Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Токсикокинетика нитрафена и влияние его на процессы окислительного фосфорилирования и метгемоглобинобразования

' и ^'РОбЬ-ЙЕМ1 АКАДЕМИЯ СЕ1ЬСК01СанйСТВЕНННХ НАУК

СЕСОЙЗЕЫЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ САНИТАРКИ, ПГО1ЕНЫ И' ЭКОЛОГИИ:

На правах рукописи УДЕ 619:615.9:632.95

ЕИРШЗЕАЕВА ДИНА ШГАСОВНА

ТСЖСШСОКИНЕТИКА НИТРАФЕНА И ВЛИЯНИЕ ЕГО НА ПРОЦЕССЫ КЙСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ И ЫЕШМОГЛОШНОЕРАЗОВАНИЯ

16.00.36 - ветеринарная санитария, ветеринарно-санитарная экспертиза я гигиена переработки продукта* животноводства

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 19.9 2

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Дружбы народов научно-исследовательском института: ветеринарной оанитарни, гигиены к экологшь.

Научные руководители - Заслуженный деятель натки РСФС1

доктор ветеринарных наук, профессор Г.А*Таланов{

доктор ветеринарных наук, профессор Т*Б.ЛЗаймурадов.

Официальные1 оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук, профессор ХГ.Аббасов. (ВНИИВСГ;

2. Кандидат биологических тук, доцент ЩЦЦугвы. (МВА)

Ведущая организация — Всесованый ордена Ленина научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (ВИЗВ)

Jo

Защита состоится " " ас-а^гкл- 1992 г. в час на заседании специализированного ученого совета Д.020.50.01 при Всесоюзном ордена Дружбы Народов научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологшг ( 123022, Москва, Звенигородское шоссе,, д.5).

С диссертацией иожна ознакомиться в библиотеке институт

Автореферат разослан ' 1992 г.

Учений секретарь специализированного

совета,кандидат биологических наук ' Л,П.Пкменова

КЮ1

IcU

г

]:{« ощлл заршерйиш рлзотк

ел

2ЙУ Актуальность темы. Ведение современного внсокопродуктив-ного сельского хозяйства невозможно без широкого применения пестицидов, которые позволяют повысить урожайность растений, снизить ущерб, причиняемый растениеводству вредителями, болезнями и сорняками, уменьшить затраты средств на единицу произведенной продукции. Однако некоторые из пестицидов имеют высокую токсичность для полезных животных или способны в процессе биологического разложения образовывать высокотоксичше метаболиты, загрязняющие охружавдую среду, корма и продукты питания. Поэтому все пестициды доошш проходить тщательную санитарно-токсикологическую оценку, которая включает определи.__параметров острой п хронической токсичности, метаболизм, скорость Зиологлчоского разлозонпя, отдаленные последствия и другие ис-злэдования. Полученные данные позволяют разработать регламенты применения пестицида в сельском хозяйстве, которые лсклэта-ат опасность его отрицательного действия на окружающую среду з полезных яивотных, санитарное качество кормов и продуктов ттания.

Одним па "старис" пестицидов отечественного производства, широко применяемого в странах СНГ для зацаты растений яв-шэтся нитрафеп. Нлтра$ен получапт п^гем нитрования сланцерчх i каменноугольных фенолов и представляет собсЗ шюгокостинент-гую смесь дпнптроалкплтенолоз. Выпуск :ся прогжлвнностьп в ¡идо 6С$ водорастворимой пасты (60 пс). Он реком-адогал з ка-¡естЕО инсектицида на ягодниках п плодоеш: лзресьях, 4унгкцл~ ;а - на картофеле, гербицида - на клевера и .тзхсрно с норг<гшгл исхода 24-45 кг д.в. на га.(НЛ.!.'ель;тков, 1965 >.

Несмотря на то, что нятрафен пргштгло'гся базеа 30-л$тг.' вопросы токсикодин&'лжи, токсикокинетики и метаболизма пестицида изучены слабо. Отсутствуем специфичный и чувствительный метод определения отдельных компонентов смеси в техническом продукте и в тканях животных, что не дает возможность осущест вить ветеринарно-санитарнув экспертизу продуктов вынужденного убоя при отравления этим пестицидом сельскохозяйственных и ди ких промысловых животных, рыбы и птиц, проводить посмертную диагностику интоксикаций, изучать метаболизм и устанавливать "срот'И убоя" при отравлениях. Слабо изучен механизм токсического действия нитрафена, его влияние на отдельные биохимические процессы в организме, в частности, окислительное фосфорг-лирование и метгемоглобивобразование. Не изучена тохсикокине-тика пестицида в организме животных.

Учитывая, что нитрафен широко.применяется в сельском хо вяйстве в качестве средства защиты растений, в том числе и на кормовых культурах с большими нормами расхода, имеется потенциальная опасность его контакта с полезными животными и отрицательного влияния на состояние их здоровья и безопасность пс

лучаемых от них продуктов питания, мы считали необходимым прс *

вести такие исследования.

Целью нашей работы являлось изучение параметров токсичности и токсикокинетшш нитрафена, его влияние на некоторые биохимические процессы в организме в интересах ветеринарной санитарии в токсикологии.

В связи о этим на разрешении были поставлены следующие задачи:

1« Разработать методику определения нитрафена в органах и

тканях яивотшп с помощью тонкослойной хроматографии,

2. Провести хтико-аналитичэское исследование различных образцов нитрсфена я дать им токсикологическую оценку.

3. Изучить дшгамику распределения остатков нптрафона в органах и тканях кроликов«

4. Исследовать влияпно нитрафэна на бяохшкчвскиа и морфологи-чэскпе позазатолп крова кроликов.

5. Изучить влияние натрафена на характеристики биоэнергетического метаболизм.

6. Исследовать влияние гптрафекч, пл процесса нэтгоноглобияоб-разсватая и гемолитическую стойкост* еритрсцитов»

Научная новйзна. 3 рзгуяьтате проведенных наследований впервые:

- разработан метод онрэдзлендя нитрафека в тканях ххзо-',^ них с помогу тонкослойной, хроматографии;

- установлена завнсюзость параметров токсичности образцов. нитрафова от соотношения в их составе различных ингрвдвег«-тов$ .

- экспериментально дскс ало присутствие ДНОК и дпносвса в тканях аивоМых при введении внутрь нитрсфока}

- изучено влияние нптрафона на процессы мзтгекоглобин»-сбразсвания а гемолитическую стойкость эритрстатов;

- изучены характеристика рсодцзй окаслггзяькию фос$от:2-лировЕния в печена крыс при длительном вводеял: пзстапидА.

Практическая ценность раЗоты. Разработка кэтодика определения остаточных колачестз нитрафока а тг.^^чх гшвотнгг: с помощью тонкослойной хроматографии, одобрении.-; Ученим созес::.:

ВНИИВСГЭ 21.03.91. Методика может использоваться для ветери-нарно-санитарной оценки продуктов вынужденного убоя при отравлении нитрафеном. Предложен метод диагностики отравлений животных нитрафеном по результатам исследований, крови на метге-моглобин г тканей на содержание остатков.

Апробация, полученных результатов. Материалы диссертации

дола зны на конференции молодых ученых МВА (Москва, 1988), на заседании биохимического общества ЫВА (Москва, 1991), на мэжг-лабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ (Москва, 1992). *

Публикация результатов исследований. По тема диссертации опубликованы 3 работы. . •

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, прадстических предложений, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 12 рисунков и 19 таблиц. Список литературы вклвчает 142 источника, 'в том числе 43 ино-' странных.

собственные исследования

Материалы и методы исследований. Исследования проводили в течении 1988-1990 годов в лаборатории; токсикологии ,„.. БНИКВСГЭ. .

т Для хжшосо-аналитнчееких и токсикологических исследова-

ний, использовали два образца пасты нитрафен: образацец К I,

одученный через Государственную комиссию по химическим сред-твам борьбы с вредителями, болезнями и сорняками и образец i 2, полученный через торговую сеть. При проведении исследо-1аний применяли реактивы фирмы "Союзхимреактив" марки "ХЧ" и. 1еактивы фирм "Лахема"' (ЧСФР1, "Серва" (ФРГ).

Разработку метода определения нитрафина в тканях живот-шх проводили в соответствии о требования:,™, предъявляемыми к летодам анализа остаточных количеств пестицидов в продуктах питания, кормах и. внешней среде (М.А.Клисенко, 1983). Выбор 1роявляквдего реагента для тонкослойной хроматографии осуществляли йутем анализа литературных данных, на основании которых отбирали химические вещества, образувщиз цветные реакции с фенол- и; динитрофенолами (Ю.Кирхнер, 1981). В качестве неподви-етой £азы для тонкослойной гроттографш (ТСХ) применяли готовые пластины "Силуфол УФ-254". При выборе подвижной системы использовали алюотропный ряд растворителей (С.Перрп с соавт,, 1974).' '

В качестве лабораторннх япзотных использовали кроликов порода "йикшшша" со средней айвой массой 2,5-3,0 кг„ белых беспородных кркс массой ISD-IB0 г, белых беспородных мыией массой 18-25 г. Всего было использовано 330 крыс., 400 милей, GO кроликов, Животных содер.глл:: в виварии ВБПГГСГЭ. При токсикологической оценке образцов пастк ш'.тра^он па крысах и мизах, препараты вводили внутрь однократно в епдо водных растворов различной концентрации щприцем с булавовидном угощением на конце иглы,черэз три часа пссле кормления в оо-л-ме но прозыла-таэм I г.и для милей, 5 мл для крас. Контрольна; -ллг>откпл вводили воду в объеме, соответствующи.! налбатьпе;"' хсличс-етту

о>

дикого раствора препарата. Каждую дозу пелкунзалг; ьа 10 ьишах и б- крысах. За животными наблюдали в течениЕ 14. дней после введения, отмечая сроки проявлена клинических признаков отравления, . иг гибель или выздоровление. По результатам испытания исчисляли величину и другие параметры токсичности. Величины этих показателей выражали в мг/кг. кивой массы в расчете на препарат и действующее вещество (д.в.) - нитроалкилфе-нолы. Павших животных вскрывали и изучали характер патояого-анатомических изменений. .

На хроликах острую токсичность определяли при однократном введении пестзцида внутрь, отмечая характер клинических признаков интоксикации, изучая изменения морфологических'и биохимических показателей крови, а такие динамику остатков пестицида в органах и тканях о помощью разработанного наш метода.

Для определекия эритроцитов .использовали унифицированный метод подсчета форменных элементов в камере Горяева (В.В.Меньшиков а соавт., 1987); содержание глюкозы - методом Гультмана (Ф.И.Комаров с соавт.,; 1981)} общего белка в сыворотке крови - рефрактометрически на рефрактометре РПЛ-2. Определение со-де]жания гемоглобина и его производных проводили спектрофото-ыетрическиы методом М.С.Кушаковского (Ц.С.Кушаковский, 1968). Для определения активности каталазы использовали метод А.Н. Баха и С.Г.Зуйковой (Е.А.Кост с соавт., 1964). Активность аце-тилхолинэстеразв определяли методом Хестрина (Г.А.Кочетов, 1980). Гемолитическую стойкость мембран эритроцитов определяли методом кислотных эритрограмм И.А.Терского и И.И.Гительзона (1959). Характеристики энерегетического обмена определяли методом Варбурга (А.Г.Малахов с соавт., 1989). Полученные данные

сбрабехзваля азтэдш гаргадксЕзсй стахамгка и корреляционного анализа на 1Ш/РС с помощью программы, написанной на алгоритмическом языке ТШЮ-РА5КАЦГ.О.Лакин, 1980).

• РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВД03АШЙ'

I* Разработка метода определения нитрафена в тканях животных.

В связи о тем, что нитрафен представляет собой многокомпонентную смесь дшштроалкилфенолов, мы считали необходимым исполь^ зозать дая определения его остатков з тканях животных разделительный метод, основанный на тонкослойной хроматографии (ТСХ). Этот метод прост по технике исполнен/л, не требует сложного оборудования и реактивов, может применяться в любой производственной. ветеринарной или медицинской лаборатории. Метод. ТСХ позволяет разделять сложные многокомпонентные смеси; на отдельна ингридиенты, производить их идентификацию и количественное определение.

• К началу наших исследований мы не имели стандарта технического нитрафана, поэтому сочли необходимым, выделить его из препаративной формы 60% пасты. С этой целью 2-3 г пасты растворяли в 50 мл воды, фильтрозали через бумажный фильтр в делительную воронку, подкисляли раствор соляной кислотой-до рН 2,0 - 3,0, охлаждали в течении 30 минут з холодильнике ffi снова фильтровали в делительную воронку. Из раствора нитрафен экстрагировали тридцн хлороформом. Х*ороформенныэ гкетрактн объединяли, упаривали з тско воздуха досуга. Кор-этлезую массу,, остагпукся на дне выпарительной чалкп, гл'.пользоеяли в качество аналитического стандарта.

После этого приступили х изыскана® прсявяявдего реактива. С этой целью •бшш испытаны ряд проявляющих реагентов, .используемых для детектирования нитропроизводннх фенола,'такие как пары брома и 2% водный раствор калия кодида, 10% стартовый раствор катая гидрооксида, пары .аммиака, спиртовый раствор диметиламинобензоальдегида, 0,25? спиртовый раствор нингидри-на, соль прочную ГГ, соль прочную РР, соль прочную голубую В„ соль прочную красную В, соль прочную голубую ВВ.

В результате проведенных исследований наилучшие показатели были получены при воздействии на пластинку паров брома с последующей обработкой 2% водным раствором калвя нодида или 10$ спиртовым раствором калия гвдрооксвда. Нижний предел обнаружения технического нитрафена без его разделения Спо суше всех иштридиентов) составил 0,1 - 0,3 мкг.

После подбора проявлящего реагента мы испытыш ряд под« вижных систем органических растворителей для наилучшего рааде* ления нитрафена на отдельные ингредиенты, В качестве неподвижной фазн использовали силикагель КСК (готовые пластины "Силу-фол УФ-254"). Наилучшие показатели разделение на этих пластин ах были достигнуты в подвижной системе хлороформ-гексан-зтил-ацетат (2:7*1), В этой системе нитрефен проявлялся в вида 10 пятен. Минимальный предел детектирования по основному компоненту составил 2 мкг« При друге« соотношении этих же раствор! телей (4:5 Д) нитрафак разделялся на 8 компонентов, однако предел обнаружения был выше - 0,3 мкг. Такое же количество С1 ставляшгас было получено при разделении пестицида в системе гексан-этилацетат (8:2), Таким образом, более высокие показа, теля по чувствительности были получены.при разделении нптраф

на в сястема яйсф^ор^чксааууяшдага« (4:5:1), которув ?о ? . дяльпейзва испатазегагш д?я определения нитрафена в тканях газетных.

При' разделении технического нитрафена посредством ТСХ г.а пластинах "Силуфол УФ-254" в подвижной системе хлороформ-гек~ сап-втняацвтат (4:511) и последующей обработки пластины в п<1- -рах брома п опрыскивания 2% водным раствором калия иодида нит— рафен проявлялся в виде 8 пятен розово-малинового цвета с 0,15} 0,23л 0,30» 0,34; 0,62; 0,64; С,77; 0,90. Пятно с ^ • 0,7? соответствовало'ДВОКу. ,

■ Для количественной, оценки содержания динитроалкилфеноло-з в тохняческш продукте и в тканях мы использовали денситоме-?-» рический'метод с помощью однолучевогс денситометра фирмы "Ка^-Цойс-Иена". В качестве стандарта, по которому определяли количество всах ингридзентоБ смеси использовали стандартный раствор ДНОКа. Определение проводили весовым методом, определяя массу частей денситомограммы, соответствующей каждому компон-« нту смеса.. - • ,

Отработку способов экстракции, и очистки экстрактов проводили путей внесения в измельченные пробы мышечной тканз печени ацетоновых растворов.технического нитрафена в количестве от I до 50 мкг с последующим анализом ваделенных ингридие5>-тоз. '

За основу способа экстракции а очистки.экстрактов мы первоначально испытали метод, предложенный В.КЛормановым (1988), основанный на трехкратной экстракции тестицида ацетоном с последующим переводом нитрафена в его натриевое производное и по-реэкстракпии в диэтиловый эфир. Однако при этом не получили

1С

четких хроматограмм, tas как очистка экстрактов бша коудс.зл# творительной.- Коэкстрактявные вещества накрывала пятна с низкий значением fy . При гсцольэо<^ашш в качества переэкстрагирующего растворителя диэтиловсго эфира из водноацэтонового экстракта извлекались не все nomonoatu нитрафена. Поэтому нами были испытаны и дополнительно внесены в схему"очистки.эко-трактов такие стадии как осаждение коэкстрактивных веществ на холоду и центрифугирование, перераспределение Пестицида из вбдноацетонового экстракта в хлороформ.

В целом схема метода определения нитрафена в тканях животных включала следующие элементы. Измельченную пробу тканей массой Ю г помещали в колбу ЭрленмэКера» заливали 40 ил ацетона« колбу встряхивали на шуттель-алпарате в течения 30 кинут. Экстракцию ацетоном повторяли. Экстракты объединяли« упаривали в токе. воздухадо20-25 ил, добавляли Ю ил. дистиллированной воды в: 2 vur 2ffifoодного раствора свинца ацетата* Колбу переносили в морозильную камеру бытового холодильника на 3-4 часа. Экстракт фильтровали через буыажныйфильтр, центрифугировали в точении ID минут при 5 тыс*об./мин. Центрифугат переносили в делштельнуп воровку йа 290 мд, добавляли 10 мя 0,1 Н водного раствора натрия гядрооксадаи подкисляли соляной кислотой до рН, 1,0 - ¡2,0 и реэкстрагировали дважды 30 мл хлороформа. Хлороформенный экстракт фильтровали через безводный, натрия сульфат. Объединенный хлороформенный экстракт упаривали в токе воздуха досуха, сухой остаток растворяли в 0,1-0,2 мл хлороформа, наносили на старт хроматографической пластинки, разгоняли в системе хлороформ-гексан-етилацетат ('4:5;1), помещали пластинку в пары брома, а затем опрыскивали 252 водным раство-

юм калия иодада, после чего проводили денситомэтрирование по (тношении' к стандартному раствору ДНСК.

Предел обнаружения составил 1-3 мкг в пробе шш 0,1 г/кг, степень определяемости 60-90,1.

. Токсичность нитрафена для белых гпгей и крыс.

Превде чем приступить к определению параметров токсично-тп двух образцов 60$ пасты нитрафена, ш считали необходимым отаковить содержание в препаративной форме динитроалкилфено-ов и в техническом продукте отдельных ингридаентов о тем, что-а определить массовую долю наиболее токсичного составляющего ШОК и выявить зависимость между его содержанием и парапетами токсичности.

Содержание динитрсаякилфенолов в пасте нитрафена двух 5разцов й I и И 2 определяли согласно ТУ - 113049883. Для того в колбу на 250 т вносили 10 г пасты и добавляли 90 мл эды. Раствор подкисляли соляной кислотой до рН 2,0 - 3,0 и >бавляли ещё 2 мл концентрированной кислоты." Раствор охлажда-5 до +1 -5®С и выпавпше динитроалкилфанолы отфильтровывали >рез предварительно взвезенный фильтр. Колбу ополаскивали 10 г воды, которую пропускали через тот же фильтр. $шгьтр с ди-ироалколфенолами взвешивали, определяли в нем влгл7, исключи массу фильтра и определяли количество выделенного техни-¡ского продукта по отношению к массе взятой паста, В резуль- • ате проведенных исследован/..", было установлено содержание ди-гроалкилфенолоЕ в образце X I - ЗЭ£ и в <-,-!разце $ 2 - 31% эсто 6Сй, которые были обозначены в качественном удостовере-

KHZ,

Заток посредством разработанного намн метода ТСХ с дгн-ситоиетрическим анализом определяли содержание разлзчшве ингредиентов в технических продуктах образцов Я I и й 2, Методой весовой денситометрии было установленог что в продукте Л I содержание выделенных посредством ТСХ ингридиентов составило 82,7%, в продукте В 2 — 85,3^ по отношению к массе исследованной пробы. Оставшую часть 17,3 и 14,7$ составляли вецества, не выделенные посредством ТСХ. В этих продуктах содержание ДНОК было определено равным 4,7 и 4,0$ соответственно.

Показатели токсичности образцов для белых мышей и крыс определяли при их однократном введении внутрь в ви^е водной эмульсии. В результате была установлено JLE^q образца Я I для белых мышей - по препарату 590- мг/кг или 230,1 мг/кг по д.в., образца В 2 - 740 и. 224,4 мг/кг соответственно; для белых крыс - образца * I по препарату 754,2 мг/кг или 294,1 мг/кг по д»в», образца Л 2 - 1750 мг/кг ff 542,5 мг/кг соответственно*

Таким образом,, в расчете на- динитрешякилфвнолы оба образца пасты имели одинаковую токсичность для белых мышей. Существенные различия были'получены в опытах на белых крысах, для которых образец Ji I был значительно более токсичным, чем Я 2. Вероятно это связано с тем,, что в образце )ё I было более высокое содержание ДНОК (4,.7$) по сравнению с образцом пасты И 2 (4,0£) к которому чувствительны крысы (Г.Майер-Боде, 1972). Оба образца нктрафена относились к группе среднетонскчных соединений с ЛДс.0 для белых мышей по д.в. 230,1 - 224,4 мг/кг, по препарату 590-740 мг/кг;; для белых крис по д.в. 294,1 - 542,5 мг/кг л по препарату 754,2 - Т75С мг/кг соответственно.

3. Влияние нитрафона на биохимические и морфологические • показатели крови кроликов.

Влияние нитрафона на биохимические и морфологические показатель- крови изучали на кроликах. Всего в опытах было использовано 60 кроликов, разделенных на 4 группы по 15 животных в каждой, из них три подопытные и одна контрольная. Животным первой группы вводили внутрь водную эмульсию нитрафена в дозе 300 мг/кг по препарату или 93 мг/кг по д.в.., второй - 600 ¿г/кг (186 мг/кг д.в.), третьей - 1000 мг/кг (310 мг/кг д.в.). 1ереэ б, 12, 24, 72 часа и 7, 14, 30 суток поело введения пес-ттттдя у животных из ушной вены брали кровь для исследований.

У кроликов первой группы через 10-20 минут после введе-ган развились признаки отравления, проявляющиеся повышением температуры тела до 39,9®С, учащением дыхания, непроизвольным ючеислусканиемг отказом от корма. На 2-3 день, признаки отрав-:ения исчезали. Падежа кроликов в этой группе отмечено не бы-о.

Яитрафен в дозе 186 мг/кг по д.в. вызвал резко выражение, признаки отравления с развитием парезов и параличей конеч-остей. Через 6-24 часов у части кроликов развались клонико-онические судорги, заканчивающиеся гибелью животных. Полное издоровление выживших животных наступало через 3 недели после ведения препарата. В третьей группе 'доза 310.мг/кг по д.в.) эгибло 100$ животных.

В крови кроликов первой группы установлено снижение со-зржания эритроцитов до 63% и во второй - до 55;? к исходному зовню. Отмечено угнетение активности каталазы на 50$, ацетил-

холинэстеразы на 42-67$, снижения уровня общего белка в сыво-^ ротке крови на 34-49$, тгвеличение в два раза содержания в крови глюкозы. Наиболее значительные изменения установлены со стороны кислородотранспортной функции гемоглобина. Под действием нитрафена происходит стойкое повышение уровня ыетгемогло-бина. Максимальная ме£ге;.юглобинеыия отмечена в первой подопытной группе' через 24 часа после введения препарата, во второй' - через 6 часов и соответственно составила 173 и 260$ по отношению к исходному уровню. Одновременно происходило снижение уровней гемоглобина и оксигемоглобина. При введении нитрафена в дозе 93 мг/кг по д.в.,'максимальное снижение этих показателей установлено на третьи сутки и соответственно составило 73 и 77$ к норме.

Таким образом, при введении кроликам нитрафена в токсических дозах установлено достоверное снижения количества эритроцитов, общего белка в сыворотке крови, подавление активности каталазы и ацетилхолинэстеразы и резкое возрастание в крови глюкозы. Однако эти изменения, по-видимому, носят вторичный характер, так как степень их изменения не коррелирует с дозой пестицида и они развиваются на фоне.общетоксического действия пестицида, когда развились клинические симптомы интоксикации. Наиболее важным биохимическим'показателем, характеризующим специфическое действие динитроалкилфенолов является метгемо-глобинобразование. Этот процесс является ведущим при отраале-ки<: хлеотных нитратами и Хорошо изучен. По-видкмог:у, в механизма токсического действия динитроалкилфенолов он играет такхе рель, так в опытах на кроликах установлена зарисимость ,-сза - урокень сэдоряандя в крови метгемсглобина.

Учитывая, Что процессы матгзмоглобинобрадовг1:ия недостаточно изучены при тог.'' экологической оценке нитрафена, мы считали необходимым провести специальные исследования е боле® шв-юким выбором доз»

U :. Динамика остатков нитрафена в организме животных.

Динамику остатков нитрафена в органах а тканях изучали га кроликах в тех хе опытах, в которых проводили исследования злияние нитрафена на биохимические и морфологические показате-га крови. Нитрафен в виде водной эмульсии был введен однократно з дозах 93, 186, 310 мг/кг по д.в., или 300, 600, 1000 мг/кг ю препарату. У животных первой группы развились клинические хризпаки отравления, но не было отмечено табели; во второй груше пало. 50Í животных; в третьей группе - I00Í гибель. Остав-пихся в живых животных первой и второй групп убивали черва I, 3,7, Т4, 30 суток после введения препарата. Органы и ткани, содержимое желудка и кишечника исследовали на содержание остатков методом ТСХ. ..

Во всех исследованных пробах павших кроликов были обнаружены в неизмененном виде все соединения, открытые в техническим нитрафене. Наибольшее количество остатков пестицида у павших животных обнаружено в содержимом желудка и кишечника. Суммарное содержание динитроалкялфенолов в содержимом желудка х кишечшжа достигало 2wG мг/кг, в легких и печени - 100 мг/кг. Эта показа!ели могут служить основанием для постановки посмертного диагноза на отравление нитрафеном.

Совершенно иная картина была выявлена у выживших живот»-

кс, ко убктых в различные сроки после введения китрафона» Бз всех пробах обнаруживала только два компонента' кнтрафеЕа о величиной Rj 0,34 и 0,77. Пятно на хроматограмме с fy 0,77 соответствует ДНОК, пятно о fy 0,34 предположительно отнесли к диносебу. Из-за отсутствия стандарта этого роединения »ci не могли идентифицировать его прямым методом...Поэтому вы— цтвдсны били использовать данные других Есададслателей по со-отаоаоклю показателя' рсадашшя Д2(Е а дыосмк*. пос.рад«сткг

Sa ojHcsçnaa анализа-праг-ш к г шагеакг^» что зЕделРЯК»'. яага nz тальсй: к органов ннвотнкх wmo с. 'у 0k34 cootsoïct-i.jù'î данос^С;.' " внсокотскснчному даклтрофенолу с JUTg-j дт~ ;;рыа 40-60

.Щшамппа накопления fc распределения ДНОК г дкносеба в. оргапизме кралнков была установлена следупдэй» Через одни сутки после однократного введения пестицида в доза: S3 мг/кг д.в., наибольшее количество остатков обнаружонэ в содержимом пезч-ника - 5,2 и; 40,0 иг/кг, в печени - 2,8 и 21,2 мг/кг, в легкю

- 0,32 и: 6,0 мг/кг соответственно. Количество остатков в мышечкой ткани было незначительным и };аходшгось на уровне по ДНОК

- О и диносебу - 0,4 кг/кг. В органах н тканях кроликов вторе! группы С доза 186 ст/ег) количество ДНОК н диносеба было в 1,£ раза выше, чом у животных' порвой груши.

Спустя 14 дней в органа:: н тканях кроликов первой груши был обнаружен только диносеб в 'количествах, не превышающих 0,i мг/кг, у кралнков второй группы - как диносеб, так и ДНОК»

Через 30 дней в тканях кроликов, получивиих нитратен в доза 93 мг/кг д.в., .остатки пестицида обнаружены не были; в доге 185 мт/кг - следы дкносеба в легких, печени, содергтамом

•елудка л кишечника.

На основании выполненных исследований можно сделать зак-гючение, в органах и тканях кроликов, павших в результате по-1адения В'организм нитрафена в смертельных дозах, пестицид накапливается в неизмененном виде. В содержимом желудка ж кишеч-шка, легких, печени, сердечной мышце нитрафен обнаружен' в ко-ничеств&х не менее 50 мг/кг по суше данитроалкилфенолов..

В органах и тканях кроликов, убитых через 1-14. дней после введения нитрафена в дозах 93-185 мг/кг д.в., бшш обнаружены два соединения, идентифицированные как ДНОКд диносеб. Уровень содержания диносеба был в 10-20 раз выше, чем ДЖЖа. Их количество зависило от сроков убоя животных после введения препарата и дозы. Остатки диносеба в виде следов были обнаружены в тканях кроликов через 30 дней. Проведенные исследования дают основания предполагать, что метаболизм нитрафена в организме животных происходит по типу "летального синтеза" с образованием более токсичных продуктов, чем исходные ингридиенты.

Полученные данные позволяют разработать основу для посмертной диагностики отравлений животных нитрафеном и проведение1 ветеринарно-слгатарлой экспертизы продуктов вынужденного убоя при подозрении на интоксикацию этим пестицидом.- Обнаружение-.в содержимом желудка л кишечника,, печени и легких нитрафена в количестве превышающем 10-20 мг/кг дает основание на постановку диагноза на отравление этим пестицидом. При вынужденном убое-животных, связанном с подозрением на отравление нитратном, продукты'убоя должы исследопться на содержание МОК и диносеба. При обнаружении их в продуктах убоя, мя.:о не должно допускаться в пищу.

5» Влияние нитрафена на процессы ыетгемоглобинобразованад

и: гемолитическую стойкость, эритроцитов.

Опыты проводили на белых крысах, которые были разделе* на четыре группы по 30 особей в каждой, три. опытные и одна контрольная. Крысам вводили через зонд однократно водную эму льсию нитрафена в следующих дозах: животным первой группы -108 мг/кг по д.в.. (1/5 ДДзд), второй - 54 мг/кг (1/10 Д%0)( третьей - 27 мг/кг (Т/20 ЛДзд). Снятие; показателей проводили через 3, 6, 9, 24 часов и: на 3 и. 14 сутки, после введения препарата. Для этого у пята особей из каждой группы брали кровь из сердца в каждый интервал времени и определяли: уровень мет-гемоглобина и показатели гемолитической стойкости эритроцито;

Исследования показали, что при введении нитрафена в максимально-переносимой дозе (108 мг/кг по д.в.) происходит снижение показателей гемолитической стойкости эритроцитов. Ч< рез одни сутки после введение показатель стойкости - Tjqq -время полного гемолиза составил 70$ от исходного уровня. В эти же сроки отмечается накопление метгеыоглоблна в крови. Через 6' часов его уровень достиг 300$ от исходного показателе У животных данной группы отмечали- выраженные клинические признаки интоксикации: повышение температуры тела, нарушение дыхания, обильную саливацию.

Нитрафвн в дозе 54 мг/кг не вызывал клиники инто'ксим цет, однако содержание мвтгемоглобина возрастало на 35$ от исходного показателя. Стойкость эритроцитов в первые три часг после введения препарата имела тенденция к снгчонта. В после-

дуюняе троэ суток происходит уваличеняо гемолитической стойкости эритроцитов, презипаядай начальный показатель на 20%. Данный эффект можно объяснить усилением гемспоэза и выбросом в кровяное русло нолоднх клеток, обладащих накболшей стойкости. Была установлена корреляционная связь, между дозой пестицида и уровнем'метгемоглобина в крови,, но такая связь не прослеживалась по отношению к- гемолитической стойкости эритроцитов. Ка основании проведенных исследований моано сделать вывод о том, что в механизме токсического действия нитрафена первичным звеном является окисление? гемоглобина до метгемоглобина и производили - енляенле стойкости, мембраны эритроцитов;. Метгемогло-бинобр^зование потно рассматривать как специфический показатель тоглсческого действия нитрафена и который может быть использован в диагностических целях.

6* Влияние нитрафена на характеристики окислительного фосфорилирования.

В основе механизма токсического действия динитрофеноль— ных пестицидов лежат процессы, связанные с нарушением биоэнергетика клетки, в частности, ш ибирование процессов окислительного фосфорялирования. Наки установлено, что в составе нитрафена присутствуют ДНОК и диносеб. Последнее соединение в значительных количествах образуется в прцессе метаболизма нитрафена, поэтому допустимо предполагать, что токсический эффект нитрафена будет реализовываться этим путем. Кроме того, как ъ опытах на крысах, так и в опытах на кроликах при введении токсически?: доз препарата отмечено повышение температуры тала ян-

воткых. Гипертермия, как правило, не является характерным признаком при отравлениях животных химическими веществами, а развивается при инфекционных заболеваниях. В связи с этим мы провели специальные исследования по изучению влияния нитрафена на процесс окислительного фосфорилирования.

Опыты проводили на белых крысах, которые были разделены на четыре группы по 15 особей в каждой, три опытные и одна контра зная. Животным первой группы водные эмульсии пасты нлтра-фена образца Л 2 ежедневно в течении месяца вводили в дозе 54 мг/кг д.в., второй - 27 мг/кг, третьей - 13,5 иг/кг. Крысы первой группы за весь период опыта получили 1620 мг/кг по д.в. нитрафена, второй - 810 мг/кг, третьей - 405 мг/кг. После окончания введения препарата животных убивали и отбирали кусочки печени для исследования.

Результ.' ты исследований влияния нитрафена на показатели . окислительного фосфорилирования представлены в таблице.

Таблица .

Показатели энергетического обмена в печени крыс после.

введения нитрафена в течении месяца

Дозы,: Поглощен— : Убыль : Р/0 ; Содержание: Активность

мг/кг ный 09, фосфата, АТ£>, мг% АТФ-азы,

д.в. мкатда . мкатом мкмоль Р/

г/мин

54 .2,42*0,02 2,86*0,04 1,18*0,07 45,43*0,38 0,86*0,02

27 4,43*0,04 6,91*0,03 1,55*0,05 77,92*1,02 1,76*0,04

13,5 6,46*0,10 11,33*0,10 1,75*0,06 112,03 2,02*0,19

конт- 4,05*0,10 9,46*0ДО 2,38*0,10 246,39 1,22*0,06

Данные исследования свидетельствуют о том, что длитель-се введение нитрафена приводит к достоверному снижению коэффициента фосфоршгарования Р/0. Уменьшение Р/С во второй и ретьей группах подопытных животных происходит не за счет пот-эбления кислорода, а за счет большей убыли фосфата. Потребле-!е кислорода клетками печени в этих группах сохраняется и да>~ 1 стимулируется, тогда как в первой группе, получившей налипшую доау нитрафена, потребление кислорода значительно снимется. Во всех подопытных группах отмечено снижение содержа-■я АТв^по отношению к контролю: у животных первой группы на ,8$, зторой - 70$, третьей - 57,8$. Этз данлне свидетвльст-ют либо о глубокЬм подавлении синтеза А®, либо об усиленном о :>аспадег. У :срсигиков второй и третьей групп отмечае-ся ги-чкая глртина разобщения сопряженности между процессами екне-ния и фосфорилирования. В первой группе -- угнатонив всей би-¡юргаггической системы организма? работы дыхательной цепи и зцесг.чэ генерации энергии* Необходимо отметить, что Р/0 а эвякь-АТ© имеют теснуэ корреляпионнуа связь 'йоза-эффехт', ! такте четко коррелируют с лйцим состоянием организма и ?■>-•ратурой тала. Практически у всех животных к концу зкепори-гаа отнечата повышенную температуру тела (33-4А), учащен-| глубокое дыхание и другие признаки интоксикации* Однако пень кс ггрояадения зг.вЕсала от дозы препарата* У'" считала, гипертермия являете» следствием разорения л л не'^чня би-ергетических реакций.. Сцшш из основных лазс-л.*:^ ¿г, огр-зий функциональное состояние мембраны .гзляетск

мдевание активности АТФ-азы. У животных первой х™л V. ак-'ость АТЗ-азы была заикгибирована на 30$. зо второй и тре-

тьей активирована на 44 и 66$. Очевидно активация АТФ-азы па фоне усиления потребления 0^ клетками печени являлось следствием обращения. АТЗ-синтетазных реакций и была направлена на поддержание электрохимического потенциала ионов водорода за счет гидролиза АТФ, для компенсации энергетических затрат организма. Ингибирование активности фермента у животных первой группы, по-видимому, связано, с нарушением целостности митохон-дриа. зной мембраны.

Такн,: образом, нитрафен при душтельном введении внутрь крыса:«; в небольших дозах проявляет еьойотва разобщителя - активирует активность АТФ-азы, снимает сопряженность. процессов окисления и фосфорилирования. При поступлении в больших дозах полностью угнетаем биоэнергетическую систему организма» Полученные данные дают возможность раскрыть механизм токсического •действия нитрафена и. другие динитрофенолов» обосновать направления разработки лечебных мероприятий При отравлении нивотнш соединениями этого- класса. Цудет переспектквным использование а, этой целью антигшоксантов: цитохрома "с", убихинока, адени-ннуклеотидов (АТБ, АЙ5, НАД,. НАДО), глутатиона, аскорбиновой кислоты»

ВЫВОДЫ

I. Разработана методика определения нитрафена в тканях животных посредством ТСХ на пластинах "Сплуфол УФ-254V Подвюская система: хлороформ-гексан-этлдацетат (4:5:1), проявлящии рее гент - пары брома и: 2% водный раствор калия иодида. Нитрафен проявляется на пластинах в' виде 6-8 пятен розово-малинового цвета с ^ от 0,13 до 0,90. Экстракцию пестицида проводят а:

етоном, очистку осаждением на холоду водным раствором свшща ацетата и центрифугированием, а также перераспределением из Бодноацетсновой смеси в хлороформ. Количественную оценку проводят денситометрическим анализом. Нижний предел обнаружения I ккг в пробе или 0,1 мг/кг при массе пробы 10 г. Степень определения 60-90$.

2. Изучен состав и содержание действугяцего вещества (д.в.) -динитроалкилфенодов в двух образцах 60$ пасты нитрафена. Содержание д.в. было определено равным 31 а 39$ вместо 60$. Технические продукты, выделенные из образцов, содержали 6-8 одинаковых ингридиентов в разных соотношениях. В обоих образцах обнаружено присутствие динитроортокрезола (ДИСК) в количестве 4,0 и: 4,7$..

3.. Изучена токсичность образцов нитрафена для белых мышей, белых крыс.и кроликов при однократном введении внутрь. ДДдд пасты по препарату находилась в пределах для мышей 590-740 мг/кг, для крыс —'754г-1750 мг/кг; по; д.в. для мышей - 224-230 мг/кг,, для крыс 294-643 мг/кг. Препарат в дозе 93 кг/кг по д.в. вызвал клинические признаки интоксикации у кроликов, в дозе 186 мг/кг гибель 50$ особей и в дозе 310 мг/кг — 100$ гибель животных. Клиника интоксикации проявлялась учащением дыхания, повышением температуры тела, гибель наступает через 2-24 часа. 4. При однократном введении нитрафена внутрь кроликам в токсических и"смертельных дозах установлено снижение содержания в крови эритроцитов на 30-40$, подавление активности каталазы и ацетилхолинэстеразы на 40-50$, снижение в сыворотке общего белка на 34-49$, увеличение глюкозы в два раза. Отмечена резко выраженная метгемоглобинемия. Количество метгемоглобина увеличивалось на 173-260$ по отношению к исходному уровню и корре-

«Í4-1

лпровало с. дозой препарата.

5. В содержимом желудка, кишечника,, легких, печени,, сердце, почках кроликов, павших после введения внутрь нитрафена в сые ртельных дозах установлен высокий уровень содержания всех ин-гридиентов техничоскога продукта с суммарным содержанием дани троалкилфенолов в количестве 50-200 мг/кг. У кроликов,, получивших нитрафен в токсических дозах и. убитых через 1-3 суток после введения препарата,, были открыты два соединения,идентифицированные как ÍH0K ж диносеб. Через сутки после убоя содержание ДЕЮЕС в печени находилось на уровне- 2,8 мг/кг» даносеба - 21,2 мг/кг, в легких - 0,32 а 6,0 иг/кг соответственно. Через 30 дней удалось обнаружить лишь- следы диносеба. Метаболизм нитрафена в организме'животных, по-видимому, происходит по типуплетального синтеза" с образованием высокотоксичного продукта - диносеба.

6.. Нитрафен в дозах 108 и 54 мг/кг (1/5 и 1/10 JU%0) снижает стойкость эритроцитов к гемолизу и повышает, уровень метгемо-глобина на фоне клинических признаков интоксикации. Пестицид в дозе. 27. мг/яг (1/20 ЛД^) повышает стойкость эритроцитов, нарушая кислородотранспортнув функции гемоглобина за счет образования ыетгемоглобина при отсутствии клинических признаков отравления. Установлена тесная корреляционная связь между дозой нитрафена и уровнем содержания в крови мотгемоглобина ( Zj - 0.92, tz - 0,94)

7„ При ежедневном введении в течении месяца внутрь крысам нитрафена в дозе- 54 щг/кг д.в.. (1/10 Д%0) происходит эффективное ингибирсаание процессов окислительного фосфорштровашя, сопровождаицееся уменьшением активности ATí-ази, прекращением

Генерации' АЗО, снижением потребления: кислорода клетками печени'.1 В дозах 27 и 13,5 мг/шг (1/20 а 1/40 нитрафен выступает в роли разобщителя процессов окисления и: фбсфорилирования» при. . этом дыхание сохраняется а даже стимулируется, на нарушается фосфорилированиё - снижается уровень ДТЙ на фоне; активации АТФ-азы.

ПРШШЕСКИВ ПРЩОЖЕШЫ

Ii. Предложена методика определения нитрафена в тканях животных посредством тонкослойной хроматографии. (ТСХ) для ветерж-нарно-санитарной оценки продуктов вынужденного' убоя при отравлении нитрафеном и .посмертной диагностики интоксикаций..

2. Разработаны принципы прижизненной и посмертной диагностики отравлений животнлх нитрафеном,, основанные на измерении тест

гдпературы тела (повышение; до 39-40 С) г определении уровня в крови, метгемоглобина и содержания остатков пестшида в тканях убитых животных.

3. Изучен механизм токсического действия нитрафена и обоснован п; пнципиальный подход к разработке- антпДоотой терапии путем применения препаратов метиленовой сини и авгпгшгсксантов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ Z. Киргизбаева Д.Ж. Токсичность нитрафена для животных // Ветеринария, 1991, $ 3, с.61-63.

2, Киргазбаева Д.2- Динамика остатков нитрафена в органике животных // Труды MBA, 1992, з печати.

3.. Киргизбаева Д.З. Влияние нитрафена ка показатели: энергетического обмена // Труды I.SA, 1992,, в печа!>.

ВНИИВСГ'Э, 1992г. Москв», Звенигородское ш.,5, зак.2^тир. 100