96207,5±1004,9 КОЕ/см3 При санации разбавленной спермы хряков препаратом ЭНРОГЕН в дозе 50 мкг/см3 среды количество микроорганизмов в ней было а пределах 87,57±18,7 КОЕ/см:, 100 мкг/см3 - 32,6±9,5 , а 150 мкг/см3 -13,5+2,9 КОЕ/см3, причем число проб спермы без микрофлоры было 61,4%, 65,0 и 69,4% соответственно

Коли-титр во всех исследованных пробах при использовании препарата ЭНРОГЕН был выше 0,1 200 мкг/см3

После получения результатов о положительном влиянии препарата ЭНРОГЕН на уровень снижения микробной контаминации спермы хряков нами были проведены исследования по санации замороженной спермы быков Для этого препарат ЭНРОГЕН был использован в дозе 200 мкг/см3 среды ЛГЖ Проведенные испытания показали, что количество микроорганизмов в 1 см3 спермы было в пределах 11,0±0,09, при этом 95,5% образцов спермы были свободными от микрофлоры, а коли-титр во всех случаях был выше 0,1 По санитарному показателю было выбраковано только 1,3% образцов спермы

Полученные данные свидетельствуют о выраженном бактерицидном действии комплекса гентамицина и энрофлона в препарате ЭНРОГЕН

Таким образом, проведенные исследования подтвердили эффективность применения нового комплексного антибактериального препарата ЭНРОГЕН для санации спермы хряков и быков-производителей

Влияние препарата ЭНРОГЕН на оплодотворяющую способность спермисв хряков - производителей

Определение эффективности применения изучаемых препаратов для санации спермы хряков-производителей проводили на двух свинокомплексах Для этого на свинокомплексе «Кузнецовский» с препаратом ЭНРОГЕН в сперме было осеменено 856 и с препаратом ПОЛИГЕН - 630 свиноматок, на свинокомплексе «Краснодонское» - 59 и 134 свиноматки, соответственно В контрольных группах осеменение свиноматок проводили разбавленной не санированной спермой

Оценку эффективности препаратов проводили по числу опоросившихся свиноматок и пришедших повторно в охоту, а также по количеству полученных поросят на 1 свиноматку (табл 8)

Таблица 8 Результаты осеменения свиноматок спермой хряков-производителей, санированной ЭНРОГЕНОМ и ПОЛИГЕНОМ

Наименование Доза, мкп Осемен :но свиноматок Опоросилось Получено поросят

препарата см3 всего повторно пришед- число % всего На одну

среды ших в охоту матку

кол-во %

Спинок шгшекс «Кузнецовский»

ЭНРОГРН 150 856 122 14,3 734 85,7 7707 10,5

ПОЛИГЕП 600 630 102 16,2 528 83,8 5333 10,1

КОНТРОЛЬ — 140 32 22,9 108 77,1 1026 9,5

Свинокомплекс «Краснодонское»

ЭНРОГЕН 150 59 9 15,3 47 80.0 484 10.3

ПОЛИГЕН 300 63 12 19,0 49 78,0 456 9,3

600 71 12 17,0 57 80.0 547 9,5

КОНТРОЛЬ — 52 11 21,0 40 77,0 364 9,1

Аналогичные исследования на свинокомплексе «Краснодонское» также выявили некоторое преимущество препарата ЭНРОГЕН в дозе 150 мкг/см3, который обеспечил плодотворное осеменение 80% свиноматок, в то время как при применении ПОЛИГЕНа в дозах 300 и 600 мкг/см3 ГХЦС среды соответственно было осеменено 78% и 80% и в контроле - 76 %, получено поросят соответственно - 10,3, 9,3 и 9,6 на одну матку, в группе без санирующих препаратов (40 свиноматок), получено поросят на одну матку - 9,1

Таким образом, проведенные исследования выявили более высокую эффективность разработанного препарата ЭНРОГЕН по сравнению с ПОЛИГЕНОМ по влиянию на оплодотворение свиноматок

В результате повышения оплодотворяемости было получено дополнительно 866 поросят, что превышает показатели контрольных свиноматок в 1,4 раза

Стоимость приплода определяли из расчета количества полученного молодняка, живой массы приплода и цены реализации 1 кг живой массы (61 руб)

- до применения препарата - 647 61 1,2 = 4736,4 руб,

- через 2 месяца после применения препарата - 866 61 1,2 = 63391,2 руб Стоимость дополнительной продукции составила

63391,2 - 4736,4 = 16030,8 руб.

Материальные затраты складывались из стоимости препарата ЭНРОГЕН, которые составили 1200 руб за 1 кг Учитывали количество израсходованного ЭНРОГЕНа -

40 мг на 105 кг продукции

Таким образом, экономический эффект применения препарата ЭНРОГЕН составил 143800,9 руб , а экономический эффект на рубль затрат - 80,72 руб

ВЫВОДЫ

1 Установлена высокая микробная контаминация свежеполученной неразбавленной спермы хряков-производителей, которая в среднем составляет 78428 ± 19237 м т в 1 см3, а коли-титр - от 0,001 до 0,0001 (у 60% исследованных проб) Микрофлора спермы состоит из ассоциации микроорганизмов, которая представчена си-негнойной, кишечной, сенной палочками, грибами, стрептококками Наиболее часто из спермы выделяют синегнойную палочку и протей

2 Выявлена определенная закономерность, что сперма хряков, полученная в весенне-летний период, содержит значительно большее количество микробных клеток и высокий коли-титр, чем сперма, полученная в зимнее время года

3 Введение в искусственные среды новых комплексных санирующих препаратов ГАМП и ПОЛИГЕН в разбавленную и замороженную сперму хряков в дозах 300-600 мкг/см3 среды подавляет рост условнопатогенной микрофлоры, снижает микробное число в 29-192 раза в разбавленной и замороженной сперме

4 На фоне применения препарата ПОЛИГЕН происходит увеличение качества спермы в среднем на 10,2%, концентрации спермиев в 1 мл объема эякулята на 0,033 млрд, активность на 0,3 балла, а резистентность - на 388,25 ед , сочетанное применение санирующих препаратов спермы у хряков-производителей оказывает положительное воздействие на соотношение живых и мертвых спермиев У 75% хряков-производителей произошло увеличение среднего показателя живых спермиев на 18,6%, а активность спермиев у 85% превышала фоновый показатель на 19,1% Санирующее действие препарата ПОЛИГЕН в разбавленной и замороженной сперме хряков в 1,5 раза эффективнее, чем препарата ГАМП

5 При санации как разбавленной, так и замороженной спермы хряков препаратами ГАМП и ПОЛИГЕН в дозах 300 и 600 мкг/см3 среды улучшались биоло! ические

показатели качества спермы сохранность акросом - на 7-12 %, а выживаемость спермиев, по сравнению с не санированной спермой - на 22-29 % Микробная контаминация спермы хряков-производителей была выше, чем обсемененность эякулятов без применения препарата ЭНРОГЕН

6 Комплексный препарат ЭНРОГЕН более эффективен по сравнению с входящими в его состав препаратами ЭНРОФЛОКСАЦИНОМ и ГЕНТАМИЦИНОМ СУЛЬФАТОМ в дозе 25 мкг/см3 и 50 мкг/см3 он оказывает бактерицидное действие на кишечную и синегнойную палочки, в дозе 150 мкг/см3 среды - на стрептококки, протей и ассоциацию исследованных микроорганизмов

7 Добавление в сперму хряков комплексного санирующего препарата ЭНРОГЕН в до 1С 150 мкг/см3 значительно улучшило санитарное качество спермы Среднее число микробных тел в 1 см3 р.избавленной спермы составляло 13,5±2,9 В 69% спермы рост микроорганизмов не установлен, а коли-титр был отрицателен во всех образцах исследованной спермы

8 Сочетание ГЕНТАМИЦИНЛ СУЛЬФАТА и ЭНРОФЛОКСАЦИНА в соотношении lin препарате ЭНРОГЕН близко к оптимальным величинам, а их бактерицидное действие на микрофлору сиязано с их синергидным действием.

9 Применение для искусственного осеменения свиноматок спермы хряков, сохраненной при температуре 16-20пС, санированной препаратами ГАМП и ПОЛИГЕН повышает оилодотворяемость сви10маюк при 1-ом осеменении на 8-13 % , а также повышают выход поросят на I свиноматку в 1,8-1,9 раз, по сравнению с не санированной спермой животных контрольной группы

10 Оплодотворяемость свиноматок после первого осеменения при применении спермы хряков, санированной препаратом ЭКРОГЕН в дозе 150 мкг/см3 среды, составила 85,7%-8()% и получение поросят в среднем 10,5-10,3 на одну свиноматку

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Для санирования спермы хр шов-производителей разработан новый эффективный комплексный препарат ЭНРО ГЕН

2 Разработан проект техничеси х условий на препарат ЭНРОГЕН (ТУ)

3 Разработана временная инструкция по применению санирующего препарата

ЭНРОГЕН в ветеринарии

4 На базе временной инструкции на препарат ЭНРОГЕН организовано серийное производство препарата Показатели качества препарата соответствуют требовани ям ТУ

5. По результатам исследований разработаны и одобрены 24 марта 2005 г (протокол № 1) секцией патологии, фармакологии и терапии Российской сельскохозяйственной академии «Методические указания по диагностике, терапии и профилактике болезней органов размножения и молочной железы свиней»

6 Материалы исследований используются в учебном процессе в ВУЗах РФ при изучении студентами и слушателями курсов повышения квалификации зооветеринарных специалистов свиноводческих хозяйств дисциплины «Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения животных»

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1 Для повышения эффективности воспроизводства свиноматок рекомендуется вводить в искусственные среды - разбавители спермы новые комплексные санирующие препараты ЭНРОГЕН в дозе 150 мкг/см3, ГАМП и ПОЛИГЕН в дозах 300-600 мкг/см3 среды

2 Для искусственного осеменения свиноматок рекомендуется применять сперму хряков сохраненную при 16-20°С и санированную препаратами ГАМП и ПОЛИГЕН, что повышает оплодотворяемость при 1-ом осеменении на 8-13 %, а выход поросят на 1 свиноматку в 1,8-1,9 раз, по сравнению с не санированной спермой животных контрольной группы, а при использовании нового санирующего препарата ЭНРОГЕН увеличивается оплодотворяющая способность свиноматок на 4-8% по отношению к контролю

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Санирующие препараты для повышения качества спермы хряков-производителей /С В Советкин, В Н Родина, М Е Евсюков, В Т Смирнов, С М Саидова //Ветеринария - 2000 - № 6 - С 48-50

2 Советкин С В Чувствительность микроорганизмов, выделенных из спермы быков-производителей к полимиксину Е и энрофлону /С В Советкин, В H Родина, С M Саидова // Сборник научных трудов ВГНКИ Том №63 M • Техполиграфцентр-2001 - С 176-177

3 Борунова С M Разработка hoboi о комплексного препрата, применяемого для санации спермы производителей /С M Борунова //Матер междунар науч -практ конф по профилактике, диагностике и лечению инфекционных болезней, общих для человека и животных - Ульяновск- ГСХА - 2006 - С 440-442

4 Борунова С М. Определение максимальной безвредной дозы для спермиев хряков и минимальной бактерицидной дозы комплексного препарата для санации спермы - «Энрогек» /С M Борунова //Матер междунар науч -произв конф по проблемам лечения и профилактики акушерско-гинекологической патологии с -х животных - Ставрополь ГСХА -2007-С

5 Борунова С M Полимиксин-М, применяемый для санации спермы /С M Борунова //Матер XV Московского международного ветеринарного конгресса - M ЗАО «Издательский Дом» - 2007 - С 155

Типография ордена «Знак Почета» издательства МГУ 119992, Москва, Ленинские горы Заказ № 235 Тираж 100 экз