Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Влияние типа культуры клеток и штамма вируса на антигенную активность инактивированной ассоциированной вакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота

РГ Б ии

- 8 МАЙ 1885

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ им. К. И. СКРЯБИНА

На правах рукописи.

СИДИБЕ ШАРЛЬ ЭМИЛЬ КАЛИЛУ

ВЛИЯНИЕ ТИПА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ШТАММА ВИРУСА

НА АНТИГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ ИНАКГИВИРОВАННОЙ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РШЮТРАХЕИТА И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

- Еетерин-.рнад микрс-С-иологил. вирусология. иммунология, эпизоотология и микология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата ^ет-рпннрных наук

МОСКВА 1995

забота выполнена е Московской государственной академии ветеринарной медицины п биотехнологии им.К.И.Скрябина.

Научный руководитель: доктор ветеринарных и биологических наук. Заслуженный деятель наук Российской Федерации, академик РАСХН, профессор 'Зорин В.Н.

Официальные оппоненты:

'1. Доктор ветеринарных наук Соболев Е.Е.

2. Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Чистова 3.Я.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Л.Р.Коваленко.

Защита диссертации состоится " 1995 г. в

/(О часов на заседании диссертационного Сонета К-120.26.05 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина ¡109472. Москва, ул. Академика Скрябина. :?5; тел. 377-93-83'I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан " %£>» ал/ь-елх 19

995 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

Ме-ЬишиКОВЬ. З.Н.

- 1 -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность теми. В условиях интенсивного ведения животноводства актуальный характер приобретает борьба о вирусными респираторными желудочно-кишечными заболеваниями молодняка крупного рогатого скота. Они обычно появляются через 15-20 дней поолэ комплектования сборного стала из хозяйств поставщиков на фоне различных стрессовых воздействий. К числу таких болезней относятся вирусная диарея (ВД) и инфекционный ринсхрахеит (ИРТ; крупного рогатого скота, надежная специфическая профилактика которых не утратила своей актуальности. Однако для эффективной нчкцини-про-филактики данных инфекций необходима высокоантигенная и иммуно-гевная вакцина, так как проблема специфической профилактики этих инфекций имеет свои особенности, обусловленные их патогенезом. Наиболее существенными из них являются: внутриутробная передача вируса и его длительная персиотенцмя у клинически здоровых иивот-ных и реконвалесцентов, сопровождающаяся наличием различного уровня специфических антител. Это обстоятельство крайне затрудняет сортировку стада по принципу: иммунное - неиммунное животное.

Специфическая профилактика ВД и ИРТ во многих странах осуществляется с помощью ливых и инактивированнызц вакцин при строгом соблюдении стратегии их применения в зависимости от направления хозяйств (откорм, репродукция) и других особенностей, связанных с биологией возбудителей и формами течения инфекции.

В предыдущие годы в лаборзторкн Бирусологии МВД созданы инзктивированные вакцины в моноварканте против БД. и ИРТ, а гг-кле пров?дены исследования па тзграСотке ассоциированной вакцины (В.Н.Сюрин 1983; Г.А.Халенев и др. 1990, 1993, 1991; С.П.Родькин 1338). Все эти вакцины готовили используя первичны* культуры клеток крупного рогатого скота, чтг яел?<-ттгудоемкям и

дорогостоящ») .процессом. Поэтому многие исследователи культивируют данные Еирусы на диплоидных или перевиваемых линиях клеток с целью получения большие: объемов относительно дешевкх инактивиро-ванных вакцин (Me Clarkin A. et al. 1974; Mareus S.J., toll F. 19o8 (ЩВЮ: Femelius A.L. 1907 (PK); Гизитдинов H.H. и др. 1976 (ППЗК); Файзулина С.И. и др. (ОП) и другие).

Существует мнение, что максимальной иммуногенностью в инак- -тивированных препаратах обладают нзиболее вирулентные штаммы, кроме того, в отношении вируса диареи достаЕерно установлено, что наибольшей иммуногенностью в инактивированных вакцинах обладают те штаммы вирусов, которые продуцируют большее количество póJtbo-римого антигена (Мо Clurkin A., Corla М. 1978). Поэтому выбор штамма и поиск чувствительной перевиваемой линии клеток для репродукции ИРТ и БД при сохранении их антигенных я иммуногенных свойств является актуальной задачей.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось научение влияния типа культуры клеток в штамма вируса на антигенную активность разработанной в лаборатории вирусологии МГАВУиБ инактивированной ассоциированной вакцины против ВД и ИРТ1 крупного рогатого скота.

В овяви о этим задачами исследований были:

1. Сравнительное изучение репродуктивных особенностей штаммов вируса диареи (БД) и инфекционного ринотрахеита (ИРТ) нз первичной и перепиваемой культурах клеток.

2. Сравнительное изучение антигенной активности двух штаммов ВД {эталонного - Орегон C-24V и эпизоотического - БДТЛ) на лабораторных животных.

3. Сравнительное изучение антигенной активности икактизиро-ьвдной ассоциированной вакцины против ВД и ИРТ, полученной с кс-

пользованием первичной и перевиваемой культур клеток на лаоо ,»<£•' торных животных.

4. Изучение корреляции результатов, полученных на лабораторных животных с таковыми на естественно-восприимчивом крупном рогатом скоте.

1.3. Научная нааиаиа. Установлено, что полевой изолят вируса диареи ВДТЛ, выделенный и культивируемый в культуре перевиваемых клеток КСТ (коронарные сосуды теленка), обладает большей антигенной активностью по сравнению о эталонным штаммом Орегон C-24V.-

Использование данного иволята ВД и чувствительных перевиваемых линий клеток (КСТ для вируса ВД и ВДВ К. для вируса КРТ) для изготовления ассоциированной инактивированной вакцины практически не снижало ее антигенной активности по сравнению о монокомпонентными препаратами, для производства которых используются первич-

.•ч

но-тряпсинизированные культуры почки эмбриона коровы (ПЭК) или тестикул бычков (ТБ). Это позволяет снизить себестоимость препарата за счет снижения затрат труда и материальных средств на его производство.

1.4. Практическая ценность. Результаты проделанной раСоты имеют значительную практическую ценность, так-как являются неотъемлемой часть» исследований, направленных на изучение высокоим)^у-

ногенной инактивированной ассоциированной вакцины против ВД и ♦

ИРТ.

'1.6. Апробация работы. Основные положения диссертация доложены и получили положительную оценку нз медлаСораторном совещании сотрудников ,'аСоратории и кэфецры Вирус огки, нз конференциях Ветеринарного факультета в 1.9г2-1994 г.г. . отражены в дчух опубликованных статьях.

1.5. Объем работы. Дпго* р гащя тт-л яа к я J'uO стрч«!'.»:

машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 15 таблицами и 41| рисунками. Библиографический указатель включает 224 источников литературы, иэ них 184 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

Работа выполнена в 1992-1694 г.г. нз базе научно-исследовательской лаборатории ветеринарной вирусологии МВА.

Вируо. В работе использовали два штамма вируса диареи крупного рогатого скота; полевой иеоллт БДТЛ, выделенный нами совместно с сотрудниками лаборатории от больного- теленка в период эпизоотической вспышки болезни в одном иг хозяйств Тульской области с титром 10^' ®ТЦДзо/мл; эталонный лтамм OpeJ-он C-24V, культивируемый в лаборатории с титром 10 5'5ТЕЙ5о/мл и производственный штамм вируса ИРТ "4016", выделенный в 1977 г. от больного теленка в лаборатории вирусологии MSA с титром Ю7' °ТЦД5о/мд.

Культура теток. В исследованиях использовали .первично-трип-синиэироваиные культуры клеток тбстикул бычка (ТВ) и их субпвоса-жи, в также перевиваемые линии культур клеток эпителия коронарных сооудов теленка (HCT) и (Madin Darby Bovine Kidney) ВДВК. Линия ТОТ была получена сотрудниками ВЙЭЗ (Куликова К.Л. Дьяконов Л.П., Жидков С. А., Гоголев М.М.) и любезно предоставлена нам.

Выращивание ВД и ИРГ и культурах клеток. Адсорбцию вирусов на монослой перевиваемых клеток проводили в течение 1-1,5 часа при 87°С. Затем в зараженную культуру добавляли поддерживающую среду Игла или 199 без сыворотки. Зараженные и контрольные культуры клеток инкубировали в термостате при 37°С. После проявления ЦПД иируссодержащую жидкость собирали и хранили при t° 4-б°С.

- б -

Идентификации выделенного вируса осуществляли в РН о постоянной дозой сыворотки (нейтралигация по индексу) по общепринятой методике.

Этиологическую роль выделейного идентифицированного вируса устанавливали путем определения к нему антител в парных пробах сывороток крови рекснвзленцентов.

Определение инфекционного титра вируоов. Инфекционньй титр ¿ируса определяли по цитопатическому действию (ЦОД) в пробирочных культурах клеток по общепринятой методике и вычисляли по методу Рида и Менча.

Кинетику репродукции вируса диареи (БДТЛ и Орегон C-24Y) в культуре клетск КСТ и вируса КРТ "4016м в культуре ЩВК изучали в зависимости от дозы заражения и времени инкубации. Пробирочные культуры клеток гаражали возраставшими дозами от Ю-5 до 10'1ТПД5о/на клетку, и каждую серию зараженной культуры инкубировали в течение от 7 до 10 дней при ежедневном отборе проб вируса для титрования, инфекционную активность вируса в каждой серии инфицированной культуры клетск определяли раздельно в КСТ.

Стабильность штаммов (Орегон C-24V и ВДТЛ) изучали в культуре KCl в процессе многократного пассирования (до 15 пассажей).

Инактивация вируса. Вирус инактивировали димером этиленимина по методу, разработанному в лаборатории вирусоло м МВА. Контроль полноты инактивации проводили на культуре клеток КСТ.

Антигенную зктлвность иначтивированных препаратов изучали на белых крысах массой 200-250 г, стельных коровах к телятах 1.5-2 месячного возраста.

Опыт 1. йру'-заи антигенную активность рялз пнактнЕИрсЕанных препаратов.

Вариант 1. иг шт. ОРЕГОН C-24V, вкращенит-го в культур? ТВ с тит-

- а -

ром 105'0Ш50./МЛ. Вариаат 2. из шт. ОРЕГОН C-24V, выраженного в культуре (КСТ) (

титром 10е'бТЦД50/мл. Вариант 3. иа эпизоотического изолята ВДТЛ, выращенного а культуре ТЕ о титром 10е' °ТЦДбо/'МЛ. Езриант 4. из эпизоотического изолята ВДТЛ, выращенного в культуре клеток КСТ с титром 10°' еТЦД5о/мл. Вариант 6. ив шт. "4016", выращенного в культуре клеток ТЕ о титром 10°'вТЦД50','мл. Вариант 6. из шт. "4016", выращенного в культуре ЦЦВК о титроь 107' °ТЦД50/ИЛ.

В опыте использовали 7 групп крыс по 6 голов в каждой. Группы 1-6 соответствовали вариантам препарата, седьмая служила контролем. Крыс 1-6 групп прививали двукратно с интервалом 14 дне* внутримышечно в' область бедра в дозе 1 мл. Об антигенной активности различии препзрзтов судили по уровню вируонейтрализующих антител. У всех подопытных групп животных брали пробы крови дс з&чцинацим, перед ревакцинацией, опустя 4 и 8 недель. В сыворотках крови одновременно определяли уровень вируонейтралиауювдх антител против вирусов ВД и KFT, последние использовали в дозе 100-500 ТВДзо/на пробирку. Полученные данные подвергали статистической обработке.

Опнт 2. Исходя иэ результатов опыта 1, наш Яшм изготовлены 4 экспериментальных ассоцкировэнных таг активированных препарате против ВД к ИРТ КРС, путем смешиванил ионокомпонентов, соотноаа-ние которых зависело от результатов предварительного контроля их активности.

с упаит 1. Смешивали инактивированные моновакцины против В| Гштьмм ОРЕГОН C-24V, выращенный в культуре TS) и ИРТ

(штамм "4016", выращенный в культуре ТБ).. Вариант 2. Смешивали инактивированные мсноьакдины претив БД (шт.

ОРЕГОН C-24V, выращенный в культуре КСТ) и против ИРТ (шт. "4016", выращенный ь культуре ВДВК). Барианты 3 и 4. Соответствовали варианту 1 и 2, но вместо шт.

ОРЕГОН C-24V использовали эпизоотический иэоаят ВДТЛ.

Сравнительное изучение различных вариантов ассоциированных вакцин проводили на белых крысах массой 250-300 г. В опыте использовали Б групп животных по Б голов в каждой.

Всех крыс групп 1-4 прививали двукратно как описано ранее в соответствии с вариантом препарата, 5 группа служила контролем.

Об активности различных вариантов судили по урогне вирус-нейтрадиэующих антител. У всех крыс брали кровь иг сердца до вакцинации, перед ревакцинацией, спустя 4 и 8 недель после ревакда-

N

нации. В сыворотках крови одновременно определяли уровень вирус-нейтрализующих антител против ВД и ИРТ по ранее описанному, методу.

Опыт 3. С цель» определения сроков и режима хранения в опыте 3 вакцину хранили в двух вариантах: в виде монокомпонентов, смешиваемых перед вакцинацией, и в смешанном виде.гОба варианта препарата хранили при температуре б-8°С (нижняя полка бытового холодильника) а при 22-24°С (комнатная температура) в течение 12 месяцев (срок наблюдения). Через 6 и 12 месяцев хранения каждым образцом одновременно прививали 4 группы крыс по гслоьы а качдой как описано ранее.

Опит 4. Исходя из результатов сравнения ра^.-пг-ш^-: вэр.нантов ассоциированных кн активированных вакцин протий ВД Н5.чл бы-

ла изучена антигенная активность лучшее? •• ? '.я-:7а нч £-1т»стнен • новссгрииучкгкх ««г-тны? t ст-"ль;-(;д ^резчк и т<ДОГ<м|<

- а -

Для этого использовали 2 групш коров на 7-3 месяцев стельности и г группы телят в возрасте 40-60 дней, по 10 голов в каждой, не имеющих вируснейтралиаующи антител в титре более 1;8 (3

Коров и телят первой группы вакцинировали двукратно о интервалом 14 дней, внутримышечно в область бедра и ревакцинировали тем же методом в дозе 10 мл и б мл соответственно. У всех животных предварительно исследовали сыворотки крови для с. ределения исходного уровня вируснейтраляэующих антител к вирусу диареи и инфекционного ргаготрахеита. Кроме того для испытания безвредности вакцины Е коровам и 5 телятам ввели однократно по 50 мл и 25 мл соответственно. В течение 7 дней после каидой прививки за животными вели клиническое наблюдение.

У ко£Юв и, телят в аналогичные сроки (до вакцинации,' перед ревакцинацией, 30, 60, 120, 180 дней после ревакцинации) исследовали пробы сывороток крови для определения титра вируснейтралиэу-ющих антител как против ВД, так и против ИРТ.

Диагностическим титром считали уровень антител в сыворотках животных более 3 log's. При наличии в стаде 30 и более процентов цоложительно реагирующих животных считали его 'неблагополучным.

2.2. Результаты иосдедавшэш.

Из.патологического материала от телят, больных респираторным заболеванием,: на. 3 пассаже в культуре клеток КС7 был выделен вирус, который стабильно репродуцировался до б пассажа..

При исследовании" в реакции нейтрализации 5-го пассажа этого вируса со специфической сывороткой из набора ди.згностккумов, индекс нейтрализации составил 3,57 lg, что позволило' вденткфициро-¿ать его. 'как гирус диареи крупного рогдтого скота, который получил ,рабоч;ее название ВДТЛ (вирус диареи Тула лимфоузлы). При не-

- э-

пользовании сыворотки крови реконвалецентов, Индекс нейтрализации был равен 3,33 1г, что указывает на этиологическую роль выделанного агента.

Полученные результаты по динамике титра вируса диареи (шпш ЩТД) показывают, что существует выраженная зависимость уртаял накопления вируса от дозы варажения. Так при заражающей доев 10~2ТЦД5о/на клетку (для КСТ) и W'îIOfeo (для ТЕ) был иояучея Наивысший инфекционный титр вируса 10е' 97ТЕД5;Уш и Ю5,7ТВД5о/мл, а сроки наступлещга «ai- шального $ЩД составили' 30-48-ч и 40-БО ч,.соответственно.

При дозах заражения 10~3- 10~4 ТЗДзо/клетка наивысш» титр!» вируса устанавливали на 3-4 сутки после заражения дйя КСТ и ТВ, соответственно. При меньших дозах (1СГ5ГЦД5о/кле1ка)яа 5 И Р сутки соответственно. Также установлено, что татр вирус?а в культуре клеток после достижения пика резко снижается в случае дальнейшей инкубации эараленной культуры клеток, что свидетельствует о высокой чувствительности внеклеточного вируса к температуре.

Для сравнения mm была изучена динамика размножения эталонного йтамыа 0FET0H С-24V в культурах ТВ и КСТ.

При сравнении репродукции шт. ОРЕГОН C-24V в обоих культурах КСТ и ТВ, было отмечено, что время для выявления максимального ЦПД для КСТ (Зв-48 часов) на 24 часа меньше, чем для культуры ТБ (60-72 часа) и титр'вируса для КСТ на 0,631 s выше, чем для ТЕ и составил 10е' 15ТЦД5оА5Л.

Параметры культивирования штамма ОРЕГОН C-24V были известны нэ-работ Femelius A.'L. st.al. 1969; Me Clurkin A.W. et al. 1974; Г°:зргио M.M. 1981 и др. à значительной степени совпадали о'наплрн далньм" по дкяакике репродукции втамма ВДТЛ. Поэтому в работе со ташты рдтл m румгшодсткжопг* , закояомернсютью, .. еколерпшн-

увеыс установленной а опытах со штанмом ОРЕГОН C-24V.

При сравнении размножения втаммов вируса диареи (Орегон C-S.4V в ШШ) за КСТ установлено, что инфекционный тктр ВДТЛ был ва 0,32lt: ТЦДзс/*к вше, кш у т. ОРЕГОН C-24V и составлял lCi5- £3Т1р150/Ш1 (РФ, СО!) о одинаковым сроком наступления ЦЦЦ (Э5-4.3 ч').

Таом образов, линия клеток КСТ оказалась более чувствительной к' сСсим штампам вируса диареи. В дальнейшем во всех опытах оо вт. ЦДТЛ попользовали заражаодпо дозу, приближенную к МГ!ТЩ5о/клетку.

Лалкыг о оохракении некоторых биологических свойств штамюв вируса диареи (ВДТЛ и ОРЕГОН C-24V) показывают, что оба втамма в процессе длительного последовательного пассирования (до 15 пассажей, срок наблюдения), в культуре КСТ сохраняли свои биологические свойства, как оо уровне накопления, так и по срокам появления ЦЦЦ (Р>0,5).

Дальнейший этапом работы была попытка адаптировать вирус ИРТ ат. "4016" к перевиваемой линии клеток КСТ. Проведенные нами 6 последовательных слепых пассажей вт. "4016" в культуре КСТ с нн-к/бированием калдого пассажа до 16 суток при t° 27°С ве позволили гыявить четкого и регулярного ВДЩ. Неудача в адаптации вт. "4016"

КС

г культуре КСТ вынудила нас изучить его репродуктивные особенности в клетках КЩВК, так как из литературных данных известно ее высокая чувствительность к вирусу ИРТ. (Петрова И.Л. и др. 1988; Гд^тов Д.Г. 1990; Крюков H.H. 1972; Соловьев В.В. 197В).

Титр вируса ИРТ, время достижения максимального ЦПД в культурах ТЕ и ВДВК также зависим от заражающей дозы. Так при оптимальной дозе заражения 10~2ТЦД5о/клетку наивысшая инфекционная активность вируса выявлялась на 48-60 часов для обоих типзв куль-

тур о титром 10е* "пЩбо/мд и 107'0ТЦД5о/нл соответственно ТВ ВДВК.

Таким образом, показана высокая чувствительность перевиваемой линии клеток ВДВК к вирусу ИРТ, практически.не отличызваяся или отличающаяся с низкой степенью достоверности '.Т>0,Б) от '.а*т>• вой в первичной культуре клеток ТВ. Во всея дальнейших опытах использовали дозу заражения, приближающуюся к 10~2ТЦГ,5о/клетку как оптимальную.

Дальнейшим этапом нашей работы была отработка параметров нз~' копления больших объемов вируссодержащрл жидкости, необходимая для изготовления вакцин. "При заражении матрасов шт. ЕДТЛ и "4016" в общепринятых объемах и оптимальных заражающих дозах, титр вируса ЕДТЛ колебался в разных сериях культур клеток КСТ (ст б,б да 7,3) 1ое2ТЦД5о/мл, а для шт. "4016" в культуре ВДВК 'от 8,0 до 7,0) 1оггТЦД5о/мл. Шт. ОРЕГОН С-24У в данной клеточной системе при тех же условиях активно репродуцировался,• достигая титра (5,0-6.6) 1ог2ТЦД50/МД-

Сравнительное изучение антигенной активности различит инзк-тотмроваяных монопрепаратов двух штаммов вируса диареи и одвэго штамма вирусе ИРТ показало, что вариант 4, изготовленный иэ вт.ад-ма ВДТЛ, выращенного в культуре КСТ, и вариант, наготовленный ил штамма "4016", выращенного в культуре ЩВК, вызывали у вакцинированных крыс выработку более высокого уровня • антитм (с,ВО и 7,65) 10£.д - для ЕДТЛ, (4,80 и 5,25) 1о?2 - для ИРТ, на 15 и 30 дни соотвественво, тогда 'как образец ив штамма ОРЕГОН С-24У имел антигенную активность (4,10 и 3,30) 1огг (различил существенные Р<0,001).

Определение антигенной активности 4 различных вариантов ао-х-ш^рсванисй инактивированной вакцины; показало белее высокий

урслеяъ аатител и длительное его оохранение у крыо, которые Оьии привлты инактивированеыии образцами, полученными на перевиваемых кужътурах меток т зивммов ВДТЛ (7,10 и 6,10 logg) и "401В" <5,£8 и 4,40 lojfc) ни 30 и 60 день после ревакцинации (срок насадили). П сэяэи с атим вс всех дальнейших опытах г.о изучению антигенной активности ияасп>:вированных ассоциированных вакцин против ВД и ИРТ использовали только шт. ВДТЛ и "4016", репродуцируемые в культурах КСТ и ЦЦВК,

Результаты определения сроков и режима хранения ассоциированной инактивироваяной вакцины в виде монокоыпонентов и оыешан-яом состоянии показали, что сохранение при t° 8-8°С в течение 12 месяцев приводило к небольшому снижению антигенной активности пс иравненгао о исходным титром. Снижение уровня антител праисходклс быстрее, когда препарат хранился' при незнатной температуре 22-24°С. -Несмотря на некоторое снижение титра антител к 12 месяцам хранения он оказался выше, чем вашитный титр и составил для ВД B.OSlff «г 5,161?, а для.ИРТ - 4,101? и 3,0lg соотвественнс при температурах 6-8°С и 22-24°С.

Эти данные свидетельствуют, что изучаемая инактивировакдо аоехэциироваиная вакцина о успехом может быть применена даже чере: 12 месяцев хранения.

Антигенные свойства инактивированной ассоциированной вакцит научали на телятах и стельных коровах. До вакцинации все подопытные телята и коровы были клинически здоровыми и практически е< содержали вируснейтралиауших антител в сыворотке крови (титр < i 1о?г)• Как первое, так и второе введение препаратов не окагаж ваметного влияния на клиническое состояние животных, что свидетельствует о полной безвредности инактивированной аосоцкирсаанно) вакцины. Вируснейтралигуюиие антитела были обнаружены у всех жи-

вотнмх уже через 15 дней после первой прявияки и достаточно внсо* них ТИТраХ (6,45-4,31) log2 У коров и (5,Е0-4,СШ)1о£2 у «ЛЯ1:, оо-отвественно для БД и ИРТ, которые еще более возросли к 2С дот после второй прививки и достигли максимума для обеих дафекцш Е'Д и.ИРТ у коров - (7,20-5,52)1огг и у телят - (7,05-3,10)1с?2, соответственно (Р<0,01). Это подтверждено многими исследоватепя-ыи, которые в настсяшее время рекомендуют двукратную илмунигацгао не только инактивированными, но и живыми вакцинами (Андреев Е.В. и др. 1981; Кенаров Д., Изунов Н. 1977; Харадамбиев X. 1977; Ferrn-llus A.L. et al. 1972; Me Clurkin A., Corla M. 1378, 1975; Si>*c-nyl E.K. et al. 1978; Жидков А. С. 1994; Калинина О .С. 19S3;' Роды кин С.П. 1988; Халенел Г.А. 1981, 1983, 1988, 1991 И Др.).

Затем уровни антител у привитых животных медленно понижастюл. и к 6-ому месяцу составили: у коров - 6,16-4,0 1одг, У телят -5,30-3,80 log2 соотвественно для ВД и ИРТ (см.таТлЛ). Нь основании анализа литературных данных и предшествующих соебщевкй можно лредпеда'-зть. что привитые животные должны быть завидены or обеих инфекций, поскольку имеющийся урсвень антител гарантирует ватту животных от ?аражения вирусами диареи (>4 1огг) (Калинина О.С. 1983) и инфекционного ринотрахеита (>3 1сгг) (Родькин С.П. iíi88).

Тагам сбраеом, приведенные выше данные собственных исследований по усовершенствование ассоциированной ^активированной вакцины против БД и ИРТ позволили изучить препарат в трех аспектах'. повышение инфекционной активности вируса; пригодность и доступ-кость биологической системы для его репродукции и снижение. .. материальных ватрат по изготовлению препарата.

Использование ассоциированной вакцины против ВД и ИРТ крупного рогатого скота предполагает возможность снижения экономического ущерба от этих, инфекций.

Таблица 1.

Средний уровень гуморальных вируонейтрализущих антител у киров и телят, псивиткх ассоциированной инактивированяой вакциной сротив ВД и ИРТ.

Груа г.» ж«--вог- ВШ АН-ТЛ- п-ла к ВЕрузу Средний титр антител в 1огг (М + ш) Р

Дни после 1-ой прм'гаха Дни после ревакцинации

0 15 дней 30 60 120 180

т спыт нзя (10 ГО" лов) коров Диа реи < 3 6.46+0.11 7.20+0.20 0.40+0.11 6.38+0.10 6.16+0.13

X/ К/ Р < 0.01

ИРТ < г 4.31+0.13 5.52+0.21 4.70+0.13 4.52+0.14 4.00+0.14

X/ ■Л/ Р < 3.01

1 опыт ная (10 голов) телят Диа рея < 2 Б. 50+0.15 7.05+0.20 Б. 75+0.22 6.10+0.19 5.30+0.14

X/ X/ Р < 0.01

ИРТ < 1 4.04+0.16¡5.10+0.27 4.89+0.14 4.04+0.12 3.85+0.18

X/ X/ Р < 0.01

II конт роль (10 голов) коров ВД < 3 < 3 3.0 3.2 3.3 3.0

ИРТ < 2 . < 2 2.3 " 3.0 " 2.5 2.3

и конт роль (10 го-лог) те-|ЛЯТ Диа рея < 2 2.5 2.7 2.4 2.6 2.5

ИРТ 1 < 2 < 2 2.2 г.б 2.3 2.5

'' Ркмечание: х - дни вакцинации

- 15 -3. ВЫВОДЫ

1. Вирусная диарея и инфекционный ринотрам'кт крут, с-го рОгатого скота широко распространены в хозяйствах Туллсшй рбл&гта где антитела к ним распространены у 50-7С'Л взрослого погсшвь обследованных стад, неблагополучных по респи;эгорным и киаечна болезням молодняка.

2. При острой вспышке респираторного заболевания т-злят в одном из хозяйств Тульской области нами, совместно с сотрух.ки.чаыии лаборатории вирусологии МГАВМИБ выделен и идентифицирован изолят вируса диареи ;вдтл) и доказана егс эткслогич'чя'яя роль.

3. Показано, что наибольшей чувствительностью, гак пря изоляции вируса диареи, так и культивировании его отводов (втагоняс-го Орегон C-24V и полевого ВДТЛ) обладала перевнвзени .шш fcae-ток'коронарных сосудов теленка (КСТ), по сравнелия о перзичноА культурой тестикул бычка (ТБ).

4. Показана стабильность репродуктивной сист<;ны (лаяяв клеток КСТ - вирус диареи) к высокая активность пслеа'.>го иэолятз НДТл для производственного накопления вируса л изготовлен»' янек-тивироьанной вакцины.

5. Р опытах на лабораторных животных установлено, что антигенная активность образцов йнактивирсванннх вакцин против анруоа диарея, полученных на основе эталонного штамма (Орегон C-24V) и полевого иеолята (ВДТЛ) о использованием лерев;шаемсй культуры КСТ, а также г прус а И^Т (штамм "4015"), репродуцированного в к-.'льтуре клеток МЛВК превосходит таковую в аналогичных препаратах, получениих на основе первичной культуры клеток TS.

3. Использование перевиваемых культур клеток КСТ и МДВК полевого изолята йДТл и штамма "4015" для изготовления ассоццировн-

нпк ин.'кткг.крс'ванной еькцины практически не снижало ее антигенной гскхивнссти по сравнению с монокомпонентяыми препаратами, изготов-лекныю: на первичных культурах клеток, в олыте на лабораторных наотвих. :

7. Испытание ассоиикрсванной инактивированной вакцины против )'РТ и ВД "ВНОПЕОТ" в эксперименте на естественно восприимчивых животных показа::, ее безвредность и высокую антигенную активность для' стельных К-ор:« и тглят. Уровень гуморальных антител на 30 деиь после ревакцинация! составил: у коров - (7,20 и 5,65) log^. а у телят, 40-60 дневного возраста (7,05 и 5,0)logg соответственно для 5?Д и ИРТ, что значительно выше минимальных защитных титров антител, которые по данным отечественной и зарубежной литературы составляют: для БД - 4,01огг и для ИРТ - 3,01og2.

4. РЕХШШДАЦИИ ВО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Полученные данные о возможности изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против вирусной диареи и инфекционного ринстрахеита КРС с использованием высокочувствительных перевиваемых линий клеток и полевого изолята ВДТЛ могут быть использованы при усовершенствовании ассоциированной инактивированной вакцины.

2. При проведении учебного процесса на факультете повышения квалификации перевиваемые линии клеток КСТ и МЦВК могут быть использованы в качестве моделей для изоляции и идентификации возбудителей ВД и ИР"

Размножено на ротапринте 1Ü0 экз., зак. 135. Типография "РОТЭКС", и&сницкая, 35.