Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (характеристика возбудителя, диагностика и специфическая профилактика)

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. Я. Р. КОВАЛЕНКО

(ВИЭВ)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

(РАСХН)

ОД

На правах рукописи

РГб

3

ЖИДКОВ Станислав Александрович

ВИРУСНАЯ ДИАРЕЯ — БОЛЕЗНЬ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(характеристика возбудителя, диагностика и специфическая профилактика)

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология и микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Москва 1994

Работа выполнена в отделе вирусологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко (ВИЭВ).

Научный консультант: академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор Коромыслов Г. Ф.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Бурлаков В. А.

(МВА)

доктор биологических наук, профессор Макаров В. В.

(ВНИИВВиМ)

доктор ветеринарных наук, профессор Мищенко Н. К-

(ВГНКИ)

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности.

Защита диссертации состоится « 7" » UWtl& 1994 г. в часов на заседании Специализированного совета

Д.020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан « А » «✓¿¿¿2-Л< 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. .. Актуальность проблемы.. Среди вирусных агентов, участвующих в этиологии вирусных заболевший телят с поражением респираторного и пищеварительного трактов, особая роль принадлежит вирусу вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС).

Впервые, как самостоятельное заболевшие, ВД-БС было установлено в США, штате Ныо-йорк в 1946 году при вспышке острой, часто со смертельным исходом, болезни крупного рогатого скота, характеризующейся диареей и эрозивными поражениями желудочно-кишечного тракта!?.ОЗ^зоп, А.МсСиНии, ?.?ох,1946) .

В настоящее время вирус ВД-БС является обычно встречающимся патогеном в большинстве стран и вместе с еще двумя пести-вирусами - классической чумы свиней (КЧС) и пограничной болезни овец (ПБО) инфицируют 173 вида домашних и диких жвачных животных И II ВИДОВ свиней (ОЛе11етапз, Е.Уап ОрйвпЬозоЬ,1 987) . Имеются публикации об обнаружении антител и антигена пестиви-руса у человека, но возможность его инфицирования пока только предполагавТСЯ(В.Ро«з ег а1.1987, М.51апдазрего etal, 1988, С.ЧШкз е^ а1. 1989, Й.Уо1кеп ег а1.1989). -

, Кроме антигенных вариантов и иммун.ологически различных, ттацмов, возбудитель ЕД-БС цредставлен двумя биотипами вируса (нецитопатогенный -.ВДЕТ и цитопатогенный - 1Щ4"), взаимодействие которых в организме восприимчивых животных определяет многообразные формы течения инфекционного процесса - от субклинического, до .тяжелой, формы, болезни слизистых с неизбежным смер-' тельным исходом. Более того, вирус .вирусной диареи, вызывая у заболевших животных постоянно проявляющееся иммуносупрес-

сявноа состояние, создает располагающий фон для развития смешанных инфекций, как вирусной, так и бактериальной микрофлоры.

Главным источником и резервуаром ВД-БС являются персистен-тн.о инфицированные животные, которые при видимом клиническом здоровье постоянно (иммунотолерантные - в течение всей жизни) выделяют вирус, заражая восприимчивое поголовье скота (J.Baker 1987, S.Düffel! et al.1985).

Поэтому многие ведущие специалисты, изучающие ВД-БС, считают, что по комплексным экономическим показателям потерь, причиняемых этой инфекцией, следует считать ее одной из важных в ветеринарии (O.Denis Ruben,J.Edwarä Dubovi et al. 1987).

ЦЦ-ЕС в бывшем СССР впервые была установлена и описана К.Н.Бучневым с соавторами; В.П.Назаровым и В.Г.Макаревичем в 1967 году.

Специфическая профилактика ЕД-БС во многих странах осуществляется с помощью живых и инактивированных вакцин при строгом соблюдении стратегии их применения в зависимости от.направления хозяйства (откорм, репродукция) и других особенностей, связанных с биологией возбудителя и формами течения инфекции.

Окончательный диагноз на ВД-БС, кроме обширных лабораторных исследований, требует анализа истории стада, включая! передвижение животных (приобретение,, хозяйственный обмен), учет рождения больных, слабых телят и,любых необъяснимых заболеваний или смерти.животных... Не .менее важной задачей диагностических исследований при. ДЦ-ЕС является своевременное выявление и удаление из неблагополучного стада персистентно инфицированных животных.

Цель и .задачи исследований. Цель исследований - разрабо-. тать средства специфической профилактики ВД-БС и метод экспресс-диагностики для установления возможности его использования с целью выявления персистентно инфицированных животных.

В задачи исследований входило:

- ввделить возбудитель ВД-БС и установить его патогенность для телят;

- изучить физико-химические и ищунобиологическиэ свойства вируса вирусной диареи крупного рогатого скота;

- разработать сывороточный препарат и способ его применения для пассивной специфической профилактики ВД-БС и сопутствующих ей вирусных инфекций;

- получить аттенуированный вирус и разработать на его основе живую вакцину против ВД-БС, испытать ее з лабораторных и производственных условиях;

- разработать технологию промышленного производства вакцины ВД-БС;

. - разработать набор компонентов иммуноферменгного анализа для экспресс-диагностики ВД-БС и установить возможность его использования для выявления персистентно инфицированных животных в неблагополучном стаде.

Научная новизна. Из различных хозяйств России и стран СНГ при всшетках инфекции от больных телят с поражениями, респираторного и пищеварительного трактов изолирован вирус вирусной . диареи-болезни слизистых оболочек, крупного-рогатого-скота, изучены его физико-химические,, .биологические свойства и показана роль в этнологии этой инфекции животных.

Впервые в стране подучен аттенуированный вакцинный штамм

вируса вирусной диареи, изучены его антигенные, иммуногенные свойства (Авторское свидетельство № 1322673) и на его основе разработана живая вакцина против ВД-БС (Авторское свидетельство № 1538304).

Аттенуированный вакцинный штамм против ЦЦ-БС использован в составе ассоциированной вакцины против респираторных заболеваний молодняка крупного рогатого скота (Авторское свидетельство № 1789219).

Установлена высокая чувствительность диплоидного штамма эпителиальных клеток коронарных сосудов плода коров к вирусу ВД-БС крупного рогатого скота ( Авторское сввдетельство № 1835849).

Разработан набор компонентов ША. для экспресс-диагностики ВД-БС и показана возможность выявления с помощью этого набора персистентно инфицированных животных.

Определены оптимальные условия и способ аэрозольного (группового) и аэроэольно-капельного (индивидуального) профилактического применения поливалентного сывороточного препарата против ВД-БС, инфекционного ринотрахеита ОРТ), парагриппа-З (ПГ-3) и парвовирусной инфекции (ПВИ) крупного рогатого скота.

Практическая ценность работы. Разработана и внедрена в производство (приказ ГУБ Госагропрома СССР № 146 от 29 ноября 1988 г.) вирусвакцина сухая культуральная против вирусной диареи крупного рогатого скота. Вакцина оо'ладает выраженной профилактической эффективностью при применении в неблагополучных по ВД-БС хозяйствах. .. ... ....

. . Разработан и.внедряется в ветеринарную практику "Набор для диагностики вирусной диареи крупного рогатого скота мето-

дом имцуноферментного анализа". Установлена высокая чувствительность, специфичность метода и показана возможность его использования при выявлении в неблагополучном стаде персистентно инфицированных ЦЦ-БС животных.

Разработана и испытана в неблагополучных хозяйствах сухая поливалентная гипериммукная сыворотка против ВД-БС, ИРТ, ПГ-3 и ПВИ для аэрозольной профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят. Применение сывороточного препарата телятам снижает заболеваемость, смертность и позволяет получать в откормочных хозяйствах дополнительный привес в сравнении с контрольной группой животных.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученых советов ВИЭВ (1973 ... 1993 гг.) и ВГНКИ ветпрепаратов (1980 ... 1992 гг.), на 1У Всесоюзной ветеринарной вирусологической конференции "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии" (Владимир, 1976 г.), У Всесоюзной ветеринарной вирусологической конференции "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии" (Казань, 1980 г.), Всероссийской научно-производственной конференции "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных" (Москва, 1993.г.),. научно-производственной конференции "¡культура клеток животных в ветеринарии и биотехнологии". (Москва, 1993 г.), семинарах и.совещаниях ветеринарных специалистов в павильош "Ветеринария". ДЦНХ. СССР. ¿1976 ,.«..1985. хг-)- -Кроме того, ..материалы диссертации .вошли .а.сообщение Международного эпизвотического бюро, которое опубликовано в 1990 году в Париже..(314)..—„______„ ...... .............';. . . __________

Основные этапы работы оценены комиссионно с участием пред-

стев"телей ВГНКИ ветпрепаратов.

Публикации результатов исследований. Основные материалы диссертации опубликованы в 23 работах, II нормативно-технических документах, утвержденных ГУВ Госагропрома СССР и ГУВ Мин-сельхоза России, четырех авторских свидетельствах и одном положительном решении ВНИйГПЭ на изобретение.

.. . Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые для защиты:

- выделение, идентификация вируса ВД-БС и воспроизведение заболевания на естественновосприимчивых животных;

- оптимизация метода получения аттенуированного вакцинного штамма ВД-БС;

- оценка безвредности, реактогенности, антигенности и им-муногенности модифицированных вариантов вируса вирусной диареи;

- изучение реверсибельности, стабильности и установление оптимальной иммунизирующей дозы аттенуированного варианта ВД-БС;

- установление генетических признаков аттенуированного и исходного штаммов вируса - возбудителя вирусной диареи;

_____ -, разработка.и внедрение в ветеринарную .практику вирусвак-

цины.сухой культуральной против ВД-БС, методов ее контроля и способа применения;

. .. - разработка .набора компонентов. .Ш>А.для экспрес.сг-диагнос-тики .ВД-БС и. установление. аозможности:йго использования при выявлении персистентно инфицированных животных;

- разработка метода изготовления и способа применения по-

ливалентного- сывороточного препарата для специфической пассивной профилактики заболевания телят с признаками массового поражения респираторного и пищеварительного трактов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 299 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, вывода, практические предложения, список литературы и приложение. Работа иллюстрирована 20 таблицами, пятью рисунками и одной схемой. Список использованной литературы включает 315 источников, из них 283 иностранных. В приложении представлено 36 документов, подтверждающих наиболее важные результаты этапов исследований и их практическую ценность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ■

2.1. Материалы и метода исследований

Работа выполнена в период 1972 ... 1993 гг. в отделе вирусология Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринария им. Я.Р.Коваленко (ВЮВ), опытной базе Вышневолоцкого отдела ВЮВ и Ставропольской биофабрике по научно-то этическим программам государственного и отраслевого назначения.

:-'... Изучение биологических свойств полевых иэолятов вируса, модифицированных вариантов ВД-БС, лабораторных образцов я опытно-промыаленных серий вирусвакцинн против вирусной диареи на естественновосприимчивых животных проводили на опытной базе Вьашеволоцкого отдела ВЮВ.

Нормативно-техническую документацию (НТД) на вирус-вакцину сухую куль тур альную против вирусной диареи крупного

рогатого скота согласовывали во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов (ВГНКИ), Всесоюзном научно-исследовательском и технологическом институте боилогической промышленности (ВНИТШП), Главном управлении биологической прмышленности Госагропрома СССР, Главном управлении "Союзглавзооветснабпром" и утверздали в Главном управлении ветеринарии с государственной ветеринарной инспекцией Госагропрома СССР.

Комиссионные испытания и депонирование аттенуированного вакцинного и эпиозотического штаммов вируса вирусной диареи проводили в ВГНКИ ветпрепаратов.

Освоение технологии опытно-промышленного, промышленного производства и контроля вирусвакцины выполняли на Ставропольской биофабрике и комиссионно с представителями ВГНКИ на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВЮВ.

Испытывали эффективность вакцины:,в хозяйствах Пензенской, Волгоградской, Тверской областей и ССР Молдова.

Разработку экспресс-диагностики ВД-БС методом имчунофер-ментного анализа (ISA) проводили в ВЮВ совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики вирусных желудочно-кишечных болезней крупного ■■ рогатого скота Л.А.Мниковой и заведующим этой лаборатории М.М.Гоголевым. НТД на опытно-промышленное производство набора компонентов И£А согласовывали и утверждали в установленном порядке.

Вирусы.В экспериментах использовали штаммы ВД-БС: цито-патогенный эпизоотический штамм BK-I, изолирован нами от боль-

ных телят с признаками пневмоэнтерита, референтные (эталонные) штаммы огевоп С24У, ^ - 59 , " Каблешково". -

При идентификации изолятов вирусных цитопатогенных агентов использовали эталонные штаммы вирусов 1РТ и 11Г-3.

Культура клеток и среды. Использовали первичные и субкультуры клеток почки телят (ПТ), почки эмбриона коров (ПЭК), почки эбриона свиньи (ПЭС), перепелиных фибробластов (ПФ) и перевиваемые линии (штаммы) клеток кожи лошади(ЭКЛ) и эпителия коронарных сосудов плода коровы (КСТ).

Суспензию клеток получали из лаборатории технологии клеточных культур и питательных сред ВКЭВ, из Научно-исследовательского института вирусных препаратов АМН СССР или перевивали и выращивали их сами по общепринятой методике.

Применяли для выращивания клеток среды: 0,5£ гадролизат лактальбумина на рабочем растворе Хеикса (ГЛА), 0,3£ ферментативный гедролизат мышечных белков с добавками на растворе Хенкса (ФГМ-с), Игла и 199.

Вакцины. Сравнительное испытание эффективности разработанной нами живой вакцины против ВД-БС проводили с такой..же коммерческой вакциной мисов1*Га . изготовленной во Франции.

Кйвотные. Воспроизведение заболевания полевыми изолята-ми вирусных цитопатогенных агентов, изучение иммунобиологических свойств модифицированных вариантов, аттенуированного штамма и вкрусвакцины против ВД-БС проводили на серонегатив- : кых к вирусу вирусной диареи телятах 4...б мес возраста..

Всего в опытах использовано 252 теленка. На овцах и ко-

зах и лабораторных животных получали гиперимыуннне сыворотки крови.

Титрование вируса. Инфекционную активность вируса устанавливали по цитопатогенноцу действии (ВДЦ) в кулыуре клеток и рассчитывали по методу Рида и Менча.

Физико-химические свойства вируса. Устанавливали ' устойчивость вируса к эфиру, хлороформу, трипсину, дезоксихо-лату натрия, прогреванию при 50 ...60°С и репродукцию в присутствии ентиметаболитов РНК и ДНК. Определяли плавучую плотность в градиенте сахарозы или хлористого цезия.

Методики общепринятые.

Электронная микроскопия. Исследования проводили в электронном микроскопе ЕМ 1000x11 японской фирмы йоь методом негативного контрастирования, совместно со старшим научным сотрудником ВГНКИ ветпрепаратов Ю. И. Могильным.

Серологические исследования.В работе применяли реакции: нейтрализации (РН) в культуре клеток, торможения гемагглютина-ции (РТГА), диффузионной преципитации (РДП) и иимунсфермент-ного анализа (ИФА). Использовали стандартные схемы постановки указанных реакций, методика ЮА подробно изложена в разделе 2.2.

Вирусологические исследования. Вирусовыделение проводили в чувствительной культуре клеток из : секретов, экскретов и патматериала от вольных и певших животных.

При необходимости выполняли до шести прямых пассажей. Таксономию вирусных цитопатогенных агентов устанавливали изучением физико-химических,.серологических, биологических свойств изолятов вируса и исследованием в электронном микроскопе.

..... . Ремагологичаскта исследования. Для установления лейкопении, которая сопровождает кмыуносупрессмо у животных, больных ВД-БС, проводили подсчет количества лейкоцитов в камере с сеткой Горяева по общепринятой методике. Положительной реакцией на лейкопению считали, если от исходного уровня в эксперименте происходило снижение количества лейкоцитов на 3000 кл/ммэ и более, а в условиях неблагополучных хозяйств, при разовом исследовании, количество лейкоцитов в крови животных было на уровне менее 4000 кл/ммэ.

Получения гтериммунных сыророток. Гиперимцунные сыворотки к вирусам ВД-БС, 1РТ, ПГ-3 и ' ПВИ получали иммунизацией телят, овец, кроликов, морских свинок по методам:

П.Цвэткова, К.Петкова, Х.Хараламбиэва, 1978; ь.,Ро*в1е1;ег, С.Ыагв, 1874$ Ь.Еаи1а,19б7).

При изучении иммунобиологических свойств на этапах разработки вирусвакцины против ВД-БС (модифицированные варианты, оттенуированный штамм» вакцина) устанавливали: безвредность, ■ роактогонность, шмуногенность. Методы исследования этих свойств вируса являются также общеизвестными.

У аттенуированного штамма с цель» установления возможности использования его в качестве вакцинного дополнительно устанавливали стабильность, реверсибельность, генетические признаки, определяли оптимальную ши(унизирующуп дозу и способ вакцинации».. ....

: Стабильность определяли дополнительным пассированием дтте.нуиройвнного вируса в культуре клеток десять раз. с после-дущга контролем онттзвтгости и напряженности иммунитета для телят.

Реверсибельность устанавливали прямым 6-кратным пассированием аттенуированного вируса на естественновосприимчивых животных.

Генетические признаки: rot - признак (способность к репродукции вируса в культуре клеток при заданной температуре инкубации), Т55 - признак (терморезистентность вируса к прогреванию в зоне 50 ... Б5°С), Ас - признак (устойчивость к воздействию на вирус кислой зоны рН) и Рь - признак (пато-генность вируса для крупного рогатого скота) устанавливали по методикам, изложенным в монографии Ю.З. Гендона, 1967.

Оптимальную иммунизирующую дозу и способ вакцинации устанавливали при подкожном в область предлопаточного лимфатического узла и внутримышечном введении аттенуированного вируса телятам в дозах 2,0 х Ю3'0, Ю4'0 и Ю5,0 Tl%)/Mjj.

Препарат испытывали при одно- и двукратном введении антигена.

Все исследования, связанные с внедрением вирусвакцины сухой культуральной против вирусной диареи крупного рогатого скота в ветеринарную практику, проведены комиссионно.

Статистическая обработка. Полученные результаты статистически обрабатывали по методике, описанной Г.Ф. Лакиным, I960.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Наделение вирусных цитопатогенных агентов

Первоначально в откормочном комплексе "Вороново" Московской области от больных телят с клиническими признаками пневмо-энтерита в первичной культуре клеток ПЭК ввделили три штамма (BK-I, ВД-2 к В—2) вирусных цитопатогенных агентов. В клеточ-

ной культуре на 4...6-е сут инкубирования при 37°С к 3.. .6-му пассажу они вызывали четкое развитие ЦГЩ и, в зависимости от штаммовой принадлежности, накапливались в титрах от 5,0 до 7,01^ ИЩздд1Л. Цитопатический эффект характеризовался мелкозернистой дегенерацией, округлением клеток, истончением и разрывом клеточного монослоя. Конечная картина ЦЦД выражалась в гибели клеток, отслоением в культуральнуга жидкость и наличием на стекле их отдельных тяжей и фрагментов.

В сыворотке крови телят установлены БН-антитела к вирусам: вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), инфекционному рино-трахеиту (ИРГ) и парагриппу-3 (ПГ—3) крупного рогатого скота. Через 90-110 сут содержания животных в комплексе специфические ИРТ и ПГ-З антитела постепенно снижали свою активность, а к вирусу ВД-БС активность Ш-антител, наоборот, увеличивалась.

В последующие годы в неблагополучных по пневмоэнтеритам телят хозяйствах различных регионов бывшего СССР от больных животных было изолировано еще 13 штаммов вирусных цитопатоген-ных агентов, отнесенных к различным возбудителям заболеваний.

2.2.2. Физико-химические свойства и идентификация изолятов вирусов

Таксономическую принадлежность вирусных цитопатогенных агентов штаммов ВК-1, ВК-2, В-2 и других штаммов, изолированных позже, устанавливали путем изучения их физико-химических свойств, определения типа нуклеиновой кислоты, исследованиями в электронном микроскопе и в перекрестной реакции нейтрализации (РН) гипериммунными сыворотками, полученными против эталонных штаммов вирусов ВД-БС, ИРТ и ПГ-З.

Штамм ВК-1 чувствителен к хлороформу, эфиру, трипсину и

прогреванию при 50°С. Антйметаболит 5 бром-, 2 дезоксиуридин (БДУ) в дозе 300-500 у/мл не подавлял репродукцию вируса, в то время как митошцин-С ее полностью ингибировал, что свидетельствует о принадлежности штамма к НШ - содержащим вирусам. Не обладал вирусный агент гемагглютинирующими свойствами, а геном характеризовался широким распределением инфекционности во фракциях от 1,05 до 1,19 г/см3 в градиенте плотности сахарозы. Морфология и размер вирионов в электронном микроскопе соответствовал эталонному штамму Oregon C24V вируса ВД-БС и составлял 40-60 нм.

Штамм ВК-2. как и штамм BK-I, оказался чувствительным к хлороформу, эфиру, трипсину и прогреванию при Б0°С. Результаты репродукции в присутствии антйметаболитов также свидетельствуют о его принадлежности к ШК-содержацим вирусам, но в отличие от штамма Ш-1, этот цитопатический агент обладал выраженными гемядсорбирующими и гемагглютинирующими свойствами. Исследованиями в электронном микроскопе обнаружен рибонуклеопротеид (КШ>, характерный вирусу ПГ-З.

Штвмм В-2 обладал устойчивостью к эфиру, хлороформу, трипсину, дезоксихолату натрия и бил резистентен к температуре 50°С. ЕДУ полностью подавлял его репродукцию в культуре клеток, что свидетельствует о принадлежности к ДНК - содержащим вирусам. После концентрирования штамм выявлял гемагглютинирующие свойства, плавучая плотность в градиенте хлористого цезия составляла 1,38-1,40 г/см3. Величина безоболочечных вирионов, установленная электронной микроскопией, составляла 20-30 нм, тип сим- . метрии икосаэдрической формы, гексагонального профиля. Эти свойства штамма В-2 характерны возбудителю ларвовирусной инфекции

крупного рогатого скота (ПШ).

В перекрестной FH между штаммами БК-1 и ВД-БС, ВК-2 и ПГ-3 установлено полное антигенное родство и только штамм изо-лятв В-2 не нейтрализовался ни одной из гипериммунных сывороток, полученных на эталонные штаммы вирусов, кроме собственной ентисыворотки.

Таким образом было установлено, что в этиологии лневмоэн-теритов телят комплекса "Вороново" Московской области, принимают участие вирусы ВД-БС, ПГ-3 и ПВИ. Иэ 13 штаммов, ввделен-ных в других неблагополучных хозяйствах различных регионов бывшего СССР, восемь отнесены к ВД-БС, три - ИРГ, один - ПГ-3 и еще один остался неклассифицированным. Причем в неблагополучных хозяйствах чаще устанавливали смешанную инфекцию при различном сочетании возбудителей болезней.

2.2.3. Воспроизведение заболевания и установление латогенности изолятов вируса для телят

В экспериментах использованы телята в возрасте 4-6 мес, серонегативные к ВД-БС, ПГ-3, ПШ и ИРГ.

В таблице I представлены результаты, отражающие патоген-ность для телят изолятов вируса штаммов Ш-I, ВК-2, В-2 от больных животных комплекса "Вороново" и штамма МРС, ввделенно-го при вспышке респираторного заболевания среди телят совхоза "Сафоновский" Московской области и идентифицированного позднее, как возбудитель ИРГ. Кроме того, для дополнительного подтверждения, что штамм Ш-I является возбудителем ВД-БС, телята, предварительно зараженные эталонным штаммом Oregon C24V и иммунные после переболевяния, были заражены штаммом БК-1.

Патогенность изолированных штаммов вирусов для естественно-восприимчивых животных в экспериментальных условиях

Штачи Толста, (вирус) число

Клиническое проявление болезни

Иммунологическая реакция, . лейкопения

заре- забо- лихорадка, ринит гингивит коньсн- диа- „_т . явно лзяо °С ктивит рея кл/мм А * ш

ВК-1 (ВД-БС)

ВК-2 (ПГ-3)

В-2 (ГВИ)

МРС (УРТ)

КХА . (не клас--сифгаиро-ван)_

8 8

2* 2

43* -

б 6

4 б

б

4 б

39,б...41,0 +

40,1,..40,5 +

39}7«»«39|9 *

39,8...41,4 +

40,5...41,3 ♦

+ +

+ +

+ 4000...1800 2950^305 + 3000...2400 2700±212

Контроль 7

"Примечание: х телята находились в прямом контакте с зараженными животными; та телята ■ предварительно переболели после заражения эталонный штаммом вируса ВД-БС.

Условные обозначения: + выраженное,

• признаков заболевания.

слабое проявление, - отсутствие клинических

+

+

Все животные, зараженные изолятом штамма BK-I (ВД-БС), и телята, находившиеся с ними в прямом контакте, заболели на 3...7-е сут с клиническими признаками: лихорадки до 41,0°С, кашля, конъюнктивита, ринита, эрозивных поражений слизистой носа, десен (гингивит) и лейкопенией со снижением количества лейкоцитов до 1800 кл/мм3. Через неделю у этих телят отмечено повторное повышение температуры тела, отказ от корма, атония рубца и диарея.

На вскрытии животных, убитых в острой стадии болезни, основные пятологоанатомические изменения локализовались в желудочно-кишечном тракте: рубце - крепитирующий отек стенки и кровоизлияния в слизистую оболочку с некротическими наложениями, тонком отделе кишечника - катаральное воспаление. Из секретов и пятматериаля больных животных реизолирован вирус, не отличающийся по своим свойствам от изолята штамма БК-1.

Телята, иммунные после переболевания от заражения эталонным вирусом ВД-БС, на инфицирование штаммом Ш-1 клинически не реагировали на протяжении опыта.

После заражения изолятом штамма ВК-2 (ПГ-3) у телят отмечен слабый респираторный синдром и незначительное повышение температуры тела без других отклонений от клинико-физиологи-ческой нормы.

Штамм В-2 (ПЕИ) вызвал заболевание телят с признаками ли- '

хорадки до 41,4°С, ринитом и диареей. «

1Итамм MPC (ИРТ) вызвал у зараженных телят четкие клинические признаки, характерные инфекционному ринотрахеиту крупного рогатого скота: кашель, лихорадка до 41,3°С, ринит и конъюнктивит.

В таблице I показано также, что неклассифицированным штаммом КХА,-выделенным от больного крупного рогатого скота в Красноярском крае, заболевание в эксперименте воспроизвести не удалось. Однако клинические признаки и патологоанатомическая картина при вспышке заболевания в с. Аево в большей степени соответствовали злокачественной катаральной горячке: лихорадка до 42,0°С, профузная дефекация с примесью крови, кровавая моча, отказ от корма, быстрое исхудание, помутнение роговицы (у некоторых), гранулярные эрозии по всей поверхности носового зеркала, голова опущена, шаткая походка, хромота, нервные явления. Все заболевшие животные пали и на вскрытии установлен септический процесс.

Проведенными испытаниями показана выраженная пятогенность ■ для естественновослриимчивых животных у изолятов штаммов БК-1, В-2 и МРС вирусов вирусной диареи, парвовирусной инфекции и инфекционного ринотряхеита крупного рогатого скота соответственно. Слабые клинические признаки болезни отмечены у телят, зараженных штаммом ЕК-2 вируса парагриппа-3, и не удалось воспроизвести заболевание неклассифицированным вирусом, который в эпизоотии вызывал смертельную болезнь крупного рогатого скота.

Разработка мер борьбы с вирусной диареей-болезнью слизистых оболочек крупного рогатого скота

2.2.4., Специфическая пассивная профилактика

Предварительно в эксперименте на модели гипериммунной сыворотки против ИРТ было установлено, что при ее аэрозольном ' . применении телятам фиксирующиеся слизистой оболочкой респираторного тракта ВН-янтитела создают местную защиту от интрана-

зального заражения эпизоотическим вирусом в течение до 16-х суток. . .'. . .. . :...'.. ' ' . ..

В хозяйствах, неблагополучных.по пневмоэнтеритам телят, аэрозольным (групповая обработка в ,специальной камере) и аэрозольно-капельным (индивидуальная обработка непосредственно в стенках, стойлах) способами применяли вначале ре-конвалесцентную сыворотку крови и "нормальный" глобулин, изготавливаемый биофабриками.

Затем использовали гиперимцунные сыворотки и глобулины против ВД-БС в ассоциации с гипэриммунными сыворотками крови против I1PT, ПГ-3 и ПВИ, которые для удобства хранения и транспортировки подвергали лиофилизации в 0,5 литровых градуированных флаконах по 200,0 мл. Перед применением лиофилизиро-вакную сыворотку крови животных аа разводили стерильной дистиллированной водой.

Расход сывороточного препарата при аэрозольном применении составлял 15 ... 20 см3 на 1,0 м3 камеры при давлении 6,0 атм и экспозиции 20 ... 30 мин. При аэрозольно-капельной аппликации в каздый носовой ход телят впрыскивали по 2,0 см3 препарата. В зависимости от эпизоотической ситуации обработку животных повторяли через каадые .Ю. .. .. 15 суток.

В результате после применения сывороточных препаратов в неблагополучных по пневмоэнтеритам телят хозяйствах наблвдали снижение количества.больных и павших животных. В откормочных комплексах за 115.. 120 суг откорма получали дополнительный привес от 2. до б кг на одно животное в сравнении с контрольной группой.

2.2.5. Специфическая активная профилактика

Для профилактики ВД-БС нами была разработана "Вирусвакци-H8 сухая культуральная против вирусной диареи крупного рогатого скота".

2.2.5.1. Получение модифицированных вариантов вируса

Аттенуацию эпизоотического штамма BK-I вируса ВД-БС проводили адаптационным способом, путем длительного пассирования его в гомологичной и гетерологичной культурах клеток. С целью клонирования вирусной популяции на отдельных этапах пассирование вируса выполняли методом предельных разведений и устанавливали его специфичность. В качестве контроля поралельно по аналогичной схема пассировали эталонный штамм Oregon с 24V вируса вирусной диареи.

В процессе культивирования вируса ВД-БС была установлена контаминация вирусными частицами, сходными с герпесвирусом. Даконтаминацию проводили цутем трехкратного пассирования культивируемого вирусного материала в присутствии аналога тимина.

Шло получено три кодифицированных варианта вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (табл. 2).

Таблица 2

Схема пассирования и инфекционная активность модифицированных вариантов вируса ВД-БС

Штвш вируса Вариант Культура клеток Титр вируса, ^ЯИюА

ПЗК гос т пт Количество пассажей

BK-I II - 6 - I 32 12 - 3 4,5 - 5,0

3 - 3 - 7 32 - 7 3 2,5 - 4,0

Oregon C24V 15 - б - I 32 7 - 3 4.0 -5,0

Условное обозначение: - пассирование не проводили.

Стерильный, свободный от контаминации и безвредный для лабораторных животных вирусный материал модифицированных вариантов был подвегнут лиофилизации и использован в дальнейших исследованиях в качестве матриксного.

2.2.5.2. Иммунобиологические свойства

модифицированных вариантов вируса

Безвредность, реактогенность, антигенность и напряженность иммунитета устанавливали в опытах на 40 телятах при подкожном введении модифицированных вариантов 11-6-1, 3-3-7 и 15-6-1 вирусной диареи-болеани слизистых оболочек крупного рогатого скота.

Кроме того, учитывая антигенное родство пестивирусов ВД-БС и классической чумы свиней (КЧС), провели исследование эффективности вирусвакцины из штамма "К" против КЧС при гетерологичной защите телят от заражения эпизоотическим штаммом вируса вирусной диареи крупного рогатого скота.

Все модифицированные варианты вируса ВД-БС вызвали кратковременную температурную реакцию (39,6..,40,3°С)и деэначительноа снижение количества лейкоцитов (на 1,0...1,5 тыс кл/ммэ) через 4...6 сут после начала опыта по установлению безвредности.

Результаты изучения реактогенности, антигенных и иммуно-, генных свойств модифицированных вариантов ВД-ВС и вирусвакцины против КЧС представлены в таблице 3, из которой видно, что при одинаковой и допустимой реактогенности для телят испытуемые варианты вируса вирусной диареи и штамма "Несущественно отличались по'антигенным и иммуногенным свойствам. Вариант I1-6-1 у животных вызывал выработку ВН-антител в Наиболее высоких титрах, в сравнении с другими модифицированными вариантами вируса ВД-БС и живой вакциной против КЧС, которая индуцировала самый низкий

Реактогенность и иммуногенность для телят модифицированных вариантов вируса ЦЦ-БС и вирусвакцины га шташа "К" против классической чумы свиней

(X + га)

Вариант Колича-

Поствакцинальная реакция

Результат контрольного заражения '

вируса (штамм) ство животных темпэра-- туркая, °С лейкоцитарная, кл/мм3 антигенная, титр _ ВН-антител лихорадка, ри-о^ нит гингивит диарея лейкопения, кл/мм3

11-6-1 (ВК-1) 8 39,6...40,3 5833*644... 5749*633 22*4,2... 22-1,9 - - - -

3-3-7 (ВК-1) 8 39,6...40,0 7341*443... 5146*284 9*1,6... 13*4,6 39,7...40,0 + (3)« (2) - - 4000*115 (I)

15-6-1 8 39,7...40,3 6566-490... 6733-296 19*3,5... 13*1,2 39,7...40,3 + (2) (2) - - 4266*176 (I)

штамм. "К" 4 39,8...39,9 6133*547 6*1,0 39,9...40,1 + (2) (2) + (I) - 4533*176, 3200*115 (2)

Контроль 6 39,7...41,0 + (6) (6) + (4) + (3) 3331*364... 3200*66 (6)

В

Условные обозначения: - отсутствие реакции,

+ положительная реакция,

* данные, обратные среднегеометрическому титру антител, за количество реагирующих жиботных.

уровень специфических вирусу вирусной диареи антител у вакциро-ванных ею телят.

Контрольным заражением вакцинированных животных эпизоотическим штаммом вируса ВД-БС установлена прямая корреляция напряженности иммунитета с показателями антигенной активности испытуемых препаратов. Не отмечено после заражения каких-либо признаков заболевания у телят, привитых вариантом П-б-1, а из 16 те-, лят, привитых двумя другими вариантами вируса вирусной диареи, у пяти установлена лихорадка до 40,3°С, четырех из них - ринит и двух - лейкопения со снижением количества лейкоцитов до 4 тыс кл/мм3. Заболели с характерными для ВД-БС признаками два из четырех телят, вакцинированных штаммом "К" против классической чумы свиней и все контрольные (неиммунные) животные.

Таким образом, на фоне одинаковой безвредности и реактоген-ности установлено иммуногенное преимущество модифицированного варианта И-6-1 вируса ВД-БС, штамма ВК-1. Всвязи с чем в дальнейших исследованиях по разработке вирусвакцины использован только этот вариант вируса. Живая вакцина против КЧС обладает определенной иммуногенностьв против ВД-БС, но значительно менее выраженной, чем при гомологичной ВД-БС защите.

Реверсибельиость модифицированного варианта П-б-1 вируса ВД-БС устанавливали в шести прямых пассажах на 12 телятах (схема):

-в 1-м пассаже модифицированный вариант вируса после введения в дозах 2хЮ4,0 ТЦЦ50Д01 аэР030ЛЬН0 и ЮхЮ4,0 внутривенно у одного из двух телят вызвал однодневный подъем температуры тела до 40,1°С со слабо выраженным серозным ринитом без других отклонений от нормального клгаико-физиологичес-

СХЕМА

Изменение свойств модифицированного варианта 11-6-1 ВД-БС в процессе пассирования на телятах (реверсибельность)

Вариант 11-6-1

I пассаж _к.

Интраназально, внутривенно, подкожно. _

Ф □ А

Контактная передача

II пассаж

Втирание носовых

оДОа ' О Д а а

1 III пассаж

Ф А □ а Ф А □ с=п

1У пассаж

о д □ си ОДПп

У пассаж

О А □ п=} ОА0п

У1 пассаж

о А па О А Ра

[/¡-незначительное снижение количес-

Реактогенность :0-характерное Лейкопения Сгвьфажена, заболевание, ™ ф-слабая лихорадка и ринит, _ тва лейкоцитов,

^/-отсутствует. [ ^-отсутствует.

Иммунитет: А-вкражен, , Вирусовыделениесз-реизолирован,

Д-отсутствует. 1—ьнв реизолирован

кого состояния;

- во втором пассаже при совместном содержании на контакте и переносе секретов носовой слизи от телят 1-го пассажа каких-либо признаков реакции у животных не зафиксировано, однако в 3-м пассаже у обоих телят отмечен только однодневный подъем температуры тела до 39,8°С;

- в 4, 5 и 6-м пассажах, кроме незначительного снижения количества лейкоцитов до 5800 кд/вд3 у одного теленка в 5-м пассаже, отклонений о клинико-физиологическом состоянии животных не установлено. -

Реиэохировать от животных модифицированный вирус ДЦ-БС ни в одном из пассажей не удалось, а ВН-антитела в титрах 1:8 -1:32 выявлены только в сыворотке крови телят 1-х трех пассажей.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии реверсии у модифицированного варианта П-б-1 штамма ВК-1, всвяэи с чем его можно отнести к оттенуированночу вирусу ВД-БС. ■

2.2.5.3. Й1мунобиологические свойства аттенуированного вируса

Оптимальную иммунизирующую дозу и способ прививки аттенуированного варианта вируса ДЦ-БС устанавливали в двух оытах на 41 теленке. Испытывали дозы: 2хЮ3»0, 2хЮ4»0 й гхЮ5,0!!^/^, при подкожном, внутримышечном одно- и.двукратной введении вируса с интервалом Ю и 21 сут. Учитывая тропизм вируса ВД-БС к . клеткам лимфоидной ткани, подкожную прививку проводили в область предлопаточного лимфатического узла животным.

После первого введения испытуемых доз вируса почти у асах

* Ч П ''

телят, эа исключением привитых дозой 2x10 » -ВДоо/мя*

на однодневная температурная реакция и незначительное снижение количества лейкоцитов. Выявляемой реакции на повторное аЕедонта антигена животным у последних не установлено.

Антигенная активность при подкожной прививке аттенуирован-ного вируса в область лимфатического узла была несколько выше, чем при внутримышечном введении. Также более высокие титры ВН- ' антител отмечены после повторного введения антигена с интервалом 21 сут.

« 1

В результате контрольного заражения гомологичным эпизоотическим штаммом ВК-1 вируса ВД-БС заболели пять из,И телят,привитых минимальной дозой 2х103*°ТВД5о/мл.и еще у одного теленка, привитого внутримышечно в дозе 2хЮ4,0ТЦЦ50д)Л,отмечено повышена температуры тела до 39,8°С и серозный ринит.Все неиммунные (контрольные) телята после заражения заболели с характерными для ВД-БС клиническими признаками и лейкопенией (табл. 4).

Таким образом, было установлено, что для профилактики ДЦ-БС оптимальной является доза аттенуированного вируса 2хЮ4'® ТВДэд/мл после двукратного с интервалом 21 сут подкожного введения в область предлопаточного лимфатического узла крупного рогатого скота.

Стабильность аттенуированного варианта вируса устанавливали на шести телятах после 10 прямых пассажей вируса в культуре клеток ПТ (СПТ). Вариант 11-6-1 оказался стабмькым, т.к. полностью сохранил свои исходные свойства: реактогенноеть, анти-генность и способность вызывать напряженный иммунитет.

Генетические признаки (маркеры) отражены в таблице 5, из которой ввдно, что аттенуированный вариант отличался от исходного эпизоотического штамма ВК-1 вируса вирусной диареи по Асз

Установление оптимальной иммунизирующей дозы и способа прививки телят аттенуированным вариантом 11-6-1 ВД-БС

(X * ш, п=3)

: СПОСОб' прививки

Доза Коли'

ЧеСГ Поствакцинальная реакция

жи температур- лейкоци- антиген-вот ная, тарная, нал,титр

ных

кл/мм3 ВН-

Результат контрольного заражения лихорад- ри- гин- диа- лейкопения, »•0С. НИТ- вст рея

антител

Подкожно: однократно

двукратно с интервалом:

Ю су?

21 сут

Внутримышечно, двукратно, с интервалом

21 сут

ЯхГС3'0 2хЮ4'0 2хЮ5'0

2Х103,0

2хЮ4'0 2хГО5'0

2хГО3'0 2хГО4'0 2хЮ5'0

2Х103'0 2хХ04'0

2x10'

5,0

3. 39,7.. .39,8 5133*101 8*2,1

3 39,9 6399*214 22*5,5

.3 39,6.. .40,0 6444*604 44*4,7

3 - 6*1,4

3. 39,6.. .39,7 6455*473 39*1,9

3 39,7.. .39,9 5324* 76 35*9,3

.3 39|9« • .40,0 6377*554 23*9,5

3 39,7.. .40,2 5800*115 95*3,7

3 39,9 '5769*387 117*3,5

2 39,8 - 4,5*0,5

3 39,6.. .39,8 5800*115 46*1,9

3 39,6.. .39,9 4666* 66 113*5.1

39,9 (2) +«)

- 4200*115(1)

4933* 66: 4266*176(2)

- 4866* 66(1)

41!о'(2) +(2) +(2) - 4033*33(2)

го

Контроль

б

41|1(6)

+(6) +(6)

+(4) 3099*150... 2733*176(6)

Примечание: "X данные зт цифра.

, обратные среднегеометрическому титру антител;

заключенная г скобки, локазываат количество реагирующих животных.

Фенотипическая характеристика аттенуированного варианта 11-6-1 в сравнении с исходный эпизоотический штаммом ВК-1 ВД-БС

Генетические признаки

Вирусный материал г6t "¡50 • Ас

температура, °С время, мин »ислотность, рН

30 , ; 34 37 . • 40 2 4 6 8 10 3,0 4,0 5,0

Исходный, эпизоотический - ■ + 0,0* 4,0 + 5,5 + 5,5 : + 5,5 ' + 4,0 1,5 1,5 1,0 1.5 + + 5,0 5,0

Аттенуированный 0,0 . + . 4,0 .+ 6,0 + 5,0 + 6,0 + 4,0 3,0 1,0 1,0 + 5,0 •»• + 5,0 5,0

8

Условные обозначения: - признак отрицательный, + признак положительный, х цифровые обозначения указывает на активность вируса в lg ТЦЦ^д^.

и ?ь- признакам. В процессе длительного пассирования в культуре клеток аттенуированный вариант в отличие от эпизоотического вируса ВД-БС приобрел устойчивость к воздействию кислой зоны рН (Лс>э+) и утратил патогенность для телят (Рь~) •

Анализ результатов исследований по разработке активной специфической профилактики вирусной диареи -болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота позволяет сделать заключение о том, что аттенуированный вариант 11-6-1 может быть использован в качестве вирусвакцины против указанного заболевания. Данный вариант вируса обозначен как аттенуированный вакцинный штамм ВК-1В1 и после депонирования в ВГНКИ петпрепаратов ему присвоен № 28.

2.2.5.4. Изготовление и контроль вирусвакцины сухой культуральной против вирусной диареи крупного рогатого скота

Стерильную расплодку в первичной культуре клеток ПТ (СНГ) аттенуированного вакцинного штамма ВК-1В1 с инфекционной актив-

5 с

ностью 10 ' ТЦЦздумл объединяли со средой высушивания.К девяти объемным частям вируссодержащай суспензии клеток добавляли по 0,5 части 5035 раствора сахарозы и 25% - желатина.Смесь вируса со средой высушивания расфасовывали в ампулы по 2,0 мл, помещали в кассеты и в течение не менее 6 час замораживали при температуре минус (4С£о,5)°С.В сублиматоре лабораторной сушильной установки процесс замораживания "продолжали в течение 18-24 час при температуре в вируссодержацем материале минус (42^,5)°С. После вакуумирования остаточное давление в камере высушивания поддерживали на уровне 9(5-100 мм.рт.ст. в течзниэ

12-14 час. Подогрев полок в сублиматоре до С15±3;0)°С выполняли в течение 6-8 час с сохранением температуры в материале до минус (30±2,0)°С.Далее за период 18-20 час температуру в материале повышали до 0°С и на конечном этапе высушивания в течение 68 час ее доводили до (I5Í3,0)°С. Досушивание вакцины при положительной температуре и давлении в камере не более 100 мм. рт. ст. проводили в течение 6-10 час, после чего процесс лиофилиза- ■ ции считали законченным. Общая продолжительность сушки составляла 60-65 час.

Всего изготовлено 1000 доз в опытной партии вирусвакцины

сухой культуральной против вирусной диареи крупного рогатого

скота с инфекционной активность» аттенуированного вакцинного

с О

вируса после лиофилизации 10 * ТЦ%о/мл •

Опытная партия вирусвакцины прошла внутриинститутские и ведомственные с представителями БГНКИ ветпрепаратов комиссионные испытания, положительные результаты которых отражены в соответствующих документах, имеющихся в приложении к диссертации. По заключению ведомственной комиссии разработана, согласована и утверждена нормативно-техническая документация (НТД) на опытно-промышленное производство, с соблюдением регламента которой на Ставропольской биофабрике были изготовлены и поставлены на контроль две серии вирусвакцины .сухой культуральной против ви-• русной диареи крупного рогатого скота. Серия ДО I в объеме 4,5 тыс. доз высушена в ампулах по 2,0 мл, запвенннх под вакуумом, и серия № 2 в объеме 3,5 тыс. доз высушена во флаконах по 5,0 мл, сохранялась без вакуума. Обе серии вакцины также с положительными результатами прошли ведомственный комиссионный контроль безвредности, реактогенности, антигенности и напряженное-

ти иммунитета для телят.

Производственными испытаниями опытно-промышленных серий вирусвакцины, изготовленных Ставропольской биофабрикой, в неблагополучных по ВД-БС хозяйствах Пензенской, Волгоградской, Тверской областей и бывшей Молдавской ССР показана высокая профилактическая эффективность препарата и его способность к купированию инфекции.

После согласования и утверждения НТД на промышленное производство приказом № 146 от 29 ноября 1988 года по Главному управлению ветеринарии Госагропрома СССР вирусвакцина против ВД-БС внедрена в ветеринарную практику и серийно производится Ставропольской биофабрикой. За период до 1994 года с мест применения вакцины в различных регионах России и стран СНГ рекламаций не поступало.

Учитывай литературные данные и собственна практические наблюдения, свидетельствующие о крайней необходимости проведения специфических мер борьбу с ВД-БС в неблагополучных репродуктивных хозяйствах, были проведены вксперименталь-ные и полевые . комиссионные испытания вирусвакцины на стельных коровах. Вакцинация таких животных ва два месяца до отейа оказалась безвредной и эффективной для выработки активного иммунитета не только у коров, но и у родившихся от них телят.

По результатам втих испытаний нами внесены соответствующий изменения в Наставление по применению, разрешающие использование вирусвакцины против ВД-БС не только в откормочных, но г в неблагополучных репродукторных хозяйствах.

2.2.5.5. Сравнительные испытания эффективное?!-

отечественной вирусвакцкны с французской коммерческой вирусвакциной против вирусной диареи крупного рогатого скота

Вирусвакцины против ВД-БС: отечественная из аттенуирован-ного штамма BK-IBI № 28 и Muoosiffa. французской фирмы Rhone Merieux из аттенуированного штамма Oregon C24V вызывали слабую температурную реакцию и незначительное снижение количества лейкоцитов у телят при введении 10-кратной иммунизирующей дозы. Реактогенность у французской вакцины была несколько выше, чем у отечественной, а показатели ентигенности и напряженности иммунитета оказались практически одинаковыми (табл. б).

2.2.6. Разработка экспресс-диагностики вирусной диареи -болезни слизистых оболочек крупного рогатого «кота

Основная цель исследований по данному разделу - установить возможность выявления в неблагополучном стаде пммунотолерантных, персистентно инфицированных вирусом ВД-БС животных с помощью реакции иммуноферментного анализа (®А). При этом,'разумеется, одновременно решался вопрос экспресс-диагностики заболевания. Работа проведена совместно с ведущим научным сотрудником Л.А.Йшсовой и заведующим лабораторией эпизоотологии, диагностики и профилактики вирусных желудочно-кишечных болезней крупного рогатого скота М.М.Гоголевым.

Антиген для И5А готовили из расплодки аттенуированного вакцинного штамма BK-IBI № 28 вируса вирусной диареи в перевиваемой линии клеток коронарных сосудов плода коровы (КСТ), гдо

Сравнительные испытания на телятах эффективности вирусвакцин иэ аттенуированного штамма ВК-1В1 № 28, изготовленной Ставропольской биофабрикой и Muc.osi.ffa ' \ ' ПрОИЗВОДСТВа французской.фирмы Ююпе Ыег1ешс

Таблица 6

(X ± т, п=3)

Вакцина Свойство Номер живот. ного. Поствакцинальная реакция Результаты контрольного заражения

препарата темпера. турная, ос лейкоцитарная, кл/ммэ лихо- ри- гин- диа-радка, нит ги- рея Од вит лейкопения, кл/мм3

штамм ' ЕК-1В1 »28 безвредность 7033 . 7242 40,2 40,0 7533*290 7500*235 _ ■■ _ _ -

рэаятоген-ность и имцуноген-ность 7613 2884 7237 7259 39,6 39,6 39,8 39.6 6033± 33 5400* 38 5066* 66 5000*115 _ -

Огвёоп С24-7 безвредность 7517 • .7852 • 39,7 39,7 4866-133 6666*240 -

реактоген-ность и иммуноген-ность 7858 7051 7270 39,6 39,6 39,6 5233*295 4866*133 5066*133 :■ -... - - - ' 4933*176

7275 : _ 4900*115 _ _ -

Контроль 6972 6940 40,6 + . + т 40,5 + + - 2800*115 3133-176

УСЛОЕКНЗ обозначена:

+ выраженное, т слабое проявлений, признаков заболевания.

отсутствие жлшичееких

ы со

©тот штамм накапливался в высоких титрах.

Антисыворотку получали гипериммунизацией телят вакцинным штаммом BK-IBI № 28, предварительно очищенным в градиенте плотности сахарозы и с использованием адъювантов.

При получении иммуноферментных конъюгатов из глобулино-еоЙ фракции использовали перокседазу хрена с показателем чистоты RZ=5. '

Активность в ®А специфического антигена была более, чем 1:512, а гипериммунной сыворотки - 1:25600.

Для обнаружения антигена ВД-БС в пробах материала от животных использовали модификацию ®А в варианте "Сэндвич".

С учетом решения проблемы диагностики ВД-БС для ветери-нарно-диагностических лабораторий был разработан набор компонентов И5А, рассчитанных на исследование 190 проб испытуемого материала.

Специфичность ИМ для диагностики ВД-БС установлена в РН в культуре клеток при сравнительных исследованиях 134 проб различного материала от крупного рогатого скота неблагополучных хозяйств Московской, Тверской, Тульской, Смоленской и Калужской областей России. Результаты исследований'- совпадающие, но процент выявления антигена ВД-БС методом ГОЛ был постоянно выше, очевидно, всвязи с обнаружением нецитопато-генного биотипа вируса.

Исследованиями в №к 40 проб крови (лейкоциты) от клинически здоровых коров неблагополучного по ВД-БС АОЗТ "Заволжское" Калининского района Тверской области в восьми пробах (20%) выявлен антиген ВД-БС. Повторным исследованием через три недели эти результаты полностью подтвердились, что дает основа-

ние восемь коров, клинически здоровых при визуальной оценке, считать персистентно инфицированными вирусом вирусной диареи.

На набор компонентов ®А для диагностики ВД-БС крупного рогатого скота разработана, согласована и утверадена ГУБ Минсельхоза России НТД на опытно-промышленное производство. Рекламаций с мест применения набора нет.

Таким образом, при использовании для накопления вируса ВД-БС высокочувствительной культуры клеток КСТ изготовлен активный и специфичный антиген, что явилось основной предпосылкой для успешной разработки экспресс-диагностики болезни методом !ЙА, Главное преимущество этого метода в сравнении с другими диагностическими тестами - простота выполнения реакции, быстрое получение результатов, юс достоверность в выявлении персистентно инфицированных животных и реальной возможности освоения и использования его в обычных ветеринарно-диагности-ческих лабораториях.

Помимо того, аттенуированный нами вакцинный штамм ВК-1В1 № 28 вируса ВД-БС в Молдавском научно-исследовательском институте животноводства и ветеринарии использован для разра-' ботки "Набора жидких эритроцитарных антигенов и сывороток для диагностики вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота". На диагностический набор утверадена НТД.

Опыт работы с ВД-БС и анализ литературных данных позволили составить схему выбора наиболее рациональных методов диагностических исследований в зависимости от форм течения инфекции и клинического проявления болезни (табл. 7), которая используется нами в работе.

.. •........ ' Таблица 7

Схема диагностических исследований на ВД-БС в зависимости от форм течения инфекции

Номер п/п Формы течения инфекции Материал для исследования Лабораторный тест

Г. Острая вирусная инфекция

а) пренатальная:

обортирование, врожден- Плодная жодкость,ки- Вирусовы-

ные дефекты, нормально шечник, миндалины, деление в

развитые телята, рож- лимфоузлы,селезенка, культуре

денные серопоэитивными сыворотка крови до клеток

и серонегативными (им- приема < молозива, (ВИС),

ыунотолерантными) кровь (лейкоциты) Ш, РН

б) постнатальная:

субклиническая инфекция, ви- Парные пробы •га.'

русная диарея, случная инфе- сыворотки кро- И5А,

кция, имцуносупрессия, боль- ви (интервал ВКК

ные новорожденные телята с I мес), секре-

признаками гингивита, диареи ты, экскреты

2. Хроническая вирусная инфек-, Кровь (лейко- .®А

ция (персистентная виремия) циты) , секреты .

3. Болезнь слизистых

а) острая: до смерти Секреты, экскреты, ИМ

кровь (лейкоциты)

после смерти Слизистая оболочка ВКК,

* носа, миндалины, ИВА

селезенка, лимфоуз-

; , ...... ..;. .•.;;.. лы, сычуг, кишечник

б) хроническая: до Парные пробы сыво- РН,

смерти ротки крови,' .ИЗ А

секреты, экскреты

после смерти То же, что при ВКК,

- острой форме ш

вывода

1. В различных регионах России и стран СИГ при массовых заболеваниях телят с поражением органов дыхания .и пищеварения изолировано девять шт.аммов вирусных цитопатогенных агентов, которые идентифицированы как возбудитель вирусной диареи -болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота. Вирус чувствителен к воздействию эфира, хлороформа, трипсина, прогреванию при 50°С; 5 бром-, 2 деэоксиуридин не подавляет его репродукцию в культуре клеток; не обладает гэмагглютинирувщей активностью; плавучая плотность в градиента плотности сахарозы -1,05...1,19 г/см3; размер оболочэчных вирионов с кубическим типом симметрии - 40...60 нм.

2. В экспериментальных условиях вирусом штамма ВК-1 воспроизведено заболевание у телят с симптомокомплексом, характерным для вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота: высокая и продолжительная лиЭсорадка, ринит, гингивит, диарея, лейкопения. Основные патологоанатомические изменения установлены на слизистых оболочхах носа, ротовой полости, сычуга и кишечника в,вцде геморрагического воспаления.

и образования эрозий.

3. После длительного пассирования эпизоотических штаммов вируса вирусной диареи в гомологичной и гетерологичной культурах клеток подучены три модифицированных варианта.-По своим рв-вктогенным, антигенным и иммуногенным свойствам вариант П-б-1 штамма ВК-1 отвечает требованиям, предъявляемым к аттенуироаеа-ным вакцинным штаммам.

4. Аттачуированный штамм ЗК-1В1 В 28, используемый для

создания живой вакцины против вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, отличается от эпизоотического исходного штамма ВК-1 по генетическим признакам Асз и Рь, В процессе аттенуации вирус приобрел устойчивость к воздействии кислой зоны рН (Асз+) и утратил выраженную патоген-ность для телят (Ръ~).

5. Вирусвакцгаа сухая культуральная против вирусной диареи крупного рогатого скота в оптимальной иммунизирующей дозе

2 х Ю4'® ТВДэд/мл после двукратного подкожного применения в области предлопаточного лимфатического узла стимулирует у животных выработку напряженного иммунитета.' Уровень вируснейтра-лизущих антител в сыворотке крови с минимальным титром 1:8 обеспечивает защиту вакцинированных животных от заражения эпизоотическим штаммом вируса вирусной диареи.

6. Применение вирусвакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота стельным коровам за два месяца до отела вызывает иммунологическую реакцию у плодов, выражающуюся в образовании вируснейтрализутацих антител в титре 1:8 ... 1:32, которые выявляются в сыворотке крови родившихся телят до приема молозива.

7. Производственные испытания вирусвакцины в неблагополучных по вирусной диарее-болезни слизистых оболочек хозяйствах показали ее профилактическую эффективность в веде снижения количества больных животных и предотвращения распространения инфекции.

8. В сравнительных экспериментальных исследованиях установлено, что живая вакцина против вирусной диареи-болезни сл то'/стих оболочек крупного рогатого скота из аттенуированного штамма

BK-IBI №28 не уступает по своей антигенной и иммуногеноой активности коммерческой вакцине Mucosiffa ( фирма Rhone Merieux, Франция).

9. Установлено, что живая вакцина против классической чумы свиней из штамма "К" в опытах на телятах обладает менее выраженной иммуногенной активностью, чем модифицированные варианты вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.

10. Показана высокая чувствительность диплоодного штамма эпителиальных клеток коронарных сосудов плода коровы к вирусу вирусной диареи. Использование указанной культуры клеток для выращивания вируса аттенуированкого штамма BK-IBI $28 обеспечивает накопление специфического вирусного белка в количестве, необходимом для изготовления антигена, используемого в реакции иммуноферментного анализа. "

11. Разработан набор компонентов и тест-система на основе иммуноферментного анализа для экспресс-диагностики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота,показана возможность ее использования с целью выявления переметен-тно инфицированных животных- в неблагополучном стаде. Метод является чувствительным, специфичным, доступным при освоении и использовании в ветеринарно-диагностических лабораториях.

12. В эксперименте.и неблагополучных по вирусным пневмо-энтеритам телят, хозяйствах после аэрозольного применения установлена профилактическая эффективность Поливалентного сывороточного препарата против вирусной диареи-болезни слизистых .оболочек, инфекционного ринотрахента, парагриппагЗ и парвови-руенэй инфекции крупного рогатого скота. '>

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана активная специфическая профилактика и экспресс-диагностика вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота:

-временная инструкция по изготовлению и контролю вирус-вакцины сухой культуральной против вирусной диареи крупного рогатого скота (утверждена ГУВ Госагропрома СССР 22 сентября 1987 года);

-ТУ 10-19-500-87 - вирусвакцина сухая культуральная против вирусной диареи крупного рогатого скота (утверждена ГУВ Госагропрома СССР 7 сентября 1987 года);

-временное наставление по применению вирусвакцины сухой культуральной против вирусной диареи крупного рогатого скота (утверждено ГУВ Госагропрома СССР 8 сентября 1987 года);

-приказ. ГУВ госагропрома СССР №146 от 29 ноября 1988 года о внедрении в ветеринарную практику вирусвакцины сухой культуральной против вирусной диареи крупного рогатого скота;'

-временная инструкция по изготовлении и контролю набора компонентов для диагностики вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (утверждена директором ВЮВ 10 апреля 1991 года);

-ТУ 10-07-078-92 - набор компонентов для диагностики вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота методом иммукоферментного анализа (утверждена ГУВ Минсельхоза России 10 августа 1992 года);

-временное наставление по применению набора компонентов для диагностики вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота методом кммуноферментного анализа (утвервдено ГУВ

Мкнсельхоза России 20 августа 1992 года);

- авторское свидетельство "Штамм вируса Bovine viral diarrhoea - mucosal dissease virus ДЛЯ изготовления вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота" " 1322673 от

8 марта 1987 года;

- авторское свидетельство "Живал вакцина против вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота и способ профилактики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота" № 1538304 от 15 сентября 1989 года;

- авторское свидетельство "Ассоциированная вакцина для профилактики респираторных заболеваний крупного рогатого скота If I8792I9 от 22 сентября 1992 года;

- авторское свидетельство "Штамм диплоидных культивируемых клеток коронарных сосудов плода коровы Bus tauruo L., используемый для культивирования вируса вирусной диареи крупного рогатого скота" № 1835849 от 13 октября 1992 года;

СПЮОК ОПУБЛШОВАННЫХ РАБОТ

1. Гоголев М.Ы., Ыникова Л.А., Жидков С.А. Диагностика вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС) методом иммуноферментного аналаза //Тезисы докл. НПК "Профилактика и.меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных", М., 1993, в. дачати. , .

2. Жвдков С.А., Крюков Н.Н.-.Зудил кна 3.S., Михайлов П.Н. Эффективность сывороточных препаратов.при вирусных.респираторных заболеваниях телят //Воя. ВЮВ, 1975, Вып. XXII.,

С. 38...41. • : г,

... 3. Жидков С.А., Зудилина З.Ф., Михайлов П.Н. Изучение этиологии респираторных заболеваний телят //Тезисы докл., 1У Всесоюзн. вет. вирусол. конфер., 17-19 ноября 1976 г., Владимир, 1976., ч. I., С. 203...204.

4. Жвдков С.А., Крюков H.H., Ярных Е.В. Гомологичная и гетерологичная профилактика вирусной диареи крупного рогатого скота //Тезисы докл. "Актуальные вопр. вет. вирусол.", Казань, 13-15 мая 1980 г., С. 134...135.

5. Жадков С.А., Суворов B.C. Генетические признаки атте-нуированного и исходного вирусов диареи (ВД-БС) крупного рогатого скота //Труды ВЮВ, 1981., т. 53, С.'29...31.

6. Жидков С.А. Способ получения аттенуированного вируса диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС) крупного рогатого скота//Бюл. ВЮВ., 1989., Вып. 71, С. 22...25.

7. Zhi&kov S.A., Khalenev Y.A. bovine virus diarrhoea - mucosal dissease: prevalence, epizootiology and control measures in the USSR. Rev. sei. tech. Off. Epiz.,T990, 9(1), 173--.179.

8. Жидков С.А. Специфическая профилактика вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота //Тезисы докл. НПК "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных", М., .1993,, в печати.

9. Жедков С.А., Лебедев А.И., Мникова Л.А. Формы течения ■ инфекции и принципы патогенеза вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота //Тезисы докл. НПК "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных", М,, 1993.,.в печати. .

. ■. 10., Зудкляна З.Ф.,. Михайлов П.Н.Жедков С.А., Надточей Г.А. Выделение парвовируса КРС //Тезисы докл, 1У Всесоиэн.

вет. вирусол. конфер. 17-19 ноября 1976 г., Владимир, 1976,, ч, I., С. 207...208.. . ... . ..

11. Крюков H.H...Жвдков С.А., Зудилина З.Ф., Михайлов П.Н., Белкина Н.М. Серопрофилактика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота //Труды ВИЭВ, 1975., т. 43., С. 185...190.

12. Крюков H.H., Зудилина З.Ф., Юров К.П., Жццков С.А.

О неспецифической профилактике вирусной диареи крупного рогатого скота //Ветергаария, 1978., # I., С. 37...39.

13. Крюков H.H., Авилов B.C., Вечеркин A.C., Зудилина З.Ф., Щуляк А.Ф., Жидков С.А., Сологуб В.К., Соколова Н.Л., Гоголев М.М., Виноградский В,И. Этиологические и впиаоотологичоские факторы вирусных респираторных заболеваний телят в промышленном комплексе //Бюл. ВИЭВ, 1984, Вып. 55., С. 3...9.

14. Куликова И.Л., Дьяконов Л.П., Жцдков С.А. Культура клеток сосудов сердца теленка и чувствительность клеток этой культуры к вирусу диареи крупного рогатого скота //Цитология, 1992, т. 34.,9., С. 75...76.

15. Куликова И.Л., Жцдков С.А. Культуральные, морфологические и биологические свойства кулмуры клеток коронарных сосудов ембриона коровы (КСТ) //Тезисы докл. НПК "Культура клеток животных в ветеринарии и биотехнологии", М., 1993., в печати.

16. Мникова Л.А., Гоголев М.М., Соколова Н.Л., Жедков С.А. ИмцуноферментныЙ анализ в диагностике вирусных желудочно-кишечных болезней крупного рогатого скота //Тезисы докл. НПК "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных", М., 1993., в печати.

17. Поздняков A.A., Юров К.П,., Мугуэким Л. И., Козыренко Т.И., Жедков С.А. Методика получения дипловдного штамма клеток

из тестикулярной ткани жеребенка и испытание его чувствительности к.некоторым вирусам //Бюл.ВЮВ, Вып.ХХ1У., С. 46...48.

18. Поздняков A.A., Авилов B.C., Гололобова М.Т., Дьяконов Л.П., Жццков С.А., Козыренко Т.И., Позднякова Е.А., Сурин Б.И. Чувствительность к вирусам новых перевиваемых линий клеток //Тезисы докл. 1У Всесоюзн. вет. вирусол. конфер. 1719 ноября 1976 г., Владимир,, 1976., ч. I., С.103...105.

19. Штамм вируса Bovine vieal diarrhoea - mucosal dissease virus для изготовления вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота /Жидков С.А., Крюков H.H. //Авторское свидетельство № 1322673 от 8.03.1987 г.

20. Живая вакцина против вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота и способ профилактики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота /Жидков С.А., Крюков H.H. //Авторское свидетельство

№ 1538304 от 19.9,1989 г.

21. Вакцина для профилактики респираторных заболеваний крупного рогатого скота /Юров К.П., Караваев Ю.Д., Зудилина З.Ф., Вечеркга A.C., Налетов Н.И., Жвдков С.А., Сухарев 0.П., Третьякова И,А., Зудилин В.А. //Авторское свидетельство

№ I7892I9 от 22.9.1992 г.

22. Штамм диплоидных культивируемых клеток коронарных сосудов плода коровы Виз taurus ь., используемый для культивирования вируса диареи крупного рогатого скота /Куликова ИЛ., Дьяконов Л.П., Жвдков С.А., Гоголев М.М. //Авторское свидетельство № 1835849 от 13.10.1992 г.

23. Способ приготовления.эритроцгаарного диагностисума

на основе,вируса диареи крупного рогатого скота /Красочно П.А., Ковалев H.A., Красочко И.А., Жвдков С.А,, Корольков В.И. //Положительное решение ВНПГПЭ Ш47 от 16.6.1991 г.

Подписано в печать OU.cn/. т1/ г. Формат 60X84/16 __Бум. офс. Печать офс.

Тираж Заказ

МП «ПЕТИТ»

107664, Москва, Богатырски!! мост, 17, корп. 5