Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка РНГА для широкомасштабной диагностики вирусной диареи /ВД/ крупного рогатого скота

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ имени К.И.СКРЯБИНА

На правах рукописи

ФОМИН Константин Юрьевич

РАЗРАБОТКА РНГА ДЛЯ ШИРОКОМАСШТАБНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ /ВД/ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва 1998

Работа выполнена в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор БелоусоваР.В. Официальные оппоненты:

1. Бурлаков Валентин Александрович, доктор ветеринарных наук, профессор.

2. Соболев Виктор Васильевич, доктор ветеринарных наук.

Ведущая организация: .Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (г. Щелково Московской области п.о. Кашинцево. Биокомбинат.)

Защита состоится " " л^ал— 1998 г. в -{О часов на заседании диссертационного совета (К-120.36.05) по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина (109472 Москва, ул. академика Скрябина, 23, тел. 377-93-83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Автореферат разослан " ¿О " 1998 г.

1 к .

Ученый секретарь диссертационного совета

З.Н. Меньшикова

Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы.

Прошло более 50 лет с тех пор, как Ülafson и Childs одновременно описали болезнь крупного рогатого скота, протекавшую с острым энтеритом, которая, как выяснилось позже, вызывается песгивирусом и была названа вирусной диареей (ВД крупного рогатого скота), болезнью слизистых (БС), которую впервые описал Ramsey и Chivers.

Вирусная диарея зарегистрирована во всех странах мира, она обычно появляется через 15-20 дней после комплектования сборного стада то хозяйств -поставщиков телят на фоне различных стрессовых воздействий. Однако для эффективной вакцинации скота против данной инфекции необходимо уточнение диагноза на наличие ее в хозяйстве.

В настоящее время молекулярно-биологические данные подтверждают, что пестивирусы отличны от семейства Togaviridae и стоят ближе к семейству флавивирусов, поэтому вирусы, в прошлом включенные в семейство Togaviridae перенесены во вновь образованное семейство Flaviviridae, которое ранее было родом.

Убытки хозяйств от вирусной диареи складываются го падежа и вынужденного убоя больного молодняка, потери упитанности, снижения молочной продуктивности, абортов, рождения нежизнеспособного приплода, затрат на проведение диагностических, лечебных и профилактических мероприятий.

Диагностика и профилактика вирусной диареи имеет свои особенности, обусловленные ее патогенезом и, как установлено в последние Годы, наличием биотипов вируса диареи.

Лабораторная диагностика вирусной диареи крупного рогатого скота основана на:

1. Обнаружении антигена в патологическом материале, полученном от больных животных в РИФ;

It. Выделении возбудителя из патологического материала в культуре клеток КСТ, ТБ, ГТЭК и его идентификации в РН и РИФ.

III. Выявлении антител в сыворотке крови больных и переболевших животных ( ретроспективная диагностика в РСК, РН и РИГА).

Однако последняя реакция - РНГА при вирусной диарее крупного рогатого скота еще не получила широкого применения, как при инфекционном ри-нотрахеите и других вирусных болезнях животных.

1.2. Цель н задачи исследовании.

Целью наших исследований являлось:

1. Разработка компонентов РНГА для серодиагностики вирусной диареи крупного рогатого скота.

2. Сравнительное изучение чувствительности РНГА и РН в экспериментальных и полевых условиях.

3. Проведение диагностических исследований на вирусную диарею крупного рогатого скота с помощью РНГА в вакцинированных и неблагополучных стадах крупного рогатого скота.

1.3. Научная новизна.

Впервые в Российской Федерации разработана РНГА для серологической диагностики вирусной диареи крупного рогатого скота. Показано, что РНГА является высокочувствительной, специфической реакцией, которая может быть использована, как экспресс-метод для серодиагностики вирусной диареи крупного рогатого скота. Проведено сравнительное изучение чувствительности РНГА и РН в экспериментальных и полевых условиях. Проведены диагностические исследования на вирусную диарею крупного рогатого скота с помощью РНГА в вакцинированных и неблагополучных стадах крупного рогатого скота.

1.4. На защиту выносятся результаты исследований по следующим

вопросам

1. Разработка компонентов РНГА для серодиагностики вирусной диареи крупного рогатого скота.

2. Сравнительное изучение чувствительности РНГА и РН в экспериментальных и полевых условиях.

3. Проведение диагностических исследований на вирусную диарею крупного рогатого скота с помощью РНГА в вакцинированных и неблагополучных стадах крупного рогатого скота.

1.5. Практическая ценность.

Результаты проделанной работы имеют значительную практическую ценность, т. к. являются неотделимой частью исследований по усовершенсгво-

вашпо метода лабораторной диагностики вирусной диареи крупного рогатого скота.

1.6. Лпробаиня работы.

Основные положения диссертации отражены в опубликованной статье (журнал «Ветеринария», 1998 , № 2) и получили положительную оценку на межлабораторном совещании сотрудников лаборатории и кафедры вирусологии 2 апреля 1998 г.

1.7. Объем работы.

Диссертация изложена на 68 страницах машинописного текста и включает введение; обзор литературы (глава I) вкшочает токсаномию вируса - диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота, сведения о геноме и белках вируса, устойчивости его к физическим и химическим факторам репродуктивных и цитопатогенных свойствах вируса, влиянии условий его культивирования, инфекционной и антигенной активности, антигенном родсгве и вариабельности биотипов его и интентификации новой группы штаммов вируса диареи. Помимо того в обзоре литературы приводится описание клиники - эпизоотических особенностей и патогенеза вирусной диареи, тератогенном и иммунодепресив-ном действии вируса, персистенции его и диабет, а также об источниках и путях передачи инфекции, спектре патогенности вируса и экспериментальной инфекции. Обзор литературы завершается описанием особенностей иммунитета при вирусной диарее крупного рогатого скота и специфической профилактики данной инфекции, современных методов лабораторной диагностики вирусной диареи, общей характеристики живых, инактивировашшх и субъединичных вакцин. Обзор изложен на 17 страницах машинописного текста. Собственные исследования описаны в главах 2,3,4. Материалы диссертации иллюстрированы 7-ю таблицами. Библиографический указатель включает 152 источника литературы из них 104 иностранных.

В Главе 2. "Разработка компонентов РИГА для серодиагностики вирусной диареи крупного рогатого скота". Описано: 1. Влияние фиксации и таниза-ции эритроцитов барана на чувствительность РНГА. 2. Оптимизация методов концентрирования и очистки вируса при изготовлении эри гроцитарного антигена. 3. Отработка оптимального режима сенсибилизации фиксированных эритроцитов барана.

В Главе 3. "Сравнительное изучение чувствительности РНГА и РН в экспериментальных и полевых условиях" показано сравнительное исследование сывороток крови на наличие антител к вирусу ВД крупного рогатого скота от экспериментально зараженных животных и "полевых" сывороток крови or животных различных областей Российской Федерации в РНГА и РН.

В Главе 4." Проведение диагностических исследований на вирусную диарею крупного рогатого скота в вакцинированных и неблагополучных стадах крупного рогатого скота" отражены результаты широкомасштабных диагностических обследований крупного рогатого скота на ВД при помощи разработанной РНГА.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Разработка компонентов РНГА для серодиагностики вирусной диареи крупного рогатого скота

2.1. Влияние фиксации и танизации эритроцитов барана на чувствительность РНГА.

В начале приводится литературная справка по данному вопросу. Эритроциты барана получали общепринятым методом и фиксировали акролеином по методу Ф.С. Носкова и.формалином по методу Whitman J.S. Hetrik (1965). Тшшзацию эритрощгтов барана проводили путем смешивания равных объемов 3%-ной взвеси эритроцитов и раствора танина

' ; / ' Таблица I

Влияние метода фиксации эритроцитов на чувствительность РНГА.

№№ п/п Метод фиксации эритрощгтов при помощи: Тигр гипериммунной сыворотки к.р.с. в РНГА Срок годности эриг-роцитарного диагно-стикума

1 Формалина 1:256 6 мес

2 Акролеина 1:1024 12 мес

Из таблицы 1 видно, что при использовании акролеина в качестве консерванта реакция обладала более высокой чувствительностью, чем при использовании для этой цели формализированиых эритроцитов. Кроме того срок год-

ности формализированных эритроцитов составлял 6 мес., тогда как акролени-зированных эритроцитов 12 мес.

Поскольку танин приметают для повышения сорбционной емкости белков, его состав зависит от источника получения препарата, поэтому при изготовлении эритроцитарного антигена мы в качало определяли серию танина, пригодную для РИГА и затем отрабатывали оптимальные условия танизации фиксированных эритроцитов. При выборе танина для обработки эритроцитов нами было испытано 12 серий аптечного препарата. В резу п>тате только 2 серии его не вызывали спонтанную агллютинацию эршроцигои и оказались пригодными для их танизации (Табл. 2).

Таблица 2

Влияния различных концентраций танина на чувствительность РНГА

Разведения та-шша Разведет« специфической сыворотки к.р.с. Нормальная сыворотка к.р.с. /контроль/

1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:4096

1 20000 1 1 1 1 ++++ -Н-++ 1 1 I 1 -н— ----

1 40000 ++++ ++++ ++— ---

1 80000 N11 ++++ ---- ----

1 160000 м 1 1 ++++ -- ---- --- ---

Как видно из таблицы 2, концентрация танина 1:20000 оказалась оптимальной; титр антител в РНГА при этом разведении достигал 1:1024, а при использовании танина в разведении 1:80000 - 1:160000 он значительно снижался. Как видно качество танина и его концентрация влияли на чувствительность РНГА. Оптимальными условиями танизации эритроцитов оказалось разведение танина 1:20000 на ФБР рН 7,2; время экспозиции 15 мин при температуре 37ПС (водяная баня при помешивании).

2.2. Оптимизация методов концентрирования и очистки вируса диареи для изготовления эритроцитарного антигена.

Экспериментам в этом разделе работы мы предпослан) литературную справку по серодиагностике адено-инфекции, инфекционного ринотрахеита и респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Наши экспе-риментачьные исследования заключались в оптимизации методов конценгри-

рования и очистки вируса диареи крупного рогатого скога для изготовления эритроцнтарного антигена.

2.2.1. Материалы и методы.

2.2.3. Вирус и его культивирование.

В работе использовали вирус диареи крупного рогатого скота штамм ВДТЛ, выделенный Г.А. Халеыевым и др. в 1992 г. из лимфатических узлов теленка в период эпизоотической вспышки болезни в одном го хозяйств. Указанный штамм репродуцировали в культуре перевиваемых клеток КСТ. Активность вируса устанавливали путем титрования в пробирочных культурах тех же клеток (КСТ), используя не менее 4-х пробирок культуры на каждое разведение вируса. Тигр последнего определяли по методу Рида и Менча.

2.2.4. Концентрирование и очистка вируса диареи при помощи полиэти-

ленгликоля (ПЭГ)-

К осветленной вирусосодержащей жидкости добавляли нормальную сыворотку крови кролика до конечной концентрации 2 %. Кондентращш) хлористого натрия доводили до 0,4%, затем добавляли ПЭГ с мол. весом 6000 до конечной концентрации 7,7% и оставляли при постоянном помешивании на магнитной мешалке при +4°С на 16-18часов. Далее суспензию центрифугировали при 5000-6000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяли в ФБР рН 7,2 и ре-суспендировали в 1/10 части общего исходного объема вируса. Полученные таким образом специфический и контрольный антигены использовали для сенсибилизации эритроцитов барана.

2.2.5. Концентрирование и очистка вируса диареи осаждением в изоэлск-

трической точке.

К осветленной вирусосодержащей жидкости добавляли 10% -ный свежеприготовленный расгвор гексаметафосфага натрия до конечной концентрации 0,5%. После этого быстро снижали рН раствора до 4,2 (рН соответствовал изо-электрической точке вируса диареи) путем добавления Ш раствора соляной кислоты. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 60 мин, затем ее центрифугировали при 5000-6000 об/мин в течение 20-30 мин. 11розрачную надосадочную жидкость выбрасывали, а осадок растворяли в 1/10 первоначального объема ФБР рН 7,2. Полученную вирусосодержащую жидкость использо-

вали в качестве специфического антигена. Контрольный антиген готовили таким же способом.

Концентрацию белка в антигене определяли на спектрофотометре СФ16 при длине волны (X) 280 нм. Результаты исследований приведены в таблице 3.

Таблица 3

Сравшгтельные титры в РНГА при использовании двух методов концентриро-

вания и очистки вируса диареи крупного рогатого скота

Антиген Уконц. / белка у/ мг/мл Титры антител

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512

Антиген, концентр. ПЭГ, ом

0,5 +-Н-+ ++++ ---- ---

1,25 +-Н-+ ++++ ++++ ++— --

2,5 -н-н- ++-Н- +-Н-+ +-Н-+ ++++ ++++

контрольный антиген

_

Антиген, концент. в изоэлектр. точке

0.5 1 1 и N 1 1- М 1 1 -Н-++ ----

1,25 ++++ +-Н-+ +-Н-+ -Н-++ +-Н-+ ----

2,5 ++++ ++++ 1111 -н-н- ++++ ++++ ++++ ++++ +-Н-+

контрольный антиген I

Как видно из таблицы 3, тигры антител с антигеном, полученным методом концентрирования и очистки вируса диареи крупною рогатого скота в ию-элекгрической точке составляли 1:256 - 1:512 при концентрации белка в нем 1,25 - 2,5 мг/мл, тогда как титры аншгел с антигеном из вируса концентрированного и очищенного ПЭГ'ом достигали значения только 1:64 - 1:128 при тех

же концентрациях белка в антигене. Метод концентрирования и очистки вируса диареи в изоэлектрической точке позволил нам проводить 10-20 кратное концентрирование вируеосодержащего материала и удалять до 80% клеточного белка. Поэтому данный метод нами был выбран для дальнейших исследований.

2.2.6. Отработка оптимального режима сенсибилизации фиксированных эритроцитов барана.

По данным ряда авторов, чувствительность антигенных диагностикумов зависит от многих факторов и, в первую очередь, от свойств, концентрации, дозы антигена и выбора оптимальных режимов нагрузки эритроцитов. Режим сенсибилизации эритроцитов оказывает существенное влияние на чувствительность РНГА, поэтому следующим этапом наших исследований являлась отработка оптимального режима сенсибилизации фиксированных эритроцитов барана

Материалы и методы. Было испытано два метода изготовления антигена для сенсибилизации эритроцитов барана: нативным антигеном, концентрированным в изоэлектрической точке в различных концентрациях по белку - 0,51; 1,25; 2,5 мг/мл, а также антигеном, обработанным детергентом (тритоном X-100) по методу Решпап (1966) в тех же концентрациях по белку. Равные объемы антигена и 3% взвеси фиксированных, танизированных эритроцитов смешивали и инкубировали, используя кислую среду (ФБР рН 6,4) и температуры: 37°С и 56°С в течение 30 и 60 мин при помешивании в водяной бане.

По окончании инкубации эритроцитарный антиген отмывали 3 раза ФБР рН 7,2, разводили до концентраций 1,5%, 1%, 0,75%, 0,5% в ФБР рН 7,2 с добавлением 1% нормальной кроличьей сыворотки и хранили при температуре +4°С. Активность разных микросерий эритроцитарного антигена проверяли в РНГА с использованием эталонной гипериммунной сыворотки крупного рогатого скота, предварительно оттитрованной в РН, где ее титр составлял 1:128 со 100ТЦД5о вируса диареи крупного рогатого скота.

Результаты исследований

• Для сенсибилизации эритроцитов применяли нативный антиген, концентрированный в изоэлектрической точке в различных концентрациях по белку и антиген дополнительно обработанный детергентом (трилоном Х-100). Эритроциты барана сенсибилизировали данными антигенами в течение 30 и 60 мин

при температуре 37°С и 56°С. Данные по активности антигенов при различных режимах сенсибилизации представлены в таблице 4.

Таблица 4

Титры антител при использовании разных микросерий эритроцитарчого антигена и режимов сенсибилизации

Температура сенсибилизации Время сенсибилизации Антиген концентрированный нативный Антиген, обработанный детергентом

0,51 1,25 2,5 0,51 1,25 2,5

37ПС 30 мин 60 мин 1:64 1:128 1:64 1:128 1:128 1:256 1:128 1:128 1:128 1:256 1:256 1:256

56°С 30 мин 60 мин 1:128 1:256 1:256 1:256 1:256 1:256 1:128 1:256 1:256 1:1024 1:512 1:1024

Из таблицы 4 видно, что оптимальным режимом сенсибилизации являлась температура 56°С и время экспозиции 60 мин. при концентрации антигена, разрушенного детергентом в пределах 1,25-2,5мг/мл. При "»том режиме сенсибилизации титр антител в РНГА составлял 1:1024.

Изменение концентрации эритроцитарного антигена влияло на чувствительность РНГА. В связи с этим мы подобрали оптимальную концентрацию эритроцитарного антигена для постановки РНГА. Данные :>тих исследований приведены в таблице 5.

Таблица 5

Влияние концентрации эритроцитарного антигена на чувствительность РНГА

Концентрации эритроцитарного антигена Разведения специфической сыворотьи Нормальная сыворотка /контроль/

1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024

1,5% +-Н-+ -н-н- ++++ --- ---- ----

1,0% -н-н- 1 м 1 -н-н- -НН-+ -и— ---

0,75% 1 1 и -н-н- ++++

0,5% ++++ ■1' 1 1 I1 ++++ — — __________

Как видно из таблицы 5, оптимальной концентрацией эритроцитарного антигена являлись: разведение его до 1%, титр антител в РНГА с указанным разведением составлял 1:512 - 1:1024. Большая концентрация его приводила к снижению титра в РНГА, уменьшение концентрации затрудняло учет результатов реакции. Таким образом, для дальнейшей работы мы использовали 1% концентрацию эритроцитарного антигена.

Глава 3. Сравнительное изучение чувствительности РНГА и РН в экспериментальных и полевых условиях.

В литературной справке к этой главе анализируется большое число исследований по разработке РНГА для выявления антител к вирусам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Однако четкость сопоставимых данных, полученных в РНГА с РН не получила в литературе однозначной оценки. Сравнение РНГА и РН в широком опыте показало, что в отношении ИРТ РНГА давно уже вышла за рамки лабораторных испытаний, чего нельзя сказать в отношении вирусной диареи крупного рогатого скота. Поэтому одной из задач наших исследований являлось изыскание методов получения специфического высокочувствительного эритроцитарного антигена, пригодного для ретроспективной диагностики этой инфекции и оценки поствакцинального иммунитета от живой и инактивированной вакцин в РНГА. В настоящее время отечественная биопромышленность освоила выпуск эритроцитарного антигена для серодиагностики ИРТ крупного рогатого скота. По данным А.Л. Семенихина и др. (30), Сюрина В.Н. (33), Fairchild et al. (30) - РНГА чувствительная и высокоспецифичная реакция с успехом используется для быстрой идентификации антител к вирусу ИРТ.

Исходя из скачанного, следующим этапом наших исследований являлось сравнительное изучение чувствительности РНГА и РН при серодиагностике вирусной диареи крупного рогатого скота.

Материалы и методы

Описывается мегодика постановки РНГА с использованием микротитра-тора Такачи. Положительными к вирусу диареи мы считали те пробы сыворотки крови, которые в разведении 1:8 и выше агглютинировали сенсибилизированные специфическим антигеном эритроциты не менее, чем на 2 креста при отрицательном результате в контроле. Там же описана и методика постановки

РН в перевиваемой линией клеток КСТ с постоянной дозой вируса (100ТЦД5о) и 10-кратными разведениями сыворотки.

Было исследовано по 10 проб гипериммунных сывороток крови крупного рогатого скота к вирусам диареи, РС, ПГ-3, адено- и ИТР, 7 проб от .экспериментально зараженных, животных и 190 проб "полевых" сывороток крови от животных, полученных из трех областей (Тульской, Белгородской и Пензенской) Росийской Федерации в РИГА и РН.

Результаты опытов представлены в таблице 6.

Таблица 6

Сравнительные титры антител в различных пробах сывороток в РИГА и РН

Происхождение проб сывороток Кол-во проб Титры в РИГА Титры в РН

1 2 3 4

1.от экспериментально зараженных животных . 3 1:128-1:256 1:32-1:64

4 1:256 1:128

2.«полевые» сыворотки 20 1:8-1:16 0

70 1:16-1:32 1:4-1:8

66 1:32-1:64 1:8-1:16

34 1:128- 1:256 1:32-1:128

3. контроли ставили паралельно со специфическим и контрольным эритроци- тарными антигенами а/ гипериммунные (положительные)

к диарее 2 1:512-1:1024 1:128- 1:256

к адено 2 0 0

к ПГ-3 2 0 0

к PC кИРТ 2 2 ___ 0 0 0 0

б/ эритроцитарный антиген + разбавитель 0

в/ исследуемые сыворотки + несен-сибилизированные эритроциты 207 0 1 !

Полученные результаты показали более высокую чувствительность и специфичность РИГА по сравнению с РН. Чувствительность первой на 3-4 порядка превосходила реакцию нейтрализации. Кроме того РИГА оказалась менее трудоемкой реакцией более простой в постановке, не требовала стерильности компонентов, гораздо короче по времени постановки и получения результатов, чем РН. Помимо этого возможно получение эритроцитарного антигена для РИГА с длительным сроком хранения (до I года). Таким образом, этот тест можно рекомендовать, как экспресс-метод серодиагностики вирусной диареи крупного рогатого скота.

Глава 4. Проведение диагностических исследовании на вирусную диарею с помощью РИГА в вакцинированных и неблагополучных стадах крупного рогатого скота.

В литературной справке к этой главе приведены обобщенные сведения о проведении диагностических исследований на инфекционные заболевания различной этиологии с помощью РИГА (ИРТ, гепатита пекинских уток, бурсаль-ной болезни кур, клещевого энцефалита человека, чума плотоядных, болезнь Ауески, ротавирусная инфекция телят, и ряд бактериальных агентов и мико-плазм, при диагностике паразитарных болезней). Из литературной справки видно, что РНГА - широко используемый метод диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций человека и животных.

Заключительным этапом наших исследований являлось использование РНГА для широкомасштабных диагностических обследований крупного рогатого скота на вирусную диарею в вакцинированных и неблагополучных стадах.

4.1. Материалы и методы.

Проведено иследование в РНГА сывороток крови крупного рогатого скота, полученных из разных регионов, используя разработанные нами компоненты реакции. Сыворотки получали:

I- от доноров после 2-5-ти кратной иммунизации их антигеном вирусов ИР Г, вирусной диареи, адено-, 11Г-3 и РС по схеме, разработанной в лаборатории вирусологии МГАВМ и Б с целью получения лечебно- профилактической поливалентной гипериммунон сыворотки. Иммунизацию крупного рогатого

скота проводили инактивированными антигенами непосредственно в хозяйствах Тульской, Белгородской, Пензенской и Волгоградской областей;

II- от коров, вакцинированных в последнем триместре стельности инак-тивированной вакциной против вирусной диареи "Пестивак" или ассоциированной инактивированной вакциной "Ринопест" против ИРТ и вирусной диареи. Вакцинацию проводили экспериментальными сериями вакцины в соответствии с "Временным наставлением по их применению";

III - исследовали так же "полевые" сыворотки коров и телят в хозяйствах Брянской, Московской областей стационарно неблагополучшлх по респираторной и кишечной патологии молодняка с целью диагностики и широты распространения вируса диареи в стаде;

IV- кроме того была исследована коммерческая сыворотка крупного рогатого скота для культур тканей производства Украины.

Результаты исследований. В нашей работе всего было исследовано 720 проб сыворотки крови крупного рогатого скота различных групп. Суммированные результаты исследования приведены в таблице 7.

Таблица 7

Результаты обследования крупного рогатого скота на наличие антител к вирусу

диареи крупного рогатого скота с помощью РИГА

Происхождение Кол-во Кол-во проб, прореагировавших а РИГА

проб сывороток проб 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512

1 2 3 4 _ L 5 6 7 8

Тульская обл.

доноры 40 0 0 0 14 14 12

вакцинированные 134 0 12 14 52 38 18

диагностика 72 36 14 6 4 10 2

Белгородская обл.

доноры 26 0 0 * 4_ 4 14

вакцинированные 78 2 20 38 10 4 4

диагностика 60 26 16 12 4 2 ' 0

11ензенская обл.

1 2 3 4 5 6 1. ■ 8

доноры 18 0 0 0 0 2 ; 16

диагностика 42 8 14 10 6 2 . 2

Волгофадская обл.

доноры 36 0 0 12 12 8 4

диагностика 72 42 18 8 4 0 0

Брянская обл.

диагностика 110 6 10 6 4 0 0

Московская обл.

диагностика 110 32 26 22 14 12 4

Коммерческая сыво-

ротка крс для культур

тканей производства

Украина 6 2 0 0 0 4 0

Как видно из таблицы 7, в группе доноров титры антител колебались от 1:64 до 1:512,. в группе вакцинированных животных, от 1:16 до 1:512, а в группе обследованных коров и телят из стационарно неблагополучных хозяйств /диагностика/ от 1:16 до 1:512.

Однако, животных с высоким уровнем антител /1:256 — 1:512/ в группе «диагностика» выявлялось меньше, чем в группах доноров и вакцинированных животных.

Таким образом, результаты серологичекого диагностического обследования стад, неблагополучных по респираторно-кишечной патологии молодняка крупного рогатого скота показали широкую циркуляцию вируса диареи в ряде хозяйств обследованных областей. Наличие высокого уровня антител к вирусу диареи /1:256/ обнаружено в 4-х из 6-ти исследованных серий сыворотки крупного рогатого скота для культур тканей производства Украины, что указывает на широкое распространение заболевания.

Кроме того, по результатам исследований можно заключить, что РНГА-высокоспецифический и чувствительный метод диагностики для проведения широкомасштабного обследования животных в вакцинированных и неблагополучных стадах.

Обсужаение.

В настоящее время РНГА часто используется в медицинской и ветеринарной лабораторной практике для диагностики ряда инфекционных болезней. Как известно, диагностикум для РНГА включает два основных компонента: 1/ сенсибилизины (антигены и антитела различной природы). 2/ эритроциты, на-тивные или фиксированные различными веществами: формальдегидом /148/, акролеином /25/, сульфасалициловбй кислотой /54/, глутаральдегидом /58/ и др.

В 1976 г Никулина В.Г. и др. /23/ использовали РНГА для выявления антител к вирусу простого герпеса I и П-го типов. Для фиксации эритроцитов барана авторы применяли акролеин, показав, что он является наиболее подходящим препаратом для фиксации эритроцитов.

Нами проведены сравнительные исследования по фиксации эритроцитов барана формальдегидом и акролеином. Результаты опытов показали, что при использовании для этой цели акролеина, РНГА оказалась более чувствительной /1:1028/, чем при использовании для этой процедуры формальдегида. Результаты наших исследований вполне согласовывались с данными, полученными Никулиной В.Г. и др. /1976/ /23/. Кроме того, преимущество сгабилиигрованных акроленном эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу /Белоусова Р.В., 1989/. Полученные нами акролеинизированные эритроциты барана хранились в течение 1 года, а формализированные 6 мес, что подтверждает преимущество акролеина для фиксации эритроцитов.

При изучении оптимальных условий для постановки РНГА многие исследователи установили, что оптимальной концентрацией танина, являлся раствор в разведении 1:20000, танизация эритроцитов происходила при 37°С в течение 15 мин/150,146,29/. А.Л.Семинихин/1970//30/и2уатЬо/1973//151/ показали, что использование более концентрированного раствора танина приводило к их спонтанной агглютинации в фосфатном буфере и наоборот, если использовать более разведенный раствор танина, то процесс сенсибилизации ухудшатся. Однако, поданным Аль-Шайбани Назар Абдель-Джалиль / I/оптимальной концентрацией танина являлось разведение его 1:40000. Полученные нами результаты /разведение танина 1:20000; титр антител РНГА при этом разведении составлял 1:1024/ согласовывались с данными \yritman, НеЬкпск/150/ Семени-хина А.Л. /20, 21/. Нами было показано, что качество танина и его концентра-

ция влияют на чувствительность РИГА. Оптимальными условиями танизании в наших опытах являлись: разведение танина 1:20000 на ФБР рН 7,2; время экспозиции 15 мин в водяной бане, при помешивании при температуре 37°С, что также согласовывалось с результатами полученными Vongris, More /46/, Семе-нихиньш А.Л. /21/, Shimizuet al., /132/.

Следующим этапом нашей работы являлась оптимизация методов концентрирования и очистки вируса диареи крупного рогатого скота при изготовлении эритроцитарного а1ггигена. Культуральный вирус диареи мы концентрировали и очищали двумя методами: при помощи полиэтиленгликоля /ПЭГ/ и осаждением в изоэлектрической точке, в присутствии 0,05% гексаметафосфата натрия. В наших опытах наиболее активным оказался антиген, концентриро-вашшй и очищенный осавдением в изоэлектрической точке. Титры антител с таким антигеном в РНГА составляли 1:256 - 1:512. Дашгый метод позволял нам проводить 10-20-кратное концентрирование вирусосодержащего материала и удалять 80% клеточного белка.

По данным Аль-Шайбани /1979//1/, который получал концентрированный и очищенный вирус ИРТ различными способами: замораживанием - оттаиванием, обработкой ультразвуком, ПЭГ' ом, осаждением в изоэлектрической точке и лучшие результаты в РНГА получил от использования концентрированного и очищенного ПЭГ'ом вируса по методу Shimizu et al., /132/. Японский исследователь Tomiyama /141/ культивировл PC-вирус в клетках VERO и «урожай» последнего 5 раз замораживал и оттаивал, в дальнейшем, подвергая его обработке ультразвуком и очищая флюрокарбоном. Полученный таким образом антиген автор использовал в РНГА для определения антител к РС-вирусу.

Наши результаты расходятся с данными, полученными Аль-Шайбани /1/ и Tomiyama /141/, что, вероятно, связано с различной репродукцией вирусов ИРТ, PC и вирусной диареи в культуре клеток и, возможно, с использованием различных культур.

Сюрин В.Н. с соавт., /35,36/ под оптимизацией подразумевали метод концентрирования и очистки вируса PC повышение его титра используя для этого: роллерный метод выращивания культуры клеток, добавление некоторых химических веществ, метод множественности заражения культуры клеток. Мы не использовали подобные приемы, т.к. штамм ВДТЛ вируса диареи хорошо культивировался в перевиваемой линии клеток коронарных сосудов теленка /КСТ/, достигая титра 107ТЦД Wmt

По данным ряда авторов, чувствительность антигенных диагностикумов зависела от многих факторов, таких как, концентрация, очистка и доза антигена, выбор оптимальных режимов нагрузки эритроцитов /длительность сенсибилизации, температура, рН и ионная сила среды и т.д./80/. По данным A.JI. Се-менихина /29,30/, Mensik et al. /112/ и др. эритроциты лучше сенсибилизировались антигеном при рН 6,4. Мы не отрабатывали режим сенсибилизации при различных значениях рН среды, используя рН.6,4, т.к. этот этап работы был проведен ранее другими /Халенев Г. А., Акбаева JIM., и др /37,38/. Из работ AJÍ. Семенихина /30/ видно, что другими оптимальными параметрами /кроме рН 6,4/ сенсибилшации эритроцитов являлись: концентрация последних до 3%, время сенсибилизации 30 Mint при температуре 37°С. По данным Zyambo et al., /151/ сенсибилизация, проходившая в течение 120 мин при 37°С, не влияла на чувствительность РИГА, но при низких температурах сенсибилизации тигры в РНГА снижались.

Наши результаты не полностью совпадали с результатами вышеприведенных авторов. В своих опытах, как указано выше, мы также использовали 3% концентрацию эритроцитов барана, а время сенсибилизации составляло 60 мин при температуре 56°С. Кроме того антиген был нами дополнительно обработан детергентом /тритоном Х-100/. Наши датшые отличались о г данных вышеупомянутых исследователей, т.к. для каждого вируса должны быть подобраны свои оптимальные режимы сенсибилизации.

В настоящее время РНГА широко используется для выявления антител к различным антигенам, в том числе - микробам и вирусам. По данным Deen и Burees /71/ между РН и РНГА при выявлении антител в вирусу ИТР имелась тесная корреляция /коэффициент корреляции был равен 0.К58/. Ichwanepod /31/ показал, что хотя титры антител в РНГА были в 8 раз выше титров в РН, они изменялись пропорционально, и по чувствительности обе реакции не уступали друг другу. Опыты, проведенные Аль-Шайбани /I/ также показали, что чувствительность РНГА не уступала РН при выявлении антител к вирусу ИРТ.

В лаборатории вирусологии МГАВМиБ разработаны эритроцитарные ди-агностикумы для выявления антител в РНГА к вирусам ИРТ / алено, РС-инфекц.//Р.В. Белоусова, B.C. Фролов, А.В.Васильев, В.Н.Сюрин. IloKa3avia высокая чувствительность и специфичность данной реакции и корреляции полученных в ней данных с результатами PH.

Нами проведены исследования по сравнительной чувствительности РНГА и РН при серодиагностике вирусной диареи крупного рогатого скота. В результате было установлено, что титры антител РИГА были на 4 порядка выше, чем в РН, причем отмечалась полная корреляция данных, полу ченных в Обеих реакциях.

Заключительным этапом работы являлось проведение диагностических исследований на вирусную диарею крупного рогатого скота в вакцинированных и неблагополучных стадах. Экспериментальных работ в этом направлении чрезвычайно мало. Представляют значительный интерес работы индийских ученых Апша, Тзип ЬаЬи /50/, которые изучали широту распростанения ИРТ среди буйволов. В результате исследований 1121 пробы сывороток крови 236 оказались положительными в РНГА /21,05%/, что указывало на достаточно широкое распространение инфекции в стадах буйволов.

В литературе имеются сообщения о применении РНГА для серодиагностики инфекционной бурсалыюй болезни /7/, клещевого энцефалита /19/, чумы плотоядных /5/, ротавирусной инфекции /48/ и т.д.

Нам предоставилась возможность исследовать 720 проб сывороток крови крупного рогатого скота из хозяйств различных областей Российской Федерации и показать широкую циркуляцию вируса диареи /титры в РНГА достигали 1:512 - 1:256/ в стадах, неблагополучных по респираторно-кишечной патологии молодняка.

Выводы.

1. Разработана РНГА для выявления антител к вирусу диареи крупного рогатого скота. Показано, что: а) фиксацию эритроцитов целесообразно проводить акролеином; б) срок годности акролеинизированных эритроцитов - не менее 1 года; в)отработаны условия таннзации эритроцитов; г) наиболее активным оказался эритроцитарный антиген при изготовлении которого использовали вирус, сконцентрированный и очищенный в изоэлектрической точке и разрушенный детергентом /тритоном Х-100/ с концентрацией по белку 1,25-2,5 мг/мл; д) оптимальный режим сенсибилизации был представлен температурой 56°С с экспозицией 60 мин.

2. Изучена сравнительная чувствительность РНГА и РН с сыворотками экспериментально зараженных и естественно-инфицированных животных. Показана тесная корреляция между результатами РНГА и РН, что подтвердило

специфичность и чувствительность РНГА, которая на 3-4 порядка превосходила РН.

3. Проведены диагностические исследования на вирусную диарею с помощью РНГА в вакцинированных и неблагополучных стадах крупного рогатого скота. Исследовано 720 проб сывороток крови крупного рогатого скота из ряда хозяйств Российской Федерации. Установлена широкая циркуляция вируса диареи в хозяйствах, неблагополучных по респнраторно-кишечной патологии молодняка крупного рогатого скота. Титры антител РНГА у обследованных животных достигали 1:256 - 1:512. По специфичности и чувствительности РНГА оказалась выше, чем РН и может быть рекомендована в качестве экспресс-метода для проведения широкомасштабной диагностики вирусной диареи.

Рекомепдапни по использованию научных выводов.

Данные по разработке компонентов эритроцитарного диагностикума для серодиагностики вирусной диареи крупного рогатого скота включщ* во временную Инструкцию по изготовлению и контролю эритроцитарного диагностикума и составления нормативной документации по практическому применению его в производственных условиях (в порядке широкого опыта).

Список опубликованных работ

1. Фомин К.Ю., Халенёв Г.А., Акбаева Л.М. "Реакция непрямой гемагглютина-ции - перспективный метод серодиагностики вирусной диареи крупного рогатого скота"., Ветеринария, 1998, № 2, с. 23-26.