Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование методов ретроспективной диагностики и оценки поствакцинального иммунитета ньюкаслской болезни птиц

На правах рукописи УДК 619:616.98:578.831.1:616-076:616-097.3

РГВ он

* •* дн;; ¿лз

МАНИН Тимофей Борисович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2000

Работа выполнена в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (ВНИИЗЖ) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель - кандидат ветеринарных наук, старший научный

сотрудник СТАРОВ С.К. Научный консультант - кандидат биологических наук, старший научный

сотрудник ДРЫГИН В.В.

'Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный —

сотрудник ДЫМИН М.А. (ВНИИВВиМ, г.Покров) кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник ДРЯГАЛИН H.H. (ВНИИЗЖ, г.Владимир)

Ведущее учреждение: Всероссийский государственный научно-

исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г.Москва)

Защита диссертации состоится" м " декабря 2000 г. в "_ и? часов на заседании диссертационного совета Д 120.60.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных Минсельхоза России по адресу: 600900, г. Владимир, п. Юрьевец, ВНИИЗЖ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ. Автореферат разослан " " ноября 2000 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета - Г.М. Семёнова.

3(/<6~b/J

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ньюкаслская болезнь (НБ) - высококонтагиозная вирусная инфекция птиц, главным образом куриных, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом, множественными точечными кровоизлияниями и поражениями внутренних органов. Гибель птиц, особенно молодых, может достигать 100%. По классификации Международного Эпизоотического Бюро НБ считается особо опасным заболеванием и отнесена в список «А».

Впервые зарегистрированная в 1926 году в Англии (Doyle Т.М.) ньюкаслская болезнь в течение 20 столетия нанесла громадный экономический ущерб птицеводству всего мира (Alexander D.J.,2000). В настоящее время, несмотря на внушительные затраты на изучение молекулярных основ патогенности возбудителя, диагностику и специфическую профилактику НБ, вспышки заболевания регистрируются почти во всех странах мира. По данным МЭБ в 1999 году официально зарегистрировано 2709 вспышек ньюкаслской болезни более чем в 100 странах мира. В Российской федерации в 2000 году было зарегистрировано 3 вспышки заболевания (B.O.I.E.,2000).

Основополагающую роль в борьбе с инфекцией имеет своевременная диагностика и последующие меры профилактики. Принятая в мире схема ретроспективной диагностики предусматривает выявление специфических антител с помощью традиционного серологического теста - реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментного анализа (ИФА) (Alexander D.J.,1997). В Российской Федерации предусмотрено применение РТГА, причём в настоящее время актуальным вопросом является повышение воспроизводимости результатов теста, путём создания стандартных диагностических наборов на базе данной реакции.

Анализируя состояние ретроспективной диагностики НБ в мире, нельзя не отметить внедрение в ветеринарную практику современных серологических методов, в частности ИФА. Основываясь на использовании антител, конъюгированых с различными ферментами, иммуноферментный анализ не уступает, а часто и превосходит стандартные методы диагностики по чувствительности и специфичности. Быстрота получения и автоматизированный учёт результатов реакции, воспроизводимость, возможность стандартизации условий постановки анализа, делают ИФА наиболее эффективным, удобным и экономичным методом для массовых серологических исследований. В зарубежной ветеринарной практике для диагностики НБ ши-

роко используются коммерческие иммуноферментные тест-системы, предусматривающие исследование сывороток в одном разведении, позволяющие определять уровень материнских антител, напряжённость поствакцинального иммунитета, корректировать сроки повторных иммунизации, а также определить возможный контакт с «полевым» вирусом (Brown J.1990; Kaleta E.F.,1992; Alexander D.J.,1995). Существующие диагностические наборы обладают различной интерпретацией качественной характеристики напряжённости иммунитета.

В научной литературе имеются данные о возможности использования ИФА для определения уровня антител, обеспечивающих 100% защиту от заболевания при контрольном заражении (Wilson R.А.,1984). Указанные выше преимущества создали предпосылку для разработки и использования диагностической тест-системы ИФА, с помощью которой возможно выявление и количественное определение уровня антител к вирусу НБ при ретроспективной диагностике, обеспечивающих защиту при контрольном заражении.

Современное производство вакцин требует разработки специфичных и точных методов оценки качества вирусного сырья. По данным литературы, для этой цели возможно использование сэндвич-варианта ИФА для прямого обнаружения и определения активности различных вирусов, вызывающих болезни птиц. Реакция гемагглютинации, применяемая в настоящее время для контроля качества антигенного сырья при производстве вакцин и диагностических наборов, при высокой чувствительности не обладает специфичностью по отношению к гемагглютинирующим вирусам.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы явилась разработка диагностических наборов ИФА и РТГА для выявления и количественной оценки специфических антител в сыворотках крови кур, позволяющих проводить массовые исследования птицепоголовья при ретроспективной диагностике НБ, оценивать состояние гуморального иммунитета и способных измерить уровень антител, обеспечивающих защиту птицы от заболевания при контрольном заражении.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

-разработать методику очистки и концентрирования антигена вируса ньюкасл-ской болезни;

-разработать диагностический набор для определения уровня антител к вирусу НБ в РТГА; '

-разработать иммуноферментную тест-систему для определения активности вируса НБ в аллантоисной жидкости, используемой для производства вакцин и ди-агностикумов, и провести сравнительный анализ данных, полученных с помощью ИФА и базовой реакции РГА;

-разработать иммуноферментную тест-систему для выявления и количественного определения антител к вирусу НБ в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении и провести сравнительный анализ данных разработанных тест-систем ИФА и РТГА с коммерческим набором КР1. (США), сертифицированным на территории РФ; _

-изучить корреляционную зависимость результатов разработанных тест-систем РТГА и ИФА при изучении динамики накопления антител, вследствие применения живых и инакгивированных вакцин против НБ;

-определить уровень антител в ИФА, обеспечивающий 100% защиту птицы от заболевания при контрольном заражении.

Научная новизна. Впервые в России разработана иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител к вирусу НБ в сыворотках крови кур при тестировании их в одном разведении. Данная тест-система предусматривает количественное определение антител по уравнению регрессионной зависимости, осуществляемое автоматически с использованием компьютерной программы для регистрации, обработки, хранения результатов иммуноферментного анализа в ветеринарии "СИНКО-ИФА", разработанной во ВНИИЗЖ.

Разработана тест-система на основе непрямого сэндвич-варианта ИФА для определения активности вируса НБ в вируссодержащем сырье при производстве ди-агностикумов и вакцин против НБ. Высокая специфичность ИФА по сравнению с РГА позволяет выявлять и определять концентрацию вируса НБ в смеси с гетерологич-ными вирусами, используемой при производстве ассоциированных вакцин.

Разработан диагностический набор для определения уровня антител к вирусу НБ в РТГА. Высокая специфичность, активность и стабильность при хранении компонентов разработанного набора позволяет повысить воспроизводимость результатов реакции.

Изучена диагностическая ценность ИФА по отношению к РТГА.

Определён уровень антител в ИФА, обеспечивающих 100% защиту птицы от заболевания при контрольном заражении.

Практическая значимость. Утверждены Департаментом ветеринарии нормативно-технические документы на "Набор препаратов для определения уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации" и "Набор для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни иммунофермент-ным методом при тестировании сывороток в одном разведении". Подготовлены технические условия и временные наставления по применению разработанных наборов. Данные тест-системы успешно прошли широкие производственные испытания и применяются для ретроспективной диагностики НБ и контроля напряжённости поствакцинального иммунитета в ветеринарии. Разработанььи утверждены директором института "Методические указания по выявлению и определению активности антигена вируса ньюкаслской болезни в непрямом сэндвич-варианте иммунофер-ментного анализа" и «Инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни кур иммунофер-ментным методом».

Основные положения, выносимые на защиту:

- набор для определения уровня антител к вирусу НБ в РТГА;

- иммуноферментная тест-система для выявления и определения активности антигена вируса НБ в вируссодержащем сырье;

- иммуноферментная тест-система для выявления и количественного определения антител к вирусу НБ при тестировании сывороток в одном разведении с использованием компьютерной программы учёта и хранения результатов "СИНКО-ИФА разработанной во ВНИИЗЖ;

- результаты сравнения результатов ИФА и РТГА при ретроспективной диагностике НБ, вследствие применения живых и инакгивированных вакцин.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ВНИИЗЖ в 1997-2000 годах, на научной конференции молодых учёных (Владимир, 2000г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, иллюстрирована 19 таблицами и 22 рисунками. Список использованной литературы включает 196 источников, из них 163 иностранных.

2.С0БСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение вируса НБ. Для изготовления антигенных препаратов вируса НБ использовали штамм Ла-Сота, адаптированный к куриным эмбрионам, полученный из Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ). Для получения матровой расплодки вируса проводили однократный пассаж полученного штамма на развивающихся 9-11-суточных куриных эмбрионах, полученных из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям кур и не имеющих антител к вирусу НБ. Матровую расплодку производственного штамма "Ла-Сота" вируса НБ применяли для проведения второго пассажа на куриных эмбрионах при получении вируссодержащей жидкости, используемой для изготовления препаратов антигена вируса НБ.

Инактивация вируса НБ. Инактивацию проводили путём добавления в ви-руссодержащую жидкость аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) в 0,1% концентрации, с дальнейшей инкубацией в термостате в течение 24 ч при температуре 37°С. Инак-тивированный вирус контролировали на авирулентность путем титрования на развивающихся, свободных от патогенной флоры (ЭРР) куриных эмбрионах (КЭ) в возрасте 9-11 суток.

Очистка и концентрирование антигена вируса НБ. Очистку и концентрирование антигена вируса НБ проводили методом низкоскоростного центрифугирования с последующим осаждением на дно пробирки при 20000 об/мин через 20% слой сахарозы. Наличие вируса, чистоту, концентрацию препарата определяли в ИФА, РГА и электронномикроскопически. Препараты концентрата антигена хранили при минус 70°С.

Лабораторные животные. Для получения вирусспецифических сывороток в качестве доноров использовали клинически здоровых кроликов в возрасте 90-180 дней с массой 2,5-3,0 кг и кур в возрасте 60-100 дней. В опытах по определению напряжённости иммунитета (постановка биопробы) использовали цыплят, не имеющих антител к вирусу ньюкаслской болезни в возрасте 40-60 дней.

Сыворотки. Вирусспецифические сыворотки кур и кроликов, используемые в качестве положительной контрольной сыворотки, детекторных и улавливающих антител, соответственно, получали путём иммунизации доноров живой вакциной и

очищенным, инактивированным концентратом вируса НБ. Нормальную сыворотку кур получали от SPF-цыгшят, а кроликов - от животных, не имеющих антител к вирусу НБ.

В опытах использовали сыворотки крови кур, невакцинированных и вакцинированных против НБ экспериментальными препаратами вакцин.

Конъюгаты. Использовали коммерческие антивидовые конъюгаты, выпус-. каемые НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, представляющие собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией животных-продуцентов IG кролика, морской свинки, курицы, меченную пероксидазой, а также коммерческий препарат антикуриного конъюгата с пероксидазой хрена производства фирмы KPL (США).

Серологические и иммунохимические методы исследования

Определение гемагглютинирующей активности вируса НБ. Гемагглю-тинирующую активность вируса НБ определяли в реакции гемагглютинации постановкой общепринятым методом в планшетах с использованием 0,7%-ой суспензии эритроцитов кур.

Определение титра антител к вирусу НБ в реакции торможения гемагглютинации. Проводили по общепринятой методике, разработанной во ВГНКИ и утверждённой Департаментом ветеринарии в 1997 г.

Иммуноферментный анализ. В работе испытывали непрямой сэндвич и непрямой варианты ИФА, оптимальные условия постановки которых определяли экспериментально.

Постановка биопробы. Экспериментальное заражение цыплят проводили внутримышечно вирулентным штаммом «Т-53» в дозе 3 lg ЛДя. Штамм «Т-53» вируса ньюкаслской болезни с титром 7,5 lg ЛД^си3 получен из коллекции ВГНКИ (Москва). Наблюдение за цыплятами велось в течение 10 суток, результаты контрольного заражения оценивали положительно в случае гибели неиммунных цыплят с клиническими признаками, характерными для НБ.

Компьютерный учёт результатов. Учёт результатов непрямого варианта ИФА, обработку, хранение и воспроизведение полученных данных проводили с использованием компьютерной программы "СИНКО-ИФА" (ВНИИЗЖ).

Статистический анализ материалов. Для статистической обработки данных использовали компьютерную программу Statistical Basic Statistics and Tables.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Разработка набора для определения уровня антител к вирусу нью-каслской болезни в реакции торможения гемагглютинации 2.2.1.1. Получение лиофильно высушенного инактивированного антигена НБ. В качестве исходного материала для антигена была использована экстраэмбриональная жидкость (ЭЭЖ) куриных эмбрионов, содержащая вирус ньюкаслской болезни из штамма Ла-Сота с титром не менее 109 ЭИДи и титром в РГА не менее 1:512. Далее полученную вируссодержащую экстраэмбриональную жидкость очищали от балластных белков путём низкоскоростного центрифугирования при 5000 об/мин в течение 20 мин.в роторе JA-10 центрифуги Beckman JA-21. Перед сушкой препарат антигена был стабилизирован сахарозой и гидролизатлактатальбумином (ГЛА) до конечной концентрации 2% и 3%, соответственно. Также были добавлены антибиотики из расчёта 100-150 ед/мл бензилпенициллина натриевой соли, 150-200 ед/мл стрептомицина сульфата и 50 ед/мл нистатина. Лиофильная сушка осуществлялась на аппарате USIFROID (Франция). Активность готового лиофильно высушенного инактивированного препарата антигена НБ составила в РГА 1:512. Восстановление антигена в исходное состояние осуществлялось с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (ФБР) с рН 7,2-7,4. Специфичность антигена определяли в РТГА с гетерологичными сыворотками к вирусам ИБК, ИББ, ИЛТ, PEO, ССЯ и Гриппа птиц 5 и 7 серотипов. Результаты тестирования представлены в табл.1.

Таблица 1.

Результаты тестирования полученного инактивированного антигена НБ с гетерологичными сыворотками в РТГА

№пробы Наименование сыворотки Титр в РТГА

1 ИБК+ отриц.

2 ИББ+ отриц.

3 ИЛТ+ отриц.

4 РЕО+ отриц.

5 ССЯ+ отриц.

6 Грипп 5 серотип+ отриц.

7 Грипп 7 серотип+ отриц.

8 НБ+ 1:512

9 норм.аллант. ж-сть отриц.

Было установлено, что полученный инактивированный препарат антигена НБ в реакции с гетерологичными сыворотками неактивен. Также исследована возмож-

ность хранения специфического антигена как в лиофильно высушенном, так и в разведённом состоянии. Сохранение исходной активности антигена определялось в реакции гемагглютинации, причём в первом случае антиген разводили в ФБР непосредственно перед каждым тестированием. Полученные результаты приведены в табл.2.

Таблица 2.

Активность лиофильно высушенного антигена НБ в зависимости от срока хранения при температуре 4°С.

Срок хранения Титр в РГАЛ Срок хранения Титр в РГАА

исходный 1:512 6 месяцев 1:512

2 недели 1:512 8 месяцев 1:512

1 месяц 1:512 12 месяцев 1:512

2 месяца 1:614 18 месяцев 1:512

3 месяца 1:512 24 месяца 1:512

Примечание: А - среднее значение по 10 пробам.

Установлено, что при хранении в лиофильно высушенном состоянии антиген НБ не терял свою гемагглютинирующую активность в течение всего срока наблюдения (24 месяца). Для проверки активности специфического антигена НБ при хранении в растворе препарат разводили только перед первым тестированием. Далее антиген хранили при различных температурных режимах в растворённом состоянии Результаты приведены в табл.3.

Таблица 3.

Активность антигена НБ, хранящегося в растворе, в зависимости от температуры и срока хранения

Срок хранения Титр в РГАА при температуре хранения:

минус 50°С 4е С 20°С

' Исходный 1:512 1:512 1:512

10 дней 1:768 1:704 1:1408

20 дней 1:640 1:640 1:890

30 дней 1:640 1:640 1:832

40 дней 1:576 1:384 1:144

Примечание: А - среднее значение по 8 пробам.

Данные таблицы 3 показывают, что оптимальным сроком хранения антигена в разведённом состоянии следует считать 30 дней при температуре 4°С или любой минусовой температуре.

2.2.1.2. Получение лиофильно высушенной положительной вирусспецифиче-сной и нормальной сывороток крови кур. Вирусспецифическую сыворотку крови кур получали путём трёхкратной иммунизации кур в возрасте 60 дней с интервалом 14 суток живой вакциной против НБ из штамма Ла-Сота с инфекционной активностью Ю10 ЭИД50, а затем, через 10 суток, инактивированным и концентрированным препаратом антигена из того же штамма, эмульгированного с масляным адъюван-том. Все иммунизации проводили внутримышечно в дозе 1.0 мл в область бедренной мышцы. Нормальную сыворотку крови кур получали от БРР цыплят в возрасте 3 дней. Далее сыворотки крови кур подвергли лиофильной сушке на аппарате иЗ^ЯОЮ (Франция). Активность полученной лиофильно высушенной вирусспецифической сыворотки крови кур в РТГА была не менее 1:256. Активность нормальной сыворотки крови кур в РТГА была менее 1:2.

Исследована возможность хранения вирусспецифической сыворотки крови кур в лиофильно высушенном состоянии. Сохранение исходной активности определялось путём постановки реакции торможения гемагглютинации, причём сыворотку крови кур разводили в ФБР непосредственно перед каждым тестированием. Результаты приведены в табл.4.

Таблица 4.

Активность вирусспецифической сыворотки крови кур, хранящейся в лиофильно высушенном состоянии при температуре 4°р, в зависимости от

срока хранения

Срок хранения Титр в РТГАа Срок хранения Титр в РТГАа

2 недели 1:256 6 месяцев 1:256

1 месяц 1:256 8 месяцев 1:256

2 месяца 1:256 12 месяцев 1:256

4 месяца 1:512 18 месяцев 1:64

Примечание: А-среднее значение по 5 пробам.

Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальным сроком хранения лиофильно высушенной сыворотки следует считать 12 месяцев при температуре 4° С

2.2.1.3. Воспроизводимость результатов РТГА в зависимости от времени и условий постановки реакции. Было протестировано 20 полевых и 15 референтных сывороток крови кур в РТГА в 3 повторностях через равные промежутки времени (7 дней). Референтные сыворотки крови кур были разделены на три группы: отрицательные (исходный титр в РТГА 1:2 и менее), слабоположительные (исходный титр в РТГА 1:16) и сильноположительные (исходный титр в РТГА 1:256). В качестве специфических компонентов для реакции были использованы полученные препараты антигена, вирусспецифической и нормальной сывороток крови кур. Все разведения в опыте производились на ФБР, имеющем рН 7,2-7,4. Полученные данные приведены в табл.5.

Было установлено, что постановка РТГА с полевыми и референтными сыворотками с использованием стандартизированных специфических (антигена, положительной и отрицательной сывороток крови кур) и неспецифических (ФБР рН 7,27,4) компонентов реакции, позволяет получить воспроизводимые результаты с максимальным диапазоном колебания титра в одно серийное разведение.

Таким образом, в результате проведённых исследований были получены специфические компоненты для постановки РТГА, определены сроки хранения препаратов инактивированного антигена и положительной вирусспецифической сыворотки крови кур, показана целесообразность использования в реакции фосфатно-солевого буферного раствора. Данная тест-система, предназначенная для определения уровня антител к вирусу НБ в сыворотках крови кур, способствует получению воспроизводимых результатов реакции и может быть использована в ретроспективной диагностике ньюкаслской болезни и оценки напряжённости иммунитета. Полученные экспериментальные данные позволили разработать и утвердить комплект нормативно-технической документации и начать выпуск коммерческих диагностических наборов.

Таблица 5.

Воспроизводимость результатов РТГА в зависимости от времени и условий постановки реакции

№сыворотки Титр в РТГА

исходный 1 повторность 2 повторность

1 1:32 1:64 1:32

2 1:256 1:256 1:256

3 1:64 1:64 1:128

• 4 1:64 1:64 1:128

5 1:256 1:256 1:256

6 1:32 1:32 1:64

7 1:512 1:512 1:512

8 1:64 1:64 1:128

9 1:32 1:64 1:64

10 1:512 1:256 1:1024

11 1:64 1:64 1:64

12 1:64 1:64 1:128

13 1:64 1:64 1:64

14 1:128 1:64 1:128

15 1:256 1:256 1:256

16 1:64 1:32 1:128

17 1:128 1:128 1:256

18 1:128 1:128 1:256

19 1:128 1:128 1:256

20 1:2 1:2 1:4

21 1:2 1:2 1:4

22 1:2 1:2 1:4

23 1:2 <1:2 1:4

24 1:2 1:4 1:4

25 1:2 1:4 1:4

26 1:16 1:16 1:32

27 1:16 1:16 1:32

28 1:16 1:32 1:16

29 1:16 1:16 1:16

30 1:16 1:16 1:16

31 1:256 1:256 1:256

32 1:256 1:256 1:256

33 1:256 1:256 1:256

34 1:256 1:256 1:512

35 1:256 1:256 1:512

36 1:256 1:256 1:512

37 1:2 1:2 1:2

рН водыЛ 6,5 6,3 7,1

рН ФБР 7,2 7,2 7,3

Примечание: №1-20 - полевые сыворотки крови кур с различным уровнем специфических антител к ВНБ;

№21-25 - референтные сыворотки крови кур с титром специфических антител к ВНБ в РТГА 1:2 и менее;

N226-30 - референтные сыворотки крови кур с титром специфических антител к ВНБ в РТГА 1:16;

№31-35 - референтные сыворотки крови кур с титром специфических антител к ВНБ в РТГА 1:256;

N236 - положительная и отрицательная контрольные сыворотки крови кур; А - рН воды, используемой для приготовления ФБР.

2.2.2. Разработка метода выявления и определения активности антигена вируса НБ в непрямом сэндвич-варианте ИФА

2.2.2.1. Получение специфических сывороток кроликов и кур. При разработке тест-системы на основе ИФА для определения активности антигена вируса НБ было необходимо определить требования к специфическим иммунореагентам. В качестве препаратов антител для создания твердофазного иммуносорбента и последующей детекции сорбированного антигена использовали специфические сыворотки крови кроликов и кур. Концентрированный, очищенный и инактивированный препарат антигена, эмульгированный с масляным адъювантом, вводили по 1 мл в межлальце-вые ткани задних конечностей кроликов (по 0,1 мл в каждую точку инъекции). Спустя 31 день, кроликов прививали повторно внутримышечно в область бедра двойной дозой концентрированного очищенного препарата в объёме 2 мл, эмульгированного с масляным адъювантом. Через 8-10 дней проводили пробное взятие крови для определения активности сыворотки в ИФА. При достижении титра специфических антител 1:12800 и более животных обескровливали. Вирусспецифическую сыворотку крови кур получали путём трёхкратной иммунизации кур в возрасте 60 дней с интервалом 14 суток живой вакциной против НБ из штамма Ла-Сота с инфекционной активностью Ю10 ЭИДи, а затем через 10 суток инактивированным и концентрированным препаратом антигена из того же штамма, эмульгированного с масляным адъювантом. Все иммунизации проводили внутримышечно в дозе 1.0 мл в область бедренной мышцы. Нормальную сыворотку крови кур получали от SPF цыплят в возрасте 3 дней.

Для оценки специфичности и активности сывороток кроликов и кур использовали непрямой вариант ИФА и РТГА. Полученные в результате иммунизации сыворотки крови имели следующую активность: кролика в ИФА 1:51200, в РТГА 1:16184; кур в ИФА 1:12800, в РТГА 1:2048. При взаимодействии с гетерологичными антигенами (ССЯ, PEO, ИБК, ИББ, ИЛТ) активность сывороток кролика и кур не превышала фоновый уровень (реакция с нормальной сывороткой).

Таким образом, для получения улавливающих антител была избрана схема двукратной иммунизации кроликов, а для получения детекторных антител была избрана схема четырёхкратной иммунизации кур. Обе схемы иммунизации обеспечивали получение активных и специфичных сывороток крови.

2.2.2.2.0птимизация условий постановки непрямого сэндвич-варианта ИФА. В результате проведённых исследований определён ряд параметров для оптимизации постановки непрямого сэндвич-варианта ИФА для контроля вируссодержащего сырья. Установлено, что время, необходимое для адсорбции улавливающих антител, разведённых в планшетах 0,05 М Карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) рН 9,5-9,6, должно составлять16-18 часов при температуре 4°С в; для всех последующих этапов ИФА инкубацию компонентов, разведённых в 0,05 М трис-HCI с 0,2 М NaCI буферном растворе рН 7,4-7,6 с 0,01% твин-20, проводить в течение 1 часа

__N

при 37°С. Оптимальные концентрации для улавливающих, детекторных антител и антивидового конъюгата составили 1:200, 1:500 и 1:1000, соответственно. В качестве блокирующего раствора использовали 10% раствор нормальной сыворотки лошади. Срок хранения сенсибилизированных антителами планшет составил 1 месяц при температуре 4°С (срок наблюдения).

2.2.2.3. Изучение корреляционной зависимости между результатами определения активности антигена вируса НБ в ИФА и РГА. При проверке в имму-ноферментном анализе и РГА 30 проб вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости, используемой в качестве сырья при изготовлении вакцины против нью-каслской болезни, и 12 проб гетерологичных антигенов (ИБК, ССЯ, ИЛТ, PEO, ИББ и лейкоза птиц, парамиксовирусных инфекций 2 и 3 серотипов, Гриппа птиц 5,7 серо-типов) были получены результаты, приведённые в табл. 6,7.

Статистический анализ данных показал наличие прямой корреляционной зависимости между результатами исследования антигена вируса НБ в ИФА и РГА, коэффициент парной корреляции (R) по 30 антигенам составил 0.93. Гетерологичные антигены в ИФА были неактивны. В РГА гемагглютинирующую активность помимо вируса НБ проявили вирус ССЯ-76, парамиксовирусы 2 и 3 серотипов и Грипп птиц 5,7 серотипов.

Таблица 6.

Результаты определения титра антигена вируса НБ в пробах вируссодер-жащей экстраэмбриональной жидкости в ИФА и РГА

Nn/n Титр вируса Nn/n Титр вируса

РГА ИФА РГА ИФА

1 1:128 1:400 17 1:8192 1:12800

2 1:128 1:533 18 1:171 1:400

3 1:256 1:733 19 1:213 1:800

4 1:256 1:800 20 1:427 1:800

5 1:512 1:1600 21 1:341 1:800

6 1:512 1:800 22 1:853 1:1333

7 1:512 1 1066 23 1:4096 1:8533

8 1:512 1 1333 24 1:2730 1:3200

9 1:1024 1 1333 25 1:4778 1:6400

10 1:1024 1 2133 26 1:512 1:800

11 1:1024 1 1600 27 1:1024 1:800

12 1:1024 1 2667 28 1:1024 1:1600

13 1:2048 1 6400 29 1:2048 1:1600

14 1:2048 1 3200 30 1:8192 1:25600

15 1:2048 1 4267 АГ' отр. <1:100

16 1:8192 1 25600 АГНБ+ 1:512 1:800

Примечание: АГ+ - положительный контрольный антиген НБ,

АГ- - нормальная аллантоисная жидкость,

Таблица 7.

Результаты определения титра антигена вируса НБ в пробах гетерологич ных антигенов методами ИФА и РГА

Антиген Титр вируса Антиген Титр вируса

Nn/n РГА ИФА Nn/n РГА ИФА

1 АГ" отр. <1:100 8 ССЯ 1:8192 <1:100

2 АГНБ + 1:512 1:800 9 CELO отриц. <1:100

3 ИЛТ отр <1:100 10 из-т KR-95 отриц. <1:100

4 ЛП отр. <1:100 11 ПМВ 2 1:512 <1:100

5 ИБК отр. <1:100 12 ПМВЗ 1:64 <1:100

6 ИББ отр. <1:100 13 Грипп серотип 5 1:128 <1:100

7 PEO отр. <1:100 14 Грипп серотип 7 1:128 <1:100

Примечание: АГ+ - положительный контрольный антиген НБ, АГ- - нормальная аллантоисная жидкость,

ЯП, ИБК, ИББ, PEO, ИЛТ, ССЯ, CELO, изолят KR-95, ПМВ 2, ПМВ 3, Грипп сер.5

Грипп сер.7 - пробы антигенов лейкоза птиц, инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальнсн болезни, реовирусной инфекции, инфекционного ларинготрахеита, синдрома снижения яйценоскости аденовирусных инфекций, парамиксовирусных инфекций 2,3 серотипов и Гриппа птиц 5,7 серотипов соответственно.

Следующим этапом нашей работы было изучение возможности определения активности вируса антигена вируса НБ в смеси инактивированных вирусов (ССЯ, ИБК), взятых в равных отношениях (по объёму). Было проведено исследование этих проб до и после смешивания в двух тест-системах ИФА для выявления вирусов НБ и ССЯ-76 и в РГА. Результаты исследований представлены в табл.8.

Таблица 8.

Определение активности вирусных компонентов смеси антигенов вирусов НБ,

ИБК, ССЯ-76 в различных иммуноферментных тест-системах и РГА

Титр вируса НБ

Мп/п Наименование ИФА для ИФА для РГА

выявления выявления 1од2

НБ ССЯ-76

1 ССЯ-76 (до смешивания) отриц. 1:1600 14

2 НБ (до смешивания) 1:800 отриц. 11

3 ИБК (до смешивания) н/о н/о н/о

4 ССЯ-ИБК-НБ (смесь 1.1:1) 1:200 1:600 11

Примечание: н/о - не определён.

Тест-система для оценки активности вируса НБ выявляла специфический антиген, как в исходном компоненте, так и в смеси с гетерологичными антигенами (ССЯ, ИБК). В РГА была определена активность только отдельных антигенов - НБ и ССЯ-76.

Таким образом, можно заключить, что существует корреляционная зависимость между результатами определения активности вируса НБ в вируссодержащем сырье в непрямом сэндвич-варианте ИФА и РГА. Данный непрямой сэндвич-вариант ИФА, имеющий большую специфичность, чем РГА и не уступающий ему по чувствительности, может быть использован для оценки активности антигена вируса НБ при контроле вируссодержащего сырья для производства моновалентных и ассоциированных вакцин.

2.2.3. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител при тестировании сывороток в одном разведении 2.2.3.1. Очистка и концентрирование вируса НБ. Первым этапом при разработке тест- системы на основе непрямого варианта ИФА был выбор условий очистки и концентрирования вируса для получения препаратов антигена. Для очистки вируса НБ нами был выбран метод центрифугирования через слой сахарозы. Для выбора оптимальных параметров очистки вируса был проведён подбор следующих условий: удаление балластных белков низкоскоростным центрифугированием; осаждение на

дно пробирки через 20% слой сахарозы. Было показано, что выдерживание аплан-тоисной жидкости при +4°С в течение 24 часов приводит к осаждению балластных белков на дно флаконов, что отражается на снижении уровня фоновых реакций. После очистки вируссодержащую суспензию концентрировали в 20 раз путём ресус-пендирования осадка в 1:20 первоначального объёма в буфере STE. В результате проведённых исследований был разработан метод очистки и концентрирования вируса НБ из алпантоисной жидкости инфицированных КЭ. Основные этапы очистки вируса представлены в виде схемы на рис.1. С помощью описанного метода очистки вируса НБ в течение 1 часа из аллантоисной жидкости инфицированных КЭ с титром вируса 101СЭИД5о/мл получали препараты антигена с концентрацией белка 3-5 мг/мл (при концентрировании в 20 раз от исходного объёма аллантоисной жидкости). Чистоту и качество вирусного препарата контролировали электронной микроскопией. Активность очищенного и концентрированного антигена в сэндвич-варианте ИФА составила 1:25600, а в РГА 11log2.

Рис.1. Схема очистки и концентрирования вируса НБ из аллантоисной жидкости инфицированных КЭ.

Подготовка исходного материала

(получение аллантоисной жидкости из КЭ, инфицированных вирусом НБ,

штамм Ла-Сота.) у

Осаждение клеточных элементов

(выдерживание аллантоисной жидкости при +4°С в течение 24 часов)

I

Осветление аллантоисной жидкости низкоскоростным центрифугированием

(при 5000 об/мин в течение 20 мин в роторе JA-10 центрифуги Beckman JA-21)

Осаждение на дно пробирки через слой сахарозы (20%)

(при 20000 об/мин в течение 30 мин в роторе АН-627 центрифуги Sorvall

OTD65B)

Таким образом, разработанный нами метод позволяет получать очищенный и концентрированный вирус НБ, который можно использовать в качестве антигена в ИФА и для иммунизации животных с целью получения вирусспецифических сывороток крови.

2.2.3.2. Получение вирусспецифической положительной и нормальной сывороток крови кур. Вирусспецифическую сыворотку крови кур, в дальнейшем используемую как положительный контроль, получали путём трёхкратной иммунизации кур в возрасте 60 дней с интервалом 14 суток живой вакциной против НБ из штамма Ла-Сота с инфекционной активностью Ю10 ЭИД50, а затем через 10 суток инаТстиви-рованным и концентрированным препаратом антигена из того же штамма. Все иммунизации проводили внутримышечно в дозе 1.0 мл в область бедренной мышцы. Активность полученной сыворотки крови кур в РТГА была не ниже 1:2048, а в ИФА не ниже 1:12800. Нормальную сыворотку крови кур,получали путём обескровливания БРР цыплят в возрасте.З дней.

2.2.3.3. Оптимизация параметров постановки непрямого варианта ИФА. В

результате проведённых исследований определён ряд параметров для оптимизации постановки непрямого варианта ИФА. Установлено, что время, необходимое для адсорбции антигена на планшетах в 0,05 М КББ рН 9,5-9,6, должно составлять 18 часов при температуре 4°С; для всех последующих этапов инкубацию компонентов, разведённых в 0,05 М трис-НС1 с 0,2 М №С1 буферном растворе рН 7,4-7,6 с 0,01 % твин-20 проводить в течение 30 минут при температуре 37°С. В качестве блокирующего раствора использовали 10% раствор нормальной сыворотки лошади. Срок хранения сенсибилизированных антителами планшет без существенной потери активности -17 месяцев при температуре 4°С (срок наблюдения). Оптимальную концентрацию антигена НБ для сенсибилизации планшет и коньюгата (КР1-) определяли для каждой партии иммунореагентов путём постановки непрямого варианта ИФА с 30 референтными специфическими сыворотками крови кур.

2.2.3.4. Определение рабочего разведения испытуемых сывороток и допустимых значений оптической плотности положительной и отрицательной контрольных сывороток. При разработке тест-системы для определения титра антител при тестировании сывороток в одном разведении первоначально определяли рабочее разведение. Были использованы результаты тестирования 35 сывороток в трёх повторностях с различным уровнем антител, предварительно опреде-

лённым в РТГА, при исследовании методом последовательных разведений в непрямом варианте ИФА. По измеренным оптическим плотностям образца (ОП), положительной (РСх) и отрицательной (NCx) контрольных сывороток рассчитывали величину (S/P) = (ОП - NCx)/(PCx - NCx) для разведений 1:200, 1:400 и 1:800 и построили отдельные линии регрессии. Результаты регрессионного анализа данны> представлены в табл.9.

Таблица 9.

Коэффициенты корреляции и стандартное отклонение для трёх отдельных разведений

Разведение Коэффициент корреляции Стандартное отклонение

1:200 0.9143 0.2323

1:400 0.9340 0.2346

1:800 0.9239 0.3239

Наиболее высокий коэффициент корреляции (R=0.9340) получился для разве дения 1:400, которое было взято в качестве рабочего. Коэффициенты уравнения соответствующие этому разведению использовали для расчёта титра антител к ви русу НБ при тестировании сывороток в одном разведении. Уравнение для расчёт« линии регрессии имело следующий вид:

LG Т= 3.639 +1.5137 * LG S/P где S/P = (ОП - NCX)/(PC* - NC*), где ОП- это измеренная оптическая плотность об разца, а РСХ и NCX- оптические плотности положительной и отрицательной кон трольных сывороток.

Полученное уравнение линейной регрессии достоверно для определённы: значений отрицательного и положительного контролей. Для определения допусти мых величин оптической плотности для контрольных положительных и отрицатель ных сывороток были проанализированы соответствующие значения оптическо! плотности положительной и отрицательной контрольных сывороток (п=20), исследс ванных в разведении 1:400. Для получения достоверных результатов реакции зна чение оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки не должно пре вышать 0.150, а значение положительного контроля должно быть не меньше 0.43£ Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки дс

пустимых значений, то результаты реакции будут считаться недостоверными и пробы Должны быть исследованы повторно.

2.2.3.5. Вычисление позитивно-негативного порога значений величины титра (Т) для качественной характеристики результатов ИФА. При определении качественной характеристики исследуемых сывороток крови по рассчитанному титру антител в ИФА за основу были взяты результаты РТГА. 109 сывороток крови кур в РТГА 1:2,1:4-1:8, 1:16 были протестированы в ИФА. Среднее значение титра для сомнительного результата оказалось равным 1:356 при доверительном интервале для Р=95% от 1:250 до 1:500. Для положительного результата средний титр специфических антител оказался равным 1:470 при доверительном интервале для Р=95% от 1:418 до 1:528.

• Сравнивая пересечение двух интервалов на числовой оси (см. рис.2)

область сомнительных область положительных

результатов результатов

Рис.2. Допустимые области величин титров специфических антител, характеризующие сомнительный и положительный результаты ИФА при тестировании проб сывороток в одном разведении

можно сделать заключение, что если титры антител в сыворотках исследуемых проб крови будут меньше или равны 1:250, то это говорит об отсутствии специфических антител к вирусу НБ. Сыворотки с титром антител, равному или большему значению 1:500, считали с достаточной вероятностью положительными. Сомнительный результат реакции характеризовали величиной интервала: 1:250 <Т< 1:500.

Результаты разработанной тест системы получают следующую качественную характеристику:

- результат отрицательный, величина Т < 1:250 (отсутствие специфических антител);

- результат сомнительный, величина Т от 1:250 до 1:500 (накопление специфических антител в количестве, не достаточном для защиты);

- результат положительный, величина Т ¿1:500 (наличие специфических антител, обеспечивающих защиту после вакцинации).

2.2.3.6. Определение корреляционной зависимости между результатами ИФА и РТГА. Было исследовано 246 проб сывороток кур с различной концентрацией специфических антител к вирусу НБ. Результаты иммуноферментного анализа (разработанной тест-системы, коммерческого набора KPL, сертифицированного на территории РФ) и реакции торможения гемагглютинации были подвергнуты регрессионному анализу с последующим вычислением коэффициентов корреляции. Коэффициент корреляции между результатами разработанной тест-системы ИФА и базовой реакции РТГА равнялся 0.80. Коэффициент корреляции между результатами, полученными с помощью коммерческого набора фирмы KPL и РТГА, составил 0.77. Коэффициент корреляции между значениями титров антител, определённых в обеих иммуноферментных тест-системах составил 0.84.

Уравнение пересчёта титра РТГА в титр разработанной тест-системы ИФА имело вид: Lg (титра ИФА)=1.9243+0.62263*1д (титра РТГА). Исходя из полученного уравнения, определены значения титров антител в ИФА, соответствующие значениям титров антител, полученных в РТГА. Полученные данные позволяют интерпретировать результаты ИФА, основываясь на результатах базовой реакции - РТГА.

На основе данных разработанной тест-системы ИФА и коммерческого набора KPL, были рассчитаны относительная чувствительность и специфичность по отношению к базовой реакции РТГА. Было исследовано 170 заведомо положительных и 76 отрицательных сывороток по результатам РТГА. Разработанная нами тест-система ИФА не уступала по чувствительности и специфичности коммерческому набору KPL.

2.2.4. Практическое применение разработанной иммуноферментной тест-системы на основе непрямого ИФА

2.2.4.1.Особенности динамики выработки антител после иммунизации цыплят живыми и инактивированными вакцинами против НБ. Была проведена однократная иммунизация цыплят 7 различными вакцинами, изготовленными из вируса НБ шт. Ла-Сота. Активность препаратов вакцин была исследована в реакции гемагглютинации, иммуноферментном анализе и титрованием на эмбрионах. На 52 день после иммунизации цыплята были исследованы в непрямом ИФА, РТГА и под-

вергнуты контрольному заражению высоковирулентным штаммом ВНБ «Т-53». Результаты представлены в табл.10.

ТаблицаЮ.

Результаты исследования вакцинных препаратов и контрольного зараже-

ния подопытных цыплят штаммом «Т-53»

Вакцина № РГА Сэндвич ИФА Титр |д эидао Ср. титр антител до заражения % защищенных цыплят

ИФА РТГА(1од2)

• 1 1:512 1:800 10,50 3471 8.92 100

2 1:1024 1:800 0 4057 9.37 100

3 1:1024 1:1600 10,50 4535 10.13 100

4 1:2048 1:1600 0 4706 9 100

5 1:8192 1:25600 11,0 4662 9.84 100

6 0 1:3200 0 4854 4.32 100

7 0 <1:100 0 2721 1.87 50

контроль 0 <1:100 0 <100 1 1

Примечание:

1-вакцина живая

2-вакцина, инактивированная аминоэтилэтиленимином в 0.1 % концентрации в течение 24 часов при 30°С;

3-вакцина, обработанная ультразвуком на установке УЗДН-А в течение 3 минут двукратно;

4-вакцина, обработанная ультразвуком на установке УЗДН-А в течение 3 минут двукратно, далее инактивированная аминоэтилэтиленимином в 0.1 % концентрации в течение 24 часов при 30°С;

' 5-вакцина живая, концентрированная в 20 раз;

6-вакцина, концентрированная в 20 раз, инактивированная путём термической обработки на водяной бане при температуре 100°С в течение 10 минут.

7- вакцина, инактивированная путём термической обработки на водяной бане при температуре 100°С в течение 10 минут.

Для изучения корреляции между результатами выявления антител к вирусу НБ в ИФА и РТГА значения титров антител были переведены в десятичные логарифмы и подвергнуты регрессионному анализу. График зависимости между титрами ИФА и РТГА у цыплят, иммунизированных живой и инактивированной вакцинами, представлен на рис.3,4.

Рис.3. Динамика накопления антител к вирусу НБ, определённая в ИФА и РТГА в результате иммунизации цыплят живой вакциной (№1)

4 3.5 3 2.5 2 1-5. 1

0.5 О

Рис.4. Динамика накопления антител к вирусу НБ, определённая в ИФА и РТГА,

в результате иммунизации цыплят инактивированной вакциной (№2)

Проведённое исследование иммунного статуса вследствие применения живы> и инактивированных вакцин против НБ в ИФА и РТГА показало, что разработанная иммуноферментная тест- система позволяет эффективно прослеживать динамику накопления специфических антител. Коэффициент корреляции между результатами ИФА и РТГА составлял 0.91-0.96. При использовании препаратов, обладающих характеристиками живых и инактивированных вакцин, пик накопления антител в ИФ£ приходился на 21-24 сутки, в РТГА на 14-21 сутки. Контрольное заражение данных

групп цыплят показало на 52 день опьгга 100% защиту против эпизоотического вируса НБ. Вакцина, изготовленная из концентрированного вируса и прошедшая термическую обработку, не проявила гемагглютинирующую и инфекционную активность, но при постановке сэндвич-варианта ИФА имела титр 1:3200 (таблицаЮ). Индуцированный данным препаратом титр антител к ВНБ, равный в непрямом варианте ИФА 1:4854 и в РТГА 4.32 1од2, обеспечил на 52 день опыта вакцинированным цыплятам 100% защиту от контрольного заражения.

2.2.4.2.0пределение защитного уровня антител против вируса НБ в ИФА.

Была определена минимальная концентрация антител к ВНБ, выявляемых в разработанной тест-системе ИФА, необходимая для защиты от заболевания при контрольном заражении цыплят, иммунизированных живой вакциной. После однократной иммунизации цыплят живой вакциной на 2, 7 и 17 день было проведено контрольное заражение штаммом ВНБ «Т-53». Значения титров антител, измеренных в ИФА и РТГА в день проведения контрольного заражения, и процент защиты дан в табл.11.

Таблица 11.

Значения титров антител в ИФА, РТГА и результаты контрольного зараже-

ния подопытных цыплят штаммом «Т-53»

Препарат № Средний титр перед заражениемА Дни после иммунизации % защищенных цыплят

ИФА РТГА(Юд2)

1 42 1 2 0

1 540 4.67 7 100

1 3310 9.28 17 100

контроль <100 1 - 0

Примечание: А - среднее значение по 25 цыплятам.

Было установлено, что на 7 сутки у группы цыплят однократно иммунизированных живой вакциной наблюдалась 100% защита при контрольном заражении. Определённый в ИФА (1:540) уровень антител к ВНБ совпадает с интерпретацией результатов реакции, заложенных при разработке данной тест-системы (1:500 и более - результат положительный, наличие специфических антител, обеспечивающих защиту после вакцинации).

Данные, полученные при разработке и испытании тест-системы, позволили разработать комплект НТД и организовать выпуск коммерческих иммунофермент-ных наборов для определения антител к вирусу НБ.

Таким образом, проведённый комплекс исследовательских работ позволил разработать диагностический набор для определения уровня антител к вирусу НБ в РТГА, тест-систему для определения активности антигена вируса НБ на основе непрямого сэндвич-варианта ИФА и иммуноферментную тест-систему для количественного определения антител к вирусу НБ при исследовании сывороток крови кур в одном разведении. Результаты количественного определения антител к вирусу НБ с применением разработанных тест-систем свидетельствуют о том, что данное направление является стратегически важным аспектом эффективной диагностики ньюкаслской болезнью.

3. ВЫВОДЫ

1. Разработан диагностический набор препаратов для определения уровня антител к вирусу НБ в РТГА, в состав которого, помимо специфических, вошли неспецифические компоненты, позволяющий получать воспроизводимые результаты независимо от времени и условий постановки реакции.

2. Разработана тест-система на основе непрямого сэндвич-варианта ИФА для выявления и определения активности препаратов антигена вируса НБ, используемых для производства вакцин и диагностических наборов. Показана его специфичность по сравнению с РГА, что позволяло выявить антиген вируса НБ в смеси с другими гемагглютинирующими вирусами.

3. В результате разработки тест-системы на основе непрямого варианта ИФД для выявления и количественного определения антител к вирусу НБ при тестировании. сывороток в одном разведении были определены рабочее разведение, оптимальные значения оптической плотности контрольных сывороток, вычислен позитивно-негативный порог для качественной оценки результатов реакции. Параметрь тест-системы были введены в программу учёта, хранения и обработки результатоЕ «СИНКО-ИФА», разработанную во ВНИИЗЖ.

4. Разработанная методика очистки и концентрирования вируса ньюкаслской болезни, позволила получать препарат антигена с активностью в РГА 131од2, в ИФ^ 1:25600 и концентрацией белка 3-5 мкг/мл.

5. Установлено, что коэффициент парной корреляции между результатами полученными с помощью разработанных тест-систем ИФА и РТГА равен 0.80, а между коммерческим набором фирмы КР1. (США) и набором РТГА - 0.77. Предлагав

мая отечественная иммуноферментная тест-система не уступала по чувствительности и специфичности сертифицированному на территории РФ коммерческому набору фирмы КР1-.

6. Изучена динамика выработки антител после применения вакцин из штамма Ла-Сота с использованием тест-систем ИФА и РТГА. Установлено, что однократная иммунизация живыми и инакгивированными вакцинами обеспечивала цыплятам на 52 день 100% защиту от заболевания при контрольном заражении.

. 7. С помощью разработанной иммуноферментной тест-системы определен защитный уровень гуморальных антител на ранних сроках после иммунизации живой вакциной, который составил 1:540 на 7 день после вакцинации.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагается нормативно-техническая документация:

- на «Набор препаратов для определения уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации» Технические условия 9388-04600008064-39 и Временное наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 1999г.;

- на «Набор для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни иммунофер-ментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» Технические условия 9338-023-00495527-00 и Временное наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 2000г.

Разработаны и утверждены директором ВНИИЗЖ:

- «Инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни кур иммуноферментным методом»;

- «Методические указания по выявлению и определению активности антигена вируса ньюкаслской болезни в непрямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа».

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Манин Т.Б., Старов С.К., Дрыгин В.В., Мудрак Н.С. Определение напряжённости иммунитета против нькжаслской болезни с помощью непрямого варианта ИФА и РТГА//Диагн., проф. и меры борьбы с особо опасными, экзотическ. и зооантропоноз. бол. ж-ных: Сб. статей Междунар. науч.-практ. конф.-Покров, 2000.-С. 170-172.

2. Манин Т.Б., Старов С.К., Дрыгин В.В., Мудрак Н.С. Применение иммунофермент-ной тест-системы для выявления и количественной оценки антител к вирусу нью-каслской болезни для контроля напряжённости поствакцинального иммунитета// Роль вет. науки в развитии жив.-ва: Мат. Междунар. науч.-произв. конф., поев. 75-летию КазНИВИ.-Алматы,2000.-С. 142-144.

3. Манин Т.Б., Старов С.К., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В. Разработка тест-системы на основе непрямого сэндвич-варианта ИФА для контроля активности антигена при производстве вакцин против нькжаслской болезни//Акт. пробл. патологии с.-х ж-ных: Матер. Междунар. науч.-практ. конф.-Минск, 2000.-С.151-152.

4. Манин Т.Б., Старов С.К., Дрыгин В.В., Мудрак Н.С., Маркина М.И. Разработка им-муноферментной тест- системы для выявления и количественной оценки антител к вирусу нькжаслской болезни методом одного разведения//Достижения молодых учёных - в ветеринарную практику: Матер. конф.-Владимир, 2000.-С. 165-170.

5. Манин Т.Б., Старов С.К., Дрыгин В.В., Черняева Т.Ю. Серологический мониторинг за парамиксовирусными инфекциями 1, 2 и 3 серотипов с помощью реакции торможения гемагглютинации//Достижения молодых учёных - в ветеринарную практику: Матер. конф.-Владимир, 2000.-С.171-172.

Отпечатано на полиграфической базе отдела координации научных исследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ Тираж 100 экз.; ноябрь 2000г.

Актуальность темы. Ньюкаслская болезнь - высококонтагиозная вирусная инфекция птиц, главным образом куриных, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом, множественными точечными кровоизлияниями и поражениями внутренних органов. Гибель птиц, особенно молодых, может достигать 100%. По классификации Международного Эпизоотического Бюро НБ считается особо опасным заболеванием и отнесено в список «А».

Впервые зарегистрированная в 1926 году в Англии (Doyle Т.М.) ньюкаслская болезнь в течение XX столетия нанесла громадный экономический ущерб птицеводству всего мира (36,46,81). В настоящее время, несмотря на внушительные затраты на изучение молекулярных основ патогенности возбудителя, диагностику и специфическую профилактику НБ, вспышки заболевания регистрируются почти во всех странах мира. По данным МЭБ в 1999 году официально зарегистрировано 2709 вспышек ньюкаслской болезни более чем в 100 странах мира. В Российской федерации в 2000 году было зарегистрировано 3 вспышки заболевания (147,148).

Основополагающую роль в борьбе с инфекцией играет своевременная диагностика и последующие меры профилактики. Принятая в мире схема ретроспективной диагностики предусматривает выявление специфических антител с помощью традиционного серологического теста -реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментного анализа (ИФА). В Российской Федерации предусмотрено применение РТГА, причём в настоящее время актуальным вопросом является повышение воспроизводимости результатов теста, путём создания стандартных у диагностических наборов на базе данной реакции.

Анализируя состояние ретроспективной диагностики НБ в мире, нельзя не отметить внедрение в ветеринарную практику современных серологических методов, в частности ИФА. Основываясь на использовании антител, конъюгированных с различными ферментами, иммуноферментный анализ не уступает, а часто и превосходит стандартные методы диагностики по чувствительности и специфичности. Быстрота получения, 6 воспроизводимость и автоматизированный учёт результатов реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают ИФА наиболее эффективным, удобным, экономичным и выгодным методом для массовых серологических исследований. В зарубежной ветеринарной практике широко используются коммерческие иммуноферментные тест-системы, предусматривающие исследование сывороток в одном разведении, позволяющие определять уровень материнских антител, напряжённость поствакцинального иммунитета, корректировать кратность повторных иммунизаций, а также определить возможный контакт с «полевым» вирусом. Существующие диагностические наборы обладают различной интерпретацией качественной оценки напряжённости иммунитета (61,109,125).

В научной литературе имеются данные о возможности использования ИФА для определения уровня антител, обеспечивающих 100% защиту от заболевания при контрольном заражении (193). Указанные выше преимущества создали предпосылку для разработки и использования диагностической тест-системы ИФА, с помощью которой возможно выявление и количественное определение уровня антител к вирусу НБ при ретроспективной диагностике, обеспечивающих защиту при контрольном заражении.

Современное производство вакцин требует разработки специфичных и точных методов оценки качества вирусного сырья. По данным литературы для этой цели возможно использование сэндвич-варианта ИФА для прямого обнаружения и определения активности различных вирусов, вызывающих болезни птиц. Реакция гемагглютинации, применяемая в настоящее время для контроля качества антигенного сырья при производстве вакцин и диагностических наборов, при высокой чувствительности не обладает специфичностью по отношению к гемагглютинирующим вирусам.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы явилась разработка диагностических наборов ИФА и РТГА для выявления и количественной оценки специфических антител в сыворотках крови кур, позволяющих проводить массовые исследования птицепоголовья при 7 ретроспективной диагностике НБ, оценивать состояние гуморального иммунитета и способных измерить уровень антител, обеспечивающих защиту птицы от заболевания при контрольном заражении.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: -разработать методику очистки и концентрации вируса ньюкаслской болезни;

-разработать диагностический набор для определения уровня антител к вирусу НБ в РТГА;

-разработать иммуноферментную тест-систему для определения активности вируса НБ в аллантоисной жидкости, используемой для производства вакцин и диагностикумов, и провести сравнительный анализ данных, полученных с помощью ИФА и базовой реакции РГА;

-разработать иммуноферментную тест-систему для выявления и количественного определения антител к вирусу НБ в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении и провести сравнительный анализ данных разработанных тест-систем ИФА и РТГА с коммерческим набором КР1 (США), сертифицированным на территории РФ;

-изучить корреляционную зависимость результатов разработанных тест-систем РТГА и ИФА при изучении динамики накопления антител, вследствие применения живых и инактивированных вакцин против НБ;

-определить уровень антител в ИФА, обеспечивающий 100% защиту птицы от заболевания при контрольном заражении.

Научная новизна. Впервые в России разработана иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител к вирусу НБ в сыворотках крови кур при тестировании их в одном разведении. Данная тест-система предусматривает количественное определение антител по уравнению регрессионной зависимости, осуществляемое автоматически с использованием компьютерной программы для регистрации, обработки, хранения результатов иммуноферментного анализа в ветеринарии "СИНКО-ИФА", разработанной во ВНИИЗЖ.

Разработана тест-система на основе непрямого сэндвич-варианта ИФА для определения активности вируса НБ в вируссодержащем сырье при 8 производстве диагностикумов и вакцин против НБ. Высокая специфичность ИФА по сравнению с РГА позволяет выявлять и определять концентрацию вируса НБ в смеси с гетерологичными вирусами, используемой при производстве ассоциированных вакцин.

Разработан набор для определения уровня антител к вирусу НБ в РТГА. Высокая специфичность, активность и стабильность при хранении компонентов разработанного набора позволила повысить воспроизводимость результатов реакции.

Изучена диагностическая ценность ИФА по отношению к РТГА.

Определён уровень антител в ИФА, обеспечивающих 100% защиту птицы от заболевания при контрольном заражении.

Практическая значимость. Утверждены Департаментом ветеринарии нормативно-технические документы на "Набор препаратов для определения уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации" и "Набор для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении". Подготовлены технические условия и временные наставления по применению разработанных наборов. Данные тест-системы успешно прошли широкие производственные испытания и применяются для ретроспективной диагностики НБ и контроля напряжённости поствакцинального иммунитета в ветеринарии.

Разработаны и утверждены директором института "Методические указания по выявлению и определению активности антигена вируса ньюкаслской болезни в непрямом сэндвич-варианте иммуноферментного о анализа" и «Инструкция по изготовлению и контролю диагнюстщ/мов и наборов для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни кур иммуноферментным методом».

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Учёного Совета ВНИИЗЖ в 19972000 годах, на научной конференции молодых учёных (Владимир, 2000г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ. 9

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, иллюстрирована 19 таблицами и 22 рисунками. Список использованной литературы включает 196 источников, из них 163 иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту:

- набор для определения уровня антител к вирусу НБ в РТГА;

- иммуноферментная тест-система для выявления и определения активности антигена вируса НБ в вируссодержащем сырье;

- иммуноферментная тест-система для выявления и количественного определения антител к вирусу НБ при тестировании сывороток в одном разведении с использованием компьютерной программы учёта и хранения результатов "СИНКО-ИФА", разработанной во ВНИИЗЖ;

-результаты сравнения ИФА и РТГА при ретроспективной диагностике НБ, вследствие применения живых и инактивированных вакцин

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1997-2000гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, г.Владимир).

Автор выражает искреннюю благодарность к.б.н. Мудрак Н.С., к.б.н. Волковой М.А., к.б.н. Оковытой Т.В., к.б.н. Фалиной Г.М., к.б.н. Кожаевой Г.И., к.б.н. Сарбасову А.Б., д.б.н. Пономарёву А.П., Зинковскому Ю.В., Ирзе В.Н. - за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы и их обсуждение.

10

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Разработан диагностический набор препаратов для определения уровня антител к вирусу НБ в РТГА, в состав которого, помимо специфических, вошли неспецифические компоненты, позволяющий получать воспроизводимые результаты независимо от времени и условий постановки реакции.

101

2. Разработана тест-система на основе непрямого сэндвич-варианта ИФА для выявления и определения активности препаратов антигена вируса НБ, используемых для производства вакцин и диагностических наборов. Показана его специфичность по сравнению с РГА, что позволяло выявить антиген вируса НБ в смеси с другими гемагглютинирующими вирусами.

3. В результате разработки тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и количественного определения антител к вирусу НБ при тестировании сывороток в одном разведении были определены рабочее разведение, оптимальные значения оптической плотности контрольных сывороток, вычислен позитивно-негативный порог для качественной оценки результатов реакции. Параметры тест-системы были введены в программу учёта, хранения и обработки результатов «СИНКО-ИФА», разработанную во ВНИИЗЖ.

4. Разработанная методика очистки и концентрирования вируса ньюкаслской болезни, позволила получать препарат антигена с активностью в РГА 131од2, в ИФА 1:25600 и концентрацией белка 3-5 мкг/мл.

5. Установлено, что коэффициент парной корреляции между результатами, полученными с помощью разработанных тест-систем ИФА и РТГА равен 0.80, а между коммерческим набором фирмы КР1 (США) и набором РТГА - 0.77. Предлагаемая отечественная иммуноферментная тест-система не уступала по чувствительности и специфичности сертифицированному на территории РФ коммерческому набору фирмы КР1.

6. Изучена динамика выработки антител после применения вакцин из штамма Ла-Сота с использованием тест-систем ИФА и РТГА. Установлено, что однократная иммунизация живыми и инактивированными вакцинами обеспечивала цыплятам на 52 день 100% защиту от заболевания при контрольном заражении.

7. С помощью разработанной иммуноферментной тест-системы определен защитный уровень гуморальных антител на ранних сроках после иммунизации живой вакциной, который составил 1:540 на 7 день после вакцинации.

102

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагается нормативно-техническая документация:

- на «Набор препаратов для определения уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации» Технические условия 9388-046-00008064-99 и Временное наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 1999г.;

- на «Набор для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении» Технические условия 9338-023-00495527-00 и Временное наставление по применению, которые утверждены Департаментом ветеринарии РФ в 2000г.

Разработаны и утверждены директором ВНИИЗЖ:

- «Инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни кур иммуноферментным методом»;

- «Методические указания по выявлению и определению активности антигена вируса ньюкаслской болезни в непрямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа».

103