Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Состояние системы иммунитета при экспериментальной хронической свинцовой интоксикации. Влияние селенита натрия.

На правах рукописи Овсянникова Алевтина Ивановна

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ СВИНЦОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ. ВЛИЯНИЕ СЕЛЕНИТА НАТРИЯ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 ДЕК т

005542727

Владикавказ - 2013

005542727

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель

Болиева Лаура Зелимхановна - доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты:

Чибисов Сергей Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры общей патологии и патологической физиологии медицинского факультета государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки Российской Федерации

Борукаева Ирина Хасанбиевна, доктор медицинских наук, доцент кафедры нормальной и патологической физиологии медицинского факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет им. X. М. Бербекова» Министерства образования и науки Российской Федерации

Ведущая организация

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 24 декабря 2013 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.095.01 в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (362019, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан 23 ноября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Свинец включен в список загрязняющих веществ ВОЗ как токсичный металл I класса опасности и является одним из наиболее токсичных и распространенных в окружающей среде тяжелых металлов (Gidlow D.A., 2004; Raviraja A. et al.,2008; Khan D.A. et al., 2010; Tabari S. et al., 2010; Falk H. et al., 2011). Источниками свинца для человека могут быть вода, атмосферный воздух, продукты питания, при этом уровень загрязнения окружающей среды этим металлом неуклонно растет (Скальный А.В. и др., 2004; Шекунов И.В. и др., 2002; Burren B.G. et al., 2010; Dong Z. et al., 2012; Falk H. et al., 2011; Queirolo E.I. et al., 2010; Feng J. et al., 2011; Zeng J. et al., 2011).

Несмотря на то, что свинец является одним из наиболее изученных промышленных ядов, его токсичность для человека продолжает вызывать значительный интерес. Достоверно установлена способность свинца оказывать токсическое действие в относительно низких концентрациях, которые ранее считались безопасными (LaBreche H.G. et al., 2011).

Одним из самых малоизученных аспектов свинцовой интоксикации является влияние свинца на иммунную систему. Имеются отдельные данные о способности свинца вызывать дисиммуноглобулинемию (Mishra К.Р. et al., 2006), модифицировать ответ Т-лимфоцитов с переключением с Thl на Th2 (Chen J.Y. et al., 2007), усиливать апоптоз клеток мишеней (Tousson Е et al., 2011), снижать функциональную активность и количество макрофагов (Sengupta М. et al., 2002). Однако исследования в данном направлении малочисленны, их результаты неоднозначны, так как не дают целостного представления о происходящих в иммунной системе изменениях и механизмах их развития при свинцовой интоксикации, что необходимо для разработки патогенетически обоснованных способов профилактики. В качестве наиболее вероятных механизмов иммунотоксического действия свинца рассматриваются его прооксидантная активность (Трахтенберг И. М. и др., 2001) и влияние на обмен и биологические функции ряда макро- и микроэлементов в организме. Повышенное поступление свинца в организм может приводить к нарушению баланса в системе ПОЛ-АОЗ и дефициту некоторых эссенциальных микроэлементов, таких как Fe, Са, Se, Zn. В то же время дефицит микроэлементов в организме и продуктах питания рассматривается как фактор, способствующий проявлению токсических эффектов свинца (Авцын А. П. и др., 1991). Приведенные данные свидетельствуют о том, что в разработке патогенетически обоснованных способов коррекции иммунотоксического действия свинца перспективным направлением является изучение модифицирующей активности эссенциальных микроэлементов, обладающих

антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью. В раде экспериментальных исследований установлена способность селена ослаблять токсическое действие тяжелых металлов, а также его несомненная роль в механизмах поддержания окислительного гомеостаза и иммуномодулирующая активность (Галачиев С.М., 2004; Тутельян В.А. и др., 2002).

Исходя из вышеизложенного, актуальной является комплексная оценка влияния свинцовой интоксикации на разные звенья иммунной системы и исследование защитных свойств селена в отношении иммунотоксического действия свинца в эксперименте.

Цель исследования: экспериментальное изучение патогенеза нарушений иммунной системы при хронической свинцовой интоксикации и анализ возможности корригирующего влияния селенита натрия. Задачи исследования:

1. Изучить влияние хронической свинцовой интоксикации на систему крови и костномозговое кроветворение крыс.

2. Изучить влияние хронической свинцовой интоксикации на факторы неспецифической резистентности экспериментальных животных.

3. Изучить влияние хронической свинцовой интоксикации на клеточный иммунитет у мышей в условиях свинцовой интоксикации.

4. Изучить влияние хронической свинцовой интоксикации на процессы клеточной гибели мононуклеаров периферической крови крыс.

5. Изучить влияние хронической свинцовой интоксикации на морфологию органов иммунной системы.

6. Изучить влияние хронической свинцовой интоксикации на систему перекисного окисления липидов - антиоксидантной защиты крыс.

7. Изучить характер функционально-морфологических изменений у экспериментальных животных, получавших на фоне хронической свинцовой интоксикации селенит натрия.

Научная новизна исследования. Проведено комплексное исследование влияния хронической свинцовой интоксикации на различные звенья иммунной системы и факторы естественной резистентности в экспериментальных моделях.

Установлено, что ацетат свинца при введении экспериментальным животным в течение 12 недель приводит к нарушениям фагоцитарного процесса, проявляющимся снижением поглотительной и переваривающей способности нейтрофильных гранулоцитов, снижением их функционального резерва; подавляет цитотоксическую активность натуральных киллеров.

Ацетат свинца при введении экспериментальным животным в течение 12 недель угнетает реакции клеточного иммунитета - спонтанную и

митогениндуцированную пролиферативную активность Т-лимфоцитов, реакцию контактной чувствительности.

Показана способность ацетата свинца при введении в течение 12 недель усиливать апоптоз и некроз мононуклеаров периферической крови крыс в условиях проведенного эксперимента.

Профилактическое использование селенита натрия эффективно препятствует токсическому поражению иммунной системы при действии ацетата свинца.

Научно-практическая значимость работы. Данное исследование носит экспериментальный характер. Результаты относятся к области фундаментальных знаний, поскольку дают возможность раскрыть патогенетические механизмы свинцовой интоксикации и вести поиск новых эффективных фармакологических средств, обладающих профилактическим и лечебным действием.

Полученные данные свидетельствуют о способности ацетата свинца оказывать токсическое действие на систему иммунитета, что позволило расширить имеющиеся представления о патогенезе свинцовой интоксикации.

Полученные результаты исследования свидетельствуют о положительном предупреждающем влиянии селенита натрия на формирование нарушений иммунной защиты, что расширяет представления о возможностях профилактики и лечения свинцовой интоксикации. В работе подобран комплекс методов, позволяющий оценивать иммунотропную активность других тяжелых металлов и разрабатывать патогенетически обоснованные методы коррекции их токсического действия.

Таким образом, полученные результаты могут стать основополагающими для разработки способов профилактики и лечения свинцовой интоксикации не только в эксперименте, но и у человека путем последующих исследований.

Новые знания о патогенезе свинцовой интоксикации и методах патогенетической коррекции иммунотоксического действия свинца могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах патофизиологии и фармакологии медицинских вузов.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Хроническая свинцовая интоксикация, вызванная ежедневным введением ацетата свинца (крысам в дозе - 10 мг/кг массы тела перорально через зонд, мышам - 0,2% р-р в качестве единственного источника питья) в течение 12 недель, оказывает повреждающее действие в отношении факторов неспецифической резистентности и иммунной защиты, которое проявляется нарушениями фагоцитарного процесса, угнетением клеточного иммунитета,

усилением апоптоза и некроза мононуклеаров периферической крови, развитием гиперплазии в органах иммунной системы.

2. Хроническое введение ацетата свинца оказывает иммунотоксическое действие в результате усиления процессов перекисного окисления липидов.

3. Профилактическое введение селенита натрия (крысы - 4 мг/л питьевой воды, мыши 2 мг/кг корма) экспериментальным животным на фоне хронической свинцовой интоксикации, уменьшает выраженность токсических изменений системы иммунитета.

4. Дополнительное введение селенита натрия при хронической свинцовой интоксикации снижает повреждающее действие свободных радикалов в отношении иммунной системы.

Личный вклад автора. На основе проведённого автором аналитического обзора отечественной и зарубежной литературы ею осуществлялась разработка методических подходов и дизайна исследований. Автор непосредственно участвовала в проведении экспериментов, заборе материала для анализов, выполнении лабораторных исследований, проведении статистической обработки полученных результатов, их анализе, обобщении и подготовке публикаций.

Апробация диссертационной работы. Основные положения работы доложены и обсуждались на X конференции молодых ученых СОГМА и Института биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН «Молодые ученые» (Владикавказ, 2011 г.); на XI и XII конференциях молодых ученых СОГМА и Института биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН «Молодые ученые - медицине» (Владикавказ, 2012, 2013 г.г.); на 3-й международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2012); на XII Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования России.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, приложений.

Диссертация иллюстрирована 32 рисунками, 2 схемами и содержит 13 таблиц. Библиографический указатель включает 174 источника литературы, из которых 46 работы отечественных и 128 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 216 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой 130-140 г и 144 мышах-самцах линии Balb/c с исходной массой 18-22 г. Эксперименты проведены в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России № 708н от 23 августа 2010 г. «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Свинцовую интоксикацию у крыс вызывали пероральным введением раствора ацетата свинца в дозе 10 мг/кг веса в пересчете на металл в дистиллированной воде ежедневно через зонд в течение 12 недель (McMurry S.T. et al., 1995; Sengupta M. et al., 2002; Flora S.J. et al., 2003). Мышам свинец спаивали с водой в виде 0,2% раствора ацетата свинца в течение 12 недель (Fernandez-Cabezudo M.J. et al., 2007; Wang С. et al., 2007). Для изучения модифицирующего действия селена на токсические эффекты свинца в питьевую воду крыс добавляли селенит натрия («Неоселен», НПЦ «Исинга», г. Чита) в дозе 4 мг/л (Беспалов В.Г. и др., 1984; Тутельян В.А. и др., 2002; Ognjanovic B.I. et. al., 2008). Мыши получали селенит натрия с кормом в дозе 2 мг/кг (Glauert Н.Р. et al., 2012). В каждой серии экспериментов животных делили на три группы, при этом животные I группы служили контролем и получали ежедневно через зонд дистиллированную воду, животные II группы получали ацетат свинца, III группа животных получала одновременно с ацетатом свинца селенит натрия в течение всего эксперимента.

Гематологические исследования. Количество лейкоцитов определяли при помощи гематологического анализатора ERMA РСЕ-210, лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Для изучения клеточного состава костного мозга использовали костный мозг из бедренных костей крыс. Мазки окрашивали по Романовскому-Гимзе, подсчитывали миелограмму по описанной методике (Первушин Ю.В. и др., 2006).

Оценка фагоцитарного процесса. Состояние системы НГ исследовали на крысах в тесте с Saccharomyces cerevisiae (Меньшиков В.В., 1987) и в НСТ тесте (Потемкина Е.Е. и др., 2003). Рассчитывали ФИ (фагоцитарный индекс) и ФЧ (фагоцитарное число) после 30- и 120-минутной инкубации. Также рассчитывали КФЧ. Кислородзависимую бактерицидную активность нейтрофилов оценивали в спонтанном и стимулированном НСТ-тесте. Рассчитывали СЦК по формуле Астальди-Верга и ИС.

Исследование цитотоксической активности натуральных киллеров. В качестве клеток-мишеней использовали клетки К562 («БиолоТ») в количестве 1х107/мл. Определяли процент цитотоксичности натуральных киллеров (Хаитов Р.М. и др., 2009).

Оценка пролиферации лимфоцитов. Пролиферативную активность лимфоцитов мышей оценивали в спонтанной и стимулированной митогеном реакции бласттрансформации. Учет результатов проводили морфологически (Потемкина Е.Е. и др., 2003).

Оценка клеточного иммунного ответа в реакции контактной чувствительности к 2,4-дннитрофторбензолу. Постановку реакции контактной чувствительности к 2,4-динитрофторбензолу у мышей линии Balb/c осуществляли по описанной методике (Kim Т.Y., 1990).

Оценка апоптоза и некроза. Ранний, поздний и активационный апоптоз исследовали методом проточной цитометрии, в тесте с пропидия иодидом. Для этого выделяли мононуклеары из крови крыс в градиенте плотности фиколл-верографина (р = 1,077). При исследовании раннего спонтанного апоптоза клетки фиксировали и окрашивали пропидия йодидом, сразу после выделения. Поздний и активационный апоптоз исследовали после 24 ч инкубации в полной среде и полной среде с фитогемаглютинином (ФГА) соответственно.

Морфологические исследования. Для патоморфологической оценки иммунокомпетентных органов животных забивали методом декапитации, фиксировали массу органов, рассчитывали коэффициент массы органа для селезенки, тимуса и лимфатических узлов. Ткани лимфоидных органов подвергали гистологической обработке по стандартной методике, срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Полученные препараты подвергали микроскопическому исследованию (Хабриев Р.У. и др., 2005).

Исследование системы перекисного окисления липидов -антиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ). Интенсивность перекисного окисления липидов изучали по концентрации МДА в эритроцитах (Камышников В.А., 2003) и по концентрации перекисей липидов в сыворотке крови (Данилова Л.А., 2003). Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности каталазы (Данилова Л.А., 2003), ГП (Мальцев Г.Ю., 2002) и СОД (Сирота Т.В., 1999).

Статистический анализ. Статистическая обработка полученных результатов выполнена с помощью программного обеспечения «GraphPad Prism 6» и «Statistica 10.0». Для анализа данных использовали среднюю величину (М) и ошибку средней (т); различия между двумя выборками оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Для сравнения средних в двух независимых группах использовали тест Манна-Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Корреляционные связи оценивали с помощью коэффициента корреляций Пирсона, в расчет брали связи г>0,7.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние свинцовой интоксикации на систему крови и кроветворение крыс. Эффекты селенита натрия.

Через 4 недели после начала эксперимента введение ацетата свинца привело к увеличению абсолютного количества лейкоцитов периферической крови в 1,7 раза (р<0,01) относительно контрольных значений. Через 12 недель данный показатель снизился по сравнению с контрольным в 1,3 раза с 8,44±0,49х109/л до 6,15±0,44х109/л (р<0,05). В лейкоцитарной формуле крыс, получавших свинец, через 12 недель наблюдалось снижение относительного количества сегментоядерных нейтрофилов в 1,8 раза (р<0,001) и увеличение относительного количества лимфоцитов в 1,2 раза (р<0,01).

У крыс, получавших наряду с ацетатом свинца селенит натрия, общее количество лейкоцитов и соотношение отдельных показателей лейкоцитарной формулы достоверно не отличалось от группы контроля на протяжении всего эксперимента (рис.1).

2015-

с;

? 10" х

50-

Рисунок 1. Влияние хронической свинцовой интоксикации на содержание лейкоцитов в периферической крови крыс и эффекты селенита натрия в динамике эксперимента. Различия с I группой (контроль) достоверны: * - р<0.05; ** - р<0.01. Различия со II группой (РЬ) достоверны: # - р<0.05.

•ЗЕ-

шЬ

1И Контроль СП РЬ И! РЬ+ве

4 нед

12 нед

При сравнении показателей лейкоцитарной формулы в группах II и III выявлено более высокое относительное количество сегментоядерных нейтрофилов в III группе - через 4 недели в 1,2 раза (р<0,05) и через 12 недель в 1,7 раза выше (р<0,05), чем в группе II при отсутствии относительного лимфоцитоза.

При исследовании показателей костномозгового кроветворения через 4 недели эксперимента выявлено статистически значимое снижение относительного количества гранулоцитов до 60,10±0,65% при действии свинца

против 64,60±0,93% в группе контроля (р<0,05). Через 12 недель свинцовая интоксикация приводила к значимым изменениям кроветворения в виде супрессии и эритроидного, и миелоидного ростков. Относительное количество гранулоцитов было достоверно более низким по сравнению с контрольными значениями 59,98±1,42% (р<0,05) при одновременном увеличении относительного количества лимфоцитов 8,98±0,38% (р<0,05), относительное количество миелобластов снизилось до 0,38±0,02% по сравнению с 0,95±0,12% в контрольной группе (р<0,001). Отмечено появление клеток с признаками фрагментоза, пикноза, вакуолизации и цитолиза, также встречались гигантские клетки. Уровень цитолиза во II группе на 12 неделе эксперимента составил 7,20±0,38% и был выше, чем в группе контроля, в 1,8 раза (р<0,05).

Профилактическое применение селенита натрия при хронической свинцовой интоксикации через 4 недели эксперимента проявилось снижением выраженности изменений показателей костномозгового кроветворения. Общее количество гранулоцитов в III группе, составило 62,55±1,13% и достоверно не отличалось от значений контрольной группы (р>0,05), в то время как во П группе животных уже отмечалось статистически достоверное снижение этого показателя. Через 12 недель эксперимента в данной группе животных общее количество гранулоцитов было также значимо ниже, чем в группе контроля (р<0,05). При оценке соотношения различных форм гранулоцитов, также как и во II группе, отмечалось снижение относительного количества молодых форм и преобладание относительного количества зрелых форм, однако эти изменения были менее выраженными - количество миелобластов снизилось в 1,8 раза, количество миелоцитов в 1,9 раза относительно группы контроля (р<0,05), достоверно меньшим было также количество миелокариоцитов с патологическими структурными изменениями, такими как фрагментоз, пикноз и цитолиз. Уровень цитолиза в III группе на 12 неделе эксперимента составил 5,32±0,33, что было достоверно ниже, чем во II группе (р<0,05) на этом же сроке, и значимо не отличается от значений в группе контроля.

Влияние свинцовой интоксикации на фагоцитарный процесс у крыс. Эффекты селенита натрия.

В группе животных, получавшей ацетат свинца, уже через 4 недели эксперимента наблюдалось отчетливое угнетение процессов кислороднезависимого фагоцитоза. ФИзо составил в данной группе 44,66±2,20%, ФИш - 47,66+4,66%, что было соответственно в 1,7 раза (р<0,001) и в 1,5 раза ниже (р<0,001) показателей в контрольной группе. Также значимо снизилась поглотительная способность нейтрофильных гранулоцитов. Среднее значение ФЧ30 составило 1,59±0,16, что было в 1,5 раза ниже (р<0,001) показателя в группе контроля. Через 12 недель эксперимента в группе,

получавшей ацетат свинца, значения ФИзо и ФИ по были достоверно ниже контрольных значений в 1,9 раза (р<0,001) и в 1,7 раза (р<0,001) соответственно. Показатель ФЧзо во II группе был ниже, чем в группе контроля, в 1,8 раза (р<0,001), КФЧ составил 0,92±0,03, что также было достоверно ниже (р<0,01) контрольных значений.

100-

60-

о

е-

рЗЕН

¡¡Ий Ж

И МИ

Ш Контроль СП РЬ Ш РЬ+Эе

_Л

■в а о.

ЯВ Контроль СИ РЬ В РЬ+Бе

ФИзо ФИ120

Рисунок 2. Влияние хронической свинцовой интоксикации на фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов крыс и эффекты селенита натрия в динамике эксперимента: А - 4 недели, Б - 12 недель. Различия с I группой (контроль) достоверны: * - р<0.05; ** - р<0.01; *** - р<0.001. Различия со II группой (РЬ) достоверны: * - р<0.05; ** - р<0.01; т - р<0.001.

На 4 неделе эксперимента в группе, получавшей наряду с ацетатом свинца селенит натрия (рис.2), ФИ30 составил 64,33±2,23%, а ФИ по - 62,00±1,12%, что было достоверно ниже (р<0,01) показателей в группе контроля (76,33±2,04% и 70,62±1,99% соответственно). Однако фагоцитарная активность в группе, получавшей коррекцию селенитом натрия, была достоверно выше (р<0,001), чем в группе, получавшей изолированное введение ацетата свинца (ФИзо 44,66±2,20%, ФИ по 47,66±4,66%). Показатели ФЧ30 и ФЧпо в группе,

получавшей селенит натрия, значимо не отличались от соответствующих показателей во II группе. КФЧ в группе, получавшей дополнительно селенит натрия, на 4 неделе эксперимента составил 1,12±0,14, что достоверно не отличалось от значений в группе, получавшей только ацетат свинца 0,94±0,09 (р>0,05).

К 12 неделе эксперимента в III группе показатели ФИзо и ФЧпо снизились в 1,2 раза (р<0,001) и 1,4 раза (р<0,001) соответственно, по сравнению с группой контроля, однако были достоверно выше (р<0,001), чем аналогичные показатели во П группе. Показатель ФЧзо в Ш группе на 12 неделе эксперимента был в 1,4 раза ниже по сравнению со значениями в группе контроля (р<0,001), однако во II группе в это же время ФЧзо был в 1,8 раза ниже относительно контрольных значений (р<0,001). Значения КФЧ во II и Ш группе на 12 неделе эксперимента были ниже (р<0,01), чем в группе контроля, при этом статистически достоверных отличий при сравнении этого показателя в группах II и III не установлено.

При исследовании метаболической активности нейтрофилов в спонтанном НСТ-тесте на 4 неделе эксперимента достоверных отличий в группе, получавшей свинец, по сравнению с контрольной группой не наблюдалось. Однако в данной группе выявлено снижение в 1,3 раза СЦК в стимулированном тесте (р<0,01) и ИС (р<0,001) по сравнению с контролем. Более выраженное снижение функционально-метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов во II группе животных наблюдалось к 12 неделе эксперимента. Процент клеток, содержащих гранулы диформазана, в спонтанном тесте снизился в 1,2 раза (р<0,05), а в стимулированном тесте в 1,8 раза (р<0,001) по сравнению с контрольными значениями; СЦК в стимулированном тесте составил 1,02±0,07 и был значимо ниже (р<0,001), чем в контрольной группе; ИС было в 1,4 раза ниже (р<0,001) контрольных значений.

Через 4 недели после начала эксперимента статистически достоверных изменений кислородзависимого фагоцитоза не было выявлено. Данные, полученные через 12 недель эксперимента, свидетельствуют, что дополнительное введение селенита натрия лабораторным животным способствовало сохранению метаболического потенциала нейтрофильных гранулоцитов в условиях свинцовой интоксикации. В III группе животных процент клеток, содержащих гранулы диформазана, как в спонтанном, так и в стимулированном тесте значимо не отличался от группы контроля, и был соответственно в 1,1 и 1,6 раза выше (р<0,05), чем во II группе. Также у крыс, получавших наряду с ацетатом свинца селенит натрия, сохранялся более высокий уровень ИС (р<0,001) по сравнению с группой, получавшей только ацетат свинца. Исходя из полученных данных, свинцовая интоксикация

приводит к дозозависимой супрессии кислородзависимого и кислороднезависимого фагоцитоза. Более высокие уровни показателей НСТ-теста в III группе указывают на способность селенита натрия оказывать протективный эффект в отношении кислородзависимых механизмов киллинга и сохранять способность нейтрофильных гранулоцитов к завершенному фагоцитозу.

Влияние свинцовой интоксикации на цитотоксическую активность натуральных киллеров у мышей. Эффекты селенита натрия.

При исследовании действия ацетата свинца на активность NK-клеток отмечалось подавление цитолитической активности натуральных киллеров, начиная с 4 недели эксперимента и до его окончания во всех серийных разведениях. Так, процент лизиса клеток мишеней на 4 неделе при соотношении эффектор - мишень 25:1 снизился в 2,5 раза (р<0,001), 50:1 в 2,2 раза (р<0,001), 100:1 в 2,1 раза (р<0,001), относительно значений группы контроля. Выраженность нарушений активности натуральных киллеров возрастала с увеличением продолжительности интоксикации. На 12 неделе эксперимента лизирующая способность натуральных киллеров в группе получавшей изолированное введение ацетата свинца была ниже в 3,8 раза (р<0,001) в соотношении эффектор-мишень 25:1, в 4,0 раза - 50:1 (р<0,001) и 100:1 (р<0,001), по сравнению с контрольными значениями.

Уровень лизиса клеток мишеней в группе, получавшей коррекцию селенитом натрия, через 4 недели эксперимента значимо не отличался от показателей в группе контроля, а в пробах, где соотношение эффектор -мишень составило 25:1, значимо (р<0,01) превышал значения контрольной группы. Через 12 недель уровень цитолитической активности оставался более высоким, чем в группе, получавшей ацетат свинца, во всех проведенных разведениях. В пробах с низким содержанием эффекторов уровень цитолитической активности в III группе животных составил 10,7±0,42% против 3,9±0,46% во II группе (р<0,001), в пробах с высоким содержанием эффекторов показатель активности натуральных киллеров при дополнительном введении селенита натрия был в 3,3 раза выше (р<0,001).

Влияние свинцовой интоксикации на пролиферативный ответ лимфоцитов мышей, стимулированных in vitro митогеном ФГА. Эффекты селенита натрия.

На ранних сроках интоксикации ацетат свинца оказывал стимулирующее действие на уровень спонтанного пролиферативного ответа лимфоцитов мышей, существенно не влияя на индуцированную митогеном бласттрансформацию. Уровень спонтанной бласттрансформации во II группе составил 7,1±0,56%, что в 1,6 раза выше (р<0,05), чем в группе контроля. На 12

неделе эксперимента стимулирующий эффект ацетата свинца сменился угнетением как спонтанной, так и индуцированной ФГА бласттрансформации (рис.3).

А 15

о юн

I-

о я с 10

5-

гЬ

А

ЯШ Контроль О РЬ ШЯ РЬ+Эе

СпТР

ФГА

Б«п

о Ю

ь

о

га Ц

ю

•=>" 5

СпТР

ФГА

ИЗ Контроль ЕЭ РЬ Ш РЬ+Бе

Рисунок 3. Влияние хронической свинцовой интоксикации на пролиферативную активность лимфоцитов мышей и эффекты селенита натрия в динамике эксперимента: А - 4 недели, Б - 12 недель. Различия с I группой (контроль) достоверны: * - р<0.05; ** - р<0.01; *** - р<0.001. Различия со II группой (РЬ) достоверны: # - р<0.05.

Уровень спонтанной пролиферации составил 3,7+0,47%, при действии ФГА данный показатель составил 8,4±0,85%, что было ниже контрольных значений в 1,5 раза (р<0,001).

При изучении иммуномодулирующей активности селенита натрия в РБТЛ в условиях свинцовой интоксикации нами получены следующие данные. Через 4 недели эксперимента не установлено статистически значимых различий показателей пролиферативной активности лимфоцитов мышей между группами II и III. Через 12 недель спонтанная бласттрансформация лимфоцитов при введении селенита натрия составила 7,6±0,50%, что было значимо выше

(р<0,05), чем в группе контроля и в группе, получавшей ацетат свинца. При действии ФГА данный показатель составил 10,8±0,50%, что достоверно превышает показатели во II группе (р<0,05).

Влияние свинцовой интоксикации на развитие реакции контактной чувствительности к 2,4-динитрофторбензолу у мышей. Эффекты селенита натрия.

Введение ацетата свинца вызывало практически полное подавление реакции контактной чувствительности - выраженность отека уха у животных, получавших свинец, была достоверно ниже (р<0,05) по сравнению с группой контроля. Выраженность супрессии в реакции контактной чувствительности прямо зависела от продолжительности воздействия - через 4 недели во II группе процент супресии составил 53,10±3,79%, через 12 недель - 81,1+4,42% (рис.4).

4 нед 12 нед 4 нед 12 нед

Рисунок 4. Влияние хронической свинцовой интоксикации на развитие контактной чувствительности к 2,4-динитрофторбензолу у мышей и эффекты селенита натрия. Показатели достоверны при р<0.05. * - достоверно по отношению к группе контроля (I группа); * - достоверно по отношению к группе получавшей РЬ (II группа).

Селенит натрия оказывал статистически значимое протективное действие на данной экспериментальной модели, что проявлялось в достоверно меньшем (р<0,05) угнетении реакции контактной чувствительности к 2,4-динитрофторбензолу у мышей

Процент супрессии в группе, получавшей коррекцию селеном, на 4 неделе составил 5,5±0,72%, а на 12 неделе - 22,0±0,63%, что статистически достоверно меньше (р<0,05) чем в группе получавшей изолированное введение ацетата свинца.

Влияние свинцовой интоксикации на процессы клеточной гибели мононуклеаров периферической крови крыс. Эффекты селенита натрия.

На 12 неделе эксперимента исследование «раннего» спонтанного апоптоза не выявило значимых различий между изучаемыми группами. «Поздний» спонтанный апоптоз в группе, получавшей ацетат свинца составил 10,22±1,24% и был в 3,8 раза выше, чем в группе контроля (р<0,05) и в 1,9 раза выше, чем в группе, получавшей дополнительно селенит натрия (р<0,01)(рис.5).

15п

§ Ю

ь ф с

ье

5-

Контроль ["□ РЬ

РЬ+Эе

п я

ъ

А

раннии

апоптоз

позднии

апоптоз

активационныи

апоптоз

некроз

Рисунок 5. Влияние хронической свинцовой интоксикации на процессы клеточной гибели мононуклеаров крыс и эффекты селенита натрия на 12 неделе эксперимента. Различия с I группой (контроль) достоверны: * - р<0.05; ** - р<0.01; *** - р<0.001. Различия со II группой (РЬ) достоверны: * - р<0.05; ** - р<0.01; *** - р<0.001.

В результате 24 ч инкубации мононуклеаров периферической крови в среде, содержащей митоген ФГА, во II группе апоптоз составил 10,84±0,55 и был в 2,5 раза выше чем, в группе контроля (р<0,05) и значимо не отличался от показателя в III группе. Наиболее высокий уровень клеток в состоянии некроза наблюдался также во II группе и составил 11,03±1,85%, против 7,98+0,54% в группе контроля (р<0,05). Уровень некроза в группе, получавшей с профилактической целью селенит натрия составил 9,75±0,62%, был выше чем в группе контроля (р<0,05) и значимо не отличался от показателя во II группе.

Влияние свинцовой интоксикации на морфологию органов иммунной системы крыс. Эффекты селенита натрия.

В условиях проведенного эксперимента статистически значимых различий относительной массы лимфоидных органов в исследуемых группах не выявлено.

Морфометрическое исследование тимуса на 12 неделе эксперимента выявило гиперплазию структур преимущественно коркового вещества. Так, плотность клеток на мм2 в группе, получавшей ацетат свинца, составила 50,27+0,86, тогда как в группе контроля плотность клеток коркового вещества составила 36,03±0,96 (р<0,001). Средняя плотность клеток в мозговом веществе тимуса П группы составила 29,24±2,17, против 23,23±1,55 в контроле. При гистологическом исследовании препаратов тимуса выявлена стертость границ между корковым и мозговым веществом. Морфометрическое исследование тимуса в группе, получавшей коррекцию селенитом натрия, также выявило гиперплазию структур коркового и мозгового вещества тимуса. Однако плотность клеток коркового вещества на мм2 в III группе составила 43,68±2,75 (р<0,05). В мозговом слое также наблюдались признаки гиперплазии, плотность клеток на мм2 составила 34,83±2,60, что статистически не отличалось от показателя во II группе.

При морфологическом исследовании селезенки и лимфоузлов выявлена гиперплазия лимфоидных фолликулов, значимых различий между опытными группами животных не выявлено.

Влияние свинцовой интоксикации на систему перекисного окисления липидов - антиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ) крыс. Эффекты селенита натрия.

В группе животных, получавшей ацетат свинца, наблюдалась активация процессов липопероксидации, что выражалось в повышении концентрации конечного продукта перекисного окисления липидов малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах. На 4 неделе данный показатель составил 48,35±0,87 мкмоль/л (р<0,01), а на 12 неделе 59,95±1,71 мкмоль/л (р<0,001) против 39,31±2,26 в контрольной группе. Значимое повышение уровня гидроперекисей (ГП) в сыворотке крови наблюдалось к 12 неделе эксперимента. В группе получавшей ацетат свинца данный показатель составил 5,95±0,19 мкмоль/л, что было в 1,4 раза выше (р<0,001), чем в контроле. Статистически значимые изменения в системе АОЗ выявлены через 12 недель после начала исследования. При действии ацетата свинца наблюдалось снижение активности антиоксидантных ферментов каталазы (р<0,001) и глутатионпероксидазы (р<0,001), относительно контрольных значений, при этом активность СОД у экспериментальных животных, получавших ацетат свинца, была выше (р<0,001) показателей контрольной группы животных (СОД 87,96±1,44 усл. ед), что, скорее всего, объясняется компенсаторной реакций на активацию ПОЛ с последующим истощением активности ферментативной системы. Полученные нами данные подтверждают имеющиеся сведения о прооксидантном действии свинца, которое, возможно, является одним из основных патогенетических

механизмов его повреждающего действия на систему иммунитета (ираваш С.О. е1 а1., 2001; Нашес! ЕЛ.й а1„ 2010; НашаёоисНе И.А. а а1., 2009).

У животных, получавших селенит натрия на фоне введения ацетата свинца, к 12 неделе эксперимента происходило некоторое увеличение концентрации МДА в эритроцитах 44,37±1,58 мкмоль/л против 39,31±2,26 мкмоль/л в контрольной группе, но при этом данный показатель был ниже соответствующего показателя у животных, получавших изолированное введение ацетата свинца, который к этому сроку эксперимента составил 59,95±1,71 мкмоль/л (р<0,001).

Дополнительное введение в рацион экспериментальных животных селенита натрия приводило также к позитивным изменениям уровня функционирования антиоксидантной защиты. У крыс, получавших селенит натрия на фоне введения ацетата свинца, активность каталазы через 12 недель хотя и снижалась относительно значений в группе контроля (6,20±0,34 МЕ/гНЬ против 8,30±0,23 МЕ/гНЬ, р<0,001), однако была достоверно выше, чем у животных, получавших изолированное введение ацетата свинца (р<0,05). Одновременно с этим к 12 неделе эксперимента отмечалось повышение активности супероксиддисмутазы до 96,64+0,62 усл.ед против значения в группе контроля 87,96±1,44 усл.ед. (р<0,01). Активность глутатионпероксидазы на 12 неделе эксперимента в группе, получавшей коррекцию селенитом натрия, была значимо выше, чем в группе получавшей изолированное введение ацетата свинца и группе контроля (р<0,001).

Менее выраженные изменения исследованных параметров системы иммунитета, может быть объяснено способностью селенита натрия поддерживать баланс окислительно-восстановительного статуса, повышать устойчивость организма к окислительному стрессу при действии ацетата свинца, снижая концентрацию малонового диальдегида и повышая активность ферментов антиоксидантной защиты каталазы, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы. Выше сказанное, является одним из механизмов протективного действия селенита натрия в отношении факторов неспецифической резистентности и иммунной защиты в условиях хронической свинцовой интоксикации.

Результаты проведенных исследований обобщены в следующей патогенетической схеме. Полученные результаты показывают, что введение селенита натрия при экспериментальной хронической свинцовой интоксикации, снижает выраженность токсических эффектов свинца на разные параметры иммунной системы, за счет повышения активности ферментов антиоксидантной защиты.

£ Патогенез корригирующего влияния селенита натрия при

- хронической свинцовой интоксикации

Схема. Патогенетическая схема механизмов развития иммунотоксического действия свинца. Влияние селенита натрия.

ВЫВОДЫ:

1. Изменения картины крови при введении крысам линии Вистар ацетата свинца в дозе 10 мг/кг массы тела в течение 12 недель характеризуются развитием лейкопении с относительной нейтропенией и супрессией миелоидного ростка кроветворения.

2. Ацетат свинца оказывает ингибирующее влияние на факторы неспецифической резистентности, подавляя фагоцитарный процесс и цитотоксическую активность натуральных киллеров.

3. Хроническая свинцовая интоксикация, вызванная у мышей линии Ва1Ь/с пероральным введением 0,2% раствора ацетата свинца, приводит к супрессии клеточного иммунитета, что проявляется торможением спонтанной и митогениндуцированной пролиферации Т-лимфоцитов и угнетением реакции контактной чувствительности.

4. Хроническая свинцовая интоксикация в течение 12 недель оказывает проапоптотическое действие в модели «позднего» и активационного апоптоза мононуклеаров периферической крови, стимулирует некроз данной клеточной популяции.

5. Нарушения в системе иммунитета при хронической свинцовой интоксикации сопровождаются развитием гиперплазии лимфоидных органов.

6. Хроническая свинцовая интоксикация приводит к активации свободно радикального окисления и угнетению ферментов антиоксидантной защиты, что может являться одним из патогенетических механизмов иммунотоксического действия свинца.

7. Селенит натрия при дополнительном введении экспериментальным животным (крысы - 4 мг/л питьевой воды, мыши 2 мг/кг корма) в условиях хронической свинцовой интоксикации оказывает иммуномодулирующее действие: ослабляет угнетающее действие свинца в отношении системы крови и кроветворения, препятствует ингибирующему действию свинца в отношении факторов неспецифической резистентности и клеточного иммунитета, тормозит апоптоз мононуклеаров периферической крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние селенита натрия на фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов крыс в условиях свинцовой интоксикации / А.И. Овсянникова, Л.З. Болиева, Т.Н. Гонобоблева, С.С. Бязрова // Устойчивое развитие горных территорий. - 2011. - №4(10). - С.76-79.

2. Овсянникова, А.И. Изучение возможности применения селенита натрия с целью профилактики иммунотоксического действия свинца / А.И. Овсянникова // «Молодые ученые»: тезисы докладов десятой конференции молодых ученых СОГМА и Института биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН. - Владикавказ, 2011. — С.42-43.

3. Изучение влияния селенита натрия на фагоцитарный процесс в условиях свинцовой интоксикации / А.И. Овсянникова, Л.А. Кокоев, Ю.В. Васылыкив, Д.Г. Гогниева // VII Международная (XVI Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых: матер, конф. - М., 2012. - С. 289-290.

4. Овсянникова, А.И. Возможные пути фармакологической коррекции иммунотоксического действия свинца / А.И. Овсянникова, Э.Г. Дряева, Л.А. Кокоев // «Молодые ученые - медицине»: тезисы докладов одинадцатой конференции молодых ученых СОГМА и Института биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН. -Владикавказ, 2012. - С. 107-109.

5. Влияние селенита натрия на лейкоциты перефирической крови и систему перекисного окисления липидов - антиоксидантной защиты в условиях свинцовой интоксикации / А.И. Овсянникова, Л.З. Болиева, Э.Г. Дряева, Ф.Э. Батагова // Фундаментальные исследования. -2012.-№ 12 (часть 1).-С. 108-111.

6. Овсянникова, А.И. Возможности регуляторных влияний селена на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов в условиях свинцовой интоксикации / А.И. Овсянникова, Л.З. Болиева, A.C. Цогоев // Вестник новых медицинских технологий. - 2013.-Т.ХХ,№1.-С.89-91.

7. Овсянникова, А.И. Влияние селенита натрия на костномозговое кроветворение крыс в условиях свинцовой интоксикации / А.И. Овсянникова // «Молодые ученые - медицине»: тезисы докладов XII конференции молодых ученых СОГМА и Института биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН. - Владикавказ, 2013. - С. 86-87.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОЗ - антиоксидантная защита

ГП - гидроперекиси.

ИС - индекс стимуляции

КФЧ - коэффициент фагоцитарного числа

МДА - малоновый диальдегид

НГ - нейтрофильный гранулоцит

НСТ - тест восстановления нитросинего тетразолия

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СЦК - средний цитохимический коэффициент

ФГА - фитогемаглютинин

ФИзо - фагоцитарный индекс после 30 минутной инкубации ФИ120 - фагоцитарный индекс после 120 минутной инкубации ФЧ3о - фагоцитарное число после 30 минутной инкубации ФЧ120 - фагоцитарное число после 120 минутной инкубации

Информационно-технический отдел ГБОУ ВПО СОГМА Минздрава РФ Подписано в печать 22.11.2013 г. Тираж 100 экз. Формат издания 60X90 усл.печ.л.1,0 Заказ № 165