Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Токсин Pasteurella multocida серологического варианта Д и его свойства

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧКОЧ'ССЛЕДОВАТЕЛЬСХИЙ ЖСТИТУТ ЭКСПЕР^ЕНТАЛЬНОЙ

ВЕТЕРИНАРИИ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

КАЛМЫКОВА ЛЩ1.ША ИВАНОВНА

ТОКСИН Pagteшгвlla пи1*ос1<1а СЕРОЛОГИЧЕСКОГО ВАРИАНТА Л И ЕГО СВОЙСТВА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и гсялунологая

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

¡,'осхва - 1992

Работа выполнена в лаборатории бактериологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко л лабораторий молекулярных основ патоген-ности бактерий Каучно-исследоьателъского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАГ-ЕН.

Научные руководители: кандидат ветеринарках наук

Э.А.Сегидевич, доктор биологических наук, профессор Ю.В.Езепчутс

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Г.А.Гродева (В'ЛЭВ)

доктор биологических наук ;.!.Я.Ярцев (ВНЖЕиШ)

Ведущее учреждение - Московская ветеринарная академия дм. К.И.Скрябина

Защита состоится " ЗО " 'г/ЮЯ'-г_ 1992г.

в ^^ час» на заседании Специализированного совета К.020.28.01. по защите кандидатских диссертаций во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.

Адрес: 103472, Москва, Кузьминки, ВИЗЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке

ВИЭВ.

Автореферат разослан " " 1992г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат ветеринарных наук

Ф.Г.Терэшков

л

ссвртациЯ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной иа актуальных проблем современной ветеринарии являются пастерсллезц сельскохозяйственных кнвотных. Пастереллы вызывают у животных и птиц ряд заболеваний, отличающихся по локализации, клиническому проявлению и характеру течения. Наибольший экономический ущерб наносят гемосептицемии и пневионийные пастереллезы, вызываемые разными серологическими вариантами р.пц11;оо1<1а и Р.&аето1у1;1оа.

Для профилактики пастереллезов сельскохозяйственных животных и пищ за рубежом и в нашей стране предложены корпускулярные живые и убитые вакцины. Однако эти вакцины часто обладают повышенной реак-тогеняостью и не всегда обеспечивают достаточно эффективную профилактику указанных болезней. В связи с этим разработка компонентных (химических) вакцин, приготовленных на основе протективных антигенов патогенных кикроорганизмов^до сих пор остается актуальной задачей. В отлично от корпускулярных, компонентные вакцины создают защиту против определенных патогенных субстанций возбудителя и отличаются меньшей реактогенностью.

Факторы патогенности с инвазивной функцией и функцией защиты от фагоцитоза ыокно объединить в одну группу факторов, обеспечивающих развитие начальной, часто клинически не проявляющейся, стадии инфекционного процесса. В отличие от указанных факторов патогенноо-ти, на принимающих непосредственного участия в развитии патологического процесса, но необходимых для возникновения инфекции, третья группа факторов патогенности ответственна за формирование специфического патологического синдрока. Эта группа включает в себя токсиг ны различной природы и разнообразного биологического действия.

Б начале носьмидесятых годов за рубекоы появился ряд публика-

ций, посвященных изучению биологических и физико-химических свойств токсина p.nultocida серологического варианта Д, однако к настоящего времени этот токсин изучен крайне недостаточно. В нашей стране исследования в данном направлении не проводились, что обосновывает актуальность и необходимость проведения таких исследований.

Цель к задачи .исследований

Целью настоящей работы явилось наделение токсина Р.cultocida серологического варианта Д, а также определение возможности исполь-, зования выделенного препарата в качестве протективног'о антигена для специфической профилактики пастереллезов сельскохозяйственных животных.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

I. Получить токсин Р.multocida серологического варианта Д и изучить динамику накопления его в жидких питательных средах.

. 2. Отработать оптимальные условия выделения и очистки токсина.

3. Изучить биологические и физико-химические свойства токсина на разных стадиях очистки.

4. В опытах на мышах изучить антигенные и имцуногеиные свойства токсина.

5. Получить антитоксические сыворотки и изучить их нейтрализующие к превентивные свойства на лабораторных животных,

6. Показать принципиальную возможность использования выделенного токсина в качестве протективного антигена.

Научная новизна работы

Выделен токсин г.multocida серологического варианта Д, изучена динамика его накопления в жидких питательных средах при

культивировании в лабораторных условиях. Отработана оптимальная схема выделения и очистки токсина, изучены его фи з ;ж о-хж.игч е с кк е свойства. Получены антитоксические сыворотки и изучены их нейтрализующие и превентивные свойства. В опытах на тдллах изучены ищу-ногенные свойства токсина и показана возможность включения его в состав компонентных вакцин»

Теоретическая и практическая ценность работы.

С учетом факторов патогенности пастерелл обоснованы критерии подбора производственных штатов, необходимых для создания определенных видов биологических препаратов. Проведенная работа позволяет внести коррективы в технологию изготовления вакцин и их контроль. Рузультаты проведенных исследований служат научны?.! обоснованием для создания компонентных биологических препаратов на основе факторов патогекдаогя пастерелл.

Апробация полученных результатов

Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценку на заседаниях Ученого Совета Всероссийского науч-но-исследовательсксго института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Ковалеяко л качестве годовых отчетов за. 1988 и 1989 гг и на научных конференциях молодых ученых ВИЭВ "Актуальные проблемы инфекционной патологии животных и ветеринарной биотехнологии". (1989, 1990 г.), на Всесоюзной научно-технической конференции "Профилактика и лечение болезней молодняка сельскохозяйственных животных" (г. Воронеж, 1991).

Публикация результатов исследований

По материала*.! диссертации опубликованы 4 научные статьи.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и Еключает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, еыводы, практические предложения и список литературы. Работа щшктрироЕана 20 таблицами, 15.рисунками. Список литературы содержит 234 источника, в том числе 197 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИСОЩОВШЯ

Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории бактериологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Д.Р.Коваленко и в лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий Научно-исследовательского шгститута эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Галилеи АМН РСССР с 1987 по 1990 год.

В работе использовано 5680 беспородных белых мышей, 250 морских свикок-альбиносоа и 6 кроликов.

. —£ляг-.выделения токсического материала использованы игаш Р.multo oída серологического варианта Д: Т-ВО и 8803, изо-

лированные от свиней, больных ппеЕмонийным пастереллеэом.

В качестве питательной среды для культивирования пастерелл использовали бульон Хоттингера с добавлением 1055 нормальной сыворотки крови лошади и синтетическую среду 199. Посевы инкубировали в термостате при 37°С с аэрированием на шуттель-аппарате (240 об/ мин) в течение 24 ч. По окончании культивирования супернатант отделяли от бактериальных клеток путей центрифугирования при 5500 g в течение 30 шн., с последующей стерилизующей фильтрацией супер-натанта через шллшюровне фильтры типа gs - 0,22 ;ясм.

Стерильность кульгуральных супернатантов контролировали посевом на агар к в бульон Хоттингера.

Концентрирование токсина осуществляли путем высаливания сульфатом аммония (35, 50 и 70$ насыщение, рН 6,0, 7,0, 8,0), кислотным осаждением е присутствии гексаметафосфата натрия, а также ультрафильтрацией на мембранах " Aaicon " РМ—10 и XJ.Î-50.

Очистку токсина проводили на Ультрагеле АсА 44 (" LK3 - Pharmacia"» Швеция), ураЕконепекном 0,05 M трис-HCI буфером рН 7,4, содержащим 0,2 M àaCI и 2,5 мМ Э£ТА в колонке 2,6x82 см. Белок элвировали тем же буфером со скорость» 18 мл/ч и собирали фракции объемом 4,5 мл. Каждую фракцию длализогали против 0,01 'Л трис-HCI буфера, тестировали на наличие дерконекротической и летальной активности введением морским свинкам и шдам. фракции, содержащие токсин, лиофилизировали.

Последующую очистку токсина проводили хроматографией на Сефакркле 5 - 200 С ïkamscia СЕецня), уравновешенном .

0,05 M трис-HCI буфером рН 7,4, содержащим 0,2 .M N aCI, з колонке размером 1,6x70 Элвдив проЕодилк тем ze буфером со скоростью 10 мл/ч. объем фракций составляя 2,5 мл. Каждую фракцию после диализа против 0,01 M трис-HCI буфера последовали на токсичность.

Летальную активность токсина тестировали на мышах. С этой целью мыаам вдутрибркшнно вводила 0,5 мл исследуемого материала и его двукратных разведений. Учет проводили яо количеству павсих мылей в течение 48 ч. Величину ДДзд рассчитывали по методу Кербера. Удвоенные обратнопропорциональныз значения разведений исследуемого токсина, вызывающего гибель 50% животных, приравнивали к количеству единиц в I мл испытуемого образца.

Дермонекротичесную активность токсина определяли в опытах на морских сЕинках. Для этого токсин и его разведения вводили морским сниякам внутрикохно е объеме 0,2 ил. За дермонекротичес-кий титр принимали наибольшее разведение токсина, вызывайте в

течение 46 ч кожную реакцию, проявляющуюся в ви^е выраженной эритемы или струпа диаметром не менее 10 мм.

Содержание белка в образцах токсина определяли по методу И.Bradford (1976).

Электрофорез проводили в вертикальной пластине ПААГ, содержащего 0,1% додецклсульфата натрия ( tf.iaeamU , 1970).

Молекулярную массу токсина определяли методом диск-электрофореза. В качестве маркеров использовали стандартные белки с определенной молекулярной массой (" iharnacia Швеция).

Чувствительность токсина к температуре изучали прогреванием препарата в водяной бане при 37, 56, 70°С в течение 30 и 60 мин. Обработку трипсином проводили, инкубируя токсин с кристаллическим реактивом при 37°С в течение 2 ч. Концентрация фермента в пробе составляла 0,25 и 0,5$. При обработке формальдегидом последний добавляли к токсину до конечной концентрации 0,25, 0,5, 2,0$ и вццеркиЕали в термостате при 37°С в течение I ч. Глутаровый альдегид вносили в пробы токсина до конечной концентрации 0,4, 4,0, 40,0 мМ и инкубировали при 37°С в течение I ч. Токсичность инак-тивированных образцов проверяли на мышах и морских свинках.

Получение антитоксических сывороток к токсину, концентрированному сульфатом аммония, к счищенному препарату проводили иммунизацией кроликов породы Шиншилла. Токсин, инактивировашши 0,25% формальдегидом, смешивали с равным объемом неполного адыъ ванта Фрейнда н в объеме 1,0 ш вводили подкошю. При иммунизации частично очищенным препаратом хаадая доза содержала 1,0 иг белка. Интервал меаду инъекциями составлял 3-4 дня. Всего проведено 13 инъекций. При икмунизащш ззвсокоочпщеннда токсином aas-дая доза содержала 30 мкг/мл белка. Весь цикл тонизации включал 8 инъекций с интервалом 6-7 дней. В Ероцзссе пмчунизацип у sn-вотиых из краевой уиной вепы бралп кровь и титры антител в сиво-

ротке исследовали е реакция гель-диффузии. АнтисыЕоротки, полученные к концентрированному сульфатом аммония и очищенному препарату, имели титры 1:16.

Способность антитоксических сывороток нейтрализовать активность токсина изучали в опытах на ¡¿шах и морских сьинках. Образцы сыЕоротки разводили физиологическим растЕором до 1:64, после чего в кавдую пробирку добавляли равный объем токсина с дермонек-ротическим титром 1:64 и инкубировали при 37°С в течение I ч, затем смесь вводили гиЕоткык. За нейтрализующий титр принимали наи-вкссее разведение сыворотки, предотвращающее гибель мыпей и нейт-ратизуэдее некротические изменения в козе морских свикок.

При изучении превентивных свойств антитоксических сывороток ¡асам подко.?ло еводили образцы натиЕкой и разведенной до 1:64 сыворотки, контрольные животным делали инъекции нормальной кроличьей сыЕорстки. Через сутки опытных и контрольных "-квотных заражали 5, 10, 20 ЛДзд культуры пастерелл или гомологичного токсина. Учет проводили по количеству павших и выкиезих мышей.

С целью изучения икмуяогенных сеойсте токсина были проЕе-дены две серии опытое, в которых мысей технизировали токсином, клетками пастерелл и смесью указанных компонентов. Б перьом случае неочищенный токсин икактивиройали 0,25$ формальдегида, смешивали с равным объемом неполного адъкванта Фрейнда. В I мл препарата со дергалось 750 мкг белка. Во втором случае антиген готовили из взвеси пастерелл, имеющей концентрацию 20 млрд. микроб, кл/мл, добавляли 0,2555 формальдегида и смеиивади с равным объемом неполного адъюваята Фрейнда. В I глл вакцины содержалось 10 млрд. микроб, кл. Комбинированный антиген состоял из первых деух и содержал 750 мкг/мл токсического белка, 10 млрд. микроб. кл/мл и неполный адъвЕант Фрейнда.

Для изучения жядуногенкых свойств очищенного токсина его переводили в анатоксин, э:лульгировали в равном объеме неполного адъ-юванта Фрейда. Концентрация белка в препарате составляла 5 мкг/мл. Каждый образец антигена вводили мылам подкожно е объеме 0,5 мл. Через 35 дней кивоткых разбивали на группы и заражали внутрибрк>-ш'инно 5, 10, 20 ЛДзд культуры пастерелл или вводили 5, 10, 20 ЛДзд гомологичного токсина. В течение 10 дней учитывали количество выживших и павших мышей.

Статистическую обработку результатов проводили по методу Кербера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Изучение способности к токспкообразованию Р.гшИогл йа серологического варианта Д и динамика накопления токсина в яилких питательных средах

В первом опыте на мышах изучили наличие летальности супер-натантов культур пастерелл указанных штаммов, выращенных в бульоне Хоттингера при культивировании в двух режимах: в стационарных условиях и при непрерывном встряхивании. Установлено, что в обоих случаях культуры продуцировали токсин, обладающий летальностью для мышей, однако культивирование пастерелл при постоянном встряхивании обеспечивало более быстрое накопление токсина в питательной среде: через 6 ч в супернатанте содержалось 9 ЛДзд /ш, а через 20 ч - 64 ЛД^/мл токсина. В стационарных условиях активность токсина в те газ промежутки времени характеризовалась соотвественно 2 ДП^/ш и 24 ЛД^/ыл.

В опытах на морских свинках было установлено, что супернатан-ты помимо летальности обладали еще к дермонекротичвской активностью. Титры дерыонекротпческой активности тага® были выие в куль-

турах, выращенных при непрерывном встряхивании.

Таким образом показано, что культуры Р.пнииос^а серологического варианта Д продуцируют токсин, вызывавдй летальный и дермонекротическяй эффекты.

Наряду с бульоном Хоттингера для продукции токсина пастерел-ламл была испытана синтетическая среда 199. На этой среде токсин обнаруживали в фильтратах уже через 4 ч инкубации, а максимальное его накопление отмечалось через 20 ч культивирования. Более продолжительное выращивание микробной культуры не приводило к увеличении содержания токсина в среде. Таким образом показано, что ток-синообразование у пастерелл происходит при культивировании как на белковых, так и безбелковьд питательных средах.

Б специальных опытах с лизатами клеток, полученными в результате ультразвуковой дезинтеграции пастерелл (20 кГц, 10 мин.), было установлено, что часть токсина находится в связанном с клеткой состоянац. Однако, по данным биологического тестирования количество секретируемого токсина приблизительно в 10 раз превышает количество связанного токсина. В окружающую среду переходит около 32 тыс. летальных доз и 80 тыс. дершнекротических доз токсина, а в бактериальной клетке остается соответственно 3,2 и 8,0 тыс. доз токсического материала.

Проведенные исследования позволяют полагать, что токсин, продуцируемый Р.ти11;ос1аа серологического варианта Д, су-

ществует в двух формах: в виде внеклеточного токсического продукта (большая часть) а токсического компонента, связанного с бактериальной клеткой.

Оптимизация условий конкенттатювания токсина р.т^Ипм ¿п

серологического варианта Д

Концентрирование и первичную очистку токсина, содержащегося в супернатанте, проводили нескольким! способами: высаливанием с

. помощью сульфата аммония, кислотным осадденлем в присутствии гек-саметафосфата натрия и методом ультрафильтрами.

Для изучения полноты осадцекяя токсина использовали следующие варианты насыщения сульфатом аммония: 3550^, 7Cf?í, осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 1/20 части первоначального объема.

Биологическую активность концентрированного материала тестировала по летальности на мылах. Выход токсина пра 35% насыщении составил 16 ДЦдоА'Л, при 5СЙ - 32 XJ^q/vji, а при 70£ - 64 ДЦдо/мл. Полное насыщение сульфатом аммония (10052) к увеличению выхода ток-сана не приводило. Таким образом, концентрация равная 7С$ насыщения обеспечивала наибольший выход активного штериала.

Одним из важных условий, влияющих на выход токсина при высаливании его сульфатом аммония, оказалась концентрация водородных ионов (рН). Исследована полнота осавденая токсического штериала при lOfo насыщении и рН 6,0, 7,0, 8,0. При рН 6,0 активность токсина характеризовалась величиной 64 ЛЛ^г/ь-л, при рН 7,0 - 126 ЛДэдА'л и при рН 8,0 - 384 Дйдд* Таким образом, выход активного штериала в щелочной среде (рН 8,0) был в три раза выше,чем в нейтральной (рН 7,0) и в шесть раз выше, чем в кислой.

Опыта по первичной очистке и концентрированию токсина гвкса-метафосфатом натрия фактически не дали положительных результатов. Активность концентрированного гегсаметафосфатом натрия токсина составляла лииь 2 ДС5с/ш. Это подтверждает ранее установленный нами факт, что кислая среда неблагоприятна для извлечения ц концентрирования токсина.

Испытания, физического метода концентрирования с использование:,; ультрамембран марка " Anicon типа R.Í-I0 я Ш-50 показала, что независимо от типа' используемой мембраны выход токсического материала существенно увеличивался далее по сравнению с высаливанием сульфатом аммония и составляет 512 ЛД^ в I мл концент-

рированного материала.

Изучение летальности токсина P.multocida серологического варианта Л нта разных способах вподания мысам

С целью выбора наиболее чувствительного способа тестирования летальности токсина концентрированный сульфатом ai.z-.oicm токсин и его двукратные последовательные разведения в дозе 0,5 мл вводили мышам разными способами: внутрибрюшнно, подко;лю и внутривенно.

Установлено, что токсин, введенный любым из указанных способов вызывал летальный эффект. Концентрированный токсин, введенный внутрибрюшнно в разведении 1:16, вызывал гибель всех етвотгак, а в разведении 1:64 погибало 8 из 10 опытных илзеЯ.(8СЙ). При вну- i тривенном введении полную гибель мыаей вызыват только неразведен-ный токсин. После разведения его в два раза погибало 9 из 10 мышей, а в разведении 1:64 - 4 из 10 животных. При подконном введении неразведанный токсин не вызывал гибели всех мышей, а в разво-денип 1:8 погабало 2 из 10 яавотных, токсин, разведенный в 16 раз не вызывал гибели мыпей.

Таким образом, установлено, что для оценки летального действия токсина целесообразнее использовать метод интраператонеально-го введения.

. Сохраняемость частично очищенного токсина P.Kuitoolda серологического варианта Д

На порвопачальном этапе работы была установлена высокая лабильность токсина, сопровождающаяся утратой его биологической активности при хранении, В связи о этом было предпринято исследование по изучению агмопения активности токсина в зависимости от условий культивирования ? .imlto dda серологического варианта Д и сроков ого хранения прп различных pozmrax.

Концентрированный сульфатом аммония токсин разделили на три части и первую хранили в холодильнике при 4°С, вторую заморозили и хранили при - 18°С, треть» подвергли лиофилизации и хранили при 4°С. Активность токсина изучали на мылах и морских свинках каждые 5 дней, а с 4 по 9 месяц хранения ежемесячно.

Установлено, что препарат, полученный на 199 среде, помещенный в холодильник при 4°С, за 5 дней хранения снижал летальность с 128 ЛД^о/мл до 32 ЛД-^оЛ'л. Спустя 10 дней активность падала до 4 ДЦ|0о/ыл, а к 15 дню хранения токсин полностью инактлвировал-ся. Сндкекле дермонекротической активности токсина в процессе хранения полностью совпадало с утратой летальных свойств. Несколько дольпо сохранялся токсин при - 18°С. В этих условиях в течение первых 25 дней активность оставалась на исходном уровне (128 ДЦ^эд /мл, 320 ЕЦ^оо/мл), а к 35 дню наблюдения она снижалась приблизительно в 2 раза. Токсин, хранившийся при - 18°С, только через 4 месяца утрачивал летальную н дермонекротичеекуг активность.

Лаофилазировакный токсин, полученный на синтетической среде, сохранял токсичность на исходном уровне на протяжении 2 месяцев. Затем активность токсина постепенно снижалась до полного исчезновения через 5 месяцев хранения.

Токсин, полученный на бульоне Хогтингера и хранившийся в холодильнике при 4°С за 5 дней снижал летальность с 128 ДЦздф/кд до 64 ДЦэдо/ыл и дерыонекротическуп активность с 320 Жю^/ш до 160 ЗДэдс/мл. Через 15 дней токсичность препарата составляла 4 ДД100/ыл и 10 ВД|00/мл, а к 25 дню хранения при 4°С токсин инакти-Бяровался полностью. . ,

Токсин, полученный в бульоне Хогтингера и хранившийся в замороженном состоянии, не изменял активности в течение 2,5 месяцев, через 3,5 месяца активности падала в 2 раза, а к 5 месяцу в I мл содер.талось 16 ДД^о по легальной и 40 ВД200 по дермонекроти-

ческой пробе. Через 8 месяцев установлено полное отсутствие активности в препарате токсина. Лио'Уллззярованшй токсин сохранял активность на исходном уровне в течение 7 месяцев, затем к 8 месяцу биологическая активность токсина снизилась в 2 раза и осталась на уровне 64 JUjqqAut и 160 EÍjqq/мя до 9 месяцев (срок наблюдения)»

Проведенные исследования позеолстт заключить, что при различных способах хранения токсин, полученный из культуры multocida серологического варианта Д с использованием белковой среды (бульон Хоттингера), дольше сохраняет биологическую активность по сравнении с токсином, приготвленнкм на безбелковой среде 199. Кроме того, установлено, что наиболее благоприятной для хранения токсина является ллофилнзированная ¿орма препарата.

Физнко-хя?.пческяэ свойства токсина J.auitooida серологического варианта Д

При изучении физико-химических свойств токсина установлено, что токсин не изменял активности после прогревания при 37°С (30 и 60 шн.), оказался нечувствительным к нагревании до 56°С в течение 30 минут, однако увеличение времени контакта до I ч приводило к спиления его летальной з дермонекротической активности на 50$. Полную потерэ токсичности наблэдала после прогревания препарата при 70°С в течение 30 минут.

• Обработка трипсином в концентрации 0,25$ сопровождалась частичным уменьшением активности токсина. Из 5 опытных мышей погибало 2 и дермонекротяческай титр снижался с 1:64 до 1:16. Обработка 0,5# трипсином полностью инактдЕировала токсин.

Глутаровяй альдегид в концептращга 0,04 jfA не изменял летальную и дермопэкротцческув активность токсина. Увеличение концентрации до 4,0 приводило к снижении токсичности препарата. Значите-но снижалась активность токспна после обработки глутаровкм альдо-

гидом б концентрации 40,0 м.М. Выжигало 60-80$ опытных мышей и дер-монекротический титр составил 1:2.

Обработка токсина в течение I ч формальдегидом в концентрации 0,25/2 не изменяла биологическую активность препарата. Повышение концентрации формальдегида до 0,5;1 частично ингибкроЕало активность токсина, при этом погибало 50% мытей, некротический титр снизился с 1:64 до 1:16. Полную потерю токсичности наблюдали при обработке токсина формальдегидом в концентрации 1,0% в течение I ч.

Таким образом установлено, что выделенный токсин - термолабильный белок, полностью теряющий активность после прогревания при 70°С в течение 30 минут, чувствительный к обработке трипсином, глутаровым альдегидом и формальдегидом.

При гоядунохимаческом анализе установлено, что токсин, концентрированный сульфатом аммония, содержит несколько антигенов, в связи с чем были предприняты исследования по дальнейаему фракциониро-

»

ванна этого препарата, Схема фракционирования включала гель-фильтрацию на Ультрагеле Ас! и хроматографию на Сефакриле s- 200.

В процессе проведенной очистки бш. получен Еысокоочщенный белок, мигрирующий в геле в виде одного компонента с молекулярной массой 12000 Д. Гомогенный токсин был активнее концентрированного сульфатом аммония в 150 раз, обладал дермонекротическим и летальным эффектом. Минимальная дермонекрогетеская доза очищенного токсина, вызывающая характерные изменения в коже морских сеинок, составляла 78 нг, ЛДзд для гдией - 280 нг.

Получение антитоксических сывороток к токсину P.aultoclda

серологического варианта Д и изучение их свойств

На кроликах были получены антитоксические сыЕоротки к концентрированному сульфатом аммония и очищенному токсину P.nulto-otdc. серологического варианта Д. Динамку титров антител в про-

цессе иммунизации контролировали поело каздого введония анатоксина. Установлено, что антитела в сыворотке крови, полученной к концентрированному препарату, обнаруживаются ллсь после 6 инъекции. 3 дальнейшем после введения антигена (всего 13 инъекций) наблюдали нарастание титра антител до 1:16. В антисиворотко, полученной к очищенному анатоксину, антитела регистрировали после 4 иммунизации, максимальный титр антител 1:16 наблвдл.ст после 7 введения пропара-та. Таким образоп, установлено, что очищенный токсин обладал имму-ногенкнш свойствам, вызывая продукцию антител при введения кроликам.

Антисыворотки к токсину, концентрированному сульфатом аммония, исследовали в реакции нейтрализации. Установлено, что сыворотка в разведении 1:16 полностью пнактавпрует активность токсина. Сыворотка в разведения 2:64 не вызывала нейтрализации токсина.

При изучении превентивных свойств сыворотки, полученной к токсину, концентрированному сульфатом а'.ело кия, установлено, что натавкая антитоксическая сыворотка защищала всех мышей при введении им токеппа в дозе 5 ЛД50 п 10 ДЦд0 л на Щ'' от 20 ¿Щ50 токепка.

Посла зводоная мылам сыворотки, разведенной в 2 раза, процент защиты составил соответственно 100$, 90$ п 6С$. По мере увеличения разведения защитные свойства сыворотка снизались и в разведении 1:16 антясыворотка но обеспечивала загдигы лшеотных от токсина.

Прз зараяошл культурой яастеролл установлено, что яатявная аптлтогссячоская сыворотка защищала милей от зараяаняя 5, 10, 20 ДН50 культуры соответственно па 100, 70 п 30>. Защатнтая свойства-:гл обладала сшзорогка псслз развйдегшя в 4 раза, процент заг?ет поело зарагзпзя 5, 10 И 20 ЛДзд кутатурн'соотвэхстасяпо ссс?гсйл 40, 10 Й Сыворотка, разведенная в 8 раз, по защгндяа хдзой о^ заражения вирулентной культурой.

При изучения прзЕэнтявшп: свойств сыворотка,полученной :: очз-

щенному токсину, установлено, что натквная сыворотка защищает всех мыаей от заражения 5 и 10 ЛДдд токсина и на 60? от введения 20 ЛДзд. После разЕедения сыЕоротки в 2-16 раз превентивная активность снижается пропорционально разгедениям.

Антитоксическая нераззеденная сыворотка защищает шлей от заражения 5 ЛД50 культуры на &0%, 10 ДД50 - на 60% и 20 ДД^ - на 10%. Введение мышам сыворотки, разведенной 1:4 - 1:16, не обеспечивает защиты от Еирулектной культуры.

СраЕниЕая превентиЕные сеойстей сыЕороток, полученных к токсину разной степени очистки, установлено, что сыворотка к частично очищенному токсину, концентрированному сульфатом аммония, обеспечивает большую на 10-20£ устойчивость приЕитых шяей к заражению культурой пастерелл по сравнению с сывороткой, полученной к гомогенному препарату. В то хе время антитоксический иммунитет у мышей, привитых сывороткой, полученной к гомогенному токсическому белку, соответствовал иммунитету, возникающее под действием сыворотки, полученной к токсину, концентрированному сульфатом аммония.

Кммуногенные свойства токсина Р<пи11;ос1<1а_

серологического варианта Д

С целью изучения иммуногенных сеойств токсина были проведены опыты по иммунизации шией препаратом, приготовленным из концентрированного сульфатом аммония анатоксина, инактивированных клеток пастерелл и смеси анатоксина с шактиЕироЕанными клетками. Для изучения иммуногенных сеойств Еысокоочиденного токсина мьплей иммунизировали его инактивированной формой, э^льгироЕанной в неполном ацъюванте Фрейнда.

Установлено, что препарат, приготовленный на основе концентрированного сульфатом атаония анатоксина, обеспечивал развитие у милей Еыраженного антитоксического иммунитета. При ЕЕедении 5

и 10 ЛЗдд токсина все прЯвитые мыжя остались гявы. Инъекция 20 ЛДдд токсина вызывала гибель 10-203 привитых япвотных. Привитые мша оказались менее устойчивы к заражению культурой пастеролл и после заражения 5 ДДзд культуры погибало 10-203 жгеотных, а 10 и 20 ДПдд соответственно 40-50 и 903 мышей.

Вакцаю. приготовленная из инактивированных клеток пасто-релл, обеспечивала меньшую устойчивость привитых мышей к введению токсина. После инъекции 5 ЛЛ^д токсина все опытные мшти остались живы, процент защиты жиеоткых от 10 ЛД^ токсина составил 50-603, а 20 ДЯзд - 403. У ыышой, привитых указанным препаратом, наблюдали более выраженный антибактериальный иммунитет. Йшунизация защищала Г003 мышей от заражения 5 ЛД^ культуры, 70-803 - от 10 ЛД^д л 603 - от 20 ДДэд.

Комбинированный препарат обеспечивал формирование выраженного иммунитета к заражению и культурой и токсиноа. После введения иммунизированным шлам 5 и 30 ДЦзд токсина наблюдали 1003 защиту, а 20 ДЦзд - 903 зацпту зиготных. Иммунизированные мыли оказались устойчивы к заражении 5 ЛД^ культуры пастеролл. После введения 10 ЛДд0 культуры погибало только 103, а 20 ДП^ - 20-30^ мышей.

Проведенные исследования показывают, что токсин, концентрированный сульфатом аммония, формирует у мышей выраженный иммунитет к вредетш токсина, по менее выраженный, к заражения культурой пас-терелло.Напртив, устойчивость к зара-кению культурой у мышей, вакцинированных антигеном, приготовленным из клеток пастерелл, была более выражена. У шлей, вакцинированных смесью анатоксина и клеток пасторелл, возрастала устойчивость как к заражения культурой, так и токсином.

При оценке пммуногепныг свойств очищенного токсина установлено, что ЕС!? вакцинированные мша оказались устойчивы к введению 5 и 10 ДД50 токсина, а поело инъекции 20 ДЦдд погибало 10-203

животных. Получениие результаты свидетельствуют о том, что у мышей, привитых анатоксином, приготовленным из высокоочищенного токсического белка, формируется напряженный антитоксический иммунитет, который соответствует таковому, развивающемуся у мышей, привитых токсином, концентрированным сульфатом аммония.

Иммунизация инактивлрованкой формой высокоочищенного токсина вызывала у мышей моньпую ус то ¿та во с ть к заражению культурой пас-торелл. Этот препарат создавая защиту у 60-70^1 хавотшас от заражения 5 ЛДзд культурц пастзрелл, у 40;» - от 10 ДД50» но практически не защищал от 20

Сравнивая результата опыта с данными, полученными при шя.ту-низацпи милей концентрированным сульфатом аммония токсином, следует отметить, что устойчивость к заражению культурой у мышей, иммунизированных препаратом на основе высокоочищенного токсина, ниже таковой у шшсй, привитых токсином, концентрированным сульфатом аммония.

Таким образом, установлено, что по мере очистки токсина не снижается его антитоксическая активность, но снижается устойчивость привитых мышей к заражению вирулентной культурой пастерелл, что свидетельствует о наличии в частично очищенном токсине компо-•нентов, причастных к созданию антибактериального иммунитета.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что штаммы P.nultocida серологического варианта Д, ввделенныа от больных пастероллезом животных, продуцируют токсин, обладающий дерызнекротдческои а летальной активностью. При культивировании на жидкой питательной сродо большая часть токсина секретируотся в кулътуралькую яндкость, а меньшая остается связанной с бактериальной клеткой.

2. Максимальное накопление токсина обеспечивается при культивировании p.maltooida серологического варианта Д в бульоне Хоттингера с добавлением ICjS нормальной сшзоротки крови лошади и

в синтетической среда 199 при 37°С с аэрированием на Е;уттель-акпа-рате в течение 20-24 часов.

3. Разработан метод частичкой очистки и концентрирования: токсина из судернатанта культуры í.nmltocida серологического варианта Д, включающий высаливание сульфатом атонля Í70T5 насыщение, рН 8,0) или улътрафлльтрацию через мембраны " Ami con " K.I-IO и Ш-50.

4. Разработан чувствительный метод тестирования летальной и дермонекротической активности токсина посредством внутрлбретипного введения белым мышам и внутракогаюй инъекции морским свинка:,'..

5. Установлено, что биологическая активность токсина 2.multo cida серологического варианта Д снижается в процессе хранения. Оптимальным режимом сохранения биологически активного токсина является ляофдазадая»

6. Разработан метод получения гомогенного препарата токсина

о

5.muítocicía серолгичосхого варианта Д, включающий внсаливзпяо сульфатом ai;копия, хрокатографиз на' Ультрагзле АсА' 44 и геяъ-фильтрапию на Сефакрзле 3 - 200, обеспечивающий удаленно щше-сой л выход активного таторяала 32,5%, Выделенный токсин представ-

ляет собой белок с молекулярное массой 120000 Д.

7. Токсин Р.тиЗлооЫа серологического варианта Д является тормолабилышм белком, чувствительным к действии трипсина, формальдегида и глутароього альдегида.

8. Гипериммунные сыворотки, полученные к концентрированному сульфатом аммония и очищенному токсину р.пш11;оо14а серологического варианта Д, обладают выраженными нейтрализующими и превентивными свойствами, обеспечивающими антитоксический и антибакто-рвалышй пассивный иммунитет.

5. Анатоксин, полученный из концентрированного сульфатом аммония токсина и гомогенного токсического белка Р»ии1гос1йа серологического варианта Д, стимулирует у мышей выраженный анти-токсическай и антибактериальный иммунитет. Введение анатоксина в состав протавопастереллезных вакцин, состоящих из убитых клеток пасгерелл, значительно (на 20-50£) повышает яммуногенность этих препаратов.

Практические предложения

Результаты проведенных исследований служат научным обоснованием для создания компонентных биологических препаратов на основе факторов патогенности пастерелл. Отработанные тесты могут быть использованы при подборе производственных штаммов, необходимых ддя создания биологических препаратов. Проведенная работа позволяет внести коррективы в технологию изготовления вакцин и их контроль.

Список опубликованных работ

. I. Калмыкова Я.И. Изучение продукции экзотоксина штаммами Р«ии1^сАс1а серологического варианта Д. Балл. ЗИЭВ, вып. 69, 1985г., с. 92-25.

2. Калмыкова Л.Л. Отработка условий концентрирования экзотоксина Р.тиЗлосхйа серологического варианта Д. Балл. ВИЗВ, вып. 69, 1989 г., с. 96-99.

3. Калмыкова Л.И. Летальное действие токсина г.талос1(1а сероварианта Д при разных способах введения мылам» Бэлл. ВИЗВ, вып. 77-78, 1991 Г., с. 66-67.

4. Калмыкова Л.И., Езепчук Ю.В., Шегидевич Э.А., Навасардянц Д.Г. Выделение и некоторые свойства дермонекротического токсина р.ти:иос1аа • Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1991 г., е.-29-32.

Подписано в печать 5.05. 92. Заказ 593 'Зормат 50x84/16 Тирая. 130

¡.'юсква. Типография Росоельхозакадемия