Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов животноводства при ботулизме методами экспресс - анализа
- Ученая степень
- кандидата ветеринарных наук
- ВАК РФ
- 16.00.06
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов животноводства при ботулизме методами экспресс - анализа
На правах рукописи
А"
Маркунина Юлия Викторовна
ВЕТЕРИНАРИЮ - САНИТАРНАЯ ЭКСПЕРТИЗА ПРОДУКТОВ ЖИВОТНОВОДСТВА ПРИ БОТУЛИЗМЕ МЕТОДАМИ ЭКСПРЕСС - АНАЛИЗА
16.00.06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно - санитарная экспертиза
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
0 5
Чебоксары - 2008
003455467
Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» и в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных - ВНИВИ» г. Казань
Научный руководитель:
Официальные оппоненты:
доктор ветеринарных наук, профессор
Волков Али Харисович
доктор ветеринарных наук, профессор
Алексеев Геннадий Александрович
доктор биологических наук Коксин Владимир Петрович
Ведущая организация:
ФГОУ впо
«Башкирский государственный аграрный университет»
Защита состоится 19 декабря 2008 г. в Кг2 часов на заседании диссертационного совета Д 220.070.02 при ФГОУ ВПО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия» (428003, г. Чебоксары, ул. К. Маркса, д. 29)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия»
Автореферат разослан « /¿» ноября 2008г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
профессор —-,{ Семенов В.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из главных задач ветеринарно - санитарной экспертизы является контроль качества пищевых продуктов и выявление возбудителей болезней и их токсинов, которые могут быть источником заболевания и отравления людей. Среди инфекционных болезней, которые могут быть причиной отравления людей и животных, особое место занимает боту-линический токсин.
Ботулизм не относится к часто встречающимся заболеваниям животных и среди инфекционных болезней не превышает сотой доли процента. Однако тяжелое течение болезни у людей с высокой летальностью не позволяет относить проблему ботулизма к второстепенным заболеваниям. Поэтому для своевременного принятия лечебно - профилактических мероприятий в таких случаях необходимо иметь набор диагностикумов для экспресс - индикации возбудителя болезни.
В последние годы в лабораторную практику для диагностики инфекционных болезней животных и людей внедряются новые тест - системы такие, как иммуноферментный анализ (ИФА), метод флюоресцирующих антител (МФА), радиоиммунный анализ (РИА), полимеразная цепная реакция (ПЦР) и т.д. Основным достоинством данных методов является их высокая чувствительность, экспрессность и возможность полной автоматизации постановки и учета.
Все вышеизложенное и обусловливает актуальность настоящей работы.
Цель и задачи исследований. Целью исследований является разработка современных высокочувствительных тест - систем для ветеринарно - санитарной оценки продуктов животноводства и экспресс - индикации возбудителя ботулизма и его токсина в них.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить культурально - морфологические, биохимические и антигенные свойства штаммов возбудителя ботулизма, хранящихся в музее штаммов ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» (г. Казань); разработать тест - систему МФА и ИФА для индикации возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства и рыбоводства;
разработать метод отбора и подготовки проб для ветеринарно-санитарной оценки продуктов животноводства и индикации в них возбудителя ботулизма и его токсина.
Научная новизна. Изучены морфологические, тинкториальные, культурально - биохимические и антигенные свойства возбудителя ботулизма, хранящегося в музее штаммов ФГУ «ФЦГРБ - ВНИВИ» (г. Казань) в течение 20 и более лет. По результатам этих исследований разработаны методы получения антигенов и антител и на их основе тест - системы для ИФА и МФА.
Разработаны способы подготовки проб для ветеринарно - санитарной оценки продуктов животноводства и рыбоводства и индикации в них возбудителя ботулизма и его токсина методами МФА и ИФА.
Научно - практическая ценность работы. Применение тест - систем МФА и ИФА позволит быстро и достоверно определять наличие возбудителя ботулизма и его токсина в исследуемом материале, способствуя предотвращению распространения и быстрой ликвидации его в случае появления.
Апробация работы. Результаты выполненных исследований доложены и обсуждены на ежегодных отчетных сессиях ФГУ «Федерального центра токсикологической и радиационной безопасности животных - ВНИВИ» (г. Казань). Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно - практической конференции «Проблемы экотоксикологического, радиационного и эпизоотолошческого мониторинга», посвященной 45 - летаю ФГНУ ВНИВИ (Казань, 2005 г.); а также на международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радио-
нуклеидов и возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний», посвященном 45 - летаю образования института (Казань, 2005 г.).
Публикация. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
На защиту выносятся следующие положения:
- изучение антигенных свойств возбудителя ботулизма и его токсина;
- методы разработки тест - систем для постановки иммунохимических реакций (ИФА, МФА);
- способы подготовки проб продуктов животноводства и рыбоводства для ветеринарно - санитарной экспертизы при ботулизме;
- ветеринарно - санитарная экспертиза продуктов животноводства и рыбоводства при ботулизме методами экспресс - анализа (ИФА и МФА).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 87 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной-литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 6 рисунками. Список используемой литературы включает 163 наименования, из них 114 источников отечественных авторов, 49 зарубежных.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований
Исследования проводили в 2003 - 2006 г.г. на кафедре ветеринарно -санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» и в лаборатории по хранению и изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней животных ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных - В НИВ И» (г. Казань).
Работа проводилась в соответствии с планами НИР ВНИВИ по заданию Департамента ветеринарии МСХ РФ (№ гос. регистрации 01200202602).
5
В ходе работы были использованы следующие материалы:
1. Штаммы возбудителя ботулизма. хранившиеся в лаборатории по изучению штаммов особо опасных болезней:
штамм №35 тип А «Пухно» выделен из трупа человека; штамм 16 - Я тип В выделен из фуражного ячменя; штамм 255 тип В; штамм 231 тип С; штамм 165 тип Д; штамм 1352 тал О выделен из почвы; штамм 5964 тип Б выделен из почвы; штамм 153 тага Е выделен из рыбы.
2. Питательные среды: мясопептонный агар (МПА); мясопептонный агар с добавлением 1% глюкозы; глюкозо - кровяной агар Цейсслера; среда Кипа - Тароцци; среда Кипа - Тароцци с добавлением 1% глюкозы; бульон Хоттипгера под вазелиновым маслом; среды Гисса; обезжиренное молоко.
3. Оборудование: термостат, анаэростат; центрифуга; холодильные установки; люминесцирующий микроскоп МЛ - 3; весы аналитические с разновесами типа АДС - 200; спектрофотометр СФ - 46; магнитная мешалка; водяная баня.
4. Реактивы: в различных микробиологических и иммунологических исследованиях применялись стандартные растворы, необходимые химические реактивы, сыворотки, метаболиты и коммерческие анатоксические противоботулиниче-ские поливалентные и моновалентные сыворотки (А, В, С, Д, Е).
5. Подопытные животные: кролики породы «Шиншилла», «Серый великан» 12 -18 месячного возраста, живой массой 2,5 - 3,5 кг - 50 гол.; морские свинки живой массой 200 - 400 г -100 гол.; белые мыши живой массой 14 - 20 г - 150гол.
Для поддержания и расплодки референтных штаммов возбудителя ботулизма использовали среду Китта - Тароцци. Для получения матровой расплодки, при изготовлении ботулинического токсина, применяли среду, состоящую из ферментативного перевара мяса (среда Хоттингера), печеночного экстракта и жидкого пептона Мартена. Посевной материал вносили в количестве 2 - 3% к объему питательной среды, перед посевом добавляли 0,5% глюкозы. Оптимальная температура для роста и токсинообразования типов возбудителя А, В, С 30 - 35°С, а для остальных - 26 - 28°С. Время для токсинообразования от 5 до 12 суток. Определение титра токсичности культу-
рального фильтрата проводили подкожным заражением белых мышей. Полученный ботулинический токсин переводили в анатоксин внесением 0,55% формалина. Формалин вносили дробно: 0,4% вносили сразу после окончания культивирования и 0,15% - через 6 суток. Инактивацию ботулинической культуры проводили при температуре 37°С в течение 30 - 35 суток. Токсин от вегетативных клеток С1. ЬоШ1тит отделяли путем охлаждения в рефрижераторе (4±2)°С в течение 18-20 часов и фильтровали с помощью мембранных фильтров «Владипор» № 4 и 6.
Заражение животных возбудителем ботулизма и его токсином, а также исследование зараженного материала проводили согласно санитарным правилам СП 1.3.1285 - 03 по работе с возбудителями особо опасных болезней I и П групп патогенности.
Для индикации возбудителя и его токсина использовали экстракт из проб консервированного мяса и рыбы, а также антигены из вегетативных клеток, полученные путем химического и термического экстрагирования.
В полученных антигенах и анатоксине определяли содержание белка спектрофотометрическим методом. Специфическую активность антигенов определяли в РНГА, ИФА, МФА. Чистоту, стерильность и безвредность, полученных антигенов и анатоксина проверяли в соответствии с общепринятыми в бактериологии методами. Оценку влияния антигена и анатоксина на организм животных осуществляли в экспериментах на лабораторных животных по состоянию клинического и иммунологического статуса (РНГА, ИФА, РН).
Для изучения антигенных свойств возбудителя ботулизма готовили микробную массу. Исследуемый штамм возбудителя ботулизма засевали на среду Китга - Тароцци с добавлением 1% глюкозы с последующей инкубацией при температуре (35±2°С). Через трое - пять суток выросшие культуры контролировали на чистоту роста и изучали морфологию путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму.
Кулыуральные свойства штаммов изучали путем посева на среду Китта -Тароцци, а характер глубинных колоний - на сахарном агаре; подвижность - ме-
тодом висячей капли; ферментативные свойства - посевом на среды Гисса, на обезжиренное молоко, а также по образованию сероводорода.
Вирулентность штаммов Cl. botulinum определяли заражением белых мышей и морских свинок с последующей оценкой характерных для возбудителя ботулизма клинических признаков.
Антигенные свойства культур штаммов Cl. botulinum изучали в ИФА с использованием антител против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой хрена, изготовленных НПО НИИ им. Н.Ф.Гамалея и в МФА с использованием люминесцирующих сывороток, изготовленных в ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» (г. Казань).
Стерильность полученных иммунопероксидазных коньюгатов проверяли посевом на сахарный МПА. Посевы со всеми средами выдерживали в анаэроста-те при температуре (35±2°С) в течение 15 суток. Питательные среды с посевами должны оставаться стерильными.
Активность иммунопероксидазных коньюгатов определяли в прямом варианте ИФА.
Ветеринарно - санитарная экспертиза продуктов животноводства для выявления ботулинического токсина
Одним из достоверных лабораторных подтверждений диагноза на ботулизм является обнаружение и идентификация токсина в реакции нейтрализации (РН) токсина на белых мышах. Метод заключается в смешивании экстракта из подозреваемых пищевых продуктов с анатоксической противобо-тулинической поливалентной сывороткой (в течение 45 минут) с последующим введением полученной смеси белым мышам. При наличии в исследуемом субстрате ботулинического токсина в живых остаются белые мыши, получившие смесь, в которой произошла нейтрализация токсина анатоксической сывороткой. Все белые мыши, получившие один токсин должны погибнуть.
В тоже время при всех своих положительных качествах реакция нейтрализации на мышах имеет ряд недостатков, которые снижают ее диагностическую ценность. Для постановки РН требуются абсолютно здоровые линейные мыши и к тому же результаты реакции (РН) продолжительны от 27 до 72 часов. Метод дает качественное, а не количественное определение токсина в исследуемом материале. При этом реакция малочувствительна и позволяет идентифицировать токсин только в продуктах питания, но не в патматериале. Гибель мышей в ходе эксперимента не исключает и не подтверждает диагноз на ботулизм, т.к. существует реальная возможность присутствия в исследуемом материале другого вида яда. И в этом случае для постановки достоверного диагноза необходимо выделение самих вегетативных форм возбудителя ботулизма из продуктов питания и патматериалов (сыворотка крови, кал и т.д.).
Для подтверждения вышеизложенного нами проведены эксперименты по индикации возбудителя ботулинического токсина в продуктах питания (консервы).
Имитацию зараженного продукта питания ботулиническим токсином провели на мясных консервах. Для этого банки с мясными консервами вскрывали, содержимое перемешивали, перекладывали в другие стерильные стеклянные банки и контаминировали спорами возбудителя ботулизма и ботулиническим токсином типов А и В. Контаминацию мясных консервов проводили следующими концентрациями анатоксина (по белку мг/мл): первая проба - 0,0001 мг; вторая проба - 0,001 мг; третья проба - 0,01 мг и концентрациями спор: четвертая проба - 100 м.к.; пятая проба - 1000 м.к.; шестая проба - 1000000 м.к. на 1 г исследуемого объекта.
Отбор проб проводили по 10 г с каждой пробы, которые смешивали 1:5 с 0,85% раствором хлористого натрия. Первую, вторую, третью пробы шутте-лировали на магнитной мешалке и фильтровали через бумажные фильтры. Подготовленные таким образом три пробы смешивали 1:1 с противоботули-нической сывороткой каждую и вводили бельм мышам. Эти же пробы также
были испытаны в РП и РНГА. Пробы 4, 5, 6 суспензировали 1:5 в физиологическом растворе, шуттелировали и центрифугировали при-7 - 10 тыс. об/мин. Полученный осадок по 0,2 мл засевали на среды Кипа - Тароцци и Цейсслера.
Результаты индикации возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах питания представлены в таблице 1.
Таблица 1. Индикация возбудителя ботулизма и его токсина в мясных консервах
Методы исследований Токсин, концентрация на мг/мл Возбудитель, м.к. на мл
0,0001 0,001 0,01 100 1000 1000000
РН на белых мышах + + + Н.и. Н.и. Н.и.
РП - - - Н.и. Н.и. Н.и.
РНГА - - - - - +
Бактериологический - - - + + +
Примечание: «+»- положительная проба
«-» - отрицательная проба «Н.и.» - не исследовали
Из таблицы видно, что выявить ботулинический токсин в мясных консервах удалось только в РН токсина на белых мышах. РП и РНГА не выявили наличие токсина в испытанных концентрациях.
Возбудитель ботулизма в серологических реакциях не обнаруживался в испытанных концентрациях, а выявлялся только в посевах на питательных средах и микроскопическим методом, при окраске препаратов из исследуемого материала.
Все описанное выше дает основание вести поиск новых средств и методов экспресс - индикации возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах питания. Внедрение высокочувствительных тестов в лабораторную практику не только облегчило бы и ускорило выявления возбудителя и его токсина, но и повысило бы эффективность индикации.
В предлагаемой работе разрабатывается решение проблемы путем соз-
10
дания тест - систем для индикации возбудителя ботулизма и его токсина в пищевых продуктах на основе МФА и ИФА.
Изучение фенотипических свойств, различных штаммов С1. botulinum
Для решения поставленных задач, на первом этапе были изучены биохимические свойства различных штаммов возбудителя ботулизма. В результате проведенных исследований установлено, что при посеве отдельных штаммов возбудителя ботулизма на среды с сахарами, они ферментируют с образованием газа и кислоты глюкозу, мальтозу. Однако этими свойствами обладают не все испытанные штаммы (165, 1352), что может осложнить идентификацию микроба и дифференциацию его токсина. Штамм серовара В обладает высокой протеолитической активностью: он свертывает обезжиренное молоко, разжижает МПЖ, а у сероваров С, D, F эти свойства были выражены слабо.
Токсинообразующие свойства у изученных штаммов сохранились не одинаково. Наиболее активным был токсин, полученный из серовара В. Однако исследования показали, что из семи изученных сероваров Cl. botulinum, каждый дает специфическую реакцию с гомологичной сывороткой и только серовар А (штамм 35 «Пухно») был наименее активен.
В антигенном отношении все изученные штаммы обладали иммуноген-ной специфичностью в РН на белых мышах и опять же серовар А в антигенном отношении был слабее, чем остальные типы. Причиной тому может быть длительное хранение на искусственных питательных средах, что привело к утрате основных свойств изученных культур Cl. botulinum. Как известно из литературных источников серовар А в антигенном отношении должен быть более активным, чем другие штаммы. Ботулинический токсин типа А чаще является одной из причин отравления людей продуктами питания. Поэтому нами для работы был выбран штамм 35 (А) для производства высокоактивных диагностических препаратов; а для производства высокоактивных диаг-
ностических препаратов необходимы штаммы, обладающие стабильными свойствами, которые бы в процессе хранения и пересевов на питательные среды, оставались неизменными.
Для того чтобы штаммы сохранили свои изначальные свойства, необходим периодический пассаж на восприимчивых лабораторных животных. В нашем случае для пассажа, с целью восстановления фенотипических свойств, мы применили чувствительных к возбудителю ботулизма морских свинок. В результате многократных пассажей С1. ЬойШпшп на морских свинках нам удалось восстановить вирулентные свойства штамма 35 - А «Пухно».
О возможности утраты биохимических свойств возбудителя ботулизма высказывают также В.Н. Никифоров и др. (1985). В то же время авторы считают, что культуры клостридий способны, в свою очередь, восстановить первоначальные свойства.
Изучение антигеных свойств возбудителя ботулизма и его токсина
Продолжая исследования по изучению антигенных свойств у штаммов, утративших вирулентность, необходимо было установить эти отличия в им-мунохимических реакциях (ИФА). ИФА ставили общепринятым методом с использованием диагностической ботулинической сыворотки, меченой пе-роксидазой. Иммунопероксидазные коньюгаты были получены нами в лаборатории по хранению и изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней животных ФГУ «ФЦГРБ - ВНИВИ» (г. Казань).
Изучаемые ботулинические токсины, полученные из различных штаммов СЛ. ЬойШпшп всегда специфично вступали в реакцию ИФА. Однако штаммы, утратившие вирулентность, не реагировали с иммуноферментным коньюгатом.
Таким образом, в результате изучения морфологических, тинкториаль-ных, культуральных, биохимических и антигенных свойств культур возбудителя ботулизма была выявлена неоднородность их по основным свойствам.
Культуры отличались между собой в основном по биохимическим свойствам. При посеве на обезжиренное молоко авирулентные штаммы не свертывали его, а при изучении сахаролитических свойств образование кислоты и газа не наблюдалось. Антиботулинические сыворотки, меченные пероксидазой, реагировали только с вирулентными штаммами.
Учитывая все вышеизложенное, мы продолжили поиск изыскания эффективного антигена для гипериммунизации кроликов, который позволил бы получить высокоактивные сыворотки к ботулиническому токсину.
По результатам экспериментов, проведенных на первом этапе, был отобран штамм 35 - А «Пухно» возбудителя ботулизма. Из отобранной культуры выделили три вида антигена: жгутиковый, белковый и анатоксин. Жгутиковый антиген получали путем вегетации спор возбудителя ботулизма на глю-козо - кровяном агаре Цейсслера. Белковый антиген выделяли воздействием на вегетативные клетки поочередно аминокапроновой кислоты и 3% раствора додецилсульфата натрия. Токсин получали культивированием возбудителя на среде, состоящей из ферментативного перевара мяса (среда Хоттингера), печеночного экстракта и жидкого пептона Мартена в течение 7-8 дней, с последующим переводом его в анатоксин добавлением 0,55% нейтрального формалина в течение 30-35 суток.
Активность полученных антигенов изучали в ИФА, а иммуногенные свойства - в сыворотке крови иммунизированных кроликов. Для этого лабораторных животных гипериммунизировали в отдельности белковым антигенам и анатоксином. Активность сывороток, полученных на антигены, изучали с гомологичными антигенами в ИФА. Результаты исследований показали, что наиболее активными оказались антисыворотки крови кроликов к белковому антигену и анатоксину. Высокая иммуногенная активность белковых антигенов и анатоксина возбудителя ботулизма подтверждается данными В.Н. Никифорова и др. (1985).
Белковый антиген и анатоксин в дальнейшем использовали как материал для получения диагностических сывороток при разработке тест - систем МФА и ИФА соответственно.
Разработка способа получения ботулинической сыворотки
Для получения гипериммунных сывороток на кроликах провели испытание трех схем введения антигена.
По первой схеме иммунизацию кроликов проводили пятикратным введением антигена в сочетании полным и неполным адъювантом Фрейнда внутрикожно вдоль позвоночного столба в пять точек с каждой стороны. Вторая схема иммунизации заключалось в трехкратном внутривенном введении антигена с интервалом 6 - .7 дней. По третьей схеме иммунизацию осуществляли однократным внутривенным и внутримышечным введением антигена.
Активность полученных сывороток определяли в ИФА. Исследованиями установлено, что высокие титры антител были выявлены при первой схеме иммунизации на анатоксин и белковый антиген. Титр антител составил 1:4096 и 1:8192 соответственно.
Об эффективности многократного введения антигена в целях получения диагностических сывороток говорили многие исследователи (Е.А. Волков и др., 1980; Г.В. Булаев и др., 1985). При таком способе введения антигена повышается авидностъ антител сыворотки крови, что важно при получении диагностических препаратов.
Очистку глобулиновых фракций из сыворотки крови получали путем высаливания сернокислым аммонием и разделения белков глобулиновой фракции на хроматографической колонке с ДЭАЭ - целлюлозой. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм, по формуле: разведение х 280/1,35. Результаты исследования показали, что белок в глобулине сыворотке составил 20 - 30 мг/мл. Активность иммуногло-
булинов, выделенных из сывороток крови кроликов, проверяли в ИФА. Титр антител был в пределах 1:8192 - 1:16384.
Из полученных результатов можно заключить, что выбранный нами метод выделения и очистки иммуноглобулинов в иммунообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ - целлюлозой, не изменяет активность и специфичность антител сывороток крови.
Ионообменная хроматография в течение последующих лет принята на вооружение во многих лабораториях. Исследователи в области белковой химии считают, что белки сыворотки крови, подвергнутые хроматографии, теряют активность (Г. Детерман, 1970). В дальнейшем, благодаря появлению улучшенных материалов, используемых для хроматографии, таких как ДЭАЭ - целлюлоза, сефадекс и т.д., положение в области очистки белков сыворотки изменилось. В настоящее время успешно можно очистить до иммуноглобулинов любого класса и выделить F(ab)2 - фрагменты иммуноглобулинов сыворотки крови (С.С. Маренникова и др., 1982; C.B. Буерова и др., 2001).
Изготовление тест - систем для постановки ИФА и МФА
Иммунохимические тест - системы для постановки ИФА И МФА стали доступными для лабораторий любого уровня. Предпочтительность использования того или иного теста зависит от конкретных условий. Например, для ветеринарно - санитарной экспертизы продуктов животноводства желательно применять сочетание нескольких методов исследования, которые взаимно контролировали бы результаты, тем самым, повышая их достоверность. Наиболее перспективным в этом плане является сочетание двух реакций МФА и ИФА. В подтверждении этому имеются обширные научные материалы и статьи, где проанализированы основные принципы ИФА и МФА (А.Т. Яковлев и др., 1990; А.Н. Егоров и др., 1991).
Придерживаясь мнения вышеупомянутых авторов, мы разработали прямой вариант ИФА на основе метки иммунных сывороток к ботулиническому токсину ферментом пероксидаза из хрена и МФА на основе метки иммунных сывороток к антигену возбудителя ботулизма флуоресцирующим изотиоцио-натом натрия (ФИТЦ).
По результатам исследования были разработаны тест - системы МФА и ИФА для выявления возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства и рыбоводства соответственно.
На втором этапе наших исследований провели испытания полученных тест - систем на вышеуказанных объектах.
Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов животноводства и рыбоводства
Отбор и подготовка проб к исследованию
Для исследования использовали проб:/, мясных и рыбных консервов. Для имитации заражения ботулиническим токсином, контаминировали спорами возбудителя ботулизма и его токсинами мясные и рыбные консервы.
В первом случае мясные консервы (500 г) вскрывали, прогревали в кипящей бане при температуре (100±5)°С в течение 1 - 2 часов, расфасовывали по 100 г в стеклянные банки с учетом высокого залива и вносили споры возбудителя ботулизма из расчета 1000 - 100000 м.к. на 1 г. Банку герметично закатывали крышкой и оставляли при комнатной температуре (20±2)°С на 5-30 дней.
Во втором случае к мясным и рыбным консервам, прогретым до (100±5)°С, вносили коммерческий ботулинический токсин типов А, В, С, Е, каждый токсин в отдельности, с последующей экспозицией в течение 3-4 часов. Схема контаминации мясных и рыбных консервов приведена в таблицах 2 и 3.
Таблица 2. Схема контаминации мясных и рыбных консервов спорами возбудителя ботулизма
Объект исследования Навеска продукта (г) Объем взвеси спор (мл) Количество спор в мл взвеси Количество спор в 1г продукта
контаминированная спорами 100 10 Ю4 10'
100 10 101 103
100 10 10" ю4
100 10 107 ю5
Неконтаминированный продукт 100 0 0 0
Таблица 3. Схема контаминации мясных и рыбных консервов ботулиническим токсином
Пробы контаминиро-ванные токсинами, каждый в отдельности. Навеска продукта (г) Объем взвеси токсина (мл) Количество токсина (мг)вмл Количество токсина мг/г продукта
А, В, С, Е 100 10 0,1 0,001
100 10 0,01 0,0001
100 10 0,001 0,00001
100 10 0,0001 0,000001
Неконтаминированная проба 100 0 0 0
Примечание: контаминацию проб мясных и рыбных консервов осуществляли боту-линическим токсином каждого типа в отдельности.
Из таблицы 2 следует, что контаминацию проб проводили спорами С1. ЬоШИпшп в объеме 10 мл с концентрацией микробной взвеси 104 - 1 проба; 105 - 2 проба; 106 - 3 проба; 107- 4 проба на 100 г пищевого продукта.
В таблице 3 контаминацию проб ботулиническим токсином каждого типа (А, В, С, Б) в объеме 10 мл с содержанием белка в токсине 0,001; 0,0001; 0,00001; 0,000001мг на 100 г пищевого продукта.
Подготовленные таким образом продукты питания переносили в боксовые помещения и вскрывали с соблюдением санитарных правил СП 1.2.011.03.
Отбор проб проводили из каждой банки по всей глубине мясных консервов стерильным шпателем в количестве 10±5 г в стерильные колбы. Пробы суспензировали в физиологическом растворе в соотношении 1:10, отстаивали и фильтровали через мембранные фильтры «Владипор» №4. Далее полученный фильтрат использовали для проведения исследования в ИФА и для постановки РН токсина на белых мышах, а фильтр помещали в ступки с битым стеклом, наливали 10 мл физраствора, растирали и делили на две части. Одну часть из них использовали для МФА, вторую вводили подкожно морским свинкам и далее исследовали общепринятыми бактериологическими методами.
Индикация ботулииического токсина в мясных и рыбных консервах в
ИФА
Эксперименты по выявлению возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства и рыбоводства проводили в условиях лаборатории. Дня этого были контаминированы в отдельности мясные и рыбные консервы возбудителем ботулизма и его токсином. Отбор проб проводили с разных мест по всей глубине мясных консервов.
Исследованиями установлено, что ботулинический токсин типа А выявляется во всех пробах иммунопероксидазным коньюгатом в ИФА. Чувствительность метода зависит от концентрации токсина в продуктах. Минимальная концентрация токсина, улавливаемая в ИФА, составила 0,000001. мг/мл. Достоверность ИФА коррелировала результатами в реакции нейтрализации токсина на белых мышах. Однако РН позволяла оценить качество токсина,
количественная оценка была не возможна. Результаты наших исследований согласуются с данными К.С. Азаренок (1970). Автор для выявления ботули-нического токсина испытал ряд серологических реакций (РЦ РСК, РИГА) и пришел к выводу, что испытанные реакции мало чувствительны и дают перекрестные реакции между типами ботулинического токсина. Учитывая то, что существуют перекрестные реакции между токсинами, мы приступили к изучению специфичности ИФА с разработанными диагностикумами.
Индикацию ботулинического токсина типов В, С и Е проводили в ИФА с иммунопероксидазным коньюгатом к токсину типа А. При этом установлено, что к иммунопероксидазному коньюгату типа А выявляется тип токсина В (Ксп = 2,7±0,2), концентрация токсина при этом составила 0,001 мг/мл. Низкие концентрации (0,0001 - 0,000001 мг/мл) токсина типа В в продуктах питания не обнаруживались. Токсин типов Е и С с испытанным коньюгатом в ИФА в перекрестную реакцию не вступал. Из этого можно предположить, что разработанный коньюгат к типу А специфично вступает в реакцию ИФА с гомологичным токсином. И только в больших концентрациях (0,01 мг/мл) перекрестно реагирует с токсином типа В. Испытанные токсины типов С и Е перекрестно не реагировали. Результаты РН на белых мышах коррелировали с результатами ИФА.
О высокой чувствительности ИФА и количественного определения токсина в продуктах питания пишет В.Н. Никифоров и др., 1980.
Одним из достоверных методов лабораторной диагностики ботулизма является обнаружение и идентификация токсина CI. botulinum в продуктах питания. В то же время выявление только ботулинического токсина без вегетативных форм ботулизма в продуктах питания не означает, что диагноз достоверный (Faston Е., Meyer К., 1974; Dowell V et al., 1977). Поэтому индикация ботулинического токсина в продуктах питания должна сопровождаться обнаружением выделения самого возбудителя и его токсина.
Исходя из вышеизложенного наряду с выявлением ботулинического токсина в продуктах животноводства методом ИФА была поставлена задача по разработке метода иммунофлуоресценции (МФА).
Индикация спор возбудителя ботулизма в мясных и рыбных консервах в МФА
Эксперименты по индикации спор возбудителя ботулизма методом МФА проводили в мясных консервах, контаминированных возбудителем ботулизма штамма 35 (А) в концентрациях от 10 до 105 спор в 1 г. В этих опытах было установлено, что вегетативные формы возбудителя выявляются в испытанных пробах в течение 2-5 суток. После,Тующие сутки возбудитель выявляется в меньших количествах по причине лизиса вегетативных клеток ботулизма в мясных консервах.
Иммунофлюоресцирутощие глобулины в МФА перекрестно реагировали со штаммом 16 - Я (В) и не реагировали со штаммами 231 (С) и 153 (Е). В то же время посевы на питательные среды и микроскопия мазков выявляли возбудителя ботулизма в контаминированных пробах. Чувствительность МФА составила 1000 спор на грамм продукта при положительной корреляции с бактериологическими методами.
Индикация ботулинического токсина в вяленой рыбе
Одной из часто встречающихся причин отравления людей ботулиниче-ским токсином является вяленая рыба. Опыты по имитации зараженной рыбы возбудителем ботулизма проводили с соблюдением санитарных правил СП 011.094.03.
Заражение свежей рыбы, спорами возбудителя ботулизма, проводили штаммом (53 (тип Е) в брюшную полость с последующим вялением при комнатной температуре в течение 10-30 дней.
Отбор и подготовка проб к исследованию. Подготовленную выше описанным методом рыбу измельчали ножницами, добавляли дистиллированную
воду в соотношении 1:10, выливали в стакан гомогенизатора и гомогенизировали. После отстаивания надосадок фильтровали через мембранные фильтры «Владипор» №4. Затем фильтрат исследовали на ботулинический токсин методом ИФА, а из фильтра делали мазки и исследовали в МФА.
Исследованиями установлено, что ботулинический токсин обнаруживается в ИФА, а его возбудитель в МФА. ИФА специфично выявляет токсин типа Е в концентрации 0,00001 мг/мл, и в больших концентрациях -0,01 мг/мл токсин типа А. МФА специфично выявляет только споры возбудителя ботулизма типа Е. Достоверность исследований подтверждается бактериологическими методами.
Таким образом, исследованиями установлено, что испытанные тест -системы для индикации возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства и рыбоводства, показали высокую специфическую активность. Результаты ИФА и МФА коррелировали в 100% случаев с бактериологическими методами. По мнению В.И. Покровского, Ф.Б. Семина (1982) внедрение в лабораторную практику иммунохимических тест - систем с автоматической установкой снижает стоимость анализа вдвое и повышает достоверность результатов. Внедрение разработанных нами тест - систем иммуно-ферментной и флуоресцирующей в ветеринарно - санитарную экспертизу позволит более планомерно и масштабно проводить диагностические исследования и индикацию возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства.
ВЫВОДЫ
1. Проведен морфологический, культуральный, биохимический и антигенный анализ различных штаммов возбудителя ботулизма. Установлено, что в процессе длительного хранения, в течение 20 и более лет, на искусственных питательных средах штаммы возбудителя ботулизма теряют биохимическую активность.
2. Пассаж штаммов возбудителя ботулизма на лабораторных животных . обеспечивает восстановление сохранности их фенотипических свойств.
Утрата биохимических свойств штаммов возбудителя ботулизма приводит к снижению их антигенной активности.
3. Белковый антиген возбудителя ботулизма, полученный путем экстракции додецилсульфатом натрия, обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью. При введении в организм лабораторных животных он обеспечивает титр антител 1:8192. На основе полученных антигенов разработаны способы получения диагностических тест - систем для индикации возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства и рыбоводства методами МФА и ИФА.
4. Разработан способ обнаружения возбудителя ботулизма и его токсина з продуктах животноводства, обеспечивающий ускоренную индикацию (в течение 2-3 часов) методами МФА и ИФА.
5. Подготовка проб с концентрированием возбудителя ботулизма на мембранных фильтрах позволит выявлять его наличие в продуктах животноводства и рыбоводства в концентрации 1000 - 100000 м.кУг в МФА и его токсина - 0,000001 мг/мл в ИФА.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Система поддержания производственных штаммов возбудителя ботулизма в лаборатории по хранению и изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» (г. Казань).
2. Применение тест - систем ИФА и МФА для ветеринарно - санитарной оценки мясных и рыбных консервов на наличие возбудителя ботулизма и его токсина регламентирует «Методические рекомендации по ветеринарно - санитарной экспертизе продуктов животноводства и рыбоводства при ботулизме методами экспресс - анализа (МФА, ИФА)», утвержденные ГУВ КМ РТ 24 ноября 2007 года.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Маркунина, Ю.В. Обнаружение возбудителя ботулизма у экспериментально зараженных животных / Ю.В. Маркунина II Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Том 183. - Казань, 2006, с. 124 - 127.
2. Маркунина, Ю.В. Определение устойчивости ботулинического токсина / Ю.В. Маркунина, С.А. Климина // Материалы Всероссийской научно - практической конференции, посвященной 45-летию ФГНУ ВНИВИ (14 -15 апреля 2005г.) «Проблемы экотоксикологического, радиационного и эпизоотологического мониторинга». - Казань, 2005. -Т.1. - С. 317-319.
3. Маркунина, Ю.В. Получение флюоресцирующей ботулинической сыворотки / Ю.В. Маркунина, А.Х. Волков, А.К. Галиуллин // Материалы Всероссийской научно - практической конференции, посвященной 45-летию ФГНУ ВНИВИ (28 - 30 ноября 2005г.) «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний». - Казань, 2005. - Т.2. - С. 220 - 222.
4. Галиуллин, А.К. Индикация ботулинического токсина в продуктах животноводства / А.К. Галиуллин, Ю.В. Маркунина, А.Х. Волков, Э.Н. Мустафина// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Том 191. - Казань, 2008, с. 49.
5. Маркунина, Ю.В. Разработка способа получения диагностической ботулинической сыворотки / Ю.В. Маркунина, А.К. Галиуллин, А.И. Ибрагимова, В.А. Курамшина // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Том 192. -Казань, 2008, с. 49 - 53.
Подписано к печати /5. //. ОЗ. Формат 60x84/16
Заказ 302 Тираж /¿Уэкз. ' Усл.-печ. л. /.О
Бумага офсетная Печать RISO
Центр информационных технологий КГАВМ 420074, Казань, Сибирский тракт, 33.
Оглавление диссертации Маркунина, Юлия Викторовна :: 2008 :: Казань
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Распространение возбудителя ботулизма и его характеристика.
2.2. Современные представления о возбудителе ботулизма. ю
2.3. Химический состав и антигенная структура возбудителя ботулизма и его токсина.
2.4. Лабораторная диагностика и идентификация возбудителя ботулизма и его токсина.
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Материалы и методы.
3.2. Результаты собственных исследований.
3.2.1. Ветеринарно - санитарная экспертиза продуктов животноводства для выявления ботулинического токсина.
3.2.2. Изучение фенотипических свойств штаммов возбудителя ботулизма.
3.2.2.1. Изучение антигенных свойств возбудителя ботулизма и его токсина.
3.2.3. Разработка способа получения ботулинической сыворотки. 40 3.2.3.1. Выделение и очистка противоботулинических иммуноглобулинов сыворотки крови кроликов.
3.2.4. Изготовление иммунопероксидазных коньюгатов к ботулини-ческому токсину.
3.2.5. Изготовление флюоресцирующих иммуноглобулинов к белковому антигену возбудителя ботулизма.
3.2.6. Ветеринарно - санитарная экспертиза продуктов животноводства и рыбоводства.
3.2.6.1. Отбор и подготовка проб к исследованию.
3.2.6.2, Индикация ботулинического токсина в мясных и рыбных консервах методом ИФА.
3.2.6.3. Индикация возбудителя ботулизма в мясных и рыбных консервах методом МФА.
3.2.6.4. Индикация возбудителя ботулизма и его токсина в вяленой рыбе.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
5. ВЫВОДЫ.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
Введение диссертации по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Маркунина, Юлия Викторовна, автореферат
Актуальность темы. Ботулизм - остро протекающая кормовая токсико-инфекция, вызываемая токсином анаэробного спорообразующего микроба Clostridium botulinum. Эпизоотология ботулизма исключительно специфична и не укладывается в классические представления об эпизоотологии инфекционных болезней. По данным JL В. Громашевского [28] источником заболевания может служить только больной человек или больное животное. С другой стороны широкое распространение возбудителя ботулизма в природе послужило причиной мнения, что возбудитель убиквитарен и может размножаться и образовывать токсин в почве.
Возбудитель ботулизма относится к политропным представителям микробов, которые в ходе инфекционного процесса занимают ряд последовательных локализаций в организме, тем самым обнаруживая адаптированность к ряду различных органов и тканей. Однако это есть единая форма болезни, в которой разные локализации возбудителя соответствуют разным стадиям болезни (кишечник, печень, почки, легкие, нервная система).
Токсин ботулизма, попадая в кишечник животного, всасывается в кровь и разносится по всему организму. Вследствие разрушения нервных центров продолговатого мозга развиваются параличи глотки, жевательных мышц и языка. Токсин подавляет выделение ацетилхолина, а это ведет к расслаблению скелетных мышц, нарушению движения, к параличам дыхательных и сердечных мышц, асфиксии и смерти животных. К. И. Матвеев [63] отмечает, что люди наиболее восприимчивы к ботулиническим ядам типов "А" и "С", лошади -"В", крупный рогатый скот - "D" и "С", овцы - "А" и "С", птицы к типу "С".
Токсин ботулизма представляет собой протеин, состоящий как бы из двух фрагментов, связанных дисульфидными мостиками. Такое строение обеспечивает необычную устойчивость токсина во внешней среде и длительное сохранение активности.
Токсин ботулизма прочно связан с телом микроба и попадает в организм животного только при аутолизе клетки. Токсин выделяется в среду хозяина по мере синтезирования, не задерживаясь в клетке при активном росте микроба.
Основой лабораторной диагностики ботулинического токсина или возбудителя является исследование остатков пищевых продуктов, каловых масс, из трупов берут кусочки печени, тонкого кишечника и желудка с содержимым; биопроба на белых мышах. В качестве экспресс - методов лабораторной диагностики определяют фагоцитарный показатель и ставят РНГА с эритроцитами, сенсибилизированными антитоксическими сыворотками или реакцию нейтрализации (РН) ботулинического токсина на белых мышах. Однако, при вскрытии животных, павших от колбасного яда, точно поставить диагноз не всегда удается, ведь концентрация яда в крови ничтожна, и выявить токсин с обычными реакциями (РНГА, РН) не всегда получается.
Все вышесказанное и обуславливает безусловную актуальность настоящей работы.
Цель и задачи исследований. Целью исследований является разработка современных высокочувствительных тест - систем для ветеринарно - санитарной оценки продуктов животноводства и экспресс - индикации возбудителя ботулизма и его токсина в них.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: изучить культурально - морфологические, биохимические и антигенные свойства штаммов возбудителя ботулизма, хранящихся в музее штаммов ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» (г. Казань); разработать тест - систему МФА и ИФА для индикации возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства и рыбоводства; разработать метод отбора и подготовки проб для ветеринарно - санитарной оценки продуктов животноводства и индикации в них возбудителя ботулизма и его токсина.
Научная новизна. Изучены морфологические, тинкториальные, культу-рально - биохимические и антигенные свойства возбудителя ботулизма, хранящегося в музее штаммов ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» (г. Казань) в течение 20 и более лет. По результатам этих исследований разработаны методы получения антигенов и антител и на их основе тест - системы для ИФА и МФА.
Разработаны способы подготовки проб для ветеринарно - санитарной оценки продуктов животноводства и рыбоводства и индикации в них возбудителя ботулизма и его токсина методами МФА и ИФА.
Научно - практическая ценность работы. Применение тест - систем МФА и ИФА позволит быстро и достоверно определять наличие возбудителя ботулизма и его токсина в исследуемом материале, способствуя предотвращению распространения и быстрой ликвидации его в случае появления.
Апробация работы. Результаты выполненных исследований доложены и обсуждены на ежегодных отчетных сессиях ФГУ «Федерального центра токсикологической и радиационной безопасности животных - ВНИВИ» (г. Казань). Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экотоксикологического, радиационного и эпизоотологического мониторинга»^ посвященной 45 - летию ФГНУ ВНИВИ (Казань, 2005 г.); а также на международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радио-нуклеидов и возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний», посвященном 45 - летию образования института (Казань, 2005 г.).
Публикация. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
На защиту выносятся следующие положения:
- изучение антигенных свойств возбудителя ботулизма и его токсина;
- методы разработки тест - систем для постановки иммунохимических реакций (ИФА, МФА);
- способы подготовки проб продуктов животноводства и рыбоводства для ветеринарно - санитарной экспертизы при ботулизме;
- ветеринарно - санитарная экспертиза продуктов животноводства и рыбоводства при ботулизме методами экспресс - анализа (ИФА и МФА).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 87 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 6 рисунками. Список используемой литературы включает 163 наименования, из них 114 источников отечественных авторов, 49 зарубежных.
Заключение диссертационного исследования на тему "Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов животноводства при ботулизме методами экспресс - анализа"
5. ВЫВОДЫ
1. Проведен морфологический, культуральный, биохимический и антигенный анализ различных штаммов возбудителя ботулизма. Установлено, что в процессе длительного хранения, в течение 20 и более лет, на искусственных питательных средах штаммы возбудителя ботулизма, теряют биохимическую активность.
2. Пассаж штаммов возбудителя ботулизма на лабораторных животных обеспечивает восстановление сохранности их фенотипических свойств. Утрата биохимических свойств штаммами возбудителя ботулизма приводит к снижению их антигенной активности.
3. Белковый антиген возбудителя ботулизма, полученный путем экстракции додецилсульфатом натрия, обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью. При введении в организм лабораторных животных он обеспечивает титр антител 1:8192. На основе полученных антигенов разработаны способы получения диагностических тест - систем для индикации возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства и рыбоводства методами МФА и ИФА.
4. Разработан способ обнаружения возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства, обеспечивающий ускоренную индикацию (в течение 2-3 часов) методами МФА и ИФА.
5. Подготовка проб с концентрированием возбудителя ботулизма на мембранных фильтрах позволит выявлять его наличие в продуктах животноводства и рыбоводства в концентрации 1000-100000 м.к./г в МФА и его токсина - 0,000001 мг/мл в ИФА.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Система поддержания производственных штаммов возбудителя ботулизма в лаборатории по хранению и изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» (г. Казань).
2. Применение тест - систем ИФА и МФА для ветеринарно - санитарной оценки мясных и рыбных консервов на наличие возбудителя ботулизма и его токсина регламентирует «Методические рекомендации по ветеринарно - санитарной экспертизе продуктов животноводства и рыбоводства при ботулизме методами экспресс - анализа (МФА, ИФА)», утвержденные ГУВ КМ РТ 24 ноября 2007 года.
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2008 года, Маркунина, Юлия Викторовна
1. Авицын, А.П. Ботулизм / А.П. Авицын, JI.M. Попова // Многотомное руководство по патологической анатомии. Т.9. -М.: Медицина, 1964. -С. 301-306.
2. Азаренок, К.С. К возможности обнаружения токсина в крови больного ботулизмом при помощи РПГА / К.С. Азаренок // Журн. микробиол., 1970. №7.-С. 112-114.
3. Асонов, Н.Р. Практикум по микробиологии / Н.Р. Асонов // 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Агропоромиздат, 1988. 155с.
4. Астафьева, О.Г. Состояние кислородного обеспечения мышц в динамике ботулинической интоксикации у кошек / О.Г. Астафьева, Н.П. Чеснокова // Труды Саратовск. мед. ин та, 1978. - Т.98. - С. 9 - 13.
5. Ашмарин И.И. Практическая медицинская микробиология / И.И. Аш-марин. Т., «Медицина», 1966. - С. - 176 - 178.
6. Бакулин, И.Н. Метод получения эритроцитарных диагностикумов для обнаружения энтеротоксина Clostridium botulinum типа А / И.Н. Бакулин, Г.Б. Кошкина, Т.И. Сергеева // ЖМЭИ. 1982. - № 11. - С. 79-82.
7. Бакулов, И.А. Эпизоотология с микробиологией / И.А. Бакулов, Е.И. Буткин, В.А, Ведерников, Г.Г. Юрков. М.: Агропромиздат, 1987. — С. 122-125.
8. Баяр, Г.И. Реакция непрямой гемагглютинации как метод экспресс -индикации в объектах внешней среды / Г.И. Баяр, Р.Е. Конникова // ВПБЗН, 1966.-Вып. 10.-С. 175-180.
9. Березин, И.В. Иммуноферментный анализ как новый метод массового обследования населения и его возможный социальный эффект / И.В. Березин // Биология и медицина. 1985. - С. 53 - 57.
10. Ю.Билибин, А.Ф. Учебник инфекционных болезней / А.Ф. Билибин. — М., Медгиз, 1962. С. 138 - 143.
11. Богомолов, В.П. О клинике и лечении ботулизма /В.П. Богомолов, И.Е Епшина, B.C. Буркин // Клин, мед., 1971. №2. - С. 134 - 137.
12. Бондарев, JI.C. Ботулизм / JI.C. Бондарев, Ю.С. Варенко // Киев: Здоровье, 1990.-72с.
13. Бочарова, Н.Г. Новая тест система обнаружения специфических антител / Н.Г. Бочарова// Сб. науч. трудов. - 1979. - Вып. 4. - С. 157-161.ч
14. Н.Булатова, Т.И. Журн. микробиологии / Т.Н. Булатова, У.А. Кабанова. — 1960.-№3.-С. 18.
15. Булатова, Т.И. Журн. микробиологии / Т.И. Булатова. 1964. - № 1. — С. 96; 1964.-№7.-С. 79.
16. Булатова, Т.И. К вопросу о применении РНГА для обнаружения боту-линических токсинов / Т.И. Булатова // ВПБЗН. 1966. - Вып. 10. - С. 167.
17. Булатова, Т.И. Ботулизм у перелетных птиц в Северном Прикаспии / Т.И. Булатова, В.Д. Ильичев, Б.Д. Анисимов // ВПБЗН. 1985. - Вып. 32. - С. 423 - 430.
18. Булатова, Т.И. Инструкция о порядке расследования, учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно — эпидемиологической службы при пищевых отравлениях / Т.И. Булатова, И.С. Каздобина // М.: Медицина, 1975. С. 98-110.
19. Булатова, Т.И. Применение люминесцирующих антител для выявления возбудителей ботулизма / Т.И. Булатова, Е.А. Кабанова, А. Я. Кульберг // Люминесцирующие антитела в микробиологии. М., 1962. — С. 98 — 116.
20. Бунин, К.В. Клиническое течение и лечение ботулизма / К.В. Бунин, С.Г. Пак // Сов. мед., 1969. №2. - С. 76 - 81.
21. Бургасов, П.Н. Эволюция клостридиозов / П.Н. Бургасов, С.Н. Румянцев // М.: Медицина, 1974. С. 12.
22. Вертиев, Ю.В. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология / Ю.В. Вертиев, А.Г. Здановский, С.А. Боринская, Т. Мартин, E.JI. Ге-нинг, Н.К. Янковский. 2000. - №4. - С. 3-7.
23. Гаффаров, Х.З. Новое в диагностике инфекционной агалактии овец и коз / Х.З. Гаффаров, Р.Г. Гизатуллин, J1.A. Жандарова // Тез. Докладов Респ. науч. произ. конф. - Казань, 1990. — С. 210.
24. Глазунова, М.Г. О раневом ботулизме / М.Г. Глазунова // Сборник научных трудов. Киргизия, 1977. - Т. 116. - С. 106-109.
25. Гоголев, В.Б. Видовая чувствительность птиц к ботулиническим ядам / В.Б. Гоголев, К.Х. Папуниди, В.В. Гулько // Респ. науч. произв. конф.: Тез. докл. КГВИ. - Казань, 1991. - С. 49.
26. Гоголев, В.Б. Иммунологическая реактивность животных при интоксикации ботулизмом / В.Б. Гоголев // Респ. науч. произв. конф.: Тез. докл. КГВИ. - Казань, 1991. - С. 95.
27. Горегляд, Х.С. Ветеринарно — санитарная экспертиза с основами технологии переработки продуктов животноводства / Х.С. Горегляд, Н.Г. Кожемякин, В.П. Коряжнов, Я.П. Шлипаков. Д., «Колос», 1974. - С. 286-290.
28. Громашевский, JI.B. Частная эпидемиология. Ботулизм / JI.B. Грома-шевский, Г.М. Вайндрих // Медгиз, 1974. С. 214.
29. Грязнова, Д.В. Выявление экзотоксинов основных возбудителей анаэробной газовой инфекции с помощью иммуноферментного анализа / Д.В. Грязнова, А.М. Николаева, Н.П. Ефимова // ЖМЭИ. 1998. - №2. -С. 36-39.
30. Далин, М.В. Белковые токсины микробов / М.В. Далин, Н.Г. Фиш. -М.: Медицина, 1980. 224с.
31. Дербин, М.И. // ВПБЗН, 1983. Вып. 31. - С. 245-252.
32. Должкевич, Н.Я. Ботулизм, вызванный тушеной свининой домашнего приготовления / Н.Я. Должкевич, И.М. Любарец, В.П. Таченко // ЖМЭИ. М.: Медицина, 1980. - № 6. - С.93.
33. Зубко, JI.А. // Труды Одесского мед. Ин — та. Одесса, 1959. — Вып. 9. -С. 68.
34. Иванов, Н.Р. Вопросы патогенеза ботулизма / Н.Р. Иванов, Н.Р. Чесно-кова, А.В. Архангельский. — Саратов, 1979.
35. Ившина, В.Л. О взаимодействии ботулинического токсина с белками сыворотки крови / В.Л. Ившина // Некоторые вопросы эпидемиологии, клиники и лабораторной диагностики кишечных инфекций. Горький, 1972.-С. 52-53.
36. Ильясова, Г.Х. Применение иммуноферментного анализа для диагностики инфекционных заболеваний животных / Г.Х. Ильясова, Г.П. Но-вошиннов, Р.Х. Юсупов // Сборник трудов КГВИ. Казань, 1983.1. С. 15 -20.
37. Казанцев, А.Г. Справочник по инфекционным болезням / А.Г. Казанцев, B.C. Матковский,- М.: Медицина, 1986.
38. Каздобина, И.С. Специфическая индикация биологически^ средств и лабораторная диагностика инфекционного заболевания /И.С. Каздобина //ВПБЗН, 1985.-Вып. 32.-С. 5-13.
39. Каздобина, И.С. Определение ботулинических токсинов в реакции пассивной гемагглютинации / И.С. Каздобина, А.Л. Винник, К.Л. Ша-халина // ВПБЗН, 1976. Вып. 26. - С. 102 - 110.
40. Калимуллин, Ф.Х. Твердофазный иммуноферментный анализ на мембранных фильтрах при серодиагностике бруцеллеза / Ф.Х. Калимуллин, Новошиннов Г.П. // Сборник научных трудов. — Казань, 1987. — С. 30-31.
41. Калинеченко, Н.Ф. Способ индикации клостридий / Н.Ф. Калинеченко // «БИ». №16. - 1981. - С. 114.
42. Калитина, Г.А. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины / Г.А. Калитина. М., 1960. - Т. 49. - № 3. - С. 81.
43. Канцур, М.Я. Значение метода кольцепреципитации для диагностики токсинов В. botulinum / М.Я. Канцур, Ф.А. Черткова // Вопросы питания. 1940. - Вып. 4. - С. 64 - 68.
44. Ковтунович, Л.Г. Изучение нового метода обнаружения ботулинического токсина / Л.Г. Ковтунович // Тез. докл. межинститутской науч. конф. по проблеме анаэробов. — 1956.
45. Козлова, Д.И. Эпизоотологический словарь — справочник / Д.И. Козлова. -М.: Россельхозиздат, 1986. 189с.
46. Колоботский, Г.В. Справочник по ветеринарно — санитарной экспертизе продуктов на мясо — молочных и пищевых контрольных станциях / Г.В. Колоботский. М., «Колос», 1974. - С. 25 - 52.
47. Коляков, Я.Е. Ветеринарная микробиология / Я.Е. Коляков. М.: Государственное издательство сельскохозяйственной литературы, 1952. -С. 279 - 284.
48. Коляков, Я.Е. Ветеринарная иммунология / Я.Е. Коляков. — М.: Агро-промиздат, 1986. — С. 11.
49. Колычев, Н.М. Ветеринарная микробиология и иммунология / Н.М. Колычев, Р.Г. Госманов. Омск: Изд. ОмГАУ, 1996. - С. 314 - 319.
50. Кост, Е.А. Справочник по клиническим и лабораторным методам исследования / Е.А. Кост. М., 1975.
51. Костенко, Т.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии / Т.С. Костенко, Е.И. Скаршевская, С.С. Гительсон. — М.: ВО Аг-ропромиздат, 1989. — С. 215-217.
52. Кошкин, А.П. Иммуноферментный анализ биологически активных веществ / А.П. Кошкин // ЦБНТИ. М., 1985. - Вып. I. - С. 43.
53. Кравченко, А.Т. Распространение возбудителей ботулизма и столбняка на территории СССР / А.Т. Кравченко, Л.М. Шишулина. М., 1970. -С. 5-14.
54. Крылов, В.Н. Место и значение метода люминесцирующих антител в системе индикации биологических средств поражения / В.Н. Крылов, Р.Б. Гольдин // ВПБЗН. Вып. 7. - 1964. - С. 41 - 52.
55. Крюкова, З.В. О клинических проявлениях ботулизма / З.В. Крюкова, И.С. Сук, Л.С. Бондарев // Врачебное дело, 1970. №7. С. 130 - 133.
56. Кузьмин, И.С. К механизму нарушения моторной функции дистальных отделов толстого кишечника при ботулинической интоксикации у кроликов / И.С. Кузьмин. Якутск, 1973. - С. 335 - 338.
57. Курстак, Э. Применение иммуноферментных и некоторых других иммунологических методов в диагностике вирусных инфекций / Э. Курстак, К. Курстак, П. Тийссен // Бюллетень ВОЗ. 1986. - 64, №3. - С. 110-124.
58. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская М.: Медицина, 1978. - С. 391.
59. Лавченко, Е.Г. Особенности белкового обмена в динамике токсинооб-разования Clostridium botulinum тип «С» Норка / Е.Г. Лавченко // Научные труды Ставропольского СХИ, 1977, вып.40. - Т.6. - С 21 - 24.
60. Лазарев, Б.Н. Ботулизм: этиология, эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика / Б.Н. Лазарев, Г.Д. Родин, А.Ф. Юрин. -Волгоград, 1980.
61. Локтионов, С.И. Ботулизм / С.И. Локтионов // Неотложная помощь при острых отравлениях. — М., 1977. С. 231 - 232.
62. Магазов, Р.Ш. Новый способ получения ботулинического анатоксина типа А / Р.Ш. Магазов // ВПБЗН. 1983. - Вып. 31. - С. 108 - 111.
63. Матвеев, К.И. Ботулизм / К.И. Матвеев. М., 1959. - С. 408.
64. Матвеев, К.И. Патогенез ботулизма / К.И. Матвеев. М., 1949.
65. Матвеев, К.И., Вспышка ботулизма у норок / К.И. Матвеев, Т.И. Булатова, Т.И.Сергеева // Ветеринария. 1957. № 10. - С. 53.
66. Мельников, В.Н. Анаэробные инфекции (клостридиозы) / В.Н. Мельников, Н.И. Мельников. «Медицина» Москва, 1973. - 287с.
67. Методическое указание по индикации ботулинических токсинов в объектах ветеринарного надзора реакцией непрямой гемагглютинации // А.Х. Шамсутдинова, Д.А. Кирилюк, К.Х. Папуниди, П.К. Сметов.
68. Минервин, С.М. Наблюдения над механизмом « сенсибилизирующего» действия ботулинового токсина / С.М. Минервин, С.П. Жак, К.И. Червякова. // ЖМЭИ. 1955. - Вып. 5. - С. 48 - 53.
69. Михайлов, В.В. Ботулизм / В.В. Михайлов. JL: Медицина, 1980. — 200с.
70. Михайлов, И.Ф. Применение метода флюоресцирующих антител для выявления патогенных анаэробов / И.Ф. Михайлов // В кн.: Флюоресцирующие антитела и методы их применения. М., «Медицина», 1968. -С. 159-161.
71. Михайлов, В.В. К механизму нарушений сократительной функции жевательной мускулатуры в экспериментальном ботулизме у крыс /В.В. Михайлов, Н.Э. Агаев // Бюлл. экспер. Биолю и медю, 1980. №1. — С. 10-12.
72. Михайлова, И.М. Clostridium botulinum тип F / И.М. Михайлова // «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии», М., 1966. -№11.-С. 56-62.
73. Моргунов, И.Н. Санитарно-эпидемиологические особенности ботулизма в ландшафтных зонах Украины / И.Н. Моргунов, М.Н. Колесников, Б.Л. Влазнева // X Украинский съезд гигиенистов. — К.: Здоровья, 1981.- 120с.
74. Моррисон, В.В. Гистохимическая характеристика быстрых и медленных мышц крыс при местном ботулизме / В.В. Моррисон, В.И. перепелов // Труды Саратовск. мед. ин та, 1978. - Т.98. С. 58-61.
75. Наследышева, С.И. Обнаружение токсина В. botulinum в пищевых продуктах посредством реакции кольцепреципитации / С.И. Наследышева, П.С. Браславская // Сообщ. т. Анналы Мечниковского института. -Харьков, 1935.-Т. l.-Вып. 1.- С. 123 132.
76. Никитин, В.М. Справочник серологических реакций / В.М. Никитин. -Кишинев, 1977. С. 205.
77. Никифоров, В.Н. Ботулизм / В.Н. Никифоров, В.В. Никифоров. М.: Медицина, 1985. - 198с.
78. Никифоров, В.Н. Дифференциальная диагностика ботулизма / В.Н. Никифоров, М.А. Фокин, Н.А. Вильфанд // Сов. мед., 1980. №1. — С. 65 - 67.
79. Овруцкая, И .Я. Питательная среда для выявления и количественного учета анаэробных бактерий / И.Я. Овруцкая // «БИ». №1. — 1980. - С. 104.
80. Орлов, Ф.М. Ветеринарная лабораторная практика / Ф.М. Орлов. — М.: Сельхозиздат, 1963. Том 1.-С315-318.
81. Орлов, Ф.М. Инфекционные болезни крупного рогатого скота / Ф.М. Орлов. М., «Колос», 1974 - 280 - 294.
82. Папуниди, К.Х. Иммунобиологическая реактивность животных, затравленных ботулиническими ядами / К.Х. Папуниди, В.Б. Гоголев, В.Г. Сафронов // Труды первого съезда ветеринарных врачей РТ (18 -20 мая). Казань, 1995.
83. Покровский, В.И. Ботулизм / В.И. Покровский // Руководство по инфекционным болезням. М., 1977. - С. 48 - 59.
84. Полевая, О.Ю. Хим.фармацевтический журнал / О.Ю. Полевая, И.Е. Ковалев, Т.Н. Робокидзе. 1980, Т. 14. - №11, - С. 31.
85. Попутайло, В.М. Заболевания ботулизмом, вызванные консервированным томатным соком / В.М. Попугайло, С.П. Журавская, Е.Е. Яро-шевская // Гиг. и сан., 1972. №2. - С. 97 - 99.
86. Постовит, А.В. Пищевые токсикоинфекции / А.В. Постовит. JL: Медицина, 1984. - С. 209 - 242.
87. Пяткин, К.Д. Микробиология / К.Д. Пяткин, Ю.С. Кривошеин. М.: Медицина, 1981. - 511с.
88. Пилат, В.В. Диагностика ботулизма в Ульяновской области / В.В Пилат, О.М. Разживина, А.А. Нафеев, Ю.А. Зинченко, А.З Якупова, Н.В. Точицкая // Журн. микробиол., 2004.- №1. С. 97 - 98.
89. Рыцай, Г. Бюллетень Польской АН / Г. Рыцай 1956. - отд.2 - Т.4. -С. 335.
90. Рягин, С.Т. Применение люминесцентно — серологического метода для обнаружения и идентификации возбудителя ботулизма / С.Т. Рягин, П.В. Миктюк // «Микробиологический журнал» 1971. - №5 (33). - С. 613-618.
91. Савин, В.Р. Ускоренная диагностика токсина ботулизма в пищевых продуктах при помощи фагоцитарного показателя / В.Р. Савин // Дисс. Одесса, 1953.
92. Савин, В.Р. Обнаружение ботулинового токсина, искусственно внесенного в пищевые продукты, при помощи фагоцитарного показателя / В.Р. Савин // ЖМЭИ. 1955. - №8. - С. 44.
93. Сенченко Б.С. Ветеринарно санитарная экспертиза сырья животного и растительного происхождения / Б.С. Сенченко // Ростов — на — Дону: Издательский центр «МарТ», 2001. - 703с.
94. Синицин, В.А. Материалы по индикации ботулинических токсинов А и В с помощью непрямой реакции гемагглютинации в пищевых продуктах и объектах внешней среды / В.А. Синицин // Дисс. канд. — Чита, 1960.
95. Синицин, В.А. Военно-медицинский журнал / В.А. Синицин. — 1961. -№10.-С. 65.
96. Сокол, А.С. Вопросы клиники, эпидемиологии и лечения ботулизма / А.С. Сокол, М.М. Колесников^ М.П. Ромазан М.П. // Врачеб. дело. — 1982. №4. - С.107 - 109.
97. Сосов, Р.Ф. Ботулизм / Р.Ф. Сосов // В кн.: Инфекционные и инвазионные болезни крупного рогатого скота, М., 1969. С. 85 — 90.
98. Степанюк, В.Д. Эпизоотологический словарь / В.Д. Степанюк, В.П. Литвин Киев, «Урожай», 1976. - 119с.
99. Тезисы докладов научной сессии Одесского мед. Институтата им. Пиро-гова / Ю.И. Донец . 1956. - С. 27.
100. Томеску, В. Зоонозы. Болезни животных, передающиеся человеку / В. Томеску, И. Гаврилэ, Д. Гаврилэ М.: Колос, 1982. - С. 148 - 152.
101. Ургуев, К.Р. Клостридиозы животных / К.Р. Ургуев. — М., 1987. 183с.
102. Феклисова, Л.В. Вспышка ботулизма в Московской области / Л.В. Фекли-сова // ВПБЗН. 1978. - Вып. 28. - С.20 - 23.
103. Хайдрих, Х.Д. Болезни крупного рогатого скота / Х.Д. Хайдрих, И. Гру-нер М.: Агропромиздат, 1985. - С. 225 - 226.
104. Хамзин, К.А. Иммуноферментный метод для серологической диагностики бруцеллеза / К.А. Хамзин, К.М. Салмаков, Э.М. Плотникова // Тезисы докл. Респуб. научно — произв. Конференция Казань, 1990. — С. 58.
105. Черткова, Ф.А. Определение антигенных свойств токсинов и анатоксинов В. botulinum / Ф.А. Черткова //ЖМЭИ. 1937. - Т. XVII. - В. I. - № I. - С. 70 -74.
106. Черкасский, Б.Л. Особо опасные инфекции / Б.Л. Черкасский. М.: «Медицина», 1996.— 160с.
107. Чеснокова, Н.П. Ботулизм : патогенез, клиника, лечение / В.В. Чеснокова, В.В. Морисон, Н.А. Соколова. Саратов: Изд - во Сарат. ун - та, 1991. -285с.
108. Шагиева, А.Х. Иммуноферментный анализ сывороток крови животных с -термическими ожогами кожи / А.Х. Шагиева, Г.П. Новошинов, В.А. Ме-детханов // Тезисы докл. Респуб. научно — производств, конф. — Казань. — 1990.-С. 101.
109. Шамов, Ю.А. Ошибки клинической диагностики ботулизма / Ю.А. Шамов //Клин, мед., 1977.-№11.-С. 112-115.
110. Шапиро, С.Е. Семейное заболевание ботулизмом, обусловленное мясом нерпы / С.Е. Шапиро, Е.Г. Таценко // ЖМЭИ. М.: Медицина, 1977. - № 8. -С. 142-143.
111. Шахбанов, А.А. Индукция бактериофага Клостридиум ботулинум типа С / А.А. Шахбанов // Сборник научных работ. — Даг. Н. — и. вет. ин т, 1978 (1979). -Т.10. - С.26 -28.
112. Шляпникова, О.В. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации штаммов Clostridium botulinum типа А / О.В. Шляпникова, А.Н. Ефименко, Т.И. Булатова, М.Э. Ляйман, Ю.В. Вертиев // ЖМЭИ. -1996. -№1.- С. 23-26.
113. Шувалова, Е.П. Ботулизм / Е.П. Шувалова // Инф. болезни. М.: Медицина, 1976.-С. 101 - 107.
114. Шувалова, Е.П. Инфекционные болезни / Е.П. Шувалова. М.,1976.
115. Action de la cortisone sur immunization du lapin par l'anatoxine boutique / A. Prevot et al. // B. Ann. Inst. Pasteur. 1953. - Y. 85. - №2. - P. 255 - 257.
116. Angew. Chem. /H.G. Eckert- 1976. 15. - P. 525.
117. Appl. Environ / A.S. Ciccarelli, D.N. Whaley, Z. M. Mclrosley et al.. 1977. -P. 34-843.
118. Arch. Immunol. Et Ther. Exp. / J. Reiss et al.. 1981. - V.l.-P. 97 - 108.
119. Arch. Immunol. EtTher. Exp. / J. Reiss et al.. 1983. - V.31. -P. 531.
120. Berson, S.A. Isotopic tracens in, the study of diabetes / S.A. Berson, R.S. Valow // In: Advances in biology and medical physics, 1958, V.6. Academic Press, New York, P. 349.
121. Boroff, P. A. Toxin of Clostridium botulinum / P. A. Boroff // In: Toxin Anim. and Plant Origin. New York. 1972. - V.2. - P. 631 - 640.
122. Bohnel, H. Visceral botulism — a new form of bovine CI. Botulinum toxication / H. Bohnel, B. Schwagerick, F. Gessler // J. veter. Med. Ser. A. 2001. - V.48. - №6. - P. 373-383.
123. Bossi, M.G. Multiplication et Sporulation de Clostridium dans Cetube digestit des bovins: Effects de Lacomposition du regime alimentaire / M.G. Bossi, P.M.
124. Toppino, G. Sfandrini II J. Microbiol. Aliments Nutrit. 1987. V.5. - №2. - P. 141-145.
125. Bull. Schwer. Ges. Klin. Chem. / M.Waart et al.. 1977. - V.4. - P. 9.
126. Burke, G.S. Occurrence of bacillus botulinus in nature / G.S. Burke // J. Bact. 1919. V.4. - P. 541.
127. Ciccarelli, A.S. Cultural and physiological characteristics of Clostridium botulinum type G and susceptibility of certain animals to toxin / A.S. Ciccarelli, D.N. Whaley, L.M. McCroskey // Apple. Envikonm. Microbiol. 1977. - V.34. - №6. — P. 343-848.
128. Dezfulian, M. Enzyme linked Immunosorbent assay for detection of Clostridium botulinum type A and type В toxic in stodsamples of infants with botulism / M. Dezfulian, Halheroaych // J. of clinical Microbiology. 1984. - V.20 (3). -P. 379-383.
129. Dezfulian, M. Kinetics of growth and toxigenicity of Clostridium botulinum in experimental wound botulism / M. Dezfulian, H.G. Bartlett // Infec. and Im-mun. 1985. - V.49. - №2. - P. 452 - 454.
130. Dezfulian, M. Rapid diagnosis of a case of intant botulism by ensime immunoassay / M. Dezfulian, R. Volken, J. Bartlett // Pediatrie Infectious Disease. — 1985. V.4. - P. 399-401.
131. Divere, T.J. Clostridium botulinum type В toxicosis in a burg of cattle and a group of mules / T.J. Divere, R.C. Bartholomew, I.B. Messich, R.H. Whitlock, R.W. Sureney.// J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1986. -V. 188. - №4. - P. 251 -255.
132. Doms J.E. The imunisation of broiler chickens against type С botulisn / J.E. Doms // Avian Dis. 1982. -26. - 2. - P. 340 - 345.
133. Do veil, V.R. Laboratory methods in anaerobic bacteriology / V.R. Dovell, J. Haukins // CDC laboratory manual. Centers for Disease Control no. 77-9272. U.S. Government Printing Office, Washington D.C.
134. Engvoll, E. Enzyme linked immunosorbentassay (ELISA), Quantitative assay of immunoglobulin G / E. Engvoll, P. Perlmann // Immunochem. - 1971. — V.7. -P.871 -874.
135. Enzyme linked immunosorbent assay for detection of Clostridium botulinum type A / S.N. Notermans et al.. 1978 // Japh J. Med. Sci. Biol. - 31 - 81 - 85.
136. Gull — Candy, S. Effects of botulinum toxin on neuromuscular transmission in the rat / S. Gull Candy, H. Lundh, S. Thesleff// J. Physiol (Lond.). - 1976. -V. 260. - P.177 - 203.
137. Gunison, I. Studies on the serologicclassification of B. botulinus /1. Gunison, P. Schocnholz // J. Immunol. 1927. -13. - №2. - P. 79 - 92, 1927. - 13. - P. 237-241.
138. Haagsma, J. Antonie van Zeawerhock / J. Haagsma 1980. - V.46. - №5. - P. 510.
139. Hatheway, C.Z. Laboratory procedures for cases of suspected infant botulism / C.Z. Hatheway // Rev. Infect. Dis. -1. P. 647 - 651.
140. In vitro assays for botulinum toxin an antitoxins / C. Shone et al. // Reduct. Anim. Usage New and Conf. Biol. Prod. Proc. Symp. London, 24 — 26 Apr.,1986. Basel e. al.. 1986. - P. 141 - 145.
141. Immunology Methods / P.J. Dobbins et al.. 1982. -V.48. - P. 251 - 255.
142. Kenny G. E., Dunsmoor C.L. // J. Clin, Microbiol. 1983. - V.17. - P. 655 -665.
143. Kiss, I. Relation between radiation resistance and salt sensitivity of Clostridium botulinum types А, В and E /1. Kiss, C.O. Rhee, N. Czecz // Appl. environm. Microbiol., 1978 V.35. - №3. - P. 533 - 539.
144. Kokubo, V. An outbreak of type С botulism among waterfowlsin a pond en Tokyo / V. Kokubo, M. Maruyama, S. Kaneko // J. Japan Veter. Med. Assn.1987. V.40. - №2. - P. 113 - 117.
145. Kozaki, S. Evalution of ELISA technigues for titration of monoclonal antibodies against botulinum toxin / S. Kozaki, J. Kamata, T. Nagai, I. Ogasawarn, E. Sakoguchig // Jap. J. Vet. Sci. - 1986. - V.48 - №5. - P. 409 - 914.
146. Le botulisme experimental du chien et la guestion du botulisme naturel / R. Legroux et al. // Ann. Inst. Pasteur. 1974. - V.73. - №2. - P. 105.
147. Med. Veb./R.Piroirdetal.. -1980.-V. 131. №1.-P.25.
148. Meyer, K.F. The status of botulism as a world health / K.F. Meyer // Bull. Wld Hlth Org. 1956 - V. 15. - P. 281.
149. Michali, K.M. ELISA for the detection and differentiatien of Clostridium botulinum toxins type A and В / K.M. Michali, J. Grzybowski // J. Immunological methods, 1986. V.93. - №2. P. 225 - 230.
150. Montville, T.J. Effect of plating medium on heat activation requirement of Clostridium botulinum spores / TJ. Montville // Appl. environm. Microbiol., 1981. V.42. - №4. - P. 734 - 736.
151. Muller, W, Ursachen Sumptome und Bekampfimd des Botulismus bei NERS / W. Muller // Dt. Pelztierzuchter. 1983. - 57. - 5. - P. 74 -75.
152. Notermans, S.N. Enzyme — linked immunosorbent assay for detection of Clostridium botulinum type E toxin / S.N. Notermans // Appl. Environ. Microbiol. — 1979.-V.37.-P. 1173-1175.
153. Notermans, S. N. Tijdschr. diergeneesh / S.N. Notermans, A.H. Havalaar // 1986. -V. Ill, №13. -P. 634-638.
154. Notermans, S. N. Dersistence of Clostridium botulinum type В on a cattle farm after an outbreak of botulism / S.N. Notermans, J. Dufrenne, J. Oosterom // Appl. Environ. Microbiol. 1981.-V.41.-P. 179-183.
155. Oguma, K. Observations on toxin and hemagglutinin produced by Clostridium botulinum type С / К. Oguma // Appl. environm. Microbiol., 1978 — V.35. -№2. P. 462 - 464.
156. Poraff, M.R. Analyse epidemiologigue du botulisme bonn dans le department de la Manche / M.R. Poraff, J.C. Legardinier, P. Mehent Ferron, G. Lexune //Rev. med. Vet - 1986. -137. - №12. - P. 857 - 865.
157. Rosin, H. Bornholmer Krankheit Botulismus / H. Rosin // Pharmahother Kindesater. Mtinchen, 1988. P. 159-161.
158. Schantz, E.J. Toxic proteins produced by Clostridium botulinum / E.J. Schantz, KL Sugiyama // J. of Agricol. Food Chem. 1974. - V.22. - P. 26 - 30.
159. Skurrie I. J., Gilbert G.L. // J. Clin. Microb. 1983. - V. 17. - P. 738 -741.
160. Smant, I. L. Roultry waste associated type С botulismin Cattle Epidemiol /1. L. Smant, Т.О. Jones, F.G. Clegg, M.J. Meneuntry // Infect. 1983. - V.98. -№1. — P. 73-79.
161. Van Weemen, B.K. Immunoassay using antigenenzyme conjugate / B.K. Van Weemen, A.H. Schuwrs // FEBS Letters. 1971. - V.15. - P. 232 - 236.
162. Valow, R.S. Assay of plasma insulin in human subjects by immunology methods / R.S. Valow, S.A. Berson // Nature. 1959. - 184. - P. 1684.
163. Volken B.H. Stophilicoccal protein A — enzyme immunoglobuli conjugates: versatile tools for enzymeimmunoassayr / B.H. Volken, F.J. Liester // J. Immunol. Meth. 1981. - V.43 (2). - P. 209 - 218.
164. Weis, H.E. Botulismus als Ursache eines Massensferbens bei Wasservogeln / H.E. Weis // Tierarztl. Unisch. 1982. - 37. - 12. - P. 842 - 846.