Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЯ ХЛАМИДИОЗНОГО АБОРТА ОВЕЦ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ _НАУК ИМЕНИ В. И. ЛЕНИНА_

I Для служебного пользования

о/ч экз..ю 000078 *

1СЮ1-Ч

/ / «> На правах рукописи

АБДУЛЛАЕВ КУДРАТ

ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЯ ХЛАМИДИОЗНОГО АБОРТА ОВЕЦ

(16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология и микология)

, Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва -—

1980

Работа выполнена а лаборатории по изучению болезней овец Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии.

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки Казахской ССР, доктор ветеринарных наук, профессор И. И. Архангельский, т Кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник 10. Д. Караваев.

Официальные оппоненты:

1. Заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор П. И. Притулин (ВИЭВ).

2. Лауреат премии Совета Министров СССР, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Н; К. Мищенко (ВГНКИ).

Ведущее научное учреждение — Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия им. К, И. Скрябина. ; '

Зашита состоится _ 1980 г. в_ча-

сов иа заседани-и специализированного совета Д 020.28.01 по защите -диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Ленина институте экспериментальной ветеринарии. (109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного ордена Лепина'института экспериментальной ветеринарии.

Автореферат разослан *_* _ 1980 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Решениями XXV съезда КПСС; июльского (1978 г.) и ноябрьского (1979 г.) Пленумов ЦК КПСС предусмотрено дальнейшее увеличение производства продуктов животноводства.

СССР занимает второе место в мире по развитию овцеводства. Эта отрасль -животноводства, особенно при переводе ее на промышленную основу, является важным источником обеспечения растущих потребностей населения ¡в мясе и сырье для промышленности. Значительное повышение производства шерсти и баранины возможно при условии выполнения комплекса мероприятий, включая профилактику болезней и падежа. В этом направлении проведены многочисленные научные исследования, разработаны и' внедрены в практику различные средства и методы борьбы с болезнями овец.

Однако некоторые болезни, ввиду их малой изученности, сдерживают дальнейшее ' развитие продуктивности овцеводства. Поэтому перед ветеринарной наукой поставлены задачи по разработке мер профилактики малоизученных болезней овец, наносящих значительный экономический ущерб.

Большую актуальность приобретает разработка мер профилактики болезней, сопровождающихся нарушением суяг-ности родов. Прежде всего это касается заболеваний, вызываемых хламидиями, для которых одним из характерных симптомокомпЛексов являются аборты и мертворожденна. Количество абортов среди суягных овцематок в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах колеблется от 5 до 70%. Экономический ущерб от этой болезни складывается в основном из недополучения молодняка и бесплодия овцематок.'

Изучением этнологии хламнднозного аборта стец, разработкой методов диагностики, лечения и профилактики занимались многие отечественные и зарубежные исследователи (Носов И. И. п Волкова А. А., 1965—1967; Шербань Н. Ф., Шербань Г. П., Ирский А. Г., 1967; Крюков Н. Н„ Караваев Ю. Д.. 1970; Гаффаров Х.З., 1970; Ковалев В. Л., 1971; Шаткин А. А., 1973; Stamp J. Т.. 1950; Spanedda А. и Ked-

ЦЕНТРАЛЬНАЛ I

Научная библиотека

Моей, сэльскокоз. с-х-ади*»*

и„1жтжт

da А., 1951; Mitscherlich E., 1954; McEwen A. D., 1954; Storz J., 1963—1971, Огнянов Д., 1960), Ими установлена этиология болезни, разработаны методы диагностики, предложены способы лечения и сделаны попытки разработки рекомендаций по профилактике хлам иди озпого аборта овец.

Несмотря на достигнутые успехи, хламидиозный аборт как в СССР, так л в других странах с развитым овцеводством нда-ег широкое распространение н наносит значительный экономический ущерб, а имеющиеся на вооружении методы и средства диагностики и профилактики нуждаются в дальнейшем усовершенствовании.

■Борьба с указанной болезнью может быть успешной только при наличии эффективных средств специфической профилактики, которые пока что не разработаны, что н определило актуальность наших исследований и послужило основанием для выполнения настоящей диссертации.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований — изучить ¡влияние различных физико-химических факторов на биологические свойства возбудителя хламидиозного аборта, овец.

Перед нами стояли следующие задачи:

■1. Изучить влияние формалина, мертиолата, температурных факторов и ультрафиолетовых лучей на возбудителя хламидиозного аборта овец и на основании полученных результатов разработать оптимальные методы инактивации хл а.мидий с учетом сохранения их антигенных свойств.

2. Приготовить опытные серии вакцин против хламидиозного аборта овец,

■3. Испытать их на лабораторных животных и суягных овцах.

Научная новизна. Впервые нами комплексно изучено влияние различных .концентраций формалина, мертиолата, температурных факторов и ультрафиолетовых лучей на возбудителя хламидиозного аборта овец.

Исследованиями установлено, что наилучшим ннактива-тором является 0,4% раствор формалина,, который няакти-вирует возбудителя хламндиозного аборта овец в течение 48 часов при +37°.

Изготовлены и испытаны на лабораторных животных и суягных овцах с положительным результатом несколько опытных серий вакцин. .

Практическая ценность работы. Полученные результаты послужили основанием и вошли лак составная часть в (ТУ) «Технические условия» и «Инструкцию по приготовлению и •контролю эмульсин-вакцины против хламндиозного аборта 2

овец», которые рассмотрены и утверждены ВГНКИ ветеринарных препаратов и Главным управлением биологической промышленности МСХ СССР, одобрены НТС МСХ СССР 24.1.1980 г. и рекомендованы для'внедрения в ветеринарную практику.

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликована одна работа.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Текст диссертации иллюстрирован 19 таблицами, 8 графиками. Список литературы таключает 196 источников, в том числе 133 иностранные, .

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседании ученого совета ВИЭВ {1979 г.), на научной конференции молодых ученых, посвященной 100-летию со дня рождения К- И. Скрябина, на межлзбораторном совещании ВИЭВ, на Всесоюзном семинаре «Хламиднозы сельскохозяйственных животных» на ВДНХ СССР и отражены в науч- ' пых отчетах лаборатории по изучению . болезней овец за 1977—1979 гг.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Работа выполнена в 1976—1979 гг. в лаборатории по изучению болезней овец ВИЭВ и на опытной базе института (остров Лисий).

Для экспериментов использовали' 15 270 куриных эмбрио- -нов, 150 белых мышей, 125 морских свинок, 50 беременных морских .свинок, 15 кроликов, 30 суягных овцематок, а также патогенные, паспортизированные штаммы («Калининский» и «Лисий») возбудителя хламидиозного аборта овей.

При изучении методов инактивации, для приготовления образцов вакцины использовали штамм «Калининский», выделенный и 1973 г. на уровне 18-го пассажа. Он вызывал гибель куриных эмбрионов на 5—12 сутки и накапливался в желточных мешках в титре 10го —Ю'"5 ЭЛД 50/0,2 мл.

Патогенность штаммов хламндий проверяли на в—7-дневных куриных эмбрионах и лабораторных животных. Для этой цели делали серийные десятикратные разведения хла-

мндиосодержащей суспензии на физиологическом растворе от ИИ до10-®. На каждое разведение использовали по 4 куриных эмбриона. Заражали 6—7-дневные куриные эмбрионы в желточный мешок х л а м и ди осод ер ж а щ и м материалом по общепринятой методике (В. Н. Сюрин, 1%6).

Зараженные и контрольные куриные эмбрионы помещали в термостат при +37° и ^относительной влажности 75%. Инфицированные и .контрольные куриные эмбрионы ежедневно овоскопировали. Гибель куриных эмбрионов в первые 4 дня рассматривали как неспецифическую. Эмбрионы, погибшие позже, вскрывали, извлекали оболочку желточного меш«а, помещали во флаконы из-под пенициллина и хранили при температуре —20°. Для обнаружения возбудителя хламиди-озиого аборта овец небольшой кусочек желточного мешка отмывали физиологическим раствором от желтка, высушивали на фильтровальной бумаге и делали по 2 мазка-отпечатка на обезжиренных предметных стеклах, фиксировали и окрашивали один по методу Романовского-Гимза, второй — по непрямому 'методу иммунофлуоресценини. Мазки просматривали в световом и люминесцентном микроскопах.

За инфекционный титр принимали наибольшее разведение возбудителя, которое вызывало гибель 50% куриных эмбрионов. Инфекционный титр определяли по .методу Рида н Мепча. Кроме «урииых эмбрионов для определения патоген-ностн использовали белых мышей и .мороких свинок.

Специфичность гибели лабораторных животных определяли по наличию хламидий в мазках-отпечатках из паренхиматозных органов, окрашенных по методу Романовсного-Гпм-за и непрямому методу иммунофлуоресценшш. Приготовление и окраску мазков-отпечатков проводили согласно «Инструкции по борьбе с вирусным (энзоотическим) абортом овец и коз», утвержденной ГУВ МСХ СССР в 1970 г. Непрямой метод иммунофлуоресценшш ставили согласно *Методнчес--ким указаниям по обнаружению хламидий в патологическом материале с помощью непрямого метода иммунофлуоресценшш», утвержденным ГУВ МСХ СССР в 1978 г.

Приготовленные путем инактивации формалином, мертио-латом, температурой и УФ-лучами опытные образцы вакцины проверяли на стерильность, высевая на питательные среды ('МГТА, МПБ, Китт-Тароцци и Сабуро). Безвредность проверяли на белых мышах, морских свинках и кроликах. Им-муногенную активность испытывали на беременных морских свинках и на-суягных овцематках А

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Определение патогенности штаммов

Перед изучением «»активации штаммов на куриных эмбрионах, белых мышах и морских свинках определяли их па-тогешюсть: ■

Для куриные эмбрионов. Куриные эмбрионы заражали очищенной путем дифференциального цетрифугиро-вания суспензией хламндий штаммов «Калининский» н «Лисий». В результате установили, что гибель инфицированных эмбрионов наступала на 5—12 день в зависимости от дозы заражения. .

При микроскопии мазков-отпечатков из желточных мешков, погибших куриных эмбрионов, окрашенных по Романовскому-Гимза и непрямому методу флуоресцирующих антител обнаруживали хлам иди и. Они располагались как внутри, так и вне клеток. При этом установлено, что штамм «Калининский» накапливался в желточном мешке куриных эмбрионов от 10 V до J07-5 ЭЛД 50/0,2 мл, а штамм «Лисий» от Ю*-1 до 10т-2 ЭЛД 50/0,2 мл,.

Контрольные (неинфицироваиные) куриные эмбрионы оставались живыми до выведения цыплят.

Для белых мышей. В опытах было использовано 100 белых мышей массой 18—20 г. Мышей разделили на три группы, из них 40 (I группа),заразили хламидиосодержащей суспензией штамма «Калининский», 40 мышей (И группа) — штаммом: «Лисий» и 20 оставили незараженными в контроле.

.Мышей инфицировали подкожно, внутрибрюшинно, вну: тримышечио и ннтраназально (под наркозом) в дозе 0,2X10®-° ЭЛД 50/0,2 мл.

В результате установили, что после подкожного заражения штаммом «Калининский» погибли на 5—15 день 70% мьшей. После виутрнбрюшшшого введения хламидий на 6— 12 день погибло 90%; после внутримышечного заражения через 8—15 дней гибель достигла 80%, а интраназального на 5—16 день — 90% мышей.

От подкожного введения штамма «Лисий» на 5—11 день погибло 90% мышей, внутри брюшинного на 5—>12 день — 100%, внутримышечного на 6—13 день — 80% и интраназального на 5—11 .день — 100%. Контрольные мыши оставались здоровыми.

Полученные результаты свидетельствуют о чувствительности белых мышей к заражению хламидиями. Штаммы «Ка-лиииношй» и «Лисий» ' вызывали их гибель на 5—15 день в зависимости от метода заражения.

М о р с к и х свинок отбирали для опыта массой 250—300 г. при этом на «каждый штамм использовали 30 свинок и 15 оставляли для контроля. Суспензию хламидий подопытным свинкам ннокулировали подкожно, внутримышечно и внутрибрюшинпо ® дозе 1ХШ3 ЭЛД 50/0,2 мл. • Клинические признаки болезни появлялись на следующий день после заражения и характеризовались повышением температуры тела до 40,2—40,6°, вялостью, угнетением, плохим поеданием корма, с последующей утратой блеска волосяного покрова.

Штамм «Калининский» при подкожном и внутрибрюшин-ном заражении вызывал гибель 80—90% животных на 8—15 день. После внутримышечного введения суспензии погибли 70% морских овин (ж (на 6—17 день), а от подкожного и внутрибрюшииного введения штамма «Лисий» погибли на 7—15 день 90% животных, от внутримышечного на 8—16 день —80%.

"В мазках-отпечатках из печени,' легких и селезенки погибших животных находили хламидки. В контрольной группе мороких свинок отклонений от нормы не регистрировали. Таким образом, оба штамма хламидий по своей п atore til юсти для морских свинок оказались почти идентичными.

i Влияние некоторых физико-химических факторов

на возбудителя хламидиозного аборта.овец

При разработке методов ина-ктивации и приготовлении образцов вакцин использовали очищенную (путем дифференциального центрифугирования) хламидиосодержащую суспензию с титром 10" ЭЛД 50/0,2 мл. Динамику инактивации учитывали путем титрования возбудителя.на,6—7-дневных куриных эмбрионах после введения его в желточный мешок.

Инактивация формалином. Отечественные и зарубежные исследователи установили, что раствор формалина е-малых концентрациях не разрушает антигенную структуру многих микроорганизмов, но снижает их патогенность. Учитывая, что действие формалина на хламидии недостаточно изучено, мы решили испытать его как ннактиватор при приготовлении образцов вакцины против хламидиозного аборта овец.

В этих целях к хламидиосодержащей суспензии добавляли формалин до конечной концентрации от 0,1 до 0-5%'. Расчет .проводили по методу Е. А. Васильевой (1975). В качестве контроля использовали очищенную' суспензию хламидий, Ь 'которую раствор формалина не добавляли. Инактивацию Проводили при температуре +37°, помещая флаконы с хла* 6

мндиосодержа щей суспензией в термостат и встряхивали их 2—3 раза в сутки.

Через каждые 12 часов брали по одному флакону с суспензией и помещали их в сосуд Дюара с жидким азотом, для предотвращения дальнейшей инактивации хламидий. Последний флакон взяли из термостата через 120 часов. Динамику ■инактивации определяли путем титрования возбудителя, заражая е желточный мешок, по 0,2 мл 6—7-дневные куриные эмбрионы.

Как показал опыт, 0,1% раствор формалина в течение 3-х суток оказывал незначительное действие на хл а мидии, снижая их активность на 4 Под ¡воздействием 0,2% формалина инфекционный титр хламидий снижался на 5 через 72 часа. Полная инактивация хламидий наступала при концентрации формалина: 0,5%—через 24 часа; 0,4%—через 48 часов; 0,3% — через 72 часа; 0,2% — через 96 и 0,1% — через 120 часов.

- Сравнительный контроль без формалина показал, что возбудитель при +37° снижал инфекционный титр на 3,5 логарифма в течение 120 часов. Контрольные незараженные куриные эмбрионы после введения им по 0,2 мл физраствора оставались живыми. ..

Следовательно, оптимальной концентрацией формалина для инактивации изучаемого возбудителя можно считать 0-4%. Уменьшение его концентрации приводит к увеличению сроков лнактивации. Установлено также, что дальнейшее увеличение (концентрации формалина до 0,5% повышает токсичность -материала для куриных эмбрионов и тем самым препятствует проверке полноты инактивации хламидий на куриных эмбрионах при изготовлении инактивированных вакцин;

Инактивация мертиолатом. Перед изучением действия мерт.нолата на биологические свойства .возбудителя хлами-диозного аборта овец мы в предварительных опытах определяли его токсичность для куриных эмбрионов. Максимально переносимые разведения мертиолата установили после введения их в желточные мешки 6—7-дневных куриных эмбрионов. С целью наибольшей статистической достоверности, для каждого разведения мертиолата использовали не менее 15 куриных эмбрионов.

Прежде всего .изготовили разведение 1:Ю0; Из него затем готовили рабочие разведения 1:1000, 1:5000, 1:10000, 1:20000, которые вводили в желточный мешок куриным эмбрионам по 0,2 мл. Контрольным эмбрионам в'желточный мешок вво-

дили по 0,2 мл физиологического раствора. В результате установили, что разведения мертиолата 1:10000, 1:20000 являются переносимыми для эмбрионов, в то время ка1к разведения 1:100, 1:1000 и 1:5000 оказались токсичными и вызывали их гибель на- 2—5-е сутки в зависимости от концентрации мертиолата. При этой бактериальная и микологическая контаминация была исключена, та« как посевы на питательные среды (МПА, МПБ, Китт-Тароцци и Сабуро) были стерильными.

В результате изучения различных концентраций мертиолата на выживаемость хламидий выявлено, что их инфекционная активность при воздействии мертиолата в концентрации 1:10000 снижается в течение 4-х суток на 3,5 логарифма и полная инактивация наступает через 7 суток. Зараженные этим материалом куриные эмбрионы оставались в 100% случаев живыми и в мазках-отпечатках, приготовленных из желточных мешков, хламидии не выявлены. Снижение концентрации мертиолата в хламидиосодержащей суспензии-до 1:20000 удлиняло срок инактивации возбудителя до 9 сут'ок.

На основании проведенных исследований мы считаем оптимальным сроком инактивации хламидий 7-сугочное воздействие мертиолатом в разведении 1:10000 при температуре + 37°. "

Влияние температуры. Термоинактивацию хламидий проводили в водяной бане при температуре 30, 40, 50, 60, 70° при различных экспозициях, начиная от 5 до 60 минут.

Кроме того, мы изучали динамику выживаемости хламидий в термостате при I +37°, при комнатной 18—20° и прл температуре бытового холодильника 4—6°, Пробы исследовали ежедневно, а при хранении в холодильнике—через каждые 5 дней. Для определения влияния низких температур жидкую :и лиофилизированную суспензию хламидий помещали в рефрижератор «Гренланд» яри температуре —20 и исследовали через каждые 50 дней в течение 350 суток (срок наблюдения).

Выживаемость хламидий в суспензиях, подвергнутых тем-пературному:воздействиюГ через различные сроки определяли заражением, куриных эмбрЙбнойГ Результаты ЪлняниУ

температуры.от 30° до 70° представлены в таблице 1. «

Таблица 1

Результаты ннактноацни возбудителя хламиднозмого аборта при различных температурах

Первоначальный титр до инактивация Температура в градусах Время инактивации в минутах Тнтр возбудителя после инактивации

ЭЛДзд!м мл 30° 5 10 7,5 7.5

20 7.5

зо. 7,5

40 ■ 7.5

50 7,5

60 7.5

40Р 5 10 7.5 , 7,5 .

н 20 7,5

_ 30 7,5 ,

...... 40 ' 7.5

50 7,5

60 - -7,5

* 50° 5 10 '7,5 7.0

■ 20 6.0

t . , 30 4.5

40 4,0

50 3,5

60 2,0

' В 60s • 5 10 7.5 5,0

■ 20 ' 4,0

30 - 3,5

40 2.0

50 1.0

60 0

70° 5 10 20 30 5,0 2,0 0 0

Как видно из таблицы 1, температура 30 и 40° в течение 60 минут не оказывала существенного влияния на жизнеспособность хламндий, в то время как повышение температуры на 10° приводило « резкому снижению инфакцнонности—'на 5,5 логарифма, однако полной инактивации хламндий не происходило, так как куриные эмбрноны, зараженные материалом, выдержанным при температуре 30—40° с экспозицией 5—60 минут, погибали ® 100% случаев на 5—12 день.

Полная ина'ктивация хламидий наступала при температуре 60° в течение 60 минут и при 70° в течение 20 минут. Зараженные таким материалом куриные эмбрноны оставались живыми, и в мазках-отпечатках элементарные тельца возбудителя не обнаружены; Следовательно, оптимальной температурой инактивации можно считать 60° в течение 60 минут.

Нами также было установлено, что инактивация хламндий наступала иа 9-« сутки при хранении в термостате при + 37°, при +18—20° на 12 сутки. В бытовом холодильнике (4-4—:6в) возбудитель оставался жизнеспособным до 30 дней, при температуре —20° возбудитель в замороженном и лио-филизированном состоянии сохранял активность в течение 350 дней (срок наблюдения).

Инактивация ультрафиолетовыми лучами. Учитывая перспективность использования УФ-лучей для инактивации многих микроорганизмов, мы сочли целесообразным1 изучить влияние УФ-лучей иа хламндни. В качестве источника УФ-лучей использовали спаренные' лампы БД-15, смонтированные в специальной .камере со светонепроницаемыми отражателями. Лампа этого типа относится к категории ламп низ--кого давления. При номинальной электрической мощности 15 Вт с длиной волны, равной 253,7 им.

Учитывая врамя стабилизации интенсивности, сеанс облучения суспензии хламндий начинали через 20 минут после прогревания'источника.

Перед облучением очищенную суспензию хламндий наливали (по 10 мл) в чашки Петри, при толщине облучаемого слоя не выше 2 мм. Перемешивали суспензию в качалке, вращающейся со скоростью 40 об/мин.

Продолжительность облучения при комнатной t 18—20° варьировала от 5 до 180 минут. Расстояние от лам-пы до облучаемой поверхности — 0,3 м. Во избежание возможной фотореактивации облучение проводили в затемненном баксе. 10

После облучения для выявления возможной бактериальной контаминации суспензию высевали на среды (МПА, МПБ, Китт-Тароици н Сабуро). Контролем при проведении опытов служила необлученная суспензия. Облученные при различных экспозициях хламидии проверяли на выживаемость путем заражения б—7-диевных куриных эмбрионов в желточный мешок.

. В результате установлено, что 5-минутное воздействие УФ-лучамн не снижает инфекционный титр хламидий, 60-минутное. облучение уменьшало их активность на 2Ю а 150-минутное воздействие снижало инфекционный титр на 6,5

Полная инактивация хламидий происходила при 180-мин. воздействии УФ-лучен, в то же время контрольные куриные эмбрионы, зараженные необлученной суспензией хламидий, погибали в 100% случаев, возбудитель в них накапливался в титре 10" ЭЛД 50/0,2 мл. Следовательно, при 180-мин.облучении происходила полная инактивация хламидий, что и было нами использовано для инактивации хламидий при изготовлении ВЭ'КШШЫ.

г - Приготовление инактивированных хламиднозных вакцин

I и их сравнительное испытание

Дли приготовления вакцин было использована хламидио-содержащая суспензия . штамма «Калининский» возбудителя хламнднозного а-борта овец с инфекционным титром 101л ЭЛД 50/0,2 мл. Хламидиосодержащие желточные /мешки предварительно измельчали в . аппарате «Вттгих», затем очищали дифференциальным центрифугированием при скорости 3— 5;тыс. об/мни в течение 30 мин. в центрифуге К-70, затем в течение двух часов в центрифуге ЦВР-1 при 18—20 тыс. об/млн. Поел« второго центрифугирования надосадочную жидкость выбрасывали, а осадок ресуспенд провал и физиологическим раствором рН 7,0—7,2 в расчете 2,5 мл иа 1 оболочку желточного мешка. .

Инактивацию хламидий для изготовления вакцин проводили четырьмя методами:

— добавлением 0,4% формалина с выдержкой в течение ■48 часов при температуре 4-37°;

— добавлением мертиолата 1:10000 с выдержкой в тече* , пне 7 суток при температуре +37°;

— воздействием температуры 60° с экспозицией 60 минут;

— воздействием УФ-лучей, 253,7'им в течение 180 ми-иут. -

В.качестве адъюванта брали легкое минеральное масло

(ТУ 38101307—72) и ланолин (фармакопея X) в соотношении 83:17 объомпых частей. Масло и ланолин помещали в стеклянную бутыль под ватном а рл свой пробкой и автоклави-ровали в течение 30—40 мин. при 1,5—2 атм. После стерилизации адъювант высевали на питательные среды (МПА, МПБ, Кнтт-Тарощш и Сабуро) для исключения бактериальной .контаминации.

Посевы суспензии хламидий на МПА, МПБ, среде Китт-Тароццн выдерживали в термостате при +37° в течение 6— 7, а на среде Сабуро— 10 суток при комнатной температуре. При отсутствии роста па питательных средах инактивиро-ваниую тем или иным способам хламидиосодержащую суспензию смешивали в равных (1:1) объемахх адъювантом. Смесь адъюванта к суспензии хламидий эмульгировали в гомогенизаторе -«Вюггнх» при вращении ножей 500—600 об/мин в течение 20—25 мин. до получения однородной елнвкооб-разной массы белого цвег-а. Препарат сливали в стерильные флаконы, закрывали 'резиновыми1 пробками и помещали в холодпильннк при +4—6°.

Приготовленные таким образом опытные образцы вакцины проверяли на стерильность, высевая на питательные среды (МПА, МПБ, Китт-Тароццн и Сабуро).

Для определения полноты инактивации возбудителя суспензию, перед добавлением адъюванта, вводили по 0,2 мл <в желточные мешжн 50 6—7-дневных < куриных эмбрионов, используя для .каждого варианта^ по Юэмбрионов.чГ'Ю'остав-; ляли "в контроле. . ■ ;

Безвредность вакцины проверяли подкожным введением вакцины по 0,3 мл белым мышам, по 1 мл ■ морок им свинкам и по 2 -мл кроликам. Всего для этих целей использовали 50 белых мышей массой 20—25 г, из них на каждый вариант вакцины брали по 10 мыщей и 10 оставляли в контроле. Для тех же целей использовали 50 морских свинок массой 250— 300 г, по 10 на каждый "вариант и 10 для контроля. Кроме того, использовали 15 кроликов, по 3 на каждый вариант и 3 для контроля. За животными вели клиническое наблюдение в течение 20 дней.

Иммуногенную активность проверяли на беременных морских свинка* и суягных овцематках. Контрольным животным вводили ту же дозу препарата из незараженных желточных мешков куриных эмбрионов.

Для изучения уровня антител в сыворотках крови беременных морских свинок и суягных овцематок использовали реакцию длительного связывания «комплемента (РДСК). Антиген для реакции готовили из инфицированных возбуднте-12

лем хламидиозного аборта овец (штамм «Сосновский») оболочек желточных мешков по методу Червонского В. Н. н Поповой П. М„ (1969). Исследование проводили согласно действующему «Наотдалению по постановке н учету РДСК при диагностике энзоотического аборта овец и коз», утвержденному ГУВ 'МСХ СССР 1.УШ. 1976 г.

Результаты исследований показали, что после введения куриным эмбрионам хламидиосодержащей суспензии, инактивированной формалином» мертиолатом, температурой я УФ-облучением, все эмбрионы остались Ж!гвыми до выведения цыплят.

Образцы вакцины, ннактивированные формалином, мертиолатом, температурой и УФ-лучамн, оказались безвредными для белых мышей, морских свинок >н кроликов.

Изучение иммуногенности хламидиозных вакцин на беременных морских свинках

Иммуногениость образцов вакцин изучал;« на беременных мороких свинках '.массой 600—800 г со сроком беременности 15—20 дней. В опытах использовали 50 свинок, которых разделили на 5 групп по 10 для каждого варианта вакцины и 10 для контроля. Вакцину вводили по 1 мл подкожно в область спяны.

. 10 морским свинкам I группы вводили вакцину, ;инактивированную формалином. Такому же числу морских свинок (2 группа) инокулировали вакцнну. ({«активированную мертиолатом. 3.группу— (10 свинок) прививали вакциной, н»активированной температурой и 4-й аналогичной группе свинок вводили вакцнну, инактнвнрованную УФ-облучением, пятой группе (контрольной) —вводили препарат из незара-женных желточных мешков.

За всеми животными вели клиническое наблюдение в течений 20 дней « каких-либо отклонений от физиологической нормы не было отмечено.

Через 21 день после вакцинации морских свинок опытных зг контрольной групп заразили штаммом «Лисий» возбудителя хламидиозного аборта овец в дозе 1 X 103 ЭЛД 50/0,2 мл влутр н£р юшн НПО.

Выживших свинок и родивших нормальное потомство через 25 дней обескровливали, сыворотку крови их исследовали в РДСК с хламндиозным антигеном. Установили, что наиболее эффективной оказалась вакцина, полученная путем инактивации формалином. Все морские свинки этой группы посте заражения возбудителем хламидиозного аборта остались здоровыми и от них получен нормальный приплод,

в то время как после заражения морских свинок, привитых вакциной, «нактивированной температурой, одна пала и одна абортировала. Из группы привитых вакциной,инактнвн-рованной УФ-облучением, одна свинка абортировала. Во второй группе животных, привитых вакциной, инактивированной мертиолатом, две свинки пали и три абортировали. Павших беременных свинок вскрывали и готовили мазки-отпечатки.

У всех вакцинированных морских свинок установили наличие антихламмдиозных комплементфиксирующих антител. При этом у морских свинок первой, третьей, четвертой групп при исследовании их на 25 день после заражения титр хла-миднозиых антител колебался от 1:16 до .1:32.

Таким образом, мы установили, что эмульсин-вакцины, приготовленные из хламидий. инактивированных формалином или УФ-облучеиием, оказались более нммуногенными, чем вакцина, инактивированная температурой.

Инактивированная мертиолатом вакцина обладала меньшей эффективностью, так как после контрольного заражения две свинки пали и три абортировали, а средний тнтр антител после вакцинации не превышал 1:8. Исходя из опыта на свинках, мы решили эту вакцину на суягных овцах не испытывать.

Из 10 контрольных морских свинок 4 пали, 6 абортировали. В мазках-отпечатках, приготовленных из органов павших и абортировавших морских свинок, был обнаружен возбудитель хламидиозного аборта овец.

Испытание иммуногенности хламидиозных вакцин на суягных овцах

В опытах использовали 30 суягных овцематок породы прекос в возрасте от 2 до 3 лет, со сроком суягности 2—2,5 месяца. Их разделили на 4 группы по 8 голов в каждой по принципу аналогов.

Предварительно животных проверили серологически на наличие антител к возбудителям хламидиозного аборта, /бруцеллеза, инфекционного эпидндимнта, токсоплазмоза, внбрн-оза и сальмонеллеза. Антител к указанным возбудителям пе было обнаружено.

Первой группе овцематок привили внутримышечно по 1 мл вакаину, инактивированную формалином; второй — в той же дозе — внутримышечно вакцину, инактивированную температурой; третьей—внутримышечно по 1 мл .вакцину, инактивированную УФ-лучами; овцематок четвертой группы (контрольной) (6 голов) — не вакцинировали, им было введено по 1 мл препарата из незараженньгх желточных мешков. 14

На следующий день после вакцинации температура тела незначительно повысилась у животных 1 и 3 групп от 40,2 до 40,4°, 2-й труппы до 40,0°'и удерживалась на этом уровне в течение 3—4 дней, затем постепенно снижалась до нормы.

При клиническом осмотре места введения вакцин отметили незначительные припухлости. Других клинических изменений не отмечено.

В пробах сыворотки крови вакцинированных овцематок средиие_тнтры комплементфиксирующнх антител в I труппе составляли па 10 день 1:4, на 15—1:14 .и на 20 день повышались до 1:52; во 2 группе на 10 день 1:1; на 15— 1:5 и на 20 день 1:32; в 3 группе на 10 день 1:2, на 15— 1:12 и иа 20 день 1:40; в 4 группе (невакштпированной) у овцематок антител не выявлено.

Таким образом, антихла-мидиозпые антитела появлялись на 10 день во всех опытных группах. В контрольной группе антитела отсутствовали. Титр антител у животных I группы был выше, чем у овец других групп, что указывало на -большую иммуногенную активность вакцины, приготовленную из хламидий, ннактнвированных формалином.

Экспериментальное заражение вакцинированных и контрольных овцематок.

Через 21 день после вакцинации подопытных животных подкожно заразили штаммом «Лисий» возбудителя хлами-диозного аборта овец в дозе 5Х103 ЭЛД 50/0,2 мл и вели клиническое наблюдение.

В 1 группе животных температура тела после заражения повышалась до '40,3—40,4° и удерживалась на этом уровне в течение 2—3 дней, во 2 группе — дс^-40,5—40,6° и оставалась в этих пределах в течение 4—5 дней, в 3 группе — температура тела повышалась до 40.4—40,5° и сохранялась в течение 4-х дней. В 4 группе (Контрольной (невакцинирован-пой) температура тела на следующий день повысилась до 40,9—41,8° и удерживалась на этом уровне 6—8 дней, после чего снизилась до нормы.

Результаты исхода суягкости вакцинированных и контрольных животных были следующими. В 1 группе из 8 овцематок, привитых вакциной, инактивированной формалином, 7 окотились нормально, от них получили 9 здоровых ягнят, за исключением одной, которая оказалась несуягной.

Во 2 группе из 8 овцематок, привитых вакциной, инактивированной температурой, 6 окотились нормально и принесли 7 здоровых ягнят, 1 абортировала, 1 родила нежизнеспособного ягненка, который пал на 5 день.

В 3 группе животных, привитых вакциной, и и активированной УФ-облучением, 7 окотились нормально, от них получили 8 ягнят, у 1 овцематки родился ягненок, который пал на 4 день.

В 4 .труппе — .контрольной (невакцинированной) 3 овцематки абортировали на 7, 24 и 51 день после заражения, 2 овцематки на 51—63 дни родили нежизнеспособных ягнят, которые пали на 2—4 день. Одна овцематжа оказалась несуягной.

Патологическая картина у всех абортированных плодоп характеризовалась отечностью и геморрагической инфильтрацией подкожной клетчатки, скоплением экссудата в брюшной и грудной полостях, незначительным-увеличением печени и селезенки, гиперемией слизистой оболочки желудка, В мазках-отпечатках из паренхиматозных органов абортированных плодов и павших ягнят обнаружены хласлндни.

У животных 1 группы средний титр комплементфиксиру-ющнх антител на 5 день после заражения составлял 1:32, « 30 дню увеличился в среднем до 1:88 и через 70 дней снизился до 1:44.

Во 2 группе овцематок на 5 день титр антител соответствовал разведению сыворотки 1:18, на'30 день повысился до 1:36 и через 70 дней снизился до 1:16.

В 3 группе привитых животных на 5 день титр составлял 1:26, на 30 день—1:38, на 70 день снизился до 1:21.

В 4 группе контрольных (невакциннрованных) овцеваток антитела появились на 10 день в титре 1:6, на 30 день уровень их составлял 1:32, на 70 день снизился до ЫЗ.

Анализ результатов исследований ■ показал, что лучшими иммуногенными свойствами обладала вакцина из хламидий, инактивированных формалином.

ВЫВОДЫ

1, Штаммы «Лисий» и «Калининский» возбудителя хла-мидиознаго аборта овец хорошо .культивируются в желточном |мешке 6—7-дневных куриных эмбрионов, накапливаются до Ю7*3—Ю7, 'ЭЛД 50/0,2 мл и вызывают их гибель на 5— 12 день в зависимости от дозы заражения.

2. Оба штамма возбудителя хламидиозното аборта овец патогенны для белых мышей ,и морских свинок. При нитра-назальном и внутри брюшинном введении материала белым мышам последние заболевают на 5—7 день и погибают в течение 15 дней. Морские свинки, инфицированные аналогичным методам, заболевают на 6—8 день и погибают в течение

15 дней,

3. Штамм «Калининский» возбудителя хламндиозного аборта овец полностью .инактивируется 0,4% раствором формалина в течение 48 чесов при температуре +37", Снижение концентрации формалина удлиняет срок инактивации хламидий.

4. Хламидии теряют инфекционную активность при воздействии мертиолата в разведении 1:10000 через 7 суток при температуре +37°.

5. Воздействие температуры +60° в течение часа приводит к инактивации хламидий. ■

6. УФ-лучи, X — 253,7 им, инактивируют хламидии через

»80 минут ^^к'комнатной температуре.

7. Прнгс^таленные лабораторные серии инактивированной вакцины из хламидий стерильны и безвредны для белых .мышей, мораких свинок и кроликов.

8. При испытании на беременных морских свинках имму-ногенная активность образцов вакцин, полученных путем инактивации формалином, температурой и УФ-лучами, оказалась значительно выше, чем препаратов, приготовленных путем инактивации возбудителя мертиолатом.

9. При сравнительном испытании на суягных овцематках образцов вакцин, полученных путем инактивации формалином, УФ-лучами и температурой, установлено, что вакцина, инактивированная формалином, обладает наиболее выраженными иммуногенными свойствами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные результаты вошли как составная часть в (ТУ) «Технические условия» и «Инструкцию по изготовлению-и контролю инактивированной эмульсин-вакцины против хламндиозного аборта овец», рассмотренные и утвержденные ЕШЦКИ л*геринарных препаратов и Главным управлением б1Щгоги»ЩРой промышленности МСХ СССР, одобрены НТС МСХ СССР 24.1. 1980 г. и рекомендованы для внедрения в ветеринарную практику.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние некоторых физико-химических факторов на возбудителя хламндиозного аборта овец,— «Бюллетень ВИЭВ». выпуск 35. Москва, 1979 год.

Поди, в печать 28,111-80 г.

Тир. >100

Зак, 4

Типография Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К. II. Скрябина

í